CN111100857B - 一种包埋量子点和酶的海藻酸钠凝胶微球及其制备方法和在生化检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种包埋量子点和酶的海藻酸钠凝胶微球及其制备方法和在生化检测中的应用。该方法直接将量子点和酶加入海藻酸钠黏稠溶液中，均匀混合，随后滴入Ba2+溶液中，静置交联得到凝胶微球。基于海藻酸钠凝胶微球内酶促反应及量子点的荧光猝灭特性，可以在紫外光激发下，实现生物样本中生物分子的裸眼可视化检测，从而实现相应疾病的早期筛查。得到的凝胶微球具有荧光稳定时间长和抗蛋白干扰能力强的特点。此外，本发明提出的分析方法操作简便，快速可控；在生化检测中展现出良好的应用前景。本发明在对某些生理参数裸眼可视化检测及对应疾病早期筛查方面展现出一定的普适性。

Description

一种包埋量子点和酶的海藻酸钠凝胶微球及其制备方法和在 生化检测中的应用
技术领域
本发明属于生物医学材料的制备技术领域，涉及一种包埋量子点和酶的海藻酸钠凝胶微球及其制备方法和在生化检测中的应用。
背景技术
海藻酸钠(C6H7O6Na)n主要是由不同数目的β-D-甘露糖醛酸(M单元)与α-L-古洛糖醛酸(G单元)依靠β-1,4-糖苷键连接组成的共聚物。当Ca2+、Ba2+、Zn2+等阳离子存在时，G单元上的Na+与二价阳离子发生离子交换反应，G单元堆积形成交联网络结构，从而形成海藻酸钠水凝胶。由于该过程条件温和，故可避免酶失活(高春梅等，化学进展，2013,25(06):1012-1022)。海藻酸钠具有良好的可修饰性，进行生物分子功能化后，可作为良好的载体，用于生物分子的分离富集。例如：Xie等人通过在海藻酸钠水凝胶表面修饰循环肿瘤细胞的抗体，从而实现了该细胞的捕获和释放(Min Xie et al,Anal.Chem.2014,86,4618-4626)。Lin等人利用海藻酸钠水凝胶修饰凝血酶的适配体，实现了凝血酶的分离富集和高灵敏分析(Yanna Lin et al,Talanta,2020,207,120300)。Ru等人制备了一种海藻酸钠/聚乙烯亚胺微球，结合结肠癌病变组织中的Cu2+，从而杀灭肿瘤细胞(Xu Ru et al,Materials(Basel,Switzerland),2019,12(9).)。可见，海藻酸钠水凝胶在化学、生物学、医学等领域可作为良好的载体。
量子点作为一种新型的荧光纳米材料，由于其具有优异的光学和化学性能，如斯托克斯位移大、吸收范围宽、发射光谱可调、抗光漂能力强、量子产率高、生物相容性好等受到了诸多关注(I.L.Medintz et al,Nat.Mater.2005,4,435)。Ma等人设计了一种量子点信标，对HIV病毒的单个RNA进行了标记和成像(Yingxin Ma et al,J.Am.Chem.Soc.2019,141,13454-13458)。Petryayeva等人制备了三种不同发射波长的量子点探针，基于荧光共振能量转移(FRET)原理，实现了三种蛋白质的同时检测(Eleonora Petryayeva et al,Anal.Chem.2014,86,3195-3202)。Mao等人设计了一种Rox-DNA功能化的双色量子点探针，成功应用于血清中葡萄糖(Guobin Mao et al,Anal.Chem.2017,89,11628-11635)和鱼精蛋白、胰蛋白酶等的高灵敏可视化检测(Guobin Mao et al,Sensors&Actuators:B.Chemical 283(2019)755–760)。
近年来，随着智能手机的发展和手机应用APP的开发，量子点与手机检测相结合，成功应用于裸眼可视化检测和现场快速检测(Shuang Li et al,Sensors&Actuators:B.Chemical 297(2019)126811)。但是，量子点在对复杂样本进行分析检测时，复杂样本基质对检测结果影响严重，极大地限制了量子点在检测方面的发展。因此，构建一种能够使量子点应用于复杂基质检测的方法就显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种包埋量子点和酶的海藻酸钠凝胶微球及其制备方法和在生化检测中的应用，用于解决量子点难以用于复杂生物样本分析的现状。该方法直接将量子点和酶加入海藻酸钠黏稠溶液中，均匀混合，随后滴入Ba2+溶液中，静置交联得到凝胶微球。得到的凝胶微球具有荧光稳定时间长和抗蛋白干扰能力强的特点。此外，本发明提出的分析方法操作简便，快速可控；在生化检测中展现出良好的应用前景。本发明在对某些生理参数裸眼可视化检测及对应疾病早期筛查方面展现出一定的普适性。
为实现上述目的本发明采用如下技术方案：
第一方面，提供一种包埋量子点和酶的海藻酸钠凝胶微球的制备方法，包括如下步骤：
1)制备量子点和酶的海藻酸钠黏稠溶液：将海藻酸钠和超纯水置于圆底烧瓶中搅拌10-20min，得到均匀的海藻酸钠黏稠溶液，在搅拌条件下，缓慢滴入量子点和酶的混合溶液，使其均匀分散，得到量子点和酶的海藻酸钠黏稠溶液；
2)制备包埋量子点和酶的海藻酸钠凝胶微球：将步骤1)制得的量子点和酶的海藻酸钠黏稠溶液缓慢滴入Ba2+溶液中，静置交联一段时间，得到包埋量子点和酶的海藻酸钠凝胶微球，过滤除去滤液，将凝胶微球置于4℃冰箱密封保存；
所包埋的量子点为水溶性量子点，所包埋的酶为酶促反应产物能使量子点猝灭的小分子；制备过程的温度控制在不影响酶活性的范围内。
优选地，上述制备方法中，所述步骤1)的缓慢滴入是指用滴管以3s/d的速度缓慢滴入量子点和酶的混合溶液；所述步骤2)的缓慢滴入是指将步骤1)制得的量子点和酶的海藻酸钠黏稠溶液用移液枪以60μL每滴的容量滴入Ba2+溶液中。
优选地，上述制备方法中，所述的酶为尿酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脱氢酶、胰蛋白激酶、丙氨酸转移酶和酪氨酸酶中的任一种，所述的小分子为过氧化氢、过氧化物、酪氨酸、ATP、NAD+、NADP+、NADH中的任一种。
优选地，上述制备方法中，步骤1)的海藻酸钠黏稠溶液中海藻酸钠质量百分比为0.5—5.0％；步骤2)Ba2+溶液的浓度为0.080—0.100mol/L，交联时间为30-240min。
第二方面，提供上述制备方法制得的包埋量子点和酶的海藻酸钠凝胶微球。
第三方面，提供上述包埋量子点和酶的海藻酸钠凝胶微球在制备生化检测试剂中的应用。
优选的，上述应用中，所述的生化检测为人的生理参数的裸眼可视化检测，具体为将三粒凝胶微球分别加入100μL超纯水、标准溶液(生理参数参考值上限所对应的浓度)、未经处理或者仅稀释过的待测生物样本中，分别编号1、2和3，反应一段时间后，对比三粒凝胶微球的荧光强度，若3号凝胶微球荧光强度与1号凝胶微球无明显区别，则说明待测生物样本所对应的生理参数偏低；若3号凝胶微球荧光强度处于1号凝胶微球与2号凝胶微球之间，则说明待测生物样本所对应的生理参数正常；若3号凝胶微球荧光强度与2号凝胶微球无明显区别，或者3号凝胶微球荧光强度低于2号凝胶微球，则说明待测生物样本所对应的生理参数偏高。
优选地，上述应用中，所述的生化检测为人的生理参数定量测定，具体为：
a.绘制标准工作曲线：将已制备好的凝胶微球分别加入100μL不同浓度的待测标准物反应一段时间，随后在紫外光照射下，利用智能手机进行照片采集，并采用电脑软件ImageJ分析照片，读取凝胶微球灰度值；以标准物的浓度为横坐标、以反应前后凝胶微球灰度值的比值为纵坐标，绘制标准工作曲线，标准工作曲线的线性范围应与生理参数参考值范围一致或成比例变化；
b.待测物生物样本定量分析：将已制备好的凝胶微球加入100μL待测生物样本反应一段时间，如步骤a的方式获得凝胶微球反应前后灰度值的比值，代入标准工作曲线，即可定量得出待测生物样本所对应的生理参数值；
或者，a步骤为标准加入法，对比分析法。
优选地，上述应用中，所述的生物样本为血清、尿液、唾液、汗液、组织液中的任一种。
优选地，上述应用中，所述的生理参数为尿酸值、葡萄糖值、乳酸值、丙酮酸值、3-羟基丁酸值中的任一种。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：
1、通常情况下，量子点和酶的水溶液长时间放置不稳定。新鲜配置的酶溶液随着保存时间的推移，酶活性逐渐下降，甚至失活。同样，量子点水溶液放置一段时间后，荧光强度也会下降。采用海藻酸钠水凝胶包埋量子点和酶后，发现减缓了量子点的猝灭和酶的失活，这为量子点和酶的保存提供了新的思路。
2、量子点溶液用于检测时，常有便携性差，不易保存和使用等缺点。所以对量子点进行附载使其方便实用就显得尤为重要。量子点附载手段，如纸芯片，我们研究发现，附载在纸芯片上的量子点会在60min内逐渐猝灭。利用海藻酸钠水凝胶包埋量子点后，其在一个月内有强且稳定的荧光。此外，该凝胶微球便于保存与携带，使用简单方便。
3、我们研究发现，海藻酸钠凝胶微球具有良好的抗蛋白干扰能力，这主要与凝胶微球的网络结构有关。选用高浓度的Ba2+对海藻酸钠溶液进行交联，可得到网络结构紧密的海藻酸钠凝胶微球，其阻碍蛋白质和酶等生物大分子进出，而生物小分子可进入微球内部与量子点反应。基于此，复杂生物样本无需处理，即可直接进行裸眼可视化检测，简化了操作步骤，极大地改善了量子点用于复杂生物样本分析的能力。
4、在实验过程中，通过改变凝胶微球内量子点的用量，可实现对微球荧光强度的控制，通过改变酶的用量，可调控微球检测时间。基于此，我们优化了酶和量子点的用量，将检测的响应时间缩短为10min。在优化数据过程中，我们发现，控制量子点和酶的投料比相同时，量子点溶液均相反应对尿酸检测的最佳响应时间为20min，而包埋量子点和酶的海藻酸钠凝胶微球对尿酸检测的最佳响应时间为10min。可见，凝胶微球能加快反应速率。
5、此方法具有强的普适性和可调控性，通过改变凝胶微球内部包埋的量子点和酶，可调控检测灵敏度、检出限和线性范围。由于凝胶微球量子点与小分子的反应场所为凝胶微球内部，故多粒微球在进行同时检测时相互之间无干扰。我们通过简单的设计，即可实现复杂生物样本中多个生理参数的同时检测。
6、此方法使用裸眼或智能手机对检测结果进行分析，无需使用大型仪器和医疗设备。也就是说，随时随地通过对尿液、唾液、汗液等生物样本进行检测，即可简单方便地监控生理参数，对疾病进行早期筛查。
附图说明
图1为包埋CdZnTeS量子点和尿酸氧化酶的海藻酸钠凝胶微球制备方法图及其对尿酸检测的原理图。如图1A所示合成水溶性CdZnTeS量子点，如图1B所示制备包埋了CdZnTeS量子点和尿酸氧化酶的海藻酸钠凝胶微球，并应用于尿酸检测。当尿酸分子进入微球后，会与尿酸氧化酶发生酶促反应，产生过氧化氢，所生成的过氧化氢猝灭CdZnTeS量子点的荧光，具体猝灭机理如图1C所示。其它酶及对应底物的检测原理同上。
图2为实施例1所制备的凝胶微球交联离子优化图。
图3为实施例1所制备的凝胶微球Ba2+浓度优化图。
图4为实施例1所制备的凝胶微球交联时间优化图。
图5为实施例2所制备的凝胶微球形貌图。
图6为实施例2所制备的凝胶微球扫描电子显微镜(SEM)图。
图7为实施例2所制备的凝胶微球检测不同浓度过氧化氢溶液的可视化效果图。
图8为实施例3所制备的凝胶微球中CdZnTeS量子点稳定性考察图。
图9为实施例4所制备的CdZnTeS量子点和尿酸氧化酶混合溶液用于尿酸标准溶液分析的条件优化图。
图10为实施例4所制备的CdZnTeS量子点和尿酸氧化酶混合溶液用于尿酸标准溶液分析结果图。
图11为实施例5所制备的凝胶微球用于0.1-0.9mM尿酸标准溶液检测结果图。
图12为实施例5所制备的凝胶微球对血清中尿酸的检测效果图和对例6血清中抗蛋白干扰效果图。
图13为实施例7所制备的凝胶微球对尿液样品中尿酸的加标回收效果图。
图14为实施例7所制备的凝胶微球对尿样品中尿酸的检测效果图。
图15为实施例8所制备的生物样本中常见离子或小分子对CdZnTeS量子点的干扰效果图。
图16为实施例9所制备的凝胶微球对葡萄糖检测的可行性效果图。
图17为实施例9所制备的凝胶微球对0-100μM的葡萄糖标准溶液可视化检测效果图。
图18为实施例10所制备的凝胶微球对葡萄糖氧化酶的活性保存效果图。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
以下实施例所使用的CdTe量子点是按照《一种以2,3-二巯基丙磺酸钠同时作为稳定剂和硫源制备CdTe/CdS量子点的方法》(ZL201610613529.X)中的方法制得。
实施例1
一种包埋CdTe量子点的海藻酸钠凝胶微球的制备方法及其条件优化，包括如下步骤：
1)制备凝胶微球：将海藻酸钠和超纯水置于圆底烧瓶中搅拌10-20min，得到均匀的质量百分比为1％的海藻酸钠黏稠溶液；在搅拌条件下，用滴管以3s/d的速度缓慢滴入CdTe量子点溶液，使其均匀分散，得到浓度为1μmol/L CdTe量子点的海藻酸钠黏稠溶液。用移液枪将其以60μL每滴的容量滴入交联离子溶液中，静置交联一段时间后，得到形状规整、粒径均一的包埋CdTe量子点的海藻酸钠凝胶微球。过滤除去滤液后，将凝胶微球置于4℃冰箱密封保存；
2)微球交联离子选择：控制步骤2)中交联离子浓度为0.100M，交联时间为2h，改变交联离子为Ca2+、Zn2+和Ba2+得到不同的凝胶微球。对得到的三种微球进行荧光对比，并运用荧光分光光度计对滤出微球后的滤液进行荧光强度的测定。此外，分别将三种微球在水中放置两天后滤出，并对滤液荧光强度进行测定，比较微球内部CdTe量子点的外漏情况。
3)Ba2+浓度优化：控制步骤2)中交联离子为Ba2+，交联时间为2h，改变Ba2+浓度得到不同的凝胶微球。对得到的三种微球进行荧光对比，并运用荧光分光光度计对滤出微球后的滤液进行荧光强度的测定。此外，分别将三种微球在水中放置两天后滤出，并对滤液荧光强度进行测定，查看微球内部CdTe量子点的外漏情况。
4)微球交联时间优化：控制步骤2)中交联离子为Ba2+，浓度为0.100M，改变交联时间，得到不同的凝胶微球。对得到的三种微球进行荧光对比，并运用荧光分光光度计对滤出微球后的滤液进行荧光强度的测定。此外，分别将三种微球在水中放置两天后滤出，并对滤液荧光强度进行测定，查看微球内部CdTe量子点的外漏情况。
如图2A所示，在紫外灯激发下，第三组利用Ba2+交联得到的凝胶微球荧光最强。对交联滤液的荧光进行考察，结果如图2B所示，Ca2+交联后滤液有强荧光，Zn2+和Ba2+交联后滤液无明显荧光。说明Ca2+交联得到的凝胶微球网络结构疏松，不利于量子点的包埋；利用Zn2 +交联的凝胶微球和滤液都未见强荧光，表明Zn2+对量子点有猝灭作用，结果如图2C所示。图2D为三种不同离子交联得到的凝胶微球静置水中两天后滤液荧光光谱图，可见，Ca2+和Zn2+交联得到的凝胶微球在两天内外泄量子点，滤液有强荧光；而Ba2+交联得到的凝胶微球无明显量子点外漏现象，滤液无明显荧光。
考察0.01—0.100M浓度范围内，Ba2+浓度对交联效果的影响，结果如图3A和图3B所示，发现Ba2+浓度大于0.050M时滤液中无明显荧光；大于0.070M时，滤液中无荧光；将0.050—0.100M Ba2+交联得到的凝胶微球静置水中两天，对所得到滤液荧光进行考察，结果如图3C所示，发现0.080—0.100M的Ba2+交联所得的凝胶微球滤液中无明显荧光。故选择0.080—0.100M的Ba2+作为最佳条件。
图4A为紫外灯激发下观察到的不同交联时间得到的凝胶微球形貌图，可见荧光无明显区别。分别对交联后滤液的荧光和凝胶微球静置水中两天后滤液的荧光进行考察，结果如图4B和图4C所示，两份滤液中均未见明显的荧光。可见交联30—240min，对其无影响，交联好的凝胶微球网络结构紧密，量子点无外漏。
实施例2
一种包埋CdZnTeS量子点的海藻酸钠凝胶微球的制备方法及其对过氧化氢的检测，包括如下步骤：
1)制备凝胶微球：将海藻酸钠和超纯水置于圆底烧瓶中搅拌10-20min，得到均匀的质量百分比为1％的海藻酸钠黏稠溶液；在搅拌条件下，用滴管以3s/d的速度缓慢滴入CdZnTeS量子点溶液，使其均匀分散，得到浓度为1μmol/L CdZnTeS量子点的海藻酸钠黏稠溶液。用移液枪将其以60μL每滴的容量滴入0.100M的Ba2+溶液中，静置交联30min后，得到形状规整、粒径均一的包埋CdZnTeS量子点的海藻酸钠凝胶微球。过滤除去滤液后，将凝胶微球置于4℃冰箱密封保存；
2)将包埋CdZnTeS量子点的海藻酸钠凝胶微球分别加入100μL 0、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3和10-2M的过氧化氢标准溶液中，反应10min后在紫外灯照射下观察凝胶微球的猝灭情况。
图5A和图5B分别为可见光照射下和紫外灯激发下凝胶微球形貌图。可见凝胶微球形状规整，粒径均一，发射强且稳定的荧光。对其粒径进行统计，约为3.0±0.11mm。
图6A显示，凝胶微球内部为疏松的网络结构，网孔直径<100μm。与量子点溶液均相反应相比，凝胶微球用于反应时，限制了量子点与小分子的反应空间，使得两者的有效碰撞几率增加，有利于提高反应速率。图6B为凝胶微球的表面形貌，可见其为致密的网络结构。相互交叠的多层网络使得微球表面网孔直径缩小，阻碍酶及蛋白质等生物大分子进出，有利于提高抗干扰能力。
如图7所示，凝胶微球包埋CdZnTeS量子点后，对0.1mM-10mM浓度范围的过氧化氢分子显示出良好的可视化检测效果，左右图分别代表不同发射波长(绿色，红色)的量子点对不同浓度的过氧化氢的可视化效果。而大多数生理参数的参考值范围正好是0.1mM-10mM。
实施例3
一种包埋CdZnTeS量子点的海藻酸钠凝胶微球的制备方法及其对CdZnTeS量子点稳定性的影响，包括如下步骤：
1)制备凝胶微球：将海藻酸钠和超纯水置于圆底烧瓶中搅拌10-20min，得到均匀的质量百分比为1％的海藻酸钠黏稠溶液；在搅拌条件下，用滴管以3s/d的速度缓慢滴入CdZnTeS量子点溶液，使其均匀分散，得到浓度为1μmol/L CdZnTeS量子点的海藻酸钠黏稠溶液。用移液枪将其以60μL每滴的容量滴入0.100M的Ba2+溶液中，静置交联30min后，得到形状规整、粒径均一的包埋CdZnTeS量子点的海藻酸钠凝胶微球。过滤除去滤液后，将凝胶微球置于4℃冰箱密封保存；
2)在0—60min内，每间隔10min于纸芯片上滴加5μL CdZnTeS量子点(1μM)溶液，随后在紫外光激发下进行荧光强度照片采集。此外，在0—25天内，每间隔5天于紫外光激发下包埋CdZnTeS量子点(1μM)的凝胶微球进行荧光强度照片采集，并与纸芯片对比。
如图8A所示，量子点溶液滴加在纸芯片上后，在60min内荧光逐渐减弱，不利于量子点生物传感分析。与其相比，海藻酸钠凝胶微球对CdZnTeS量子点显示出良好的稳定性，25天内CdZnTeS量子点荧光无明显变化，相关效果如图8B所示。
实施例4
CdZnTeS量子点和尿酸氧化酶混合溶液用于尿酸标准溶液的分析，包括如下步骤：
1)优化尿酸氧化酶用量：分别向100μL CdZnTeS量子点(150nM)和100μL尿酸标准溶液(5mM)混合溶液中加入不同量的尿酸氧化酶，随后用pH＝8.5的Tris-HCl缓冲溶液补足1ml，反应30min后，用荧光分光光度计对荧光强度进行测定。
2)优化反应时间：向100μL CdZnTeS量子点(150nM)和100μL尿酸标准溶液溶液(5mM)中加入50μL尿酸氧化酶(5u/ml)，随后用pH＝8.5的Tris-HCl缓冲溶液补足1ml，反应不同时间后，用荧光分光光度计对荧光强度进行测定。
3)绘制尿酸标准工作曲线：分别向100μL CdZnTeS量子点(150nM)和50μL尿酸氧化酶(5u/ml)的混合溶液中加入100μL 0、1、2、3、4、5、6、7、8和9mM的尿酸标准溶液标准溶液，反应20min后，用荧光分光光度计对荧光强度进行测定，绘制标准工作曲线。
图9A和图9B为尿酸氧化酶用量优化图，可见，CdZnTeS量子点和尿酸氧化酶的最佳投料比为15nM:0.25u/ml。反应时间优化结果如图9C和图9D所示，最佳反应时间为20min。
如图10所示，尿酸在0.1-0.9mM范围内，CdZnTeS量子点的荧光强度与尿酸的浓度的对数呈线性关系。在紫外光激发下观察量子点溶液的猝灭情况，如图10B所示，可见，能实现裸眼可视化检测。
实施例5
一种包埋CdZnTeS量子点和尿酸氧化酶的海藻酸钠凝胶微球的制备方法及其对血清中尿酸的检测，包括如下步骤：
1)制备凝胶微球：将海藻酸钠和超纯水置于圆底烧瓶中搅拌10-20min，得到均匀的质量百分比为1％的海藻酸钠黏稠溶液；在搅拌条件下，用滴管以3s/d的速度缓慢滴入CdZnTeS量子点和尿酸氧化酶的混合溶液(量子点与尿酸氧化酶投料比为15nM:0.25u/ml)，使其均匀分散，得到浓度为1μmol/L CdZnTeS量子点和尿酸氧化酶的海藻酸钠黏稠溶液。用移液枪将其以60μL每滴的容量滴入0.100M的Ba2+溶液中，静置交联30min后，得到形状规整、粒径均一的包埋CdZnTeS量子点和尿酸氧化酶的海藻酸钠凝胶微球。过滤除去滤液后，将凝胶微球置于4℃冰箱密封保存；
2)裸眼可视化检测：将三粒凝胶微球分别加入100μL超纯水、尿酸标准溶液(400μM)、未经处理的血清样品(血清样品由武汉大学中南医院提供)中，分别编号1、2和3，反应10min后，对比三粒凝胶微球的荧光强度。若3号凝胶微球荧光强度与1号凝胶微球无明显区别，则说明尿酸值偏低；若3号凝胶微球荧光强度处于1号凝胶微球与2号凝胶微球之间，则说明尿酸值正常；若3号凝胶微球荧光强度与2号凝胶微球无明显区别，或者3号凝胶微球荧光强度低于2号凝胶微球，则说明尿酸值偏高；
3)生理参数定量测定：a.绘制标准工作曲线：将已制备好的凝胶微球分别加入100μL0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和0.9mM的尿酸中反应10min后，在紫外光照射下，利用智能手机进行照片采集，并采用电脑软件ImageJ分析照片，读取凝胶微球灰度值；以尿酸的浓度为横坐标、以反应前后凝胶微球灰度值的比值为纵坐标，绘制标准工作曲线；b.尿酸的定量分析：将步骤2)中的凝胶微球反应前后灰度值的比值，代入标准工作曲线，即可定量得出血清的尿酸值；
凝胶微球反应时间为10、15、20、25和30min时，可视化效果分别如图11A、B、C、D和E所示。可见，在10-30min内，凝胶微球显示出较好的可视化效果。对所得照片进行处理，可得到不同反应时间的标准工作曲线，发现反应10min时，在0.1-0.9mM范围内，凝胶微球灰度值的比值与尿酸浓度呈良好的线性关系，随着反应时间的增加，线性逐渐变差。故此，选择10min时得到的标准工作曲线进行后续生物样品分析，选择10min作为凝胶微球的最佳反应时间。可见，与量子点溶液相比，量子点凝胶微球能够缩短反应时间，这可能与空间限域作用相关。
如图12A所示，3号血清样品荧光强度与1号无明显区别，说明尿酸值偏低；4号血清样品荧光强度处于1号与2号之间，说明尿酸值正常；5号血清样品荧光强度比2号更弱，说明尿酸值偏高。经过对比发现，裸眼可视化检测所得结果与中南医院检验科测定结果一致。用本方法对其进行定量分析后所得结果如表1所示，与真实值相比，本方法所得结果存在5％-25％左右的误差，分析原因可能是尿酸分子不稳定，见光易分解，导致结果偏低。此外，3号血清样品相对误差较大的另一原因可能是由于此方法线性范围为0.1-0.9mM，对于低于0.1mM的样品定量分析结果不准确。这也是本方法的局限性。
表1
Figure BDA0002347052220000111
实施例6
一种包埋CdZnTeS量子点和尿酸氧化酶的海藻酸钠凝胶微球对血清中总蛋白质的抗干扰能力考察，包括如下步骤：
用30KD超滤管对血清样品(血清样品由武汉大学中南医院提供)进行超滤处理，得到血清滤液和血清总蛋白，转速为8000rpm，时间为10min。将例5所制备的凝胶微球分别加入100μL超纯水、尿酸标准溶液(400μM)、血清滤液、血清总蛋白中，反应10min后对比凝胶微球的荧光强度，并与未做处理的血清样品所得结果对比。
对例5所涉及的3、4和5号血清样品进行超滤处理，得到如图12B所示的血清滤液(左图)和血清总蛋白(右图)。如图12C所示，3、4和5号血清滤液与凝胶微球反应后，所得结果与图12A结果一致；3、4和5号血清总蛋白与凝胶微球反应后，荧光强度变化不明显或者仅略微降低。此实验结果说明海藻酸钠凝胶微球有强的抗蛋白干扰能力，这与凝胶微球表面的多层致密网络结构相关。
实施例7
一种包埋CdZnTeS量子点和尿酸氧化酶的海藻酸钠凝胶微球对尿液中尿酸的检测，包括如下步骤：
1)尿液样品中尿酸的检测：将例5所制备的凝胶微球分别加入100μL超纯水、尿酸标准溶液(446μM)、稀释十倍处理的尿液样品(尿液样品由武汉大学中南医院提供)、加标(1000μM)并稀释十倍的尿样中，反应10min后，在紫外光激发下对凝胶微球进行照片采集，并采用电脑软件ImageJ分析照片，读取凝胶微球反应前后灰度值的比值；代入标准工作曲线，即可定量得出加标前后尿液样品的尿酸值。
2)裸眼可视化检测：将例5所制备的凝胶微球分别加入100μL超纯水、尿酸标准溶液标准溶液(446μM)、稀释十倍处理的尿液样品(尿液样品由武汉大学中南医院提供)中，分别编号1、2和3，反应10min后，对比三粒凝胶微球的荧光强度。若3号凝胶微球荧光强度与1号凝胶微球无明显区别，则说明尿酸值偏低；若3号凝胶微球荧光强度处于1号凝胶微球与2号凝胶微球之间，则说明尿酸值正常；若3号凝胶微球荧光强度与2号凝胶微球无明显区别，或者3号凝胶微球荧光强度低于2号凝胶微球，则说明尿酸值偏高；
3)生理参数定量测定：将步骤2)中的凝胶微球反应前后灰度值的比值，代入标准工作曲线，即可定量得出尿液的尿酸值；
如图13所示，从第三粒凝胶微球起，后一粒加标尿样中微球荧光明显比前一粒样品微球荧光更弱。用本方法进行数据处理后，所得结果如表2所示，五个不同尿样加标回收率在90％—110％范围内，说明该方法对稀释十倍的尿样品中尿酸的定量测定准确度较高，具有良好的应用前景。
表2
Figure BDA0002347052220000121
Figure BDA0002347052220000131
如图14所示，3号尿样品荧光强度处于1号与2号之间，说明尿酸值正常；4号尿样品荧光强度与1号无明显区别，说明尿酸值偏低；5号尿样品荧光强度比2号更弱，说明尿酸值偏高。经对比发现，裸眼可视化检测所得结果与中南医院检验科测定结果一致。对其进行定量分析后所得结果如表3所示，值得关注的是，与真实值相比，尿酸值高者显示出较小的误差。此外，运用本方法对22组尿液样品(尿液样品由武汉大学中南医院提供)进行了裸眼可视化检测，并用“-”号表示尿酸低值、“*”号表示尿酸正常值、“+”号表示尿酸高值、“1”号表示监测值与真实值相吻合、“0”号表示监测值与真实值不符，对结果进行统计，如表4所示，22组尿液样品中仅有2组可视化检测结果与中南医院检验科给出结果相悖，准确率高达91％。可见，本方法可用于快速筛选高尿酸患者和低尿酸患者，实现尿酸相关疾病的早期筛查。
表3
Figure BDA0002347052220000132
表4
Figure BDA0002347052220000133
实施例8
生物样本中常见离子或小分子对CdZnTeS量子点的干扰考察，包括如下步骤：
分别向100μLCdZnTeS量子点(150nM)和50μL尿酸氧化酶(5u/ml)的混合溶液中加入100μL浓度为0.1M的K+、Ca2+、Na+、Mg2+、抗坏血酸、葡萄糖、脲、硫脲、L-谷氨酸、甘氨酸，随后用pH＝8.5的Tris-HCl缓冲溶液补足1ml，作为实验组。再向100μL CdZnTeS量子点(150nM)和50μL尿酸氧化酶(5u/ml)的混合溶液中加入100μL尿酸(0.01M)，并用pH＝8.5的Tris-HCl缓冲溶液补足1ml，作为对照组。反应20min后，用荧光分光光度计对荧光强度进行测定并对比。
如图15所示，在尿酸氧化酶存在时，对照组中尿酸对CdZnTeS量子点的荧光有良好的猝灭效果。而与其相比，实验组中十倍尿酸浓度的离子和小分子如：K+、Ca2+、Na+、Mg2+、抗坏血酸、葡萄糖、脲、硫脲、L-谷氨酸、甘氨酸对CdZnTeS量子点的荧光无明显影响。
实施例9
一种包埋CdZnTeS-GOx复合物的海藻酸钠凝胶微球的制备方法及其对葡萄糖的检测，包括如下步骤：
其中CdZnTeS-GOx复合物按照申请人2019年6月10日提交的《一种基于点击化学的DNA功能化量子点的制备方法及其在生物标记与检测中的应用》(申请号：201910495182.7)的专利申请的公开文本说明书实施例2的方法制得。
1)制备凝胶微球：将海藻酸钠和超纯水置于圆底烧瓶中搅拌10-20min，得到均匀的质量百分比为1％的海藻酸钠黏稠溶液；在搅拌条件下，用滴管以3s/d的速度缓慢滴入CdZnTeS-GOx溶液，使其均匀分散，得到浓度为1μmol/L CdZnTeS-GOx的海藻酸钠黏稠溶液。用移液枪将其以60μL每滴的容量滴入0.100M的Ba2+溶液中，静置交联30min后，得到形状规整、粒径均一的包埋CdZnTeS-Gox复合物的海藻酸钠凝胶微球。过滤除去滤液后，将凝胶微球置于4℃冰箱密封保存；
2)裸眼可视化检测：将凝胶微球分别加入100μL 0、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100μM葡萄糖溶液中，反应10-20min后，在紫外灯照射下观察凝胶微球的猝灭情况。
如图16A和图16B所示，CdZnTeS-GOx溶液和包埋CdZnTeS-GOx的海藻酸钠凝胶微球中加入过氧化氢溶液和葡萄糖溶液均产生裸眼可见的荧光猝灭现象。
如图17所示，凝胶微球与50-100μM的葡萄糖标准溶液反应后，在紫外灯照射下有良好的裸眼可视化效果。这为唾液葡萄糖(唾液葡萄糖的正常值为20-63μM)的可视化检测及糖尿病的早期筛查提供了可能。
实施例10
一种包埋CdZnTeS量子点和葡萄糖氧化酶的海藻酸钠凝胶微球的制备方法及其酶活性变化研究，包括如下步骤：
1)制备凝胶微球：将海藻酸钠和超纯水置于圆底烧瓶中搅拌10-20min，得到均匀的质量百分比为1％的海藻酸钠黏稠溶液；在搅拌条件下，用滴管以3s/d的速度缓慢滴入CdZnTeS量子点和葡萄糖氧化酶的混合溶液(量子点与葡萄糖氧化酶投料比为15nM:1u/ml)，使其均匀分散，得到浓度为1μmol/L的CdZnTeS量子点和葡萄糖氧化酶的海藻酸钠黏稠溶液。用移液枪将其以60μL每滴的容量滴入0.100M的Ba2+溶液中，静置交联30min后，得到形状规整、粒径均一的包埋CdZnTeS量子点和葡萄糖氧化酶的海藻酸钠凝胶微球。过滤除去滤液后，将凝胶微球置于4℃冰箱密封保存；
2)海藻酸钠凝胶微球对葡萄糖氧化酶保存过程中的活性变化研究：将凝胶微球分别加入100μL超纯水和0.1mM葡萄糖溶液中，反应50min后，在紫外灯照射下利用智能手机进行照片采集，并采用电脑软件ImageJ分析照片，读取凝胶微球的灰度值，用反应前后凝胶微球灰度值的变化值与反应前凝胶微球灰度值的比值表示酶的活性。0-15天内每间隔3天重复此实验，并将数据进行对比。
3)葡萄糖氧化酶溶液在保存过程中的活性变化研究：向100μL CdZnTeS量子点和葡萄糖氧化酶混合溶液(量子点与葡萄糖氧化酶投料比为150nM:10u/ml)中加入100μL葡萄糖溶液(1mM)，用pH＝7.8的Tris-HCl缓冲补足1ml，反应50min后用荧光分光光度计进行荧光强度的测定，用反应前后荧光强度的变化值与反应前荧光强度值的比值表示酶活性。0-15天内每间隔3天重复此实验，并将数据进行对比。
如图18A所示，凝胶微球包埋葡萄糖氧化酶后，在0-15天内与葡萄糖标准溶液反应显示出良好的裸眼可视化检测效果。对照片进行处理后如图18B所示，0-15天内，凝胶微球包埋的葡萄糖氧化酶活性较为稳定，无明显波动。与其相比，葡萄糖氧化酶在溶液保存时，酶活性会随着保存时间的增加而下降，相关结果如图18C所示。

Claims (10)

1.一种包埋量子点和酶的海藻酸钠凝胶微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）制备量子点和酶的海藻酸钠黏稠溶液：将海藻酸钠和超纯水置于圆底烧瓶中搅拌10-20min，得到均匀的海藻酸钠黏稠溶液，在搅拌条件下，缓慢滴入量子点和酶的混合溶液，使其均匀分散，得到量子点和酶的海藻酸钠黏稠溶液；
2）制备包埋量子点和酶的海藻酸钠凝胶微球：将步骤1）制得的量子点和酶的海藻酸钠黏稠溶液缓慢滴入Ba2+溶液中，静置交联一段时间，得到包埋量子点和酶的海藻酸钠凝胶微球，过滤除去滤液，将凝胶微球置于4℃冰箱密封保存；
所包埋的量子点为水溶性量子点，所包埋的酶发生的酶促反应的产物是能使量子点猝灭的小分子；制备过程的温度控制在不影响酶活性的范围内。
2.根据权利要求1所述的包埋量子点和酶的海藻酸钠凝胶微球的制备方法，其特征在于，所述步骤1）的缓慢滴入是指用滴管以3s/d的速度缓慢滴入量子点和酶的混合溶液；所述步骤2）的缓慢滴入是指将步骤1）制得的量子点和酶的海藻酸钠黏稠溶液用移液枪以60μL每滴的容量滴入Ba2+溶液中。
3.根据权利要求1所述的包埋量子点和酶的海藻酸钠凝胶微球的制备方法，其特征在于，所述步骤1）的海藻酸钠黏稠溶液中海藻酸钠质量百分比为0.5—5.0%；步骤2）Ba2+溶液的浓度为0.080—0.100mol/L，交联时间为30-240min。
4.根据权利要求1-3任一项所述的包埋量子点和酶的海藻酸钠凝胶微球的制备方法，其特征在于，所述的酶为尿酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脱氢酶、胰蛋白激酶、丙氨酸转移酶和酪氨酸酶中的任一种；相应地，所述的小分子为过氧化氢、过氧化物、酪氨酸、ATP、NAD+、NADP+、NADH中的任一种。
5.权利要求1-3任一项所述的包埋量子点和酶的海藻酸钠凝胶微球的制备方法制得的包埋量子点和酶的海藻酸钠凝胶微球。
6.权利要求5所述的包埋量子点和酶的海藻酸钠凝胶微球在制备生化检测试剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的生化检测为人的生理参数的裸眼可视化检测，具体为将三粒凝胶微球分别加入100μL超纯水、标准溶液、未经处理或者仅稀释过的待测生物样本中，所述标准溶液的浓度为生理参数参考值上限所对应的浓度，分别编号1、2和3，反应一段时间后，对比三粒凝胶微球的荧光强度，若3号凝胶微球荧光强度与1号凝胶微球无明显区别，则说明待测生物样本所对应的生理参数偏低；若3号凝胶微球荧光强度处于1号凝胶微球与2号凝胶微球之间，则说明待测生物样本所对应的生理参数正常；若3号凝胶微球荧光强度与2号凝胶微球无明显区别，或者3号凝胶微球荧光强度低于2号凝胶微球，则说明待测生物样本所对应的生理参数偏高。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的生化检测为人的生理参数定量测定，具体为：
a. 绘制标准工作曲线：将已制备好的凝胶微球分别加入100μL不同浓度的待测标准物反应一段时间，随后在紫外光照射下，利用智能手机进行照片采集，并采用电脑软件ImageJ分析照片，读取凝胶微球灰度值；以标准物的浓度为横坐标、以反应前后凝胶微球灰度值的比值为纵坐标，绘制标准工作曲线，标准工作曲线的线性范围应与生理参数参考值范围一致或成比例变化；
b. 待测物生物样本定量分析：将已制备好的凝胶微球加入100μL待测生物样本反应一段时间，如步骤a的方式获得凝胶微球反应前后灰度值的比值，代入标准工作曲线，即可定量得出待测生物样本所对应的生理参数值；
或者，a步骤为标准加入法或对比分析法。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述的生物样本为血清、尿液、唾液、汗液、组织液中的任一种。
10.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述的生理参数为尿酸值、葡萄糖值、乳酸值、丙酮酸值、3-羟基丁酸值中的任一种。
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