CN1697880A - 荧光酶分析方法和组合物 - Google Patents

Abstract

披露了检测和/或表征酶的荧光组合物和方法及其各种用途。

Description

荧光酶分析方法和组合物

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求对下列申请的优先权：申请系列号60/409,178，发明名称“荧光酶分析方法和组合物”，于2002年9月9日提交；和申请系列号60/486,393，发明名称“荧光酶分析方法和组合物”，于2003年7月10目提交，所述申请的公开在此全文引用作为参考。

发明领域

本发明涉及用于检测或表征酶的荧光组合物和方法及其各种用途。

背景技术

对于研究和检测用于生物和工业应用的酶而言，酶分析是重要的工具。在活的生物体内，酶进行着多种工作，例如核酸的合成和复制、多肽的修饰和降解、代谢物的合成、以及许多其它功能。在工业中酶也被用于许多用途，例如在洗衣用洗涤剂中的所用的蛋白酶、用来制备特制(specialty)化学品例如氨基酸和维生素的代谢酶，和制备对映体上纯的药物的手性特殊酶。在医学检测中，酶是人类患者健康或疾病的重要指示剂。

虽然已发展出用来分析酶的众多方法，仍然存在很大的需求，以发现能被用来便宜而方便地检测和表征多种多样的酶的新分析设计。例如，蛋白激酶构成介导大量基本细胞过程的一大类酶。新近得到几乎完整的人类基因组序列使得鉴定许多蛋白激酶候选物成为可能，这些蛋白激酶候选物将需要多年的研究，以揭示它们的各种代谢作用(参见例如J.C.Venter等， Science 291：1304-1351(2001))。借助于适合高处理量筛选的新分析方法，这样的研究可被大大促进。然而，目前已有的分析操作不方便、昂贵，或是有其它缺陷。

发明概述

在一方面，本发明提供在样本中检测一个或更多蛋白激酶的磷酸化活性的方法。该方法提供了包含样本和至少一个激酶底物的混合物，其中所述激酶底物包含(a)一个蛋白激酶识别部分，该部分包含至少一个能被蛋白激酶磷酸化的非磷酸化残基，(b)一个疏水部分，和(c)一个荧光部分。将混合物置于当在样本中存在蛋白激酶时足以使非磷酸化的残基磷酸化的条件下，从而增大荧光部分所产生的荧光信号。检测到荧光信号的增大指示样本中存在蛋白激酶。

所要检测的蛋白激酶可以是本领域已知的任何蛋白激酶。例如，在一个实施方式中，蛋白激酶是蛋白激酶A。在另一个实施方式中，蛋白激酶是蛋白激酶C。在另一个实施方式中，蛋白激酶是蛋白激酶候选物，并且该方法被用来证实和/或表征候选物的激酶活性。

可对蛋白激酶底物进行设计，使其对特殊的蛋白激酶或一组蛋白激酶具有反应性，或对其进行设计，以测定底物特异性和/或其它催化特征，例如测定kcat或Km值。蛋白激酶识别部分中的非磷酸化残基可以是能够被蛋白激酶磷酸化的任何基团。在一个实施方式中，例如，残基是酪氨酸残基。在另一个实施方式中，残基是丝氨酸残基。在另一个实施方式中，残基是苏氨酸残基。

除了具有一个或更多能够被磷酸化的非磷酸化残基之外，识别部分可包括促进结合特异性、亲和力和/或加快被待检测蛋白激酶磷酸化的速率的额外氨基酸残基(或其类似物)。在有些实施方式中，识别部分包含至少3、4、5、6或7个氨基酸残基。

底物的疏水部分能够将底物整合入微团(micelle)。在一个实施方式中，疏水部分包含一个烃部分，该烃部分包含6到30个饱和碳原子。其它实施方式在下面进一步进行讨论。优选选择在底物磷酸化后促进荧光部分的荧光增强的疏水部分，使得增强幅度比用缺乏疏水部分的相同底物结构所获得的要大。

底物可被设计成在非磷酸化状态下具有特定的净电荷。在一个实施方式中，当在pH 8下测量时，底物具有的净电荷(净中性电荷)为0、或大约为0，使得添加一个磷酸根(phosphate)基团生成净电荷为负2的产物。在另一个实施方式中，底物具有的净电荷不为0，例如-1、-2或+1。在一个实施方式中，底物的净电荷是0或更少。在另一个实施方8式中，净电荷是-1或更少。

荧光部分可以是根据本发明可进行操作的任何荧光实体。在一个实施方式中，荧光部分包含荧光素。在另一个实施方式中，荧光部分包含磺基荧光素。在另一个实施方式中，荧光部分包含罗丹明。也可使用其它荧光部分。

将蛋白激酶识别部分、疏水部分和荧光部分以任何允许它们行使各自功能的方式连接。在一个实施方式中，疏水部分和荧光部分通过蛋白激酶识别部分彼此连接。例如，可将疏水部分和荧光部分连接于包含识别部分的底物部分的相对末端。在另一实施方式中，疏水部分和识别部分通过荧光部分彼此连接。在另一实施方式中，一个三价接头连接疏水部分、荧光部分和识别部分。

混合物可包括单一激酶底物，或其可包括多种不同激酶底物。当混合物包含多种不同激酶底物时，底物可在它们的蛋白激酶识别部分、疏水部分和/或荧光部分中的任一或更多个方面彼此不同。一个具体例子为，混合物可包括两个激酶底物，该两个激酶底物至少在它们的荧光部分上彼此不同。在一个实施方式中，可选择不同荧光部分，使得它们的荧光光谱彼此可分辨。例如，可选择第一激酶底物上的荧光部分在光谱的绿色区域发荧光，并且可选择第二激酶底物上的荧光部分在光谱的红色区域发荧光。在此实施方式中，当对不同激酶或激酶家族特异的底物与特定的荧光信号相关时，激酶底物也可在它们的激酶识别部分的特异性上彼此不同，使其能以“复合”(multiplexed)方式实施所述方法。当使用带有这样的光谱上可分辨的荧光部分的激酶底物时，可选择具有不同吸收或激发光谱或最大值的荧光部分，或可选择具有类似的吸收或激发光谱或最大值的全部或一个亚群(subset)，从而使得它们可用单一激发源同时激发。

当使用多种不同激酶底物时，虽然对于操作不是必需的，仍可选择一个或更多底物上的荧光部分，从而当这些部分彼此非常接近时，它们会淬灭一个或更多其它底物上的荧光部分的荧光，例如通过碰撞淬灭、荧光共振能量转移(FRET)、或通过另一机制(或机制的组合)。具体例子为，可选择第一激酶底物的荧光部分，使其所具有的吸收光谱与第二激酶底物的荧光部分的发射光谱充分重叠，从而第一荧光部分在与第二荧光部分十分接近，例如当两种激酶底物被整合入同一微团时，会基本上淬灭第二荧光部分的荧光。另一个具体例子为，可选择两个(或更多个)不同激酶底物的荧光部分，使得它们在十分接近时会淬灭彼此的荧光。

虽然对于操作不是必需的，混合物可任选包括一或更多个两亲性淬灭分子，当激酶底物和淬灭分子彼此十分接近，例如当激酶底物和淬灭分子被整合入同一微团时，该两亲性淬灭分子能够淬灭激酶底物的荧光部分的荧光。这样的淬灭分子通常包含一个能够将淬灭分子整合入微团的疏水部分和一个淬灭部分。疏水部分的具体实施方式可包括与激酶底物一起讨论的疏水部分中的任何一个。

淬灭部分可以是能够淬灭激酶底物的荧光部分的荧光的任何部分。在有些实施方式中，淬灭部分自身可以是一个荧光部分，该部分在非常接近处能，例如通过碰撞淬灭、荧光共振能量转移(FRET)或通过其它机制(或机制的组合)来淬灭激酶底物的荧光部分的荧光。一个具体例子为，淬灭部分可以是一个荧光部分，该部分所具有的吸收光谱与激酶底物的荧光部分的发射光谱充分重叠，使得当淬灭部分和激酶底物的荧光部分彼此十分接近时，例如当淬灭分子和激酶底物被整合入同一微团时，淬灭部分会基本上淬灭激酶底物的荧光部分的荧光。在另一个实施方式中，淬灭部分是无荧光的(non-fluorescent)。淬灭分子可任选包括蛋白激酶识别部分。

在另一方面，本发明提供在样本中检测一个或更多蛋白磷酸酶的磷酸酶活性的方法。在所述方法中，提供包含样本和至少一个磷酸酶底物的混合物，其中磷酸酶底物包含(a)一个磷酸酶识别部分，该部分包含至少一个能够被磷酸酶脱磷酸化(水解)的磷酸化残基，(b)一个疏水部分，和(c)一个荧光部分。混合物被置于在样本中存在磷酸酶时有效使得磷酸化的残基脱磷酸的条件下，从而增大荧光部分所产生的荧光信号。在混合物中检测到荧光信号的增大指示样本中存在磷酸酶。

所要检测的磷酸酶可以是本领域已知的任何磷酸酶。此外，磷酸酶可以是磷酸酶候选物，并且该方法被用来证实和/或表征候选物的磷酸酶活性。

可对磷酸酶底物进行设计，使其对特殊的磷酸酶或一组磷酸酶具有反应性，或对其进行设计，以测定底物特异性和其它催化特征，例如测定kcat或Km值。磷酸酶识别部分中的磷酸化残基可以是能够被磷酸酶脱磷酸化的任何基团。在一个实施方式中，例如，残基是磷酸酪氨酸残基。在另一个实施方式中，残基是磷酸丝氨酸残基。在还有另一个实施方式中，残基是磷酸苏氨酸残基。

除了具有一个或更多能够被脱磷酸化的磷酸化残基之外，识别部分可包括促进结合特异性、亲和力和/或加快被磷酸酶脱磷酸化的速率的额外的氨基酸残基(或其类似物)。在有些实施方式中，识别部分包含至少3、4、5、6或7个氨基酸残基。

底物的疏水部分能够将底物整合入微团。在一个实施方式中，疏水部分包含一个烃部分，该烃部分包含6到30个饱和碳原子。其它实施方式在下面进一步进行讨论。优选选择在底物磷酸化后促进荧光部分的荧光增强的疏水部分，使得增强幅度比用缺乏疏水部分的相同底物结构所获得的要大。

底物可被设计成在磷酸化状态下具有特定的净电荷。在一个实施方式中，当在pH 8下测量时，底物具有的净电荷(净中性电荷)为0、或大约为0，使得除去一个磷酸根基团会生成净电荷为+2的产物。在其它实施方式中，底物具有不为0的净电荷，例如+1、+2或-1。在一个实施方式中，底物的净电荷是0或更多。在另一个实施方式中，净电荷是+1或更多。

磷酸酶底物的荧光部分可以是根据本发明可进行操作的任何荧光实体。在一个实施方式中，荧光部分包含荧光素。在另一个实施方式中，荧光部分包含磺基荧光素。在另一个实施方式中，荧光部分包含罗丹明。也可使用其它荧光部分。

将磷酸酶识别部分、疏水部分和荧光部分以任何允许它们行使它们各自的功能的方式连接，连接方式类似于上面对蛋白激酶底物所讨论的设计构想。

混合物可包括单一磷酸酶底物，或其可包括多种不同磷酸酶底物。当混合物包括多种不同磷酸酶底物时，底物可在它们的磷酸酶识别部分、疏水部分和/或荧光部分中的任一或更多方面彼此不同。一个具体例子为，混合物可包括两个磷酸酶底物，该两个磷酸酶底物至少在它们的荧光部分上彼此不同。在一个实施方式中，可选择荧光光谱彼此可分辨的不同荧光部分。例如，可选择第一磷酸酶底物上的荧光部分在光谱的绿色区域发荧光，并且可选择第二磷酸酶底物上的荧光部分在光谱的红色区域发荧光。在此实施方式中，当对不同磷酸酶或磷酸酶家族特异的底物与特定的荧光信号相关时，磷酸酶底物也可在它们的磷酸酶识别部分的特异性上彼此不同，使其能以“复合”方式实施所述方法。当使用带有这样的光谱上可分辨的荧光部分的磷酸酶底物时，可选择具有不同吸收或激发光谱或最大值的荧光部分，或可选择具有类似的吸收或激发光谱或最大值的全部或一个亚群，从而使得它们可用单一激发源同时激发。

当使用多种不同磷酸酶底物时，虽然对于操作不是必需的，仍可选择一或更多个底物上的荧光部分，从而当这些部分彼此非常接近时，它们能，例如通过碰撞淬灭、荧光共振能量转移(FRET)、或通过其它机制(或机制的组合)来淬灭一个或更多其它底物上的荧光部分的荧光。一个具体例子为，可选择第一激酶底物的荧光部分，使其所具有的吸收光谱与第二磷酸酶底物的荧光部分的发射光谱充分重叠，从而第一荧光部分在与第二荧光部分十分接近，例如当两种磷酸酶底物被整合入同一微团时，会基本上淬灭第二荧光部分的荧光。作为另一个具体例子，可选择两个(或更多个)不同磷酸酶底物的荧光部分，使它们在十分接近时会淬灭彼此的荧光。

虽然对于操作不是必需的，混合物可以选择性地包括一个或更多两亲性淬灭分子，当磷酸酶底物和淬灭分子彼此十分接近，例如当磷酸酶底物和淬灭分子被整合入同一微团时，该两亲性淬灭分子能够淬灭磷酸酶底物的荧光部分的荧光。这样的淬灭分子通常包含一个能够将淬灭分子整合入微团的疏水部分和一个淬灭部分。疏水部分的具体实施方式可包括与磷酸酶底物一起讨论的疏水部分中的任何一个。

淬灭部分可以是能够淬灭磷酸酶底物的荧光部分的荧光的任何部分。在有些实施方式中，淬灭部分可本身是一个荧光部分，该部分在非常接近处能，例如通过碰撞淬灭、荧光共振能量转移(FRET)或通过另一机制(或机制的组合)来淬灭磷酸酶底物的荧光部分的荧光。一个具体例子为，淬灭部分可以是一个荧光部分，其所具有的吸收光谱与磷酸酶底物的荧光部分的发射光谱充分重叠，从而当淬灭部分和磷酸酶底物的荧光部分彼此十分接近时，例如当淬灭分子和磷酸酶底物被整合入同一微团时，淬灭部分会基本上淬灭磷酸酶底物的荧光部分的荧光。在其它实施方式中，淬灭部分是非荧光的。淬灭分子可以选择性地包括磷酸酶识别部分。

在一个更广泛的方面，本发明提供检测或测量酶活性的方法。在所述方法中，提供包含样本和所述酶的一个底物的混合物。底物包含(a)一个酶识别部分，该部分包含能够被所述酶以改变底物净电荷的方式加以修饰的化学反应位点，(b)一个疏水部分，和(c)一个荧光部分。混合物被置于有效使得所述酶对所述化学反应位点进行修饰，以产生荧光上可检测的产物的条件下，所述荧光上可检测的产物包含修饰的酶识别部分、疏水部分和荧光部分，从而增大荧光部分所产生的荧光信号。检测到荧光信号的增大指示样本中磷酸酶的存在。

在一个实施方式中，所述酶是蛋白激酶。在另一个实施方式中，所述酶是蛋白磷酸酶。

在一个实施方式中，酶识别部分包含一个多肽片段，该片段包含在分析过程中被所述酶加以化学改变的基团，以导致荧光信号的增大。在一些实施方式中，识别部分包含至少3、4、5、6或7个氨基酸残基。

底物的疏水部分能够将底物整合入微团。在一个实施方式中，疏水部分包含一个烃部分，该烃部分包含6到30个饱和碳原子。其它实施方式在下面进一步进行讨论。优选选择在底物磷酸化后促进荧光部分的荧光增强的疏水部分，使得增强幅度比用缺乏疏水部分的相同底物结构所获得的要大。

底物可被设计成在与酶反应前具有特定的净电荷。在一个实施方式中，当在pH 8下测量时，底物具有的净电荷(净中性电荷)为0、或大约为0。在其它实施方式中，底物具有不为0的净电荷，例如-1、-2或+1或+2。在一个实施方式中，底物的净电荷是0或更少。在另一个实施方式中，净电荷是-1或更少。在其它实施方式中，底物的净电荷是0或更多，或+l或更多。

在一个实施方式中，酶与底物反应，以加上或除去一个导致底物电荷改变的基团。例如，底物与酶的反应可导致底物净电荷幅度的增高，使得产物与底物相比具有较多负电荷或较多正电荷。

荧光部分可以是根据本发明可进行操作的任何荧光实体。在一个实施方式中，荧光部分包含荧光素。在另一个实施方式中，荧光部分包含磺基荧光素。在另一个实施方式中，荧光部分包含罗丹明。也可使用其它荧光部分。

将酶识别部分、疏水部分和荧光部分以任何允许它们行使它们各自的功能的方式连接。在一个实施方式中，疏水部分和荧光部分通过酶识别部分彼此连接。例如，疏水部分和荧光部分可被连接于包含识别部分的底物部分的相对末端。在另一实施方式中，疏水部分和识别部分通过荧光部分彼此连接。在另一实施方式中，通过一个三价接头连接疏水部分、荧光部分和识别部分。

在本发明的另一个实施方式中，酶作用足以形成一种在反应混合物中比底物更具荧光的产物，使得酶识别部分、疏水部分和荧光部分保留在产物中(没有从产物上切割下来)。

混合物可包括单一的酶底物或多种酶底物，其方式可以与上面与激酶底物和磷酸酶底物一起描述的方式类似。如上面所讨论的，混合物可还包括一个或更多淬灭分子。

本文将进一步讨论本发明可包括荧光底物和组合物和包含它们的试剂盒。

本文将进一步讨论本发明的方法和组合物还可被用于检测、筛选和/或表征酶活性的底物、抑制剂、激活剂或调节剂(modulator)。

从详细说明中本发明的这些和其它特征在此将变得更加明白。

附图简述

图1显示在存在不同浓度(0.15μM，0.3μM，和0.6μM)的本发明荧光蛋白激酶底物时，蛋白激酶A的动力学数据(荧光对时间)。

图2显示用来自图1的数据生成的双倒数作图(1/V作为1/S的函数进行作图)。

图3显示在存在本发明的荧光磷酸酶底物时磷酸酶的动力学数据(荧光对时间)。

图4显示在不存在(最低痕量(lowest trace))或存在抑制剂星形孢菌素(5mM，中等痕量)或PKA特异性抑制剂TYADFIASGRTGRRNAI(20nM，最高痕量)时、在几种浓度的ATP(50、10、3和2μM)下，以双倒数作图(1/V作为1/S的函数进行作图)的形式得到的蛋白激酶A的动力学数据。

图5显示在不同浓度的抑制剂星形孢菌素存在下(痕迹A：0nM，B：2nM，C：5nM，和D：10nM)，蛋白激酶C-βII与PKC-βII底物(化合物8)反应的荧光时间图。获得最低痕量(E)作为无酶对照。

图6显示pp60^c-src-相关蛋白酪氨酸激酶与荧光底物(化合物9)反应的荧光时间作图(一式三份)。也进行了在无酶情况下的两个对照反应(底部的两条痕迹)。

图7A显示在ATP＝10μM时以30秒读数间隔得到的PKC的原始动力学数据。

图7B显示在ATP＝10μM时PKC的起始速率(velocity)数据。系列1至10代表0、0.1、0.5、1、2、5、10、20、50、100nM星形孢菌素浓度。以相同方式排列线性方程式。

图8A显示在ATP＝50μM时以30秒读数间隔得到的PKC的原始动力学数据。

图8B显示在ATP＝50μM时PKC的起始速率数据。系列1至10代表0、0.1、0.5、1、2、5、10、20、50、100nM星形孢菌素浓度。以相同方式排列线性方程式。

图9显示在ATP＝10、50、100和200μM时PKC的IC50。

图10显示在ATP＝10、50、100和200μM时PKC的IC50。

发明内容

定义

除非另外说明，本文所使用的如下术语和用语旨在具有如下意义：

“检测(detect)”和“测定(detection)”具有其标准的意义，旨在包含选定的酶或酶活性的检测、测量和表征。例如，酶活性可以在检测、筛选、或表征酶活性的抑制剂、激活剂和调节剂的过程中被“检测”。

“微团”具有其标准意义，旨在指水中或水环境中两亲性分子所形成的聚集体，使得它们的极性末端或部分与水或水环境接触，并且它们的非极性末端或部分在聚集体内部。微团可采取任何形状或形式，包括但不限于，不包围(enclose)一部分水或水环境的非层状聚集体，或包围一部分水或水环境的单层或多层泡样聚集体，例如脂质体。

“淬灭”具有其标准意义，并且在荧光信号的上下文中，旨在指在一特定检测波长下，荧光强度的可测量的降低或减少，而不管其发生的机制为何。通过不带有限制作用的举例说明，当一个荧光信号在一个特殊检测波长下其强度被降低25％、50％、75％、80％、90％、95％或甚至更多时，荧光信号被淬灭。

多肽序列以N末端到C末端的定向(左到右)提供，其中氨基酸残基用标准3个字母或1个字母代码(例如Strver.L.， Biochemistry.第二版，W.H.Freeman and Co.，San Francisco，CA，第16页(1981))代表。

酶底物组合物

本发明提供酶底物，该底物可被设计为用来检测各种各样不同酶中的任何酶。底物包含能够将底物整合入微团的疏水部分。底物还包含荧光部分，在与目的酶反应后该荧光部分的荧光增大，而无需淬灭基团在底物与酶反应前抑制荧光部分的荧光。有利地，本发明的底物能够在连续监测状态下被实时使用，使得用户能迅速确定样本中是否有酶活性存在，并且任选地，确定酶的量或特异活性。

通过例证的方式，下面根据蛋白激酶、将其作为将要被检测的例证性酶而对本发明进行讨论。除了发挥重要的生化作用外，蛋白激酶也用于举例说明使酶底物净电荷增加的酶，这种增加是通过向羟基上添加磷酸根基团以形成磷酸化底物而实现的。在碱性条件下，底物的磷酸化导致添加两个负电荷，电荷的净变化为-2。也讨论了实现相反反应的酶，蛋白磷酸酶，该酶在碱性条件下导致+2的电荷净增长。在任何一种情况下，酶底物上净电荷的幅度是增加的。例如，在如上面所描述磷酸化酶底物之后，酶底物上的净负电荷的幅度增加到-2。另一方面，在酶底物被磷酸酶去磷酸化之后，酶底物上的净正电荷的幅度增加到+2。

在一个实施方式中，本发明提供了用于检测或表征样本中一个或更多蛋白激酶的激酶底物。在化合物的一个示例性分类中，激酶底物至少包含(a)至少包含一个非磷酸化的残基的蛋白激酶识别部分，该非磷酸化残基能够被蛋白激酶所磷酸化，(b)能够将底物整合入微团的疏水部分，和(c)荧光部分。

蛋白激酶识别部分一般包括氨基酸侧链，该氨基酸侧链包含能够被蛋白激酶磷酸化的基团。在一个实施方式中，可被磷酸化的基团是羟基。通常所提供的羟基为酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的侧链的一部分，但也可以使用任何其它天然或非天然氨基酸侧链或其它包含可磷酸化的羟基基团的实体。可被磷酸化的基团也可以是氮原子，例如赖氨酸ε氨基基团中的氮原子，组氨酸的咪唑氮原子，或精氨酸的胍基氮原子。可被磷酸化的基团也可以是天冬氨酸或谷氨酸残基中的羧基基团。

蛋白激酶识别部分还可包含一个片段，通常是多肽片段，该片段包含一个或更多亚单位或残基(除了可被磷酸化的残基)，该亚单位或残基赋予底物鉴别特性，使底物与将被检测或表征的蛋白激酶的底物特异性相适应。

在过去几十年中，已表征了各种各样的蛋白激酶，并且鉴定出许多种类(参见，例如，S.K.Hanks等， Science 241：42-52(1988)；B.E.Kemp和R.B.Pearson， Trends Biochem.Sci.15：342-346(1990)；S.S.Taylor等， Ann. Rev.Cell Biol.8：429-462(1992)；Z.Songyang等， Current Biology4：973-982(1994)；和 Chem.Rev.101：2209-2600，“Protein Phosphorylationand Signaling”(2001))。示例性的蛋白激酶种类包括cAMP依赖的蛋白激酶(也称为蛋白激酶A家族，A-蛋白，或PKA)，cGMP依赖的蛋白激酶，蛋白激酶C酶(PKC，包括二酰基甘油激活的钙依赖的PKC)，Ca²⁺/钙调蛋白依赖的蛋白激酶I或II，蛋白酪氨酸激酶(例如，PDGF受体，EGF受体，和Src)，有丝分裂原活化蛋白(MAP)激酶(例如，ERK1，KSS1，和MAP激酶I型)，依赖细胞周期蛋白的激酶(CDK，例如Cdk2和Cdc2)，以及受体丝氨酸激酶(例如TGF-β)。示例性的各种蛋白激酶的共有序列示于下面表1。这些各种共有序列可被用来设计蛋白激酶识别部分，该蛋白激酶识别部分具有对特定激酶和/或激酶家族的理想特异性。

也可以设计具有对特定激酶和/或激酶家族的理想特异性的蛋白激酶识别部分，例如使用在Brinkworth等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(1)：74-79(2003)中所描述的方法和/或示例性序列。

表1
			符号	说明	共有序列a
PKA	cAMP依赖	-R-R-X- S/T-Z-
			PhK	磷酸化酶激酶	-R-X-X- S/T-F-F-
cdk2	依赖细胞周期蛋白的激酶-2	- S/T-P-X-R/K
			ERK2	细胞外调节的激酶-2	-P-X- S/T-P-
PKC	蛋白激酶C	KKKKRFSFKbXRXXSXRX
			CaMKI	Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶I	LRRLSDSNFc
CaMKII	Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶II	KKLNRTLTVAd
			c-Src	劳斯肉瘤病毒转化剂的细胞形式	-E-E-I- Y-E/G-X-F-
v-Fps	藤浪肉瘤病毒的转化剂	-E-I- Y-E-X-I/V-
			Csk	C末端Src激酶	-I- Y-M-F-F-F-
InRK	胰岛素受体激酶	- Y-M-M-M-
			EGFR	EGF受体	-E-E-E- Y-F-

^a参见，例如，B.E.Kemp和R.B.Pearson， Trends Biochem.Sci.15：342-346(1990)；Z.Songyang等， Current Biology 4：973-982(1994)；J.A.Adams， Chem Rev.101：2272(2001)以及其中所引用的参考文件；X指任何氨基酸残基，“/”指示互换残基；并且Z是疏水氨基酸，例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。

^bGraff等， J.Biol.Chem.266：14390-14398(1991)

^cLee等， Proc.Natl.Acad.Sci.91：6413-6417(1994)

^dStokoe等， Biochem.J.296：843-849(1993)

蛋白激酶识别序列通常包含L-氨基酸残基的序列。然而，也可以使用各种具有不同骨架或侧链结构的氨基酸中的任何一个，例如D-氨基酸多肽、通过硫代酸酯或磺酰基团连接的烷基骨架部分、羟基酸酯(相当于用酯键替代酰胺键)、用氮代替α碳以形成氮杂类似物、由氨基甲酸酯基团连接的烷基骨架部分、聚乙烯亚胺(PEI)和氨基醛，其导致由仲胺组成的聚合物。更详细的骨架列表包括N-取代的酰胺(-CON(R)-代替-CONH-键)、酯(-CO₂-)、酮亚甲基(-COCH₂-)、亚甲基氨基(-CH₂NH-)、硫代酰胺(-CSNH-)、次膦酸盐(-PO₂RCH₂-)、亚膦酰胺(phosphonamidate)和亚膦酰胺酯(-PO₂RNH₂)、逆肽(retropeptide)(-NHC(O)-)，反式烯(-CR＝CH-)、氟烯(例如-CF＝CH-)、二亚甲基(-CH₂CH₂-)、硫醚(例如-CH₂SCH₂-)、羟基乙烯(-CH(OH)CH₂-)、亚甲基氧(-CH₂O-)、四唑(-CN₄-)、逆硫代酰胺(retrothioamide)(-NHC(S)-)、逆还原的(-NHCH₂-)、亚磺酰氨基(-SO₂NH-)、亚甲基亚磺酰氨基(-CHRSO₂NH-)、逆氨磺酰(-NHS(O₂)-)、和类肽(peptoid)(N-取代的甘氨酸)、以及带有丙二酸盐和/或偕-二氨基烷基亚单位的骨架，如M.D.Fletcher等， Chem.Rev.98：763(1998)和其中所引用的参考文件所综述。也可以使用类肽骨架(N-取代的甘氨酸)(例如H.Kessler， Angew.Chem.Int.Ed.Engl.32：543(1993)；R.N.Zuckermann，Chemtracts-Macromol.Chem.4：80(1993)；和Simon等， Proc.Natl.Acad. Sci.89：9367(1992))。

识别部分可包含多肽片段，该多肽片段包含将被磷酸化的基团或残基。在一个实施方式中，多肽片段具有的多肽长度等于或少于30个氨基酸残基、25个残基、20个残基、15个残基、10个残基或5个残基。在另一个实施方式中，多肽片段具有的多肽长度在3-30个残基、或3-25个残基、或3-20个残基、或3-15个残基、或3-10个残基、或3-5个残基、或5-30个残基、或5-25个残基、或5-20个残基、或5-15个残基、或5-10个残基、或10-30个残基、或10-25个残基、或10-20个残基、或10-15个残基范围内。在另一实施方式中，多肽片段包含3-30个残基、或3-25个残基、或3-20个残基、或3-15个残基、或3-10个残基、或3-5个残基、或5-30个残基、或5-25个残基、或5-20个残基、或5-15个残基、或5-10个残基、或10-30个残基、或10-25个残基、或10-20个残基、或10-15个残基。在另一实施方式中，多肽片段包含至少3、4、5、6或7个氨基酸残基。

底物的疏水部分能够在用来检测酶的分析条件下将底物整合入微团。优选选择在底物磷酸化后促进荧光部分的荧光增强的疏水部分，使得增强幅度比用缺乏疏水部分的相同底物结构所获得的要大。

可改变疏水部分的精确长度、大小和/或组成以获得所期望的结果。在一个实施方式中，疏水部分包含烃(由碳和氢原子组成)，所述烃包含6-30个碳原子、或6-25个碳原子、或6-20个碳原子、或6-15个碳原子、或8-30个碳原子、或8-25个碳原子、或8-20个碳原子、或8-15个碳原子、或12-30个碳原子、或12-25个碳原子、或12-20个碳原子。烃可以是线性、分枝或环状的，或其任何组合。示例性的完全饱和的线性烃基团包括C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C22、C24和C26正-烷基(n-alkyl)链。此外，烃可包含环丙基、环丁基、环戊基或环己基。在一个实施方式中，疏水部分是完全饱和的。在另一个实施方式中，疏水部分可以包含一个或更多可以是顺式或反式的碳-碳双键，和/或一个或更多碳-碳三键。在有些情况下，疏水部分可以具有一个或更多芳基环或芳香基烷基，例如1或2个苯环。如在实施例3中对下面方案3中的化合物进行的举例说明那样，通过制备具有不同疏水部分的几个底物化合物，可以进行最优化测试。

在另一实施方式中，疏水部分是不具有环状芳族π电子系统的非芳族部分。在另一实施方式中，如果疏水部分包含一个或更多不饱和的碳-碳键，那些碳-碳键不是共轭的。在另一实施方式中，疏水部分的结构不能通过FRET或堆集(stacking)相互作用与荧光部分相互作用，来淬灭荧光部分的荧光。本发明还包含涉及前述实施方式中任何两个或更多个的组合的实施方式。

对于其中疏水部分与荧光部分相连接的实施方式，应该理解为疏水部分与荧光部分截然不同，因为疏水部分不包括荧光部分中的任何原子，该荧光部分是产生荧光信号的芳族或共轭π电子系统的部分。因此，如果疏水部分与呫吨环的4位连接，疏水部分不包括呫吨环的任何芳族环原子。

虽然荧光增大的基本原理还不能肯定，预期本发明的荧光底物由于疏水部分的存在能够在反应混合物中形成微团，使得荧光部分由于它们非常接近和高局部浓度而彼此淬灭。光散射的增加和/或荧光部分最大吸光度的位移可以作为微团形成的证据。在为支持本发明所进行的实验中，已发现包含疏水部分在有些情形下导致荧光部分的最大吸光度的大幅度红移(大约20nm)。然而，有可能由底物实际形成微团对于本发明的可操作性不是必需的。

底物中的荧光部分可以是提供荧光信号的任何实体，所述荧光信号可以被用来追踪酶介导的磷酸化。通常荧光部分包含荧光染料，该荧光染料继而包含对吸收事件作出响应而在第一波长吸收光和在第二波长发射光的共振离域系统或芳香环系统。本领域已知多种多样的这种荧光染料分子。例如，荧光染料可选自各种各样种类的荧光化合物中的任何一种，例如呫吨、罗丹明、荧光素、花青、酞菁(phthalocyanine)、方酸(squaraine)和bodipy染料。

在一个实施方式中，染料包含呫吨类型的染料，该染料包含如下形式的融合三环系统：

此呫吨母环可以是非取代的(即所有的取代基是H)，或者可以是用例如下面描述的各种相同或不同取代基中的一个或更多取代。

在一个实施方式中，染料包含具有如下一般结构的呫吨母环：

在上面所描述的呫吨母环中，A¹是OH或NH₂，A²是O或NH₂ ⁺。当A¹是OH并且A²是O时，呫吨母环是荧光素型呫吨环。当A¹是NH₂并且A²是NH₂ ⁺时，呫吨母环是罗丹明型呫吨环。当A¹是NH₂并且A²是O时，呫吨母环是对甲氨基酚类型呫吨环。在上面所描述的呫吨母环中，A¹和A²的一个或两个氮(当存在时)和/或位置C1、C2、C4、C5、C7、C8和C9的碳原子中的一个或更多可用各种相同或不同取代基独立取代。在一个实施方式中，典型的取代包括，但不限于，-X，-R，-OR，-SR，-NRR，全卤(C₁-C₆)烷基，-CX₃，-CF₃，-CN，-OCN，-SCN，-NCO，-NCS，-NO，-NO₂，-N₃，-S(O)₂O^-，-S(O)₂OH，-S(O)₂R，-C(O)R，-C(O)X，-C(S)R-，-C(S)X，-C(O)OR，-C(O)O^-，-C(S)OR，-C(O)SR，-C(S)SR，-C(O)NRR，-C(S)NRR和-C(NR)NRR，其中每一X独立地是卤素(优选-F或Cl)，并且每一R独立地是氢、(C₁-C₆)烷基、(C₁-C₆)烷基(alkanyl)、(C₁-C₆)链烯基、(C₁-C₆)炔基、(C₅-C₂₀)芳基、(C₆-C₂₆)芳香烷基、(C₅-C₂₀)芳香芳基、杂芳基、6-26元杂芳香烷基、5-20元杂芳-杂芳基、羧基、酰基、磺酰基、亚磺酰基、砜、磷酸盐或膦酸盐。此外，C1和C2取代基和/或C7和C8取代基可以被加在一起形成取代或非取代的丁[1，3]二烯并(dieno)桥或(C₅-C₂₀)亚芳并(aryleno)桥。一般地，优选不倾向于淬灭呫吨母环的荧光的取代基，但在有些实施方式中可能需要淬灭取代基。倾向于淬灭呫吨母环的荧光的取代基是吸电子基团，例如-NO₂、-Br和-I。在一个实施方式中，C9是非取代的。在另一个实施方式中，C9是用苯基取代的。在另一个实施方式中，C9是用苯基之外的取代基取代的。

当A¹是NH₂和/或A²是NH₂ ⁺时，这些氮可以被包括在涉及相同氮原子或相邻碳原子的一个或更多桥中，例如(C₁-C₁₂)亚烷基(alkyldiyl)、(C₁-C₁₂)亚烷基并(alkyleneo)桥、2-12元杂亚烷基(heteroalkyldiyl)和/或2-12元杂亚烷基并桥。

碳C1、C2、C4、C5、C7、C8、C9上的取代基中的任何一个和/或C3和/或C6上的氮原子(当存在时)可用相同或不同取代基中的一个或更多进一步取代。典型的取代包括，但不限于，-X，-R’，-OR’，-SR’，-NR’R’，-CX₃，-CN，-OCN，-SCN，-NCO，-NCS，-NO，-NO₂，-N₃，-NHOH，-S(O)₂O^-，-S(O)₂OH，-S(O)₂R’，-P(O)(O^-)₂，-P(O)(OH)₂，-C(O)R’，-C(O)X，-C(S)R’，-C(S)X，-C(O)OR’，-C(O)O-，-C(S)OR’，-C(O)SR’，-C(S)SR’，-C(O)NR’R’，-C(S)NR’R’和-C(NR)NR’R’，其中每个X独立地是卤素(优选-F或-Cl)，并且每个R’独立地是氢、(C₁-C₆)烷基、2-6元杂烷基、(C₅-C₁₄)芳基或杂芳基、羧基、酰基、磺酰基、亚磺酰基、砜、磷酸盐或膦酸盐。

示例性的呫吨母环包括，但不限于，罗丹明型的呫吨母环和荧光素型呫吨母环。

在一个实施方式中，染料包含罗丹明型呫吨染料，该呫吨染料包括如下环系统：

在上面所描述的罗丹明型呫吨环中，如例如上面对呫吨母环所做的描述那样，一个或两个氮和/或位置C1、C2、C4、C5、C7或C8上的碳中的一个或更多可用各种各样相同或不同取代基独立取代。C9可以用氢或其它取代基取代，例如邻羧基苯基或邻(磺酸)苯基基团。示例性的罗丹明型呫吨染料包括，但不限于，在美国专利5,936,087、5,750,409、5,366,860、5,231,191、5,840,999、5,847,162和6,080,852(Lee等)、PCT公开WO 97/36960和WO99/27020，Sauer等，J.Fluorescence 5(3)：247-261(1995)，Arden-Jacob，NeueLanwellige Xanthen-Farbstoffe für Fluorescence und Farbstoff Laser，VerlagShaker，Germany(1993)，和Lee等，Nucl.Acids Res.20：2471-2483(1992)中所描述的罗丹明染料的呫吨环。在定义“罗丹明型呫吨环”中还包括的是在1999年6月3日提交的美国申请系列号09/325,243中所描述的扩展罗丹明染料中的扩展(extended)共轭呫吨环。

在另一实施方式中，染料包含具有如下结构的荧光素型呫吨母环：

在上面所描述的荧光素型呫吨母环中，如上面对呫吨母环所做的描述那样，位置C1、C2、C4、C5、C7、C8和C9上的一个或更多碳可用各种各样的相同或不同取代基独立取代。C9可以用氢或其它取代基取代，例如邻羧基苯基或邻(磺酸)苯基基团。示例性的荧光素型呫吨母环包括，但不限于，在美国专利4,439,356、4,481,136、4,933,471(Lee)、5,066,580(Lee)、5,188,934、5,654,442和5,840,999、WO 99/16832和EP050684中所描述的荧光素染料的呫吨环。在定义“荧光素型呫吨母环”中还包括的是在美国专利5,750,409和5,066,580中所描述的荧光素染料的扩展呫吨环。

在另一实施方式中，染料包含罗丹明染料，该罗丹明染料包含罗丹明型呫吨环，其中C9碳原子用邻羧基苯基取代基(侧链(pendent)苯基)取代。此化合物在此也称为邻羧基罗丹明。在这样的罗丹明中，通常使用如下的编号规则：

特别优选的罗丹明染料的亚类为4，7，-二氯罗丹明。典型的罗丹明染料包括，但不限于，罗丹明B，5-羧基罗丹明，罗丹明X(ROX)，4，7，-二氯罗丹明X(dROX)，罗丹明6G(R6G)，4，7，-二氯罗丹明6G，罗丹明110(R110)，4，7，-二氯罗丹明(dR110)，四甲基罗丹明(TAMRA)和4，7，-二氯-四甲基罗丹明(dTAMRA)。另外的罗丹明染料可见，例如美国专利5,366,860(Bergot等)、5,847,162(Lee等)、6,017,712(Lee等)、6,025,505(Lee等)，6,080,852(Lee等)、5,936,087(Benson等)、6,111,116(Benson等)、6,051,719(Benson等)、5,750,409、5,366,860、5,231,191、5,840,999和5,847,162，美国专利6,248,884(Lam等)、PCT公开WO 97/36960和WO99/27020、Sauer等，1995，J.Fluorescence5(3)：247-261、Arden-Jacob，1993，Neue Lanwellige Xanthen-Farbstoffe fürFluorescence und Farbstoff Laser，Verlag Shaker，Germany(1993)和Lee等，Nucl.Acids Res.20(10)：2471-2483(1992)、Lee等，Nucl.Acids Res.25：2816-2822(1997)和Rosenblum等，Nucl.Acids Res.25：4500-4504(1997)。在一个实施方式中，染料包含4，7-二氯-邻羧基罗丹明。

在另一实施方式中，染料包含荧光素染料，该荧光素染料包含荧光素型呫吨环，其中C9碳原子用邻羧基苯基取代基(侧链苯基)取代。在这样的荧光素染料中，通常使用如下的编号规则：

荧光素型染料的优选亚类是4，7-二氯-荧光素。典型的荧光素染料包括，但不限于，5-羧基荧光素(5-FAM)、6-羧基荧光素(6-FAM)。另外的典型荧光素染料可在，例如美国专利5,750,409、5,066,580、4,439,356、4,481,136、4,933,471(Lee)、5,066,580(Lee)、5,188,934(Menchen等)、5,654,442(Menchen等)、6,008,379(Benson等)和5,840,999、PCT公开WO 99/16832和EPO公开050684中找到。在另一个实施方式中，染料包含4，7-二氯-邻羧基荧光素。

在其它实施方式中，染料可以是花青、酞菁、方酸或bodipy染料，例如在如下参考文献和其中所引用的参考文献中所描述的：专利号5,863,727(Lee等)、5,800,996(Lee等)、5,945,526(Lee等)、6,080,868(Lee等)、5,436,134(Haugland等)、US 5,863,753(Haugland等)、6,005,113(Wu等)和WO 96/04405(Glazer等)。

在其它的实施方式中，荧光部分可包括一染料网络，其中的染料例如通过FRET或另一机制彼此协作以提供大的Stoke位移。这样的染料网络通常包括荧光给体部分和荧光受体部分，并且可包括既作为荧光受体也作为荧光给体的部分。荧光给体和受体部分可包含前面描述的可彼此协同作用的染料中的任何染料。在一个特定的实施方式中，荧光部分包含包含荧光染料的荧光给体部分，以及包含荧光素或罗丹明染料的荧光受体部分。

将蛋白激酶识别部分、疏水部分和荧光部分以允许它们行使各自功能的方式连接。在一个实施方式中，疏水部分和识别部分通过荧光部分彼此连接。在另一实施方式中，疏水部分和荧光部分通过蛋白激酶识别部分彼此连接。例如，疏水部分和荧光部分可被连接于包含识别部分的底物部分的相对末端。在另一实施方式中，疏水部分、荧光部分和识别部分通过三价接头连接。

下面的方案1举例说明了一个底物的实施方式，其中疏水部分和识别部分通过荧光部分彼此连接。在图解的化合物(化合物1)中，疏水棕榈酰基通过氨甲基苯甲酰氨甲基接头与荧光素呫吨环的4碳连接。蛋白激酶识别部分通过N-端磷酸丝氨酸残基连接于荧光素的侧链苯环的5-羰基基团。更通常地，疏水部分和识别部分可附着于荧光部分的不同位点(例如，呫吨环的1’、2’、4’、5’、7’或8’碳，或罗丹明或荧光素结构的侧链苯环的4、5、6或7位置，或罗丹明的3’或6’氮原子)，任选如果适当的话通过接头。

下面的方案2描述了一个实施方式，其中疏水部分和荧光部分可通过蛋白激酶识别部分彼此连接(当位置7的丝氨酸处于非磷酸化状态时)。疏水部分连接于N末端亮氨酸。荧光部分连接于赖氨酸的ε氨基基团，该赖氨酸邻近识别部分的C末端。或者，疏水部分和荧光部分中的一个或两个可附着于多肽片段内的内部残基。而且，疏水部分可连接于识别部分的一个位点，该位点与荧光部分附着的位点相比更偏向N端。

方案3还举例说明了一个实施方式，其中疏水部分、荧光部分和识别部分通过三价接头连接。在举例说明的化合物组中(化合物3-6和3P-6P)，疏水部分(CH₃(CH₂)_X-C(O)-基团)连接于2，3-二氨基丙酸残基(在此也称为α-氨甲基氨基乙酸残基，缩写为“Dpr”)的2-氮上，而染料连接于2，3-二氨基丙酸残基的3-氮上。因此，2，3-二氨基丙酸残基是三价接头。这种底物的例子在实施例3-6中提供。

底物可设计成在非磷酸化状态下具有特定的净电荷。在一个实施方式中，当在pH 8下测量时，底物具有的净电荷(净中性电荷)为0，或约为0，使得添加磷酸根基团所生成的产物具有负2的净电荷。在另一实施方式中，底物具有不为0的净电荷，例如-1、-2或+1。在一个实施方式中，底物的净电荷是0或更少。在另一实施方式中，净电荷是-1或更少。通过由于磷酸化将底物的净负电荷的幅度提高到-2，形成在微团形式中不如底物稳定的磷酸化产物。相应地，产物比底物更具有荧光，所以能很容易地检测酶活性。

通过在底物中包括适当数量的带负电荷和带正电荷的基团，可以确立底物的净电荷。例如，为了确立净中性电荷(净电荷＝0)，底物被设计成包含相等数量的带正电荷和带负电荷的基团。赖氨酸和精氨酸包含在生理pH(pH＝6至8)下携带一个正电荷的侧链。天冬氨酸和谷氨酸包含具有一个负电荷的羧基侧链。磷酸丝氨酸残基在磷酸根基团上携带两个负电荷。组氨酸的咪唑侧链具有大约为7的pK，使得其在大约6或更小的pH下携带完全的正电荷。半胱氨酸具有大约8的pK，因此其在pH为约9或更高时携带完全的负电荷。此外，荧光基团也可包含带电基团，该带电基团应被认为获得了底物的特定净电荷。至于下面的方案1-4，关于底物电荷状态的指导将在第III部分中予以提供。

本发明的底物可通过本领域已知的合成方法很容易地形成。多肽可通过自动合成仪在固体支持物上进行制备(Perkin  J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154(1963))，该制备通过任何已知方法，例如Fmoc或BOC(例如Atherton.Chem.Soc.538-546(1981)； Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis.A Practical Approach，Chan，Weng C.和White，Peter D.编辑，Oxfoford UnicersityPress，New York，2000)。可通过一个氨基酸的α碳羧基基团和另一个氨基酸的氨基基团之间的缩合反应，用合成的方法形成多肽。用适当的偶联剂将激活的氨基酸偶联到氨基酸的延长链上。可用氨基酸单体单位合成多肽，其α氨基基团被Fmoc(芴基甲氧基羰基)保护。或者，可进行肽合成的BOC方法，以制备本发明的肽轭合物。

具有反应性侧链的氨基酸可进一步用适当的保护基团保护。将要被标记的赖氨酸侧链上的氨基可用Mtt保护基保护，该保护基可选择性地用在二氯甲烷中的5％三氟乙酸来除去。可使用大量的不同保护基团策略来有效制备多肽。

示例性的固体支持物包括聚环氧乙烷/聚苯乙烯(polyethyleneoxy/polystyrene)移植共聚支持物(TentaGel，Rapp PolymereGmbH，Tubingen，Germany)和带有可用酸断裂的接头的低交联、高膨胀Merrifield型聚苯乙烯支持物(Applied Biosystems)，虽然其它的也可以被使用。

多肽通常以3-50μmol范围内的规模在商业上可购的合成仪上合成。用在二甲基甲酰胺(DMF)中的哌啶溶液，典型的是30％哌啶，将Fmoc基团从肽链末端除去，需要若干分钟以完成去保护。氨基酸单体、偶联剂和激活剂被递送入合成室或柱中，同时用涡流或摇动来。通常偶联剂是HBTU，激活剂是1-羟基苯并三唑(HOBt)。偶联溶液也可包含二异丙基乙基胺或另一有机碱，来将pH调整到最适水平，以快速和有效偶联。

或者通过典型的固相肽合成方法用433A型肽合成仪(AppliedBiosystems，Foster City，CA)和Fmoc/HBTU化学(Fields，(1990)Int.J.Peptide Protein Res.35：161-214)在氯三苯甲基聚苯乙烯树脂上制备肽。树脂上的粗制的受保护肽可用在二氯甲烷中的1％三氟乙酸(TFA)断裂大约10分钟。滤液立即用有机胺碱，例如4-二甲基氨基嘧啶，提升至pH 8。在将挥发性试剂蒸发后，得到粗制的受保护肽，该肽可用另外的基团标记。

合成后，将固相支持物(树脂)上的肽去保护，并从支持物上断裂。去保护和断裂可以任何顺序进行，这取决于保护基、肽和支持物之间的连接，以及标记策略。断裂和去保护后，可通过凝胶过滤、沉淀或其它方法将肽脱盐和分析。用于本发明的肽和肽轭合物的典型分析方法包括质谱分析、吸收光谱法、HPLC和Edman降解测序。本发明的肽和肽轭合物可用反向HPLC、凝胶过滤、电泳或透析来纯化。

可用荧光染料偶联或“标记”多肽，以提供底物的荧光部分。通常荧光染料标记试剂携带亲电子连接部分，该部分与多肽，例如氨基末端上的亲核基团，或氨基酸的侧链亲核体(nucleophile)反应。或者，染料可以具有亲核部分，例如氨基或硫羟连接部分，该部分与肽上的亲电子基团，例如氨基酸的羧基末端的NHS或羧基侧链反应。在标记反应中多肽可以在固体支持物，例如合成树脂上。或者，多肽可以在标记前被断裂。

用报道分子例如荧光染料标记来修饰蛋白质是免疫学、组织化学和细胞生物学的强有力工具(Means，G E.和Feeney，R.E.(1971)ChemicalModification of Proteins，Holden-Day，San Francisco，CA；Means(1990)Bioconjugate Chem.1：2；Glazer等(1975)Chemical Modification of Proteins.Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology(T.S.Work和E.Work编辑)American Elsevier Publishing Co.，New York；Lundblad，R.L.和Noyes，C.M.(1984)Chemical Reagents for Protein Modification，Vols.I和II，CRC Press，New York；Pfleiderer，G.(1985)Chemical Modification of Proteins，In Modern Methods in Protein Chemistry.H.Tschesche编辑，Walter DeGryter，Berlin and New York；Wong(1991)Chemistry of Protein Conjugation andCross-linking，CRC Press，Boca Raton，FL)。

多肽可包含许多反应性氨基酸侧链。某些氨基酸侧链可用荧光染料标记试剂的激活形式进行标记。天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、组氨酸、酪氨酸和其它氨基酸具有用于标记的反应性官能度。通过适当选择保护基，肽上的某些反应性官能度可选择性地暴露于标记试剂反应。可通过反应性侧链的化学修饰将特定反应部分引入多肽。反应性侧链可以天然地是蛋白质的一部分，或在肽合成过程中或通过合成后修饰，例如通过去保护(Coull，美国专利号6,197,513)来人工引入。它们起“柄”的作用，用来附着各种各样的分子，包括标记或其它蛋白。胺(赖氨酸，α-氨基基团)是蛋白质最通常的反应性基团，例如氨基酸赖氨酸的脂肪族ε胺。赖氨酸通常在某种程度上存在，并且常非常丰富。赖氨酸胺(pK_a＝9.2)在中性或碱性条件下，例如高于pH 8.0，是相当好的亲核体(Fasman，G.D编辑(1989)Practical Handbook of Bilchemistry and Molecular Biology，p13，CRCPress，Boca Raton，FL)，并且因此与各种试剂反应以形成稳定的键(反应式1)。

   (1)

在蛋白质中发现的其它反应性胺是N末端氨基酸的α-氨基基团，该氨基酸比赖氨酸碱性小，在大约pH 7具有反应性。有时，它们可在赖氨酸存在下被选择性修饰。在蛋白质中通常至少有一个α-氨基酸，在蛋白质具有多条肽链或几个亚基的情况下，可有更多α-氨基酸(每个是一个肽链或亚基)。

硫醇(硫氢基、巯基)是胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸侧链的另一反应性基团。半胱氨酸包含游离硫醇基，该基团比胺更具亲核性，通常是蛋白质中最具反应性的功能基。它和与前面部分所讨论的胺一样的修饰试剂中的一些反应，并此外可与并不与胺非常具有反应性的试剂反应。硫醇在中性pH下是有反应性的，在某些条件下在胺存在时可选择性地与其它分子偶联(反应式2)。

  (2)

由于游离硫醇基团是相对具反应性的，具有硫醇的蛋白质在它们的氧化形式中通常作为二硫化物连接的寡聚体存在，或具有内部跨接的二硫化物基团。用试剂例如二硫苏糖醇(DTT)对二硫键进行还原对于生成反应性游离硫醇是必需的。除了胱氨酸和半胱氨酸，有些蛋白质还具有氨基酸甲硫氨酸，该氨基酸在甲基硫醚形式中包含硫。

在水和非水条件下胺反应性标记试剂可与蛋白质和肽中的赖氨酸和α-氨基基团反应。反应性酯，特别是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯，属于最常用的用于修饰多肽胺基团的胺反应性试剂。这些试剂对脂肪族胺具有高度选择性。它们与芳香胺、醇(丝氨酸、苏氨酸)、酚(酪氨酸)和组氨酸的反应速率相对低。所形成的脂肪族胺产物非常稳定。商业上可得到的NHS酯是具有磺化基团的，并具有增高的水溶性(参见Brinkley，1992， Bioconjugate Chem.3：2)。

在能在蛋白质氨基基团上进行的许多反应中，一个对标记用途有用的反应是酰化，或可被认为类似于酰化的反应。酰化反应可通过下面的一般方案进行描述：

            

其中P是蛋白质，X是离去基团，R是被引入的官能团(funetion)，例如荧光染料。活性试剂X-CO-R可通过激活剂，例如碳二亚胺的作用，在标记试剂的游离羧酸上原位产生。或者，稳定活性酯可作为固体试剂储存。其它胺反应性标记试剂，X-CO-R，具有亲电子功能基团，例如异硫氰酸盐(例如FITC，荧光素异硫氰酸盐)，磺酰卤化物和二氯三嗪。硫醇反应性标记试剂包括碘乙酰和马来酰亚胺衍生物。碘乙酰和马来酰亚胺试剂也可被用于胺修饰，但需要较高pH(＞9.0)和较长反应时间。

荧光染料标记试剂包括反应性连接基团，或“连接部分”，它在取代位置之一将染料共价附着于多肽上。能够形成共价键的连接部分通常是能够与亲核分子反应的亲电子官能基团，例如醇、醇盐、胺、羟基胺和硫醇。亲电子连接部分的例子包括琥珀酰亚胺酯、异硫氰酸盐、磺酰氯、磺化酯、甲硅烷基卤化物、2，6-二氯三嗪基、五氟苯基酯、亚氨基磷酸酯(phosphoramidite)、马来酰亚胺、碘乙酰胺、卤乙酰、环氧化物、烷基卤化物、烯丙基卤化物、醛、酮、酰叠氮和酐。

酯N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和更水溶性的磺化形式(NHSS)，由于它们作为试剂的稳定性而具有高效率，由于它们与蛋白氨基基团的反应性而具有方便的反应时间(通常是0.5-2小时)，并且相对容易合成。染料的NHS酯形式通过如下结构示例：

其中F是荧光部分。连接L可以是一个键，或者一个不带电荷的接头，例如C₁-C₃₀亚烷基(alkyldiyl)，氧烷基，萜，类脂，脂肪酸，或甾族化合物。接头可以具有功能基团，包括-C(O)-，-C(O)O-，-O-，-S-，-S-S-，-C(O)-NR，-OC(O)NR，-NRC(O)NR，和-NRC(S)NR；其中R选自H、C₁-C₆烷基和C₅-C₁₄芳基。

染料的激活的酯，例如NHS或HOBt酯，可被预制、分离、纯化和/或表征，或者它可以甾原位形成，并与多肽的亲核基团反应。通常荧光染料的羧基取代基通过与如下有些组合反应而被激活：(1)碳二亚胺试剂，例如二环己基碳二亚胺，二异丙基碳二亚胺，或脲盐(uronium)试剂，例如TSTU(O-(N-琥珀酰亚胺基)-N，N，N’，N’-四甲基脲盐四氟硼酸盐，HBTU(O-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲盐六氟磷酸盐)，或HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲盐六氟磷酸盐)；(2)激活剂，例如1-羟基苯并三唑(HOBt)或1-羟基氮杂苯并三唑(HOAt)；并且(3)N-羟基琥珀酰亚胺，以得到染料的NHS酯。

其它激活和偶联试剂包括TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1-1，3，3-四甲基脲盐六氟磷酸盐)，TFFH(N，N’，N”，N-四甲基脲盐-2-氟-六氟磷酸盐)，PyBOP(苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷-鏻六氟磷酸盐)，EEDQ(2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氢喹啉)，DCC(二环己基碳二亚胺)；DIPCDI(二异丙基碳二亚胺)，MSNT(1-(1，3，5三甲基苯-2-磺酰基)-3-氮-1H-1，2，4-三唑)，和芳基磺酰基卤化物，例如三异丙基苯磺酰氯。

合成荧光染料标记的多肽的一个途径具体为在除去其它保护基团和从树脂上释放标记肽之前，将荧光染料试剂偶联至树脂结合的肽的N末端。每个固定肽的胺通常使用大约5当量的胺反应性荧光团。呫吨荧光团，包括荧光素和对甲氨基酚，在用BOC方法合成后对氟化氢(HF)以及大多数其它酸相当稳定。对于那些用来对用FMOC化学合成的肽去保护的试剂，这些荧光团也稳定。(Haugland，1996，Molecular Probes Handbook of FluorescentProbes and Research Chemicals，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。

在另一方面，发明提供在样本中检测一个或更多蛋白磷酸酶的磷酸酶活性的方法。在所述方法中，提供包含样本和磷酸酶底物的混合物，其中磷酸酶底物包含(a)磷酸酶识别部分，该部分包含至少一个能够被磷酸酶去磷酸化(水解)的磷酸化的残基，(b)能够将底物整合入微团的疏水部分，和(c)荧光部分。当样本中存在磷酸酶时，将混合物置于有效允许磷酸化残基去磷酸化的条件下，从而增大荧光部分所产生的荧光信号。在混合物中检测到荧光信号增大指示样本中磷酸酶的存在。

将要被检测的磷酸酶可以是本领域已知的任何磷酸酶。同时，磷酸酶可以是磷酸酶候选物，并且该方法被用来证实和/或表征候选物的激酶活性。

各种各样蛋白磷酸酶已被鉴定(例如，参见P.Cohen，Ann.Rev.Biochem.58：453-508(1989)， Molecular Biology of the Cell，3^rd edition，Alberts等，编辑，Garland Publishing，NY(1994)，和 Chem.Rev.101：2209-2600，″ProteinPhosphorylation and Signaling″(2001))。丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶代表一大类酶，该类酶逆转例如蛋白激酶A酶的作用。丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶被分成四组，称为I、IIA、IIB和IIC。蛋白酪氨酸激酶也是一个重要种类的磷酸酶，并且组氨酸、赖氨酸、精氨酸和天冬氨酸磷酸酶也是已知的(例如，参见P.J.Kennelly，Chem Rev.101：2304-2305(2001)和其中所引用的参考文献。在有些情况下，磷酸酶仅对一个或几个蛋白质具有高度特异性，但在其它情况下，磷酸酶是相对非特异性的，能作用于大范围的蛋白靶向。相应地，可设计本发明的磷酸酶底物，以通过适当选择磷酸酶识别部分来检测特定磷酸酶。能被磷酸酶活性去磷酸化的肽序列的例子在P.J.Kennelly，Chem.Rev.101：2291-2312(2001)中加以描述。

磷酸酶底物可被设计成与一种特殊磷酸酶或一组磷酸酶具有反应性，或者其可被设计用来确定底物特异性和其它催化特征，例如确定kcat或Km值。磷酸酶识别部分中的磷酸化残基可以是能够被磷酸酶去磷酸化的任何基团。在一个实施方式中，残基是磷酸酪氨酸残基。在另一个实施方式中，残基是磷酸丝氨酸残基。在另一个实施方式中，残基是磷酸苏氨酸残基。

除了具有一个或更多能被去磷酸化的磷酸化残基之外，识别部分可包括额外的氨基酸残基(或其类似物)，其能增进结合特异性，和/或加快被磷酸酶去磷酸化的速度。

识别部分可包含多肽片段，该片段包含将要被去磷酸化的基团或残基。在一个实施方式中，多肽片段具有等于或小于30个氨基酸残基、25个残基、20个残基、15个残基、10个残基、或5个残基的多肽长度。在另一实施方式中，多肽片段具有在3-30个残基、或3-25个残基、或3-20个残基、或3-15个残基、或3-10个残基、或3-5个残基、或5-30个残基、或5-25个残基、或5-20个残基、或5-15个残基、或5-10个残基、或10-30个残基、或10-25个残基、或10-20个残基、或10-15个残基范围内的多肽长度。在另一实施方式中，多肽片段包含3-30个氨基酸残基、或3-25个残基、或3-20个残基、或3-15个残基、或3-10个残基、或3-5个残基、或5-30个残基、或5-25个残基、或5-20个残基、或5-15个残基、或5-10个残基、或10-30个残基、或10-25个残基、或10-20个残基、或10-15个残基。在另一实施方式中，多肽片段包含至少3、4、5、6或7个氨基酸残基。

底物中的疏水部分能够将底物整合入微团。疏水部分的特征可以与上面所描述的蛋白激酶底物的疏水部分相同的特征。优选选择在底物磷酸化后促进荧光部分的荧光增强的疏水部分，使得增强幅度比用缺乏疏水部分的相同底物结构所获得的要大。

底物可被设计成在磷酸化状态具有特定的净电荷。在一个实施方式中，当在pH 8下测量时，底物具有的净电荷(净中性电荷)为0，或大约为0，使得除去磷酸基生成具有净电荷为+2的产物。在另一实施方式中，底物具有不为0的净电荷，例如+1、+2或-1。在一个实施方式中，底物的净电荷是0或更大。在另一实施方式中，净电荷是+1或更大。

磷酸酶底物的荧光部分可以是按照本发明起作用的任何荧光实体。在一个实施方式中，荧光部分包含荧光素。在另一实施方式中，荧光部分包含磺基荧光素。在另一实施方式中，荧光部分包含罗丹明。也可使用在蛋白激酶底物方面与上面所讨论的相同类型的其它荧光部分。

将磷酸酶识别部分、疏水部分和荧光部分以任何允许它们行使相应功能的方式连接、该方式在蛋白激酶底物方面与在此所讨论的设计理由类似。

更通常地，可设计用于检测酶，例如蛋白激酶、磷酸酶、或其它酶的底物可以被设计成具有下述特征中的任何特征，包括其任何组合。在一个实施方式中，酶反应产物的荧光在摩尔：摩尔基础上是底物荧光的至少2倍、至少3倍、至少4倍、或至少5倍。在另一实施方式中，底物的分子量小于5000道尔顿，或小于4000道尔顿，或小于3000道尔顿，或小于2000道尔顿。在另一实施方式中，底物排除(不包含)其中荧光部分结合于脱辅基酶或脱辅基蛋白的结构。

方法

将要被测试的样本可以是用户所选择的任何合适样本。样本可以是天然存在的或人制造的。例如，样本可以是血液样本、组织样本、细胞样本、口腔(buccal)样本、皮肤样本、尿样本、水样本、或土壤样本。样本可以来自活的生物体，例如真核细胞、原核细胞、哺乳动物、人、酵母、或细菌。在与本发明的底物接触前，可以用本领域已知的任何方法将样本进行加工。例如，可以对样本实行沉淀步骤、柱层析步骤、热步骤，等等。在有些情况下，样本是纯化的或用合成方法制备的酶，该酶被用来筛选或表征酶底物、抑制剂、激活剂或调节剂。

如果样本既包含激酶也包含磷酸酶，使得一个的活性可能干扰另外一个的活性，则可将一种灭活试剂(例如一种针对活性位点的不可逆抑制剂)加入样本，来灭活任何一个不需要的活性。

反应混合物通常包括缓冲液，例如在2000-2001 Sigma目录的“生物学缓冲液”部分所描述的缓冲液。示例性的缓冲液包括MES，MOPS，HEPES，Tris(Trizma)，N-二羟乙基甘氨酸，TAPS，CAPS，等等。缓冲液以足够生成和维持所需pH的量存在。反应混合物的pH根据所要检测的酶的活性的pH依赖性加以选择。例如，pH可以是2-12，4-11，或6-10。反应混合物也包含酶的任何需要的辅因子和/或辅底物(例如对蛋白激酶而言的ATP，对钙依赖性激酶而言的Ca²⁺离子，和对蛋白激酶A而言的cAMP)。额外的混合物成分在下面第IV部分中加以讨论。在一个实施方式中，反应混合物不包含洗涤剂或基本上没有洗涤剂。

在有些实施例中，可能需要将离子强度保持在尽可能低，以帮助避免掩蔽反应混合物中的带电荷基团，使得产物分子的微团形成是不利的并且是不稳定的。例如，高盐浓度(例如1M NaCl)可能是不合适的。此外，可能需要避免反应混合物中可能对产物的荧光特性产生不利影响的某些其它成分的高浓度。关于离子种类，例如金属离子的影响的指导可在 Surfactants and Interfacial Phenomena，2 ^nd  Ed.，M.J.Rosen，John Wiley&Sons，NewYork(1989)，特别是第3章中找到。例如，浓度为1mM的Mg²⁺离子在下面所提供的实施例中是有用的，但更高浓度可能导致较差效果。

在实施本发明的某些方面时，本发明的酶底物与包含酶的样本混合，该酶是要被检测的，或被用来筛选、检测或表征底物、抑制剂、激活剂或调节剂活性的化合物。酶与底物反应导致底物净电荷绝对幅度的增大(对于电荷更大的种类)，使得已反应的底物的荧光大于未反应的底物的荧光。在一个实施方式中，底物具有的净电荷(净中性电荷)为0，并且底物与酶的反应使得底物或者(1)带净负电荷，通过(1A)在底物上加入或生成新的带负电荷基团，或(1B)除去或阻断底物上的带正电荷的基团；或者(2)带净正电荷，通过(2A)在底物上加入或生成新的带正电荷基团，或(2B)除去或阻断底物上的带负电荷的基团。如果底物具有正的或负的净电荷，倘若产物比在反应混合物中的底物具有更强的荧光，使得酶活性可被检测的话，则酶作用于底物能将净电荷改变为负性增加或负性减少。

例如，通过在底物的羟基基团上加上磷酸根基团(例如用蛋白激酶，将中性带电基团变为带有-2电荷的基团)，通过断裂羧酸酯或酰胺以产生羧基基团(例如，使用酯酶或酰胺酶，将中性带电基团变为带有-1电荷的基团)可以完成反应(1A)。通过将底物中的氨基或肼基与乙酰化酶反应来产生中性乙酰酯基，与N-氧化酶反应以生成中性N-氧化物，与氨裂合酶反应以除去氨，或与引起氧化脱氨的氧化酶反应，可完成反应(1B)。例如，通过用酰胺酶处理底物中的酰胺基团来生成底物中的带正电氨基基团，可以完成反应(2A)。例如，使用脱羧酶以除去羧酸或通过将羧基与甲基转移酶反应以形成羧酸酯，可完成反应(2B)。各种能够实行这种转化的酶在文献中是已知的(例如，参见C.Walsh， Enzymatic Reaction Mechanisms，WH Freeman andCo.，New York(1979)，Worthington产品目录(Worthington酶)，Sigma生命科学目录，和其它商品化酶的供应商的产品目录)。

在另一实施方式中，酶底物在与酶反应前具有净负电荷，例如-1、-2、-3、-4或更多，但由于未反应的底物的荧光足够低，所以与酶反应造成的底物净负电荷增加使荧光有可检测的增强。

或者，在另一实施方式中，酶底物在与酶反应前可具有+1、+2、+3、+4或更高的净正电荷，但由于未反应的底物的荧光足够低，所以与酶反应造成的底物净正电荷增加使荧光有可检测的增强。

方案1方案1举例说明了一种可被用来检测测蛋白激酶A的示例性底物(化合物1)。化合物1的结构可表示为X-L-染料-SereOPO₃ ^2-)LeuArgArgArgArgPheSrLys(ε-N-Ac)Gly(NH₂)，其中是C-16脂肪酰基(棕榈酰基)，L是将X连接于染料的接头(对NHCH₂C₆H₄C(＝O)NHCH₂)，染料是荧光部分(在此情况下，是荧光素)，ε-N-Ac是乙酰基团，Ser、Leu、Arg、Phe、Lys和Gly分别是丝氨酸、亮氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和甘氨酸的标准三字母代码，NH₂指示C末端甘氨酸的羧基基团是酰胺。化合物1的示例性合成在实施例1A中加以描述。

如所能看出的，化合物1在染料部分中包含酚盐阴离子和羧基阴离子，和在N末端丝氨酸残基中的具有两个额外负电荷的磷酸根基团，使得总负电荷为-4。这被四个精氨酸残基中的总共四个正电荷的胍基抵销。因此，化合物的净电荷在PH 8下约为0。

化合物1还包括多肽形式的蛋白激酶识别部分，该多肽包含被蛋白激酶A识别的氨基酸序列。识别部分也包含非磷酸化的丝氨酸，该丝氨酸能够被激酶磷酸化。磷酸化后，底物的净电荷从中性变为-2，从而导致荧光增强。

虽然荧光增强的基础还不肯定，而且发明人不希望被束缚于某一特定理论，预期本发明的荧光底物由于疏水部分而能在反应混合物中形成微团，使得荧光部分由于它们非常接近而彼此淬灭。当底物带中性电荷或具有微小的负净电荷或微小的正净电荷时，特别有利于微团形成，使得微团形成不因为相互的电荷排斥而受阻碍。假定的微团可以与溶液中单分子、无联系的种类处于平衡状态，但微团形式是主要形式。然而酶反应的产物具有增加的净电荷(总共净负或总共净正)，使得不利于底物的微团形成。游离底物发出明亮荧光，因为它与溶液中其它荧光底物分子保持相对游离。

图1显示使用实施例1B所描述的方法，在蛋白激酶A存在下，从化合物1得到的动力学数据。在恒定量的酶的存在下，随时间监测含有三个不同浓度的化合物1(0.15，0.30，和0.60μM)的反应混合物的荧光信号。如所看到的，荧光增强的速度与反应混合物中的化合物的量成比例。此外，数据显示荧光信号的显著增大伴随低噪音，使得信噪比高。初始速率的双倒数作图(见图2)得到Km值为0.3μM，与酶对底物的磷酸化一致。

这些结果证明，通过使净负电荷幅度增加，通过将具有净0电荷的底物转变成具有-2的净负电荷的产物，可导致荧光的显著增加，以检测酶活性。

方案2

方案2显示用来检测碱性磷酸酶活性的示例性底物(化合物2)。化合物可用X-LeuArgArgArgArgPheSer(OP_O3^2-)Lys(ε-N-染料)Gly-NH₂代表，其中X是C-16脂肪酰基(棕榈酰基)，染料是连接至赖氨酸残基的ε氨基基团的荧光部分(荧光素)，NH₂指示C末端甘氨酸的羧基基团是酰胺。化合物2的示例性合成在实施例2A中加以描述。在此结构中，疏水X基团通过酰胺键直接连于多肽片段的N末端氨基，而不使用额外接头原子。然而，应意识到，如果需要，也可包括包含一个或更多连接链原子的接头。

在用磷酸酶反应前，底物包含由四个精氨酸侧链提供的总共四个正电荷，和四个负电荷，该四个负电荷由荧光染料部分中(一个酚盐阴离子和一个羧基阴离子)的两个负电荷以及磷酸根基团中的两个额外负电荷所提供，导致在pH 8下总净电荷大约为0。在将磷酸基从与苯丙氨酸残基相邻的磷酸化的丝氨酸上水解下来以后，由于丢失磷酸根基团上的两个负电荷，所得到的产物具有+2的净正电荷。相应地，由于微团不稳定性，产物预期比未反应形式的荧光更明亮。

图3显示根据实施例2B描述的方法，在碱性磷酸酶存在下，从化合物2得到的动力学数据。如所看到的，与化合物2反应导致荧光随时间立即并显著增强，并具有高信-噪比。这些结果证明，通过导致净电荷幅度增高，在这种情况下通过将具有净0电荷的底物转变为具有+2的净正电荷的产物，可导致荧光显著增强，以检测酶活性。

化合物1和2结构的一个区别在于：化合物2中的疏水部分和荧光部分位于多肽骨架的相反末端，而化合物1中的疏水部分和荧光部分在多肽骨架的相同末端上相对靠拢。如从图1-3所示数据所看到的，两种设计都适于分析本发明的酶。

方案3

            表1

化合物	变量
		3	x＝0，R＝H
3P	x＝0，R＝PO3 2-
		4	x＝7，R＝H
4P	x＝7，R＝PO3 2-
		5	x＝10，R＝H
5P	x＝10，R＝PO3 2-
		6	x＝14，R＝H
6P	x＝14，R＝PO3 2-

方案3中举例说明了根据本发明的酶底物的另一设计(见化合物3-6和3P-6P)。方案3显示一组具有不同长度烷基酰基(X)的化合物，作为通过荧光检测检测蛋白激酶A的可能底物。这些底物的一般结构可用X-Y(染料)-LeuArgArgAlaSer(OR)LeuGly-NH₂代表，其中X是CH₃(CH₂)_xC(＝O)-形式的脂肪酰基，x如表1中所定义，Y是2-氨甲基甘氨酸，染料是4，7-二氯荧光素染料，该染料通过与染料的侧链苯环的5-羰基连接附着于Y的2-氨基，R是H或PO₃ ^2-(参见表1)，NH₂指示C末端甘氨酸的羧基基团是酰胺。实施例3A显示了化合物3的示例性合成。

这些底物中的每一个包含来自两个精氨酸侧链的总共两个正电荷，和来自荧光素染料部分的两个负电荷(一个酚盐阴离子合一个羧基阴离子)，使得在pH 8下的总净电荷大约为0。底物包含一个非磷酸化的丝氨酸残基，该残基能够被激酶磷酸化。磷酸化后，底物的净电荷从中性变为-2。

为了达到有效，不仅底物应与酶反应以形成所需的修饰产物，产物也应比底物荧光更强，才能观察到荧光有可检测的增强。一般地，只要能达到足够低的信-噪比，荧光的较大改变提供更好的分析敏感性。因此，可能需要测试多种底物变体，以发现具有最适荧光特性的底物。

实施例3描述了一项研究，其中以磷酸化和非磷酸化形式制备了具有方案3种所示结构的几种化合物。底物结构在其疏水部分(X)的烃“尾”长度上有所不同，链长为1、8、11和15饱和碳原子。结果示于表2。

表2
					化合物	烃尾长度	荧光(非磷酸化)1	荧光(磷酸化)1	荧光比例(大约)2
3，3P	1	1680	1930	1
					4，4P	8	575	1370	2
5，5P	11	45	431	10
					6，6P	15	3	20	7

¹对底物的非磷酸化(非磷酸化)或磷酸化(磷酸化)形式以任意单位进行的荧光测量。

²荧光(磷酸化)/荧光(非磷酸化)的四舍五入值

如在表2中所看到的，对化合物3和3P而言，实际上在非磷酸化(非磷酸化)和磷酸化形式之间没有观察到荧光的差异。这指示乙酰基团太小，不足以有利于非磷酸化底物的微团形成。然而，对于较长的X基团则观察到荧光的显著区别。十二烷酰基(化合物5，5P)似乎提供了磷酸化后最大的增加(大约900％的增加)，但十四烷酰基团(化合物6，6P)也非常有效，显示大约600％的增加。壬酰基(化合物4，4P)所观察到的荧光指示此底物也可能有用。结果证明，能够将底物整合入微团的疏水部分的存在有效导致非磷酸化底物的荧光淬灭，显然是由于自我淬灭微团形式占优势，而磷酸化底物在微团和游离形式之间的平衡向有利于游离形式的方向偏移，使得来自磷酸化底物的信号较少自我淬灭。

表2还显示，随着疏水部分长度增加，每一化合物的两种形式的荧光信号幅度都降低。一个可能的解释是，较长的疏水链可导致形成微团的磷酸化产物的比例增加，使得产物的有些荧光信号因为自我淬灭而受抑制。然而，如果产物的游离和微团形式之间的平衡常数大于非磷酸化底物的相应平衡常数，则酶催化的磷酸化可导致荧光有可观察的增强。例如，基于荧光检测，已发现化合物5是大肠杆菌蛋白激酶A的有效底物(数据未示)。

根据本发明的酶底物的另一实施方式包括其中疏水部分可以被至少一个卤素原子(例如氟)取代的底物。这样的酶底物的例子显示于方案4和方案5。方案4显示用来检测蛋白激酶A活性的示例性底物(化合物7)。该化合物可用X-Lys(ε-N-染料)LeuArg-ArgAlaSerLeuGly-NH₂代表，其中X是n-(1H，1H，2H，2H全氟癸基-1-硫羟-2-乙酰基团，染料是连接于赖氨酸残基的ε氨基基团的荧光部分(5-羧基磺基荧光素)(5-carboxysulfofluorescein)，NH₂指示C末端甘氨酸的羧基基团是酰胺。实施例4A中描述了化合物7的示例性合成。在此结构中，疏水X基团通过硫羟-2-乙酰基团连接于多肽片段的N末端氨基基团。然而，应该意识到，如果需要，也可包括可选择的接头。

方案4

如所看到的，化合物7在染料部分包含总负电荷为-2的一个酚盐阴离子和一个磺酸盐阴离子。染料中的此负电荷被两个精氨酸残基中的两个带正电荷的胍基抵销。因此，pH 8下化合物7的净电荷大约为0。

化合物7还包括多肽形式的蛋白激酶识别部分，该多肽包含被蛋白激酶A识别的氨基酸序列。识别部分也包括能够被激酶磷酸化的非磷酸化丝氨酸。磷酸化后，底物的净电荷从中性变为-2，从而导致荧光增强。化合物7的荧光数据可见实施例4B。

方案5显示用来检测蛋白激酶A活性的另一示例性底物(化合物8)。化合物可表示为染料-Lys(ε-N-X)LeuArg-ArgAlaSerLeuGly-NH₂，其中X是连接于赖氨酸残基的ε氨基基团的N-全氟辛酰脯氨酸，染料是荧光部分(5-羧基-2’，7’-二吡啶基-磺基荧光素)(5-carboxy-2’，7’-dipyridyl-sulfofluorescein)，NH₂指示C末端甘氨酸的羧基基团是酰胺。实施例5A描述了化合物8的示例性合成。在此结构中，疏水X基团通过脯氨酸连接于赖氨酸残基的ε氨基基团。应该意识到，如果需要，也可包括可选择的接头。此外，荧光染料通过酰胺键直接连于多肽片段的N末端氨基基团，而不使用额外的接头原子。然而，应该意识到，如果需要，也可包括包含一个或更多连接链原子的接头。

方案5

如所看到的，化合物8在染料部分包含总负电荷为-2的一个酚盐阴离子和一个磺酸盐阴离子。染料中的这个负电荷被总共两个正电荷抵销，此两个正电荷由两个精氨酸残基中的两个带正电荷的胍基提供。因此，pH8下化合物8的净电荷大约为0。

化合物8还包括多肽形式的蛋白激酶识别部分，该多肽包含被蛋白激酶A识别的氨基酸序列。识别部分也包含能够被激酶磷酸化的非磷酸化丝氨酸。磷酸化后，底物的净电荷从中性变为-2，从而导致荧光增大。化合物8的荧光数据可在实施例5B中找到。

在还有另一个实施方式中，本发明包含包括进一步的间隔基的酶底物。方案6显示本实施例所设想的用来检测蛋白激酶A活性的示例性底物(化合物9)。化合物可表示为N-Ac-ArgGlyArgProArgThrSerSerPheAlaGluGly-OOOLys(ε-N-染料)Lys(ε-N-X)-NH₂，其中X是连接于赖氨酸残基ε氨基基团的十八烷酰基基团，染料是连接于赖氨酸残基ε氨基基团的荧光素部分(5-羧基-磺基荧光素)，O是2-氨基乙氧基-2-乙氧乙酰基团所提供的接头，NH₂指示C末端甘氨酸的羧基基团是酰胺。实施例6A描述了化合物9的示例性合成。在此结构中，疏水X基团连接于赖氨酸残基的ε氨基基团，而无需任何进一步的接头原子。然而，应该意识到，如果需要，也可包括包含一个或更多连接链原子的接头。此外，荧光染料通过酰胺键直接连于赖氨酸残基的ε氨基基团，而不使用额外的接头原子。然而，应该意识到，如果需要，也可包括包含一个或更多连接链原子的接头。

方案6

如所看到的，化合物9包含在染料部分中的一个酚盐阴离子和一个磺酸盐阴离子，以及在谷氨酸残基侧链上的羧酸盐，使总负电荷为-3。染料中的此负电荷被三个精氨酸残基中的三个带正电荷的胍基抵销。因此，pH 8下化合物9的净电荷大约为0。

化合物9还包括多肽形式的蛋白激酶识别部分，该多肽包含被蛋白激酶A识别的氨基酸序列。识别部分也包含两个非磷酸化的丝氨酸残基和一个非磷酸化的苏氨酸残基，其中至少一个能够被激酶磷酸化。化合物8的荧光数据可见实施例6B。

表3中显示了激酶底物的其它例子，其中掺入了接头。

表3
					激酶	肽	10μL时的RFU(起始→终末)	浓度(μM)	增加倍数
PKA	C13-K(染料2)-LRRASLG-NH2	1000→5000	8	5x
					PKA	C13-OOOK(染料2)-LRRASLG-NH2	1000→5000	8	5x
PKC	C16-OOOK(染料2)-RREGSFR-NH2	650→3000	4	4.5x
					PKC	C17-OOOK(tet)-RQGSFRA-NH2	700→4900	6	7x
Src，lyn，fyn	C16-OOOK(染料2)RIGEGTYGVVRR-NH2	1000→6500	8	6.5x
					Akt	C15-OOOK(染料2)RPRTSSF-NH2	1500→7500	8	4x
MAPK	C17-OOOK(染料2)PRTPGGR-NH2	1100→5700	16	5x
					MAPKAP2	C16-OOOK(染料2)RLNRTLSV-NH2	800→3200	8	4x

在表3中，每一“O”代表由2-氨基乙氧基-2-乙氧基乙酰基基团提供的接头；“染料2”是由5-羧基-2’，7’-二吡啶基-砜荧光素(5-carboxy-2’7’-dipyridyl-sulfonefluorescein)提供的荧光部分；“tet”是由2’，7’，4，7一四氯-5-羧基荧光素(2’，7’-二氯-5-羧基-4，7-二氯荧光素)提供的荧光部分；并且NH₂指示C末端氨基酸残基的羧基基团是酰胺化了的。

如从表3中的数据所能看到的，在磷酸化测试条件下，几个种类的激酶显示出类似的荧光增大。实施例7中描述了这些底物中的一个示例性成员(化合物10，方案7)的示例性合成。

方案7

化合物可表示为N-X-OOOLys(ε-N-染料)ArgArgGluGly-SerPheArg-NH₂，其中X是通过接头-OOO-连接于赖氨酸残基的α-氨基基团的十六烷酰基基团，染料是与赖氨酸残基的ε氨基基团连接的荧光部分(5-羧基-2’7’-二吡啶基-磺基荧光素)，O是2-氨基乙氧基-2-乙氧基乙酰基基团所提供的接头，NH₂指示C末端甘氨酸的羧基基团是酰胺。实施例7A中描述了化合物10的示例性合成。在此结构中，疏水X基团通过接头-OOO-连接于赖氨酸残基的α氨基基团。应该认识到，如果需要，也可包括交替的接头。此外，荧光染料通过酰胺键直接连于多肽片段的N末端氨基基团，而不使用额外的接头原子。然而，应该认识到，如果需要，也可以包括包含一个或更多个连接链原子的接头。

如所看到的，化合物10包含在染料部分的一个酚盐阴离子和一个磺酸盐阴离子、以及在谷氨酸残基侧链上的羧酸盐，使总负电荷为-3。这被三个精氨酸残基中的胍基抵销，后者总共带三个正电荷。因此，在pH 8下化合物的净电荷大约为0。

在此所举例说明的激酶底物的各种示例性实施方式中，任何末端羧基都是酰胺化的。例如，在化合物1、2、3、4、5、6、7、8和10中，激酶识别部分的C末端是酰胺化的。在化合物9中，连接疏水部分的赖氨酸残基的游离C末端是酰胺化了的。当被酰胺化了的时候，在pH 8下这样的C末端羧基不对底物的净电荷作出贡献。应该认识到，其它基团可被用来“遮蔽”末端羧基(如果需要的话，以及侧链羧基)的电荷效应。例如，这样的羧基可以是酯化的。或者，这样的羧基可以是非遮蔽的，并被用来对底物的总净电荷作出贡献。

本发明预期不仅检测靶酶，还检测涉及如下的方法：(1)在样本中对酶活性进行筛选和/或定量，(2)测定一种酶或酶混合物对所选择的底物的kcat和/或km，(3)对酶底物进行检测、筛选和/或表征，(4)对酶活性的抑制剂、激活剂和/或调节剂进行检测、筛选和/或表征，和(5)测定针对选定的酶的底物特异性和/或底物共有序列或底物共有结构。

例如，在筛选酶活性时，将包含或可能包含一种特别的酶活性的样本与本发明的底物相混合，并测量荧光以确定是否出现荧光增强。可在多孔或多反应板或设备中同时对许多样本进行筛选，以提高产率。可通过标准方法测定Kcat和Km，如例如在Fersht， Enzyme Structure and Mechanism，2^ndEdition，W.H.Freeman and Co.，New York，(1985))中所描述的。

在有些实施方式中，反应混合物可包含两个或更多不同酶。这对例如同时筛选多种酶、以确定是否酶中的至少一种具有特殊酶活性是有利的。

通过将一种酶与具有不同酶识别部分的不同底物反应，可测定酶的底物特异性，并且基于它们荧光的增强可测定酶对底物的活性。例如，通过将酶与具有几种不同蛋白激酶识别部分的几种不同底物反应，可制备一种激酶的优选底物的共有序列。

每个不同底物可在不同反应混合物中分别测试，或者两个或更多底物可在一个反应混合物中同时存在。在不同底物同时存在于反应混合物中的实施例中，底物可包含相同的荧光部分，在这种情况下所观察到的荧光信号是酶与两种底物反应的信号之和。或者，不同底物可包含不同的、荧光上可区别的荧光部分，从而能分别监测和/或检测酶与同时存在相同混合物中的每一不同底物的反应。可对荧光部分进行选择，来用同一激发源激发它们中的全部或其亚群，或者可用不同激发源激发它们。也可对它们进行选择以使其具有额外的特性，例如当其非常接近时，通过例如碰撞淬灭、FRET或另一机制(或机制的组合)彼此淬灭的能力。

虽然对于本方法的操作不是必需的，测试混合物可以选择性包括一种或多种两亲的淬灭化合物，该化合物被设计来淬灭底物(和/或当混合物中存在多于一种底物时为多个底物)的荧光部分的荧光。这样的两亲的淬灭分子通常包含一个疏水部分和一个淬灭部分，该疏水部分能够将淬灭化合物整合入微团。疏水部分可以是任何能够将化合物整合入微团的部分，并且特定的、非限制性的示例性实施例可包含前面与例如激酶底物一起描述的疏水部分中的任何一种。

淬灭部分可包括能够淬灭在分析中所使用的酶底物(或者如果使用多种底物，为底物中的一种或多种)的荧光部分的荧光的任何部分。能够淬灭上面所讨论的各种不同类型的荧光染料的荧光的化合物是已知的，这些荧光染料例如呫吨、荧光素、罗丹明、花青、酞菁和方酸染料。这样的淬灭化合物可以是非荧光的(也称为“暗淬灭剂”(dark quencher)或“黑洞淬灭剂”(black hole quencher))，或者，它们自身可以是荧光的。可包含淬灭部分的适宜的非荧光暗淬灭剂的例子包括，但不限于，Dabcyl、美国专利号6,080,868(Lee等)中所描述的各种非荧光淬灭剂、和在WO 03/019145(Ewing等)中所描述的各种非荧光淬灭剂。适宜的荧光淬灭剂的例子包括，但不限于，上面与激酶底物一起描述的各种荧光染料。

淬灭剂淬灭特定荧光部分的荧光的能力可取决于各种不同因素，例如淬灭发生的作用机制。淬灭的机制对于成功并不是决定性的，可例如通过碰撞、通过FRET、通过另一机制或机制的组合发生。针对一个特殊用途的淬灭剂的选择可根据经验容易地确定。一个具体例子为，暗淬灭剂Dabcyl和荧光淬灭剂TAMRA已被显示可有效淬灭各种不同荧光团的荧光。在一个特定实施方式中，选择淬灭剂可基于光谱上其与荧光部分光谱重叠的光谱重叠特性。例如，可选择一种淬灭剂，它的吸收光谱与荧光部分的发射光谱充分重叠，使得淬灭剂淬灭与之彼此十分靠近的荧光部分的荧光，例如当淬灭剂分子和包括淬灭剂部分的底物被整合入同一微团时。

在分析中存在多种底物的实施例中，例如上面所描述的复合实施例中，可能需要选择一种淬灭部分，该淬灭部分能淬灭分析中存在的所有底物的荧光部分的荧光。

可将疏水和淬灭部分以允许它们行使各自功能的任何方式连接。一个具体例子为，疏水部分可不借助于接头直接被连接于淬灭部分。这样的淬灭化合物的非限制性的例子包括其中包含伯氨基基团(或其它适宜的基团)的染料(例如，一种罗丹明或荧光素染料)被脂肪酸酰化了的分子。另一个具体例子为，连接可通过接头的方式介导。接头的特性不是决定性的，并可包括肽片段(或其类似物)。虽然在许多实施方式中肽片段将不包括被所测试的一个或更多酶识别的酶识别部分，其可任选包括这样的一个或多个部分。一个具体例子为，淬灭剂分子可以是本文所描述的激酶或其它酶底物中的任何一个的衍生物或类似物，其中荧光部分被淬灭部分所取代，并且酶识别部分的序列被修饰，使得其不再被样品中所分析的一种或多种酶所识别。

与酶底物一样，淬灭剂分子可被设计成具有特定的电荷特性。

检测、筛选和/或表征酶活性的抑制剂、激活剂和/或调节剂，可以通过形成包含这样的已知或潜在的抑制剂、激活剂和/或调节剂的反应混合物、并确定荧光信号相对于在没有抑制剂、激活剂或调节剂时观察到的信号增大或减小(如果有的话)的程度。可测定这些物质的不同量，以确定例如Ki(抑制常数)、K_H(希尔系数)、Kd(解离常数)等参数，以表征这种物质对酶活性具有浓度依赖的效应。

实施例8描述了用蛋白激酶A进行的抑制研究(还参见图4)。在不存在(最低痕量)或存在抑制剂星形孢菌素(5mM，中等痕量)或PKA特异性抑制剂TYADFIASGRTGRRNAI(20nM，最高痕量)时、在不同浓度的ATP(50、10、3和2μM三磷酸腺苷)存在下，将来自大肠杆菌的PKA进行温育。磷酸化的荧光底物具有结构N-棕榈酰-α-2-氨甲基-Gly(5-羧基-砜荧光素)LeuArgArgAlaSer(OH)LeuGly-NH₂(N-palmitoyl-alpha-2-aminomethyl-Gly(5-carboxy-sulfonefiuorescein)LeuArgArgAlaSer(OH)LeuGly-NH₂)(化合物11)，其中疏水部分(棕榈酰)和荧光部分(染料)均与激酶识别部分的N-末端残基连接，类似于上面方案3中所示结构。染料5-羧基-砜荧光素通过5-羰基基团和2-氨甲基基团的2-氨基氮之间形成的酰胺键连接于N-末端残基。棕榈酰基团经由α氨基氮偶联至N-末端残基。该结构示于方案8，并在实施例8A中提供了合成过程。

方案8

以双倒数作图(1/V作为1/S的函数)的形式将分析的结果(实施例8B)示于图4。如所看到的，当与无抑制剂的对照相比时，酶介导的磷酸化的速率被两种抑制剂抑制。由于抑制剂曲线与无抑制剂对照曲线的y-截距不相交，两种抑制剂都不是ATP结合的竞争性抑制剂(参见例如A.Fersht， Enzyme Structure and Mechanism，2^nd Edition，W.H.Freeman and Co.，New York，第3章(1985))。此结果与这些抑制剂结合于激酶的位点不同于ATP结合位点的事实是相一致的。

实施例9中描述了对蛋白激酶C-βII的抑制研究。制备PKC底物(化合物12)，该底物具有类似于上面方案4中所示的PKA底物的通式结构，不同之处在于蛋白激酶识别部分含有被设计来与PKC-βII反应的肽序列。特别地，底物包含能被PKC-βII磷酸化的C-末端酪氨酸残基(Y)。一式两份制备反应混合物，该混合物在不同量的抑制剂星形孢菌素(痕迹A-D 0、2nM、5nM和10nM)存在下包含化合物12。也进行了无酶对照(痕迹E)。结果示于图5。如所看到的，随着抑制剂浓度增大，激酶活性降低。

实施例10描述了对pp60^c-src相关蛋白酪氨酸激酶的分析。在此研究中，制备底物(化合物13)，该底物具有与化合物12类似的通式结构，不同之处在于蛋白激酶识别部分含有为pp60^c-src激酶设计的肽序列，并且磷酸化位点是内在地位于识别部分内的酪氨酸。针对单一底物浓度一式三份进行酶反应，并且还进行两个无酶对照。分析结果示于图6。如所看到的，在三个相同的底物反应观察到几乎同样的荧光图形，证明分析条件所提供的荧光信号有可重复性并且快速。此研究的另一值得注意的特征在于尽管反应体积非常小(5μL)、并且底物浓度低(2.5μM)，观察到具有高信-噪比的强荧光信号。这证明使用本发明可获得高敏感性。

荧光信号的检测可以任何适宜的方式进行。有利的是，可在连续监测期实时地使用本发明的底物，以使得用户快速确定样本中是否存在酶活性，并可任选确定酶的量或特异活性。从至少两个不同时间点测量荧光信号，通常直到能测定一个初始速率(速度)(rate)。可连续或在几个选定的时间点监测信号。或者，可在一个终点(end-point)实施例中测定荧光信号，其中在在特定量的时间后测量信号，并且将该信号与对照信号(在反应开始前)、阈限信号或标准曲线进行比较。

实施例11描述了星形孢菌素蛋白激酶C的抑制研究，以测定星形孢菌素在各种固定的ATP浓度下的IC₅₀。来自上面描述的实施例7的化合物10是此研究所用的底物。每一轮以固定的ATP浓度(10、20、50或100μM)、在一系列星形孢菌素浓度下(0、0.1、0.5、1、2、5、10、20、50和100nM)进行分析。10μM ATP下的未加工过的动力学数据示于图7A。在图7A中观察到的荧光信号的起始跃升是由于温度改变所造成的，该温度改变是当使反应从孵育温度(在添加ATP前使反应所保持的温度)0℃升温至环境温度时发生的。结果是，荧光信号在大约最初的200秒内迅速升高。出于此原因，图7B中所示的线性配合是由获自3.5至13.5分钟之间的数据构建的。此范围内的数据被用来计算在不同星形孢菌素浓度下的斜率，并从斜率获得起始速率。当线性配合的斜率是负值时，(分别为50和100nM的高星形孢菌素浓度)应用为0的斜率。

图8A和8B显示在50Mm ATP，在相同范围的星形孢菌素浓度时原始动力学数据(图8A)和起始速率数据(图8B)。如从图8A中所看到的，信-噪比相对于图7A有所改善。同样，在这种情况下，用获自2.5至13.5分钟之间的数据来进行线性配合(图8B)。

可用本领域已知的方法从起始速率计算IC₅₀。IC₅₀数据示于图9。对此特定分析而言，发现在10、50、100和200μM ATP浓度下的IC₅₀分别为5、6、10和16μM。这些IC₅₀数值与文献中所找到的那些数值对应得很好。

或者，可以用终点分析测定IC₅₀数值。图10用图解说明用此方法所得到的IC₅₀值。在1小时反应时间后测量荧光强度。这些数值通常比用初始速率测定的IC₅₀数值高出4倍。

表4中显示将分别用自起始速率和终点数据得到的IC₅₀值进行比较。

表4
					ATP(μM)	10	50	100	200
起始速率(IV)(nM)	5	6	10	16
					终点(nM)	26	40	49	52

IV. 试剂盒

本发明还提供了用于进行本发明的方法的试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒包含至少一个用来检测靶酶的酶底物，和用来制备便于酶反应的反应混合物的缓冲液。缓冲液可在容器中以干的形式或液体形式提供。特定缓冲液的选择可取决于多种因素，例如所要检测的酶的最适pH，底物中荧光部分的溶解度和荧光特性，以及从其中获得靶酶的样本的pH。通常将足够在混合物中产生某一特定pH的量的缓冲液加入反应混合物。在有些实施方式中，以储存溶液的形式提供缓冲液，该储存溶液具有预先选定的pH和缓冲液浓度。如上面所讨论的，在与样本混合后，缓冲液产生一个对酶分析来说适宜的最终pH。反应混合物的pH也可用酸或碱滴定以达到一个最终的、所需要的pH。试剂盒可额外地包括对酶活性有利的其它成分，例如盐(例如KCl，NaCl，或NaOAc)，金属盐(例如Ca²⁺盐例如CaCl₂，MgCl₂，MnCl₂，ZnCl₂，或Zn(OAc)，洗涤剂(例如TWEEN20)，和/或可对特定酶有益的其它成分。这些其它成分可以彼此分开提供，或以干的或液体形式混合在一起。

酶底物也可以干的或液态形式与缓冲液一起或与缓冲液分开提供。为了促进在反应混合物中溶解，酶底物可在易于与反应混合物中的其它成分混合的水溶液、部分水溶液、或非水储存溶液中提供。例如，除了水之外，底物溶液可还包含共溶剂例如二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲醇或乙醇，通常是在1％-10％(v∶v)范围内。

对于检测蛋白激酶活性来说，试剂盒可还包含一个磷酸盐供给基团，例如ATP、GTP、ITP(肌苷三磷酸)或其它三磷酸核苷或三磷酸核苷类似物，它能被激酶用来对底物磷酸化。

根据下面的非限制性实施例，可进一步理解本发明的操作，这些实施例对本发明的多个方面进行了举例说明。

实施例

材料和方法

A. 试剂

用于肽合成的树脂和试剂，Fmoc氨基酸，5-羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯获自Applied Biosystems(Foster City，CA)。Fmoc-Lys(Mtt)-OH，Fmoc-Ser(OPO(OBzl(OH)-OH和Fmoc-Dpr(ivDde)获自Novabiochem。蛋白激酶A和蛋白激酶C获自Promega(Madison，WI)。星形孢菌素和ATP获自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。活性src和蛋白激酶CβII获自Upstate，Inc.(Lake Placid，NY)。所有其它化学药品和缓冲液获自Sigma/Aldrich。

B. 仪器

在Applied Biosystems 433A型肽合成仪上进行肽合成。在Agilent1100系列HPLC上进行HPLC。在Cary 3E UV-Vis分光光度计上进行UV-Vis测量。使用电雾化电离自PE Sciex API 150EX质谱仪上获得质谱数据。

C. 吸光度测量

通过将纯化的肽稀释到1M pH 9 AMPSO(3-[1，1-二甲基-2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸)缓冲液(5μL)中的三氟乙醇(500μL)、并且在染料的最大吸光度(对5-羧基荧光素来说是497nm)测量其吸光度来测定染料标记的肽的浓度。5-羧基荧光素的消光系数假定为80m000cm^-1M^-1。

D. 分析反应

在环境温度下进行酶分析反应。在384孔、NBS、黑平板(Corning，NY)中进行蛋白激酶C分析反应。

实施例1

蛋白激酶检测

A. 蛋白激酶底物(化合物1)

如下述制备用于检测蛋白激酶A的示例性酶底物棕榈酰-FAM-S(OPO₃ ^2-)LRRRRFSK(Ac)G-酰胺。使用标准FastMoc^TM化学法在625mg的Fmoc-PAL-PEG-PS树脂上以0.16mmol/g经由固相肽合成构建肽Fmoc-L(R(Pmc))₄FS(tBu)K(Mtt)G，该树脂是生成羧基酰胺肽的固体支持物。将最终受保护的肽-树脂的一部分(20mg，2μmol肽)转移至1.5mlEppendorf管，并用二氯甲烷(DCM)中的5％三氟乙酸(TFA)1mL处理，生成特征性的黄色三苯甲基的颜色。通过加入0.1mL甲醇并洗涤(3×1mL二甲基甲酰胺，DMF)来沉淀树脂。向树脂中加入二异丙基乙胺(50μL)和封端溶液(1mL乙酸酐溶液(0.5M)和在N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的羟基苯并三唑(0.015M))，将混合物搅拌10分钟。洗树脂(3×1mL DMF)，并用哌啶(在DMF中的20％哌啶1mL)处理。4分钟后，用DMF(6×1mL)洗树脂。并用Fmoc-Ser(OPO(OBzl)OH)-OH(10mg)、偶联溶液(50μL的HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)1，1，3，3-四甲基脲盐六氟磷酸盐，0.45M)溶液)和HOBT(1-羟苯并三唑，0.45M)和二异丙基乙胺(20μL)处理树脂。搅拌35分钟后，用DMF(3×1mL)洗树脂，并用哌啶(在DMF中的20％哌啶1mL)处理。5分钟后，树脂用DMF洗(6×1mL)，并用4’-(对-(Fmoc-NHCH₂)C₆H₄C(＝O)NHCH₂)-5-FAM琥珀酰亚胺基酯)(10mg)和二异丙基乙胺(35μL)处理。搅拌1小时后洗树脂(6×1mL DMF)，并用哌啶(在NMP中的20％哌啶)处理。5分钟后，树脂用NMP洗(6×1mL)，并用棕榈酰氯(5μL)和二异丙基乙胺(35μL)处理。搅拌16分钟后，洗树脂(3×1mLNMP，1×1mL 1∶1甲醇/DCM)，在真空离心机中干燥。用1mL切割溶液(950μL TFA，50μL水，25μL三异丙硅烷，和25μL苯硫基甲烷)将肽从树脂上切割。1.5至2小时后，将混合物过滤，在旋转蒸发机上将滤液浓缩至干燥。残余物溶解在水(0.5mL)中，其一部分用乙腈中0.1％TFA相对于水中0.1％TFA的10％-40％梯度在10分钟的时间里(using a 10％to40％ gradient over 10min of 0.1％TFA in acetonitrile vs.0.1％TFA inwater)通过反向HPLC(Metachem Technologies柱：150×4.6mm，PolarisC18，5μm)来纯化。染料标记的肽通过ESI质谱仪进行分析，其得到所期望的M/z＝2141。

B. 蛋白激酶活性的检测

制备包含20mM Tris缓冲液pH 8.5、Mg-ATP(1Mm)、cAMP(1μM)、和不同浓度的化合物1(0.15μM、0.3μM和0.6μM)的反应混合物(1001μL)，随后向其中加入蛋白激酶A的催化亚单位(2单位)。以500nm激发和530nm发射，以及5nm的隙缝宽度在Perkin-Elmer LS-50B荧光分光计上监测荧光。初始速率以双倒数作图进行作图得到化合物1的Km的值为0.3μM。结果示于图1和2。

实施例2

磷酸酶检测

A. 磷酸酶底物(化合物2)

下面描述了示例性染料标记的肽，化合物2，棕榈酰-LRRRRFS(OPO₃ ^2-)K(5-FAM)G-酰胺的合成。使用标准FastMoc^TM化学法在625mg的Fmoc-PAL-PEG-PS树脂上以0.16mmol/g经由固相肽合成构建肽Fmoc-LR(Pmc)₄FS(OPO(OBzl)OH)K(Mtt)G，该树脂是生成羧基酰胺肽的固体支持物。带有羧基端的肽用Fmoc-Gly-PEG-PS树脂构建。将最终受保护的肽-树脂的一部分(20mg，2μmol肽)转移至1.5ml Eppendorf管，并用二氯甲烷(DCM)中的5％三氟乙酸(TFA)1mL处理，生成特征性的黄色三苯甲基的颜色。通过加入0.1mL甲醇并洗涤(3×1mL二甲基甲酰胺，DMF)来沉淀树脂。向树脂中加入5-羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(5mg，10μmol)、二异丙基乙胺(30μL，173μmol)和DMF(100μL)，将混合物轻轻搅拌2-10小时。洗树脂(5×1mL DMF)，并用哌啶(在NMP中的20％哌啶1mL)处理5分钟。树脂用NMP(3×1mL NMP)洗。向树脂中加入棕榈酰氯(5μL)和二异丙基乙胺(35μL)，将混合物搅拌10分钟。洗树脂(3×1mL NMP，1×1mL 1∶1甲醇/DCM)，在真空离心机中干燥。用1mL切割溶液(950μL TFA，50μL水，25μL三异丙硅烷，和25μL苯硫基甲烷)将肽从树脂上切割。1.5至2小时后，将混合物过滤，在旋转蒸发机上将滤液浓缩至干燥。残余物溶解在水(0.5mL)中，其一部分用乙腈中0.1％TFA相对于水中0.1％TFA的10％-40％梯度在10分钟的时间里通过反向HPLC(Metachem Technologies柱：150×4.6mm，Polaris C18，5μm)来纯化。染料标记的肽通过ESI质谱仪进行分析，其得到所期望的M/z＝1850。

B. 磷酸酶活性的检测

在包含化合物2(20μM)、pH 9的TrisHCl缓冲液(50mM)和MgCl₂(1mM)的100μL反应混合物中进行磷酸酶反应。通过加入在1-5μL中的0.5单位的大肠杆菌碱性磷酸酶来启动反应。以480nm激发和525nm发射，以及5nm的隙缝宽度在Perkin-Elmer LS-50B荧光分光计上监测荧光。结果示于图3。

实施例3

荧光的动态范围

此实施例描述了一项研究，以测定蛋白激酶A底物的磷酸化和非磷酸化形式之间在荧光上的不同。目的是为了确定化合物在将非磷酸化的形式进行磷酸化后能够以良好信噪比提供荧光信号增大的程度。

A. 候选底物(化合物3、3P、4、4P、5、5P、6和6P)

既以磷酸化也以非磷酸化形式制备具有不同长度烷基酰基基团的一系列化合物(上面的方案3)，由下式代表：X-Y(染料)LRRAS(OR)LG-NH₂，其中X是CH₃(CH₂)_xC(＝O)-形式的脂肪酸酰基基团，x是0、7、10或14，Y是α-氨甲基甘氨酸，染料是通过与染料的侧链苯环进行5-羰基连接而附着于Y的2-氨基氮原子的4，7-二氯荧光素，并且R是H或PO₃ ^2-。

对化合物3-6而言，使用标准FastMoc^TM化学法在625mg的Fmoc-PAL-PEG-PS树脂上以0.16mmol/g经由固相肽合成构建肽Fmoc-L(R(Pmc)₂AS(tBu)LG，该树脂是生成羧基酰胺肽的固体支持物。下面是化合物4的代表性合成。

将最终受保护的肽-树脂的一部分(20mg，2μmol肽)转移至1.5mlEppendorf管，并用哌啶(在DMF中的20％哌啶1mL)处理。5分钟后，树脂用DMF洗(6×1mL)，并用Fmoc-Dpr(ivDde)(20mg)、偶联溶液(100μL，组成见上)和二异丙基乙胺(40μL)处理。搅拌20分钟后，洗树脂(4×1mL DMF)，并用哌啶(在NMP中的20％哌啶1mL)处理。洗树脂(4×1mL NMP)，并周壬酰氯(5μL)和二异丙基乙胺(30μL)处理。搅拌20分钟后，洗树脂(5×1mL NMP)，并用肼(在DMF中的2％，1mL)处理。5分钟后，洗树脂(5×1mL DMF)，并用4，7-二氯-5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(4mg)和二异丙基乙胺(30μL)处理。1小时后，洗树脂(10×1mL DMF，1×1mL 1∶1甲醇∶二氯甲烷)，在真空离心机中干燥。如上述将肽从树脂上切割、纯化和分析。

除了用乙酸酐(化合物3)、月桂基氯(化合物5)或棕榈酰氯(化合物6)取代壬酰氯之外，以同样方式制备化合物3、5和6。除了使用PAL树脂上的肽fmocLR(Pmc)₂AS(OPO(OBzl)OH)LG外，类似于化合物3-6制备化合物3P、4P、5P和6P。

B. 荧光的动态范围

将不同化合物的溶液稀释到100mM TrisHCl缓冲液pH 8.5中至终浓度5μM。通过稀释到三氟乙醇来测定储备溶液的浓度，并假定染料的消光系数为80,000cm^-1M^-1。以500nm激发和546nm发射在Perkin-ElmerLS-50B荧光分光计上测量荧光。隙缝宽度对稀释溶液来说是5nm，对大多数高度荧光的溶液来说是3nm、具有衰减因数4.4。结果示于上面表2。

实施例4

蛋白激酶检测(化合物7)

A. 蛋白激酶A底物(化合物7)

下面描述了示例性染料标记的肽，化合物7，N-(1H，1H，2H，2H-全氟癸基-1-硫羟-2-乙酰基)-K-(5-羧基磺基荧光素)LRRASLG-酰胺。使用标准FastMoc^TM化学法在625mg的Fmoc-PAL-PEG-PS树脂上以0.16mmol/g经由固相肽合成构建肽Fmoc-K(ivDde)LRRASLG，该树脂是生成羧基酰胺肽的固体支持物。将最终受保护的肽-树脂的一部分(20mg，2μmol肽)转移至1.5ml Eppendorf管，并用二甲基甲酰胺(DMF)中的20％哌啶(500μL)处理20分钟，以除去FMOC保护基。树脂随后用3×1mL DMF、接着用3×1mL二氯甲烷(DCM)洗。混合碘乙酸(2.5mg，13μmol)、在乙酸乙酯(EtOAc)(70μL，13μmol)中的0.2M二环己基碳二亚胺、在EtOAc(200μL，40μmol)中的0.2M N-羟基琥珀酰亚胺、和DMF(100μL)，使其静置30分钟。将此混合物加入树脂，轻轻搅拌3小时。用5×1mL DMF，随后用5×1mL DCM洗树脂。将在100μL DMF中的1H，1H，2H，2H-全氟癸基-1-硫醇(35mg，75μmol)加入树脂，轻轻搅拌15小时。用5×1mLDMF，随后用5×1mL DCM洗树脂。用DMF中的10％肼(500μL)处理树脂20分钟以除去ivDde保护基团。用3×1mL DMF，随后用3×1mL DCM洗树脂。将5-羧基磺基荧光素(5mg，10μmol)、0.45M HOBT/HBTU(40μl，18μmol)、2M在NMP中的二异丙基乙胺(20μL，40μmol)和DMF(100μL)加入树脂，将混合物轻轻搅拌3小时。用5×1mL DMF，随后用5×1mLDCM洗树脂。用1mL切割溶液(950μL TFA，50μL水，25μL三异丙硅烷，和25μL苯硫基甲烷)将肽从树脂上切割。1.5至2小时后，将混合物过滤，在旋转蒸发机上将滤液浓缩至干燥。残余物用3×1mL己烷洗来进行研制，其一部分用乙腈中0.1％TFA相对于水中0.1％TFA的25％-70％梯度、在25分钟时间内用反向HPLC(Agilent柱：150×4.6mm，300Extend，5μM)来纯化。染料标记的肽通过ESI质谱仪进行分析，其得到所期望的M/z＝1814。

B. 蛋白激酶活性的检测

在Perkin-Elmer LS-50B荧光分光计上收集荧光数据。发现包含化合物7(1μM)、Tris缓冲液pH 8.1(20mM)、MgCl₂(1mM)和蛋白激酶A(35单位)的100μL溶液在480nm激发和520nm发射的荧光为35荧光单位。将ATP加至终浓度0.5mM，并监测荧光，荧光在6分钟后达到最大值180荧光单位，或增强5倍。

实施例5

蛋白激酶检测(化合物8)

A. 蛋白激酶A底物(化合物8)

下面是示例性激酶底物，化合物8，(5-羧基-2，7-二吡啶基-磺基荧光素)-K-(N-全氟-辛酰基-脯氨酸)-LRRASLG-酰胺的合成。使用标准FastMoc^TM化学法在625mg的Fmoc-PAL-PEG-PS树脂上以0.16mmol/g经由固相肽合成构建肽Fmoc-K(ivDde)LRRASLG，该树脂是生成羧基酰胺肽的固体支持物。将最终受保护的肽-树脂的一部分(20mg，2μmol肽)转移至1.5ml Eppendorf管，并用二甲基甲酰胺(DMF)中的20％哌啶(500μL)处理20分钟，以除去FMOC保护基。用3×1mL DMF，随后用3×1mL DCM洗树脂。向树脂中加入5-羧基-2’，7’-二吡啶基-磺基荧光素(5mg，9μmol)、0.45M HOBT/HBTU(40μl，18μmol)、NMP(20μL，40μmol)中的2M二异丙基乙胺和DMF(100μL)，将混合物轻轻搅拌3小时。用5×1mL DMF，随后用5×1mL DCM洗树脂。用DMF中的10％肼(500μL)处理树脂20分钟以除去ivDde保护基团。树脂用3×1mL DMF、随后用3×1mL DCM洗。将N-全氟-辛酰基-L-脯氨酸(25mg，49μmol)(通过Curran和Luo，JACS 1999，121，9069-9072的方法制备)、0.45M HOBT/HBTU(40μL，18μmol)和2M DIPEA/NMP(20μl，40μmol)加入树脂，轻轻搅拌15小时。用5×1mL DMF，随后用5×1mL DCM洗树脂。用1mL切割溶液(950μL TFA，50μL水，25μL三异丙硅烷，和25μL苯硫基甲烷)将肽从树脂上切割。1.5至2小时后，将混合物过滤，在旋转蒸发机上将滤液浓缩至干燥。残余物用3×1mL己烷洗来进行研制，其一部分用乙腈中0.1％TFA相对于水中0.1％TFA的25％-70％梯度、在25分钟时间内用反向HPLC纯化(Agilent柱：150×4.6mm，300 EXTEND，5μm)。染料标记的肽通过ESI质谱仪进行分析，其得到所期望的M/z＝1940。

B. 蛋白激酶活性的检测

在Perkin-Elmer LS-50B荧光分光计上收集荧光数据。发现包含化合物8(1μM)、Tris缓冲液pH 8.1(20mM)、MgCl₂(1mM)和蛋白激酶A(35单位)的100μL溶液在520nm激发和550nm发射的荧光为140荧光单位。将ATP加至终浓度0.5mM，并监测荧光，荧光在5分钟后达到最大值493荧光单位，或增强3.5倍。

实施例6

蛋白激酶检测(化合物9)

A. 蛋白激酶A底物(化合物8)

下面描述了示例性底物，化合物9，N-乙酰基RGRPRTSSFAEGOOOK(N-5-羧基磺基荧光素)K(N-十八酰基)-酰胺的合成，其中O是2-氨基乙氧基-2-乙氧乙酰基团所提供的接头。使用标准FastMoc^TM化学法在625mg的Fmoc-PAL-PEG-PS树脂上以0.16mmol/g经由固相肽合成构建肽N-乙酰基RGRPRTSSFAEG(AEEA)₃K(ivDde)K(Mtt)，该树脂是生成羧基酰胺肽的固体支持物。将最终受保护的肽-树脂的一部分(20mg，2μmol肽)转移至1.5ml Eppendorf管，用二甲基甲酰胺(DMF)中的5％三氟乙酸(TFA)处理(4×200μL，每次处理等待5分钟)，以除去mtt保护基团。然后用3×1mLDMF、再用3×1mL二氯甲烷(DCM)洗树脂，并且用硬脂酸(25mg，88μmol)、0.45M HOBT/HBTU(100μl，45μmol)、NMP中的2MDIPEA(40μL，80μmol)和DMF(200μL)处理树脂。轻轻搅拌混合物2小时，用3×1mL DMF、随后用3×1mL DCM洗树脂。用DMF中的10％肼(500μL)处理树脂20分钟以除去ivDde保护基团，随后用3×1mL DMF和3×1mLDCM洗树脂。向树脂中加入5-羧基-磺基荧光素(5mg，9μmol)、0.45MHOBT/HBTU(40μl，18μmol)、NMP中的2M二异丙基乙胺(20μL，40μmol)和DMF(100μL)，将混合物轻轻搅拌3小时。用5×1mL DMF、随后用5×1mL DCM洗树脂。用1mL切割溶液(950μL TFA，50μL水，25μL三异丙硅烷，和25μL苯硫基甲烷)将肽从树脂上切割。1.5至2小时后，将混合物过滤，在旋转蒸发机上将滤液浓缩至干燥。残余物用3×1mL己烷洗来进行研制，其一部分用乙腈中0.1％TFA相对于水中0.1％TFA的25％-70％梯度、在25分钟时间内用反向HPLC(Agilent柱：150×4.6mm，300 EXTEND，5μm)来纯化。染料标记的肽通过ESI质谱仪进行分析，其得到所期望的M/z＝2714。

B. 蛋白激酶活性的检测

在Perkin-Elmer LS-50B荧光分光计上收集荧光数据。发现包含化合物9(1μM)、Tris缓冲液pH 8.1(20mM)、MgCl₂(1mM)和ATP(0.5mM)的100μL溶液在480nm激发和520nm发射的荧光为50荧光单位。加入蛋白激酶A(7单位)，并监测荧光，荧光在3分钟后达到最大值420荧光单位，或增强8倍。

实施例7

蛋白激酶检测(化合物10)

A. 蛋白激酶C底物(化合物10)

下面描述了(N-棕榈酰)-Lys(N-5-羧基-2’，7’-二吡啶基-磺基荧光素)-OOO-RREGSFR-酰胺的合成。缩写O描述的是2-氨基乙氧基-2-乙氧乙酰基团所提供的接头。使用标准FastMoc^TM化学法在625mg的Fmoc-PAL-PEG-PS树脂上以0.16mmol/g经由固相肽合成构建肽Fmoc-OOOK(ivDde)RREGSFR，该树脂是生成羧基酰胺肽的固体支持物。将最终受保护的肽-树脂的一部分(20mg，2μmol肽)转移至1.5mlEppendorf管，并用二甲基甲酰胺(DMF)中的20％哌啶(500μL)处理20分钟，以除去fmoc保护基。用3×1mL DMF、随后用3×1mL DCM洗树脂。向树脂中加入棕榈酸(20mg，78μmol)、0.45M HOBT/HBTU(100μl，45μmol)、2M二异丙基乙胺/NMP(40μL，80μmol)，轻轻搅拌2小时，随后进行上述洗涤。通过用DMF中的10％肼(500μL)处理树脂20分钟以除去ivDde保护基团。用3×1mL DMF、随后用3×1mL DCM洗树脂。

向树脂中加入5-羧基-2’，7’-二吡啶基-磺基荧光素(5mg，9μmol)、0.45M HOBT/HBTU(40μL，18μmol)、NMP中的2M DIEPA(20μL，40μmol)和DMF(100μL)，将混合物轻轻搅拌3小时。用5×1mL DMF，随后用5×1mL DCM洗树脂。然后用DMF中的20％哌啶(500μL)、随后用5×1mLDCM洗树脂，以除去染料相关的杂质。用1mL切割溶液(950μL TFA，50μL水，25μL三异丙硅烷，和25μL苯硫基甲烷)将肽从树脂上切割。1.5至2小时后，将混合物过滤，在旋转蒸发机上将滤液浓缩至干燥。残余物用3×1mL己烷洗来进行研制，其一部分用乙腈中0.1％TFA相对于水中0.1％TFA的25％-70％梯度、在25分钟时间内用反向HPLC(Agilent柱：150×4.6mm，300 EXTEND，5μm)来纯化。染料标记的肽通过ESI质谱仪进行分析，其得到所期望的M/z＝2255。

B. 蛋白激酶C分析操作

将蛋白激酶C反应混合物等分部分(每份9μL)加入384孔平板的孔中，该等分部分包含2μL 5×缓冲液(由100mM Tris，pH 8.1+25mM MgCl₂，和0.5％v/vβ-巯基乙醇组成)、1μL Upstate类脂活化剂、0.05μL Promega蛋白激酶C、5.55μL去离子水和0.4μL底物。通过向每孔中加入1μLSigma-A1drich ATP来启动反应。在Molecular Devices Gemini平板读数仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上收集数据，该读数仪设置为500nm激发和550nm发射。结果示于表3。

实施例8

蛋白激酶A的抑制

A. 蛋白激酶A底物

具有N-棕榈酰基-α-(2-氨甲基)甘氨酸(5-羧基-砜荧光素)LeuArgArgAlaSer(OH)LeuGly-NH₂(N-pahnitoyl-alpha-(2-aminomethyl)glycine(5-carboxy-sulfonefluorescein)LeuArgArgAlaSer(OH)Leu-Gly-NH₂)结构的荧光PKA底物(化合物11)通过与制备上面化合物6所用的方法类似的方法制备，但有如下改变。不是将棕榈酰氯，而是将棕榈酸(5mg)、偶联溶液(100μL)、和二异丙基乙胺(30μL)添加到疏水部分。此外，附着荧光染料的反应涉及使用5-羧基砜荧光素(5mg)、偶联溶液(50μL)和二异丙胺(20μL)。这导致荧光染料附着到N末端α-(2-氨甲基)甘氨酸残基的α-氨基基团，并且5-羧基-砜荧光素通过与染料的5-羰基基团进行酰胺连接而附着到同一残基的2-氨甲基基团的2-氨基氮。

B. 激酶活性的抑制

制备包含20mM Tris-HCl pH 8.1、1mM MgCl₂、1μM化合物和3单位蛋白激酶A的反应混合物(100μL)。加入ATP至终浓度50、10、3和2μM以启动反应。以480nm激发和520nm发射在Perkin-Elmer LS-50B荧光分光计上收集荧光数据。在星形孢菌素(5nM)或PKA特异性肽抑制剂(20nM)TYADFIASGRTGRRNAI存在下重复该分析。结果示于图4。

实施例9

蛋白激酶C-βII的抑制

A. 蛋白激酶C-βII底物

制备具有如下结构(化合物12)的PKC底物：α-棕榈酰基-Lys(ε-N-5-羧基-砜荧光素)S(OPO₃ ^2-)KLKRQGSFKY-酰胺(alpha-palmitoyl-Lys(ε-N-5-carboxy-sulfonefluorescein)S(OPO₃ ^2-)KLKRQGSFKY-amide)，其中棕榈酰基通过酰胺键连接于N末端赖氨酸残基的α氨基基团，并且荧光素染料通过与染料的5-羧基基团之间的酰胺键连接于同一赖氨酸残基的ε氮原子。合成步骤与上面描述的PKA底物的合成步骤类似，只是在PAL树脂上形成Fmoc-S(PO(OBzl)OH)KLKRQGSFKY，并且Fmoc-Dpr(ivDde)被Fmoc-Lys(ivDde)代替。

B. PKC活性的抑制

制备反应混合物(100μL)，该反应混合物包含20mM Tris-HCl pH 8.1、1mM MgATP、10μL Upstate类脂活化剂、2.5μM PKC-βII底物(化合物8)和各种剂量的抑制剂星形孢菌素(0、2、5和10nM)。通过加入8ng PKC-βII酶以启动反应。在Molecular Devices Gemini平板读数器(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)上收集数据，该读数器设置为动态模式的485nm激发和520nm发射。结果示于图5。

实施例10

pp60 ^c-src 相关的蛋白酪氨酸激酶的检测

A. 蛋白酪氨酸激酶底物

制备具有如下结构的底物(化合物13)：N-棕榈酰基-Lys(ε-N-5-羧基-砜荧光素)KVEKIGEGTYGVVKK-酰胺(N-palmitoyl-Lys(ε-N-5-carboxy-sulfonefluorescein)KVEKIGEGTYGVVKK-amide)。合成步骤类似于合成化合物8所使用的步骤，只是使用了肽树脂Fmoc-Lys(ivDde)-KVEKIGEGTYGVVKK。结果示于图6。

B. 酪氨酸激酶活性

在Molecular Devices Gemini平板读数器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上追踪荧光信号，该读数器设置为动态模式的485/520nm激发/发射波长。使用Corning 384孔平板中的5孔，将非结合表面和低容量孔涂黑(black with a non-binding surfacee and low volume wells)(目录号3676)(Corning，Inc.，Acton，MA)。每孔包含5μL溶液，该溶液包含化合物9(2.5μM)、MgCl₂(1mM)、Tris缓冲液pH 8.2(20mM)和活性src(1单位，目录号14-326)。通过在其中的3孔中加入1.25μL ATP(200μM)至终浓度50μM来启动激酶反应。结果示于图6。

实施例11

星形孢菌素的蛋白激酶CIC50

A. 蛋白激酶C底物

实施例7中描述的化合物10是此研究所使用的底物。

B. 蛋白激酶C分析

酶浓度为10μL体积中的0.15ng/μl，其包含20mM Tris-HCl pH 8.1，1mM Mg²⁺，10％类脂活化剂，具有图9图例中所指定的ATP浓度。所使用的底物是化合物10，终浓度对所有反应来说都是3μM。用MolecularDevice平板读数器上的515nm截止滤波器在480nm激发样本而在520nm监测荧光强度。

本文中所提及的所有公开和专利申请均在此引入作为参考，就如同每一公开和专利申请都特别地和逐个地被指示引入作为参考。

虽然本发明参照了某些例证性的实施方式和实施例来进行描述，应被理解为可对其进行各种修饰和改变，而不偏离本发明的保护范围和精神。

Claims (55)

1.一种底物化合物，该底物化合物包含能够将所述化合物整合入微团的疏水部分、荧光部分和酶识别部分。

2.权利要求1的底物化合物，所述底物化合物在pH为大约pH8的水溶液中具有净中性电荷。

3.权利要求1的底物化合物，其中所述酶识别部分包含蛋白激酶识别序列，所述蛋白激酶识别序列包括至少一个能被蛋白激酶磷酸化的非磷酸化残基。

4.权利要求3的底物化合物，其中所述至少一个非磷酸化残基是酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸。

5.权利要求3的底物化合物，其中所述蛋白激酶识别序列被TK激酶、AGC激酶、CAMK激酶、CMGC激酶、STE激酶、TKL激酶、CKI激酶或属于“其它”的组的激酶所识别。

6.权利要求3的底物化合物，其中所述蛋白激酶识别序列被蛋白激酶A、蛋白激酶C、Src激酶、Lyn激酶、Fyn激酶、Akt激酶、MAP激酶、MAPKAP2激酶或cAMP依赖性激酶所识别。

7.权利要求3的底物化合物，其中所述蛋白激酶识别序列包含选自如下的肽序列：

-R-R-X-S/T-Z-                               (SEQ ID NO：1)；

-R-X-X-S/T-F-F-                             (SEQ ID NO：2)；

-S/T-P-X-R/K-                               (SEQ ID NO：3)；

-P-X-S/T-P-                                 (SEQ ID NO：4)；

-K-K-K-K-R-F-S-F-K-                         (SEQ ID NO：5)；

-X-R-X-X-S-X-R-X-                           (SEQ ID NO：6)；

-L-R-R-L-S-D-S-N-F-                         (SEQ ID NO：7)；

-K-K-L-N-R-T-L-T-V-A-                       (SEQ ID NO：8)；

-E-E-I-Y-E/G-X-F-                           (SEQ ID NO：9)；

-E-I-Y-E-X-I/V-                             (SEQ ID NO：10)

-I-Y-M-F-F-F-                               (SEQ ID NO：11)；

-Y-M-M-M-                                   (SEQ ID NO：12)；

-E-E-E-Y-F-                                  (SEQ ID NO：13)；

-L-R-R-A-S-L-G-                              (SEQ ID NO：14)；

-R-Q-G-S-F-R-A-                              (SEQ ID NO：15)；

-R-I-G-E-G-T-Y-G-V-V-R-R-                    (SEQ ID NO：16)；

-R-P-R-T-S-S-F-                              (SEQ ID NO：17)；

-P-R-T-P-G-G-R-                              (SEQ ID NO：18)；

-R-L-N-R-T-L-S-V-                            (SEQ ID NO：19)；和

其类似物和保守性突变体，其中X代表任何残基，并且Z代表疏水残基。

8.权利要求3的底物化合物，所述底物化合物在pH为大约pH8的水溶液中具有净中性电荷。

9.权利要求3的底物化合物，所述底物化合物具有如下结构：

其中：

m是4到28的整数；

n是3到15的整数；

p是1到6的整数；

L¹是任选的接头；

染料是荧光染料，所述荧光染料任选包括将染料连接到图示的相邻羰基基团的接头；

每个X¹是不依赖于其它的氨基酸侧链；

并且

X²是OR或NH₂，其中R是氢或包含1到8个碳原子的烷基，

附带条件是底物化合物的图示-[NH-CH(X¹)C(O)]_n-X²部分包括至少一个能被蛋白激酶磷酸化的残基。

10.权利要求9的底物化合物，其中L¹是-[CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂C(O)NH]_q-，其中q是0、1、2或3。

11.权利要求9的底物化合物，其中所述染料包含荧光素或罗丹明染料。

12.权利要求11的底物化合物，其中所述染料包含选自如下的任选取代的结构：

和

其中

X³是-C(O)O^-或-SO₃ ^-，并且虚线指示与图示结构余下部分的附着点。

13.权利要求12的底物化合物，其中所述染料具有染料2结构：

14.权利要求9的底物化合物，其中所述底物化合物的图示-[NH-CH(X¹)C(O)]_n-部分是选自如下的肽：

LRRASLG                      (SEQ ID NO：14)；

RQGSFRA                      (SEQ ID NO：15)；

RIGEGTYGVVRR                 (SEQ ID NO：16)；

RPRTSSF                      (SEQ ID NO：17)；

PRTPGGR                      (SEQ ID NO：18)；和

RLNRTLSV                     (SEQ ID NO：19)。

15.权利要求3的底物化合物，其中所述疏水部分包含具有6到30个碳原子的取代或非取代的、饱和或不饱和的烃。

16.权利要求15的底物化合物，其中所述烃是线性的、分枝的或环状的、饱和的或不饱和的烷基。

17.权利要求16的底物化合物，其中所述烃是含有10到26个碳原子的线性烷基。

18.权利要求17的底物化合物，其中所述烷基是完全饱和的正烷基。

19.权利要求17的底物化合物，其中所述烷基包括一个或更多碳-碳双键和/或一个或更多碳-碳三键，其中每一个所述碳-碳双键可以不依赖于其它的是顺式或反式构型。

20.权利要求3的底物化合物，其中所述疏水部分含有至少一个带正电荷的基团。

21.权利要求3的底物化合物，其中所述疏水部分含有至少一个带负电荷的基团。

22.权利要求3的底物化合物，其中所述荧光部分包含一种选自如下的染料：呫吨染料、罗丹明染料、荧光素染料、花青染料、酞菁染料、方酸染料和bodipy染料。

23.权利要求3的底物化合物，其中所述荧光部分包含荧光给体部分和荧光受体部分。

24.权利要求23的底物化合物，其中所述荧光给体部分包含荧光素染料。

25.权利要求23的底物化合物，其中所述荧光受体部分包含荧光素或罗丹明染料。

26.权利要求25的底物化合物，其中所述荧光给体部分包含荧光素染料。

27.权利要求3的底物化合物，其中所述荧光部分包含少于150个的原子。

28.权利要求3的底物化合物，其中所述疏水部分和所述酶识别部分通过所述荧光部分彼此连接。

29.权利要求3的底物化合物，其中所述疏水部分和所述荧光部分通过所述酶识别部分彼此连接。

30.权利要求3的底物化合物，其中所述疏水部分、所述荧光部分和所述酶识别部分经由三价接头彼此连接。

31.权利要求3的底物化合物，其中所述疏水部分通过接头连接于所述荧光部分，所述接头不包括所述酶识别部分的一部分。

32.权利要求3的底物化合物，其中所述疏水部分通过接头连接于所述荧光部分，所述接头包括所述酶识别部分的至少一部分。

33.权利要求1的底物化合物，其中所述酶识别部分包含磷酸酶识别序列，所述磷酸酶识别序列包括至少一个能够被磷酸酶脱磷酸化的磷酸化残基。

34.权利要求33的底物化合物，所述底物化合物在pH为大约pH8的水溶液中具有净中性电荷。

35.检测样本中存在的酶的活性的方法，包含如下步骤：

将样本与包含根据权利要求1的底物化合物的组合物接触，其中所述底物化合物的酶识别部分被所述酶识别，其有效条件是在所述酶存在于样本中时可修饰所述底物化合物，从而导致所述底物化合物的荧光部分产生的荧光信号增大；并且

检测荧光信号，其中荧光信号增大指示样本中酶的存在和/或数量。

36.权利要求35的方法，其中所述底物化合物以等于或高于其临界微团浓度的浓度存在。

37.权利要求35的方法，其中所述荧光信号作为时间的函数被检测。

38.权利要求35的方法，其中所述组合物还包含淬灭化合物，所述淬灭化合物包含能够将所述淬灭化合物整合入微团的疏水部分，和能够淬灭所述底物化合物的荧光部分的荧光的淬灭部分。

39.权利要求35的方法，所述方法还包含确定所述样本中酶的Km值或Kcat值。

40.鉴定调节酶活性的化合物的方法，包含如下步骤：

在候选调节剂化合物存在时，将所述酶与包含根据权利要求1的底物化合物的组合物接触，其中所述底物化合物中的酶识别部分被所述酶所识别，其有效条件是允许所述酶修饰所述底物化合物，从而导致所述底物化合物的荧光部分产生的荧光信号增大；并且

检测荧光信号，其中与对照反应或标准曲线相比荧光信号的增大或减小指示所述候选调节剂化合物调节所述酶的活性。

41.权利要求40的方法，其中所述候选调节剂化合物是所述酶活性的已知调节剂，并且所述方法被用来评价所述调节剂化合物对所述酶活性的影响。

42.权利要求40的方法，所述方法被实施来鉴定酶活性的抑制剂，其中与对照反应或标准曲线相比荧光信号的减小指示所述候选调节剂化合物抑制所述酶的活性。

43.权利要求42的方法，所述方法还包含确定所述抑制剂化合物的Ki。

44.权利要求42的方法，其中所述候选调节剂化合物是所述酶的活性的已知抑制剂，并且所述方法被用来确定所述化合物的Ki。

45.检测样本中一个或更多蛋白激酶的磷酸化活性的方法，包含如下步骤：

将样本与包含蛋白激酶底物的组合物接触，该蛋白激酶底物包含(1)蛋白激酶识别部分，所述蛋白激酶识别部分含有至少一个能够被蛋白激酶磷酸化的非磷酸化残基，(2)能够将底物整合入微团的疏水部分，和(3)荧光部分，其有效条件是在当样本中存在所述蛋白激酶时使得所述残基磷酸化，从而增大荧光部分所产生的荧光信号；并且

检测荧光信号，其中荧光信号增大指示样本中所述蛋白激酶的磷酸化活性的存在和/或量。

46.权利要求45的方法，其中所述蛋白激酶底物是根据权利要求3-32任一项的底物化合物。

47.权利要求45的方法，其中所述荧光信号作为时间的函数被检测。

48.权利要求45的方法，其中所述组合物还包含淬灭化合物，所述淬灭化合物包含能够将所述淬灭化合物整合入微团的疏水部分，和能够淬灭所述蛋白激酶底物的荧光部分的荧光的淬灭部分。

49.权利要求45的方法，所述方法还包含确定所述样本中蛋白激酶的Km值或Kcat值。

50.鉴定调节蛋白激酶磷酸化活性的化合物的方法，包含如下步骤：

在候选化合物存在时，将蛋白激酶与包含蛋白激酶底物的组合物接触，所述蛋白激酶底物包含(1)蛋白激酶识别部分，所述蛋白激酶识别部分含有至少一个能够被蛋白激酶磷酸化的非磷酸化残基，(2)能够将底物整合入微团的疏水部分，和(3)荧光部分，其有效条件是允许所述残基被蛋白激酶磷酸化，从而增大荧光部分所产生的荧光信号；并且

检测荧光信号，其中与对照反应或标准曲线相比荧光信号增大或减小指示所述候选化合物调节所述蛋白激酶的活性。

51.权利要求50的方法，其中所述候选化合物是所述蛋白激酶磷酸化活性的已知调节剂，并且所述方法被用来评价所述化合物对所述蛋白激酶磷酸化活性的影响。

52.权利要求50的方法，所述方法被实施来鉴定所述蛋白激酶磷酸化活性的抑制剂，其中与对照反应或标准曲线相比荧光信号的减小指示所述候选化合物抑制所述蛋白激酶的磷酸化活性。

53.权利要求50的方法，所述方法还包含确定所述抑制剂化合物的Ki。

54.权利要求50的方法，其中所述候选化合物是所述蛋白激酶磷酸化活性的已知调节剂，并且所述方法被用来确定所述化合物的Ki。

55.权利要求50的方法，其中所述组合物还包含淬灭化合物，所述淬灭化合物包含能够将所述淬灭化合物整合入微团的疏水部分，和能够淬灭所述蛋白激酶底物的荧光部分的荧光的淬灭部分。

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