CN103396420A - 一种试剂及其在检测二价锌离子中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测二价锌离子的试剂，它是荧光素衍生物：吡哆醛荧光素酰腙Pyridoxal fluorescein hydrazone。吡哆醛荧光素酰腙由荧光素酰肼和盐酸吡哆醛在含有乙酸的乙醇中回流2小时制得，原料便宜，反应条件简单，易于生产。本发明提供了二价锌离子的定量检测方法，是基于吡哆醛荧光素酰腙，在pH为7.0的HEPES溶液中定量地检测二价锌离子的含量。该检测方法，对二价锌离子显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。

Description

一种试剂及其在检测二价锌离子中的应用

技术领域

本发明涉及光学探针，具体涉及一种试剂及其合成方法，以及这种试剂在检测二价锌离子中的应用。

背景技术

锌是人体中含量仅次于铁的重要金属元素，广泛分布于人体细胞和体液中。很多事实表明锌在细胞生物学和细胞营养过程中起着重要的作用。Zn²⁺是组成三百多种生物酶活性中心的重要金属离子之一。另外，锌在细胞生长、生存中所起到的关键作用已在生物学、生理学和病理学中得到认识，例如蛋白质结构和功能、DNA和RNA合成、基因表达和大脑新陈代谢的产生都与锌密切相关。同时锌和钙一样，在各种类型的细胞中还是一种信号离子。但是生物体中的锌大多以络合物形式存在，分子内和分子间游离的Zn²⁺的浓度很低，大部分锌离子与酶或蛋白质紧密结合，而游离的锌也存在于脑、肠、胰腺和视网膜等人体组织中。近年来人们已经了解到Zn²⁺的几种传输器的结构、功能以及它的传输形式，但Zn²⁺的吸收、传输、分配及其与蛋白质结合的控制因素还需进一步解释。而进一步了解锌的作用的关键是在一个比较宽的浓度范围内在细胞内和细胞外定量检测锌的流量和水平。由于Zn²⁺具有稳定的d¹⁰电子构型，很多常用的光谱和电化学分析方法，如紫外-可见光谱、电子顺磁共振和循环伏安法等均不适用于锌离子的测定。荧光分子探针检测法不仅简便，而且灵敏度、选择性、时间分辨、实时原位检测方面均有突出优点。因此，应用荧光探针体系在比较宽的范围内定量检测和反映Zn²⁺的流量和水平，对进一步了解Zn²⁺在生物体内的作用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种体系简单、操作方便、选择性高、灵敏度高、水溶性好的定量检测二价锌离子的试剂，以及该试剂用于检测二价锌离子的方法。

本发明提供的一种试剂：它是吡哆醛荧光素酰腙Pyridoxal fluorescein hydrazone（PFH），结构式为：

试剂的合成路线：

试剂的合成方法，步骤为：将荧光素酰肼、吡哆醛按摩尔比1︰2混合，完全溶解在乙醇中，用滴加1摩尔量当量的无水乙酸，回流2小时，用体积比为1︰1的甲醇和石油醚重结晶得到浅黄色的吡哆醛荧光素酰腙。

本发明提供的一种检测二价锌离子的方法，包括如下步骤：

（1）、配制pH=7.0、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，配制2mM的吡哆醛荧光素酰腙乙醇溶液；

（2）、按体积比250︰1将HEPES缓冲溶液和吡哆醛荧光素酰腙乙醇溶液加到干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，526nm的荧光强度逐渐增强；

（3）、把2mL的HEPES缓冲溶液、8μL的吡哆醛荧光素酰腙乙醇溶液加到另一个荧光比色皿中，分别在加入Zn²⁺溶液的体积为20、40、60、80、100、120、140、160、180、200μL时，在荧光分光光度仪上测定526nm对应的荧光强度F为134、174、224、259、309、349、389、429、489、509，以Zn²⁺浓度为横坐标，以相对荧光强度F-F₀为纵坐标绘制图，F₀﹦99，得到Zn²⁺浓度的工作曲线；线性回归方程为：F-F₀=-13.3+2.32c，c的单位为10^-6mol/L；

（4）、测定样品溶液时，将测得的荧光强度代入线性回归方程，即可求得Zn²⁺的浓度c。

经实验证明，其它离子不干扰体系对二价锌离子的测定。

本发明的试剂可用于细胞成像。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：1、检测体系成本低廉，试剂由荧光素酰肼和吡哆醛，回流一步制得，原料便宜，反应条件简单，易于生产；2、本发明的检测方法，对二价锌离子显示了高的灵敏性和选择性；3、检测过程简便、快速，检测结果准确；4、检测手段简单，只需要借助荧光分光光度仪。

附图说明：

图1实施例2检测二价锌离子的荧光发射图。

图2实施例3吡哆醛荧光素酰腙和各种阳离子作用的荧光柱状图。

图3实施例4工作曲线。

图4实施例5检测样品的荧光发射图。

图5实施例6细胞成像图。

具体实施方式：

实施例1

吡哆醛荧光素酰腙的合成：将荧光素酰肼1mmoL、吡哆醛2mmoL，溶解在20mL的乙醇中，滴加1mmoL无水乙酸，回流2小时，用1︰1的甲醇和石油醚重结晶得到黄色的吡哆醛荧光素酰腙，产率65%。

吡哆醛荧光素酰腙的表征:

¹H NMR(300MHz,25℃,DMSO-d₆):δ11.75(s,1H),10.11(s,2H),9.09(s,N=C-H,1H),8.05(s,1H),7.99(t,1H),7.67(m,2H),7.17(t,1H),6.71(s,2H),6.54(m,2H),6.48(m,2H),4.41(s,2H),2.61(s,3H);¹³C NMR(75MHz,DMSO-d₆):δ163.6,158.4,151.3,150.4,143.0,142.0,135.9,137.00,134.7,129.7,129.0,127.80,127.6,126.5,123.4,112.3,107.4,102.0,64.5,57.7,14.6;ESI-MS m/z496.25[PFH+H]⁺;Elemental analysis(calcd.%)for C₂₈H₂₁N₃O₆:C,67.87;H,4.27;N,8.48;Found:C,67.85;N,8.52;H,4.21.

实施例2

配制pH=7.0的HEPES（10mM）缓冲溶液，配制2mM的二价锌离子水溶液，并用乙醇配制2mM的吡哆醛荧光素酰腙溶液；把2mL的HEPES缓冲溶液和8μL的吡哆醛荧光素酰腙乙醇溶液加到干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着Zn²⁺的加入，526nm处荧光强度逐渐增强。荧光发射图见图1。

实施例3

配制pH=7.0、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，并用乙醇配制2mM的吡哆醛荧光素酰腙溶液；在27个荧光比色皿中，各加入2mL的HEPES缓冲溶液和8μL的吡哆醛荧光素酰腙乙醇溶液，再分别加入25摩尔当量的Zn²⁺，以及100摩尔当量的其他各种分析物（Hg²⁺,Ni²⁺,Cu⁺，Mn²⁺,Ru³⁺,Cd²⁺,Pb²⁺,La³⁺,Ce⁴⁺,Yb³⁺,Er³⁺,Mg²⁺,Sn²⁺,Al³⁺,Nd³⁺,K⁺,Sm³⁺,Fe²⁺,Fe³⁺,Eu³⁺,Ag⁺,Vo²⁺,Cr³⁺,Zr⁴⁺,Co²⁺,Cu²⁺，在荧光分光光度仪上检测，绘制不同分析物对应的526nm荧光强度的柱状图，得到荧光发射图（见图2），Zn²⁺使得吡哆醛荧光素酰腙的荧光强度由99变到510左右，其它的分析物基本没有引起吡哆醛荧光素酰腙荧光强度的变化。

经实验证明，其它分析物不干扰体系对Zn²⁺的测定。

实施例4

用乙醇配制2mM的吡哆醛荧光素酰腙溶液，把2mL的HEPES缓冲溶液、8μL的吡哆醛荧光素酰腙乙醇溶液加到荧光比色皿中，分别在加入Zn²⁺溶液的体积为20、40、60、80、100、120、140、160、180、200μL时，在荧光分光光度仪上测定526nm的对应的荧光强度F为134、174、224、259、309、349、389、429、489、509，以Zn²⁺浓度为横坐标，以相对荧光强度F-F₀为纵坐标绘制图，F₀﹦99，得到Zn²⁺浓度的工作曲线（见图3）；线性回归方程为：F-F₀=-13.3+2.32c，c的单位为10^-6mol/L。

实施例5检测Zn²⁺

配制pH=7.0的的HEPES（10mM）缓冲溶液，配制2mM的Zn²⁺水溶液，并用乙醇配制2mM的PFH溶液；把2mL的HEPES缓冲溶液和8μL的PFH乙醇溶液加到干净的荧光比色皿中，取Zn²⁺的溶液145μL，用微量进样器加到此比色皿中，同时在荧光光谱仪上测定526nm的对应的荧光强度F为396，相对荧光强度F﹣F₀﹦297，通过实施例4的线性回归方程，求得c=133.75×10^-6mol/L，偏差为0.92%。见图4

实施例6

用乙醇配制2mM的吡哆醛荧光素酰腙溶液；将吡哆醛荧光素酰腙乙醇溶液加入肝癌细胞培养液中，使得其浓度为8μM，在37℃下，反应30min，体系在荧光共聚焦成像仪下无显示了强的绿色荧光。图5为荧光共聚焦成像仪下原始的肝癌细胞a（无荧光发射）以及与吡哆醛荧光素酰腙和Zn²⁺作用的细胞b（绿色荧光）成像图。

Claims (3)

1.一种试剂，特征在于它是吡哆醛荧光素酰腙,其结构式为：

2.如权利要求1所述的一种试剂的合成方法，其特征在于步骤为：将荧光素酰肼和盐酸吡哆醛按摩尔比1︰2完全溶解在乙醇溶液中，滴加1摩尔当量的无水乙酸，回流2小时，用体积比为1︰1的甲醇和石油醚重结晶得到吡哆醛荧光素酰腙。

3.一种检测二价锌离子的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）、配制pH=7.0、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，配制2mM的吡哆醛荧光素酰腙乙醇溶液；

（2）、按体积比250︰1将HEPES缓冲溶液和吡哆醛荧光素酰腙乙醇溶液加到干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，526nm的荧光强度逐渐增强；

（3）、把2mL的HEPES缓冲溶液、8μL的吡哆醛荧光素酰腙乙醇溶液加到另一个荧光比色皿中，分别在加入Zn²⁺溶液的体积为20、40、60、80、100、120、140、160、180、200μL时，在荧光分光光度仪上测定526nm对应的荧光强度F为134、174、224、259、309、349、389、429、489、509，以Zn²⁺浓度为横坐标，以相对荧光强度F-F₀为纵坐标绘制图，F₀﹦99，得到Zn²⁺浓度的工作曲线；线性回归方程为：F-F₀=-13.3+2.32c，c的单位为10^-6mol/L；

(4)、测定样品溶液时，将测得的荧光强度代入线性回归方程，即可求得Zn²⁺的浓度c。

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