CN105017270A

CN105017270A - 一种荧光素-苯甲酰硫脲基双功能荧光探针及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN105017270A
Application number: CN201510211111.1A
Authority: CN
Inventors: 李剑利; 杨征; 厍梦尧; 刘萍
Original assignee: Northwest University
Current assignee: Northwest University
Priority date: 2015-04-29
Filing date: 2015-04-29
Publication date: 2015-11-04

Abstract

本发明提出了结构式(I)所示的荧光素-苯甲酰硫脲基双功能荧光探针及其制备方法与应用，该化合物在不同溶液中分别对Ag⁺和Zn²⁺表现出高选择性检测且互相不受干扰，该探针可适用pH范围较宽，水溶性好，灵敏度较高，可应用于环境和生物样品中Ag⁺和Zn²⁺的选择性检测，应用前景广阔。？？？？

Description

一种荧光素 - 苯甲酰硫脲基双功能荧光探针及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种荧光素-苯甲酰硫脲基双功能荧光探针及其制备方法与其在Ag⁺和Zn²⁺检测方面的应用。

背景技术

锌是生物体中含量第二丰富的重金属元素，是多种金属酶和转移因子的重要组成部分，广泛存在于海洋生物体和人体的许多酶中。细胞内的锌离子与许多病变过程如大脑局部缺血、胞死亡、老年痴呆症和婴幼儿腹泻等息息相关。贵金属银作为广泛应用的催化剂、燃料电池、珠宝和抗癌药物等，其残渣的累积，将会对水资源和土地造成损害并进而影响生物体的健康，阻碍环境中有益菌的生长，破坏其生殖能力，束缚其代谢产物以及使巯基酶失活等。因此，检测并追逐锌离子和银离子在生物样品中的位置和浓度变化情况具有极其重要的意义。

功能分子探针技术在表达分子间识别行为及复杂生命和环境体系的内状态信息方面具有非常优异的性能。近年来，随着荧光化学标记和分子探针技术的迅速发展，荧光功能分子探针技术以其优异的光学性能和生物相容性已被广泛应用在生物及环境体系信息检测、药物高通量筛选及荧光组织化学研究等领域，并且开创了众多交叉科学研究的新突破。

当今光敏探针技术正趋于多功能的集成，其宽广的应用前景源于新型探针分子的合成设计、结构调控与性能优化。虽然目前已报道了多种Zn²⁺和Ag⁺探针，但是却没有可同时检测这两种离子的多功能探针。

发明内容

本发明的目的在于提供一种荧光素-苯甲酰硫脲基双功能荧光探针及其制备方法，与该荧光探针在环境和生物体中的Ag⁺和Zn²⁺检测方面的应用。

本发明的实现过程如下：

结构式 (I)所示的化合物，

。

结构式 (I)所示化合物的制备方法，包含如下步骤：

（1）在乙醇溶剂中，荧光素和水合肼反应得到荧光素酰肼；

（2）在乙醇溶剂中，通过所得到的荧光素酰肼和苯甲酰异硫氰酸酯反应即可得到目标产物；

。

具体地说，其制备方法如下：

（1）在圆底烧瓶中加入0.01 mol荧光素，加入50 mL无水乙醇作为溶剂，然后在30 分钟向其中滴加5 mL 30%水合肼，加热回流反应6-8 小时，反应结束后，冷却至室温将反应物倒入水中，有固体析出，将所得固体抽滤、干燥，即得到荧光素酰肼；

（2）于圆底烧瓶中加入0.01 mol荧光素酰肼，50 mL无水乙醇，加热回流，待荧光素酰肼全部溶解后，向其中加入0.01 mol苯甲酰基异硫氰酸酯，继续回流反应12 小时，反应结束后，将反应液冷却至室温，有淡黄色固体析出，抽滤，所得固体用乙酸乙酯重结晶，即得淡黄色粉末状目标产物。

结构式 (I)所示化合物用于在环境和生物体中检测Ag⁺和Zn²⁺，其检测原理如下：在EtOH-H₂O (2:8, v/v)溶剂中，探针溶液本身无色无荧光，但向其中加入Ag⁺后，Ag⁺作为亲硫元素可以和异硫氰酸酯中的S反应生成1,3,4-噁二唑而使荧光素内酰胺基团开环并在525 nm处产生强烈的荧光发射；而在CH₃CN-H₂O (2:8, v/v)溶剂中，探针溶液本身同样为无色无荧光，当向溶液中加入Zn²⁺后，Zn²⁺可以和探针发生配位作用而使探针发生内酰胺开环反应产生荧光，其发射波长为528 nm。通过测定探针荧光发射强度变化，达到测定Ag⁺和Zn²⁺浓度的目的。

本发明的积极效果：（1）该探针在不同溶剂中对两种离子的检测均具有较高的选择性且互相不受干扰；（2）该探针对两种离子的检测均具有灵敏度高、水溶性优良、响应时间短、适用pH范围宽和检测浓度范围广等优点，特别是不受其它亲硫元素如Hg²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺等干扰，可通过荧光信号进行检测；（3）该探针的优良性能使其可用于环境和生物样品中Ag⁺和Zn²⁺的检测，显示出较强的应用前景。

附图说明

图1为该探针的单晶结构图；

图2为该探针在EtOH-H₂O (2:8, v/v)溶剂中的离子选择性荧光发射图；

图3为该探针在CH₃CN-H₂O (2:8, v/v)溶剂中的离子选择性荧光发射图；

图4为该探针在EtOH-H₂O (2:8, v/v)溶剂中的抗干扰能力荧光发射图；

图5为该探针在CH₃CN-H₂O (2:8, v/v)溶剂中的抗干扰能力荧光发射图；

图6为该探针在EtOH-H₂O (2:8, v/v)溶剂中的荧光发射滴定图；

图7为该探针在CH₃CN-H₂O (2:8, v/v)溶剂中的荧光发射滴定图；

图8为该探针在EtOH-H₂O (2:8, v/v)溶剂中荧光强度随Ag⁺浓度的变化图；

图9为该探针在CH₃CN-H₂O (2:8, v/v)溶剂中荧光强度随Zn²⁺浓度的变化图；

图10为该探针在EtOH-H₂O (2:8, v/v)溶剂中荧光发射强度随pH的变化图；

图11为该探针在CH₃CN-H₂O (2:8, v/v)溶剂中荧光发射强度随pH的变化图；

图12为该探针在EtOH-H₂O (2:8, v/v)溶剂中与Ag⁺的配位比测定图；

图13为该探针在CH₃CN-H₂O (2:8, v/v)溶剂中与Zn²⁺的配位比测定图；

图14为该探针在EtOH-H₂O (2:8, v/v)溶剂中加入Ag⁺后的时间响应图；

图15为该探针在CH₃CN-H₂O (2:8, v/v)溶剂中加入Zn²⁺后的时间响应图；

图16为该探针在CH₃CN-H₂O (2:8, v/v)溶剂中加入Zn²⁺后的可逆性检测图；

图17为该探针在活的MG-63细胞中对Ag⁺和Zn²⁺检测的细胞成像图；

图18为该探针在细胞-胞外聚合物-矿物聚集体中对Ag⁺和Zn²⁺的成像图。

具体实施方式

为了更加清楚的理解本发明，下面通过具体实施例对本发明做进一步的详细描述。

在众多的功能识别基团中，苯甲酰基硫脲基团以其和亲硫元素如Zn²⁺，Cu²⁺，Hg²⁺，Ag⁺等良好的识别和络合效应，成为设计相关离子探针不可忽略的识别团。因此，本发明应用苯甲酰基硫脲基团作为识别基团，结合性能优良的荧光素发光团，设计合成可同时应用于Zn²⁺和Ag⁺检测的多功能荧光探针。

实施例1：探针的合成

在250 ml圆底烧瓶中加入3.32 g (0.01 mol)荧光素，加入50 mL无水乙醇作为溶剂，然后在30 分钟向其中滴加5 mL 30%水合肼，加热回流反应6-8 小时。反应结束后，冷却至室温将反应物倒入水中，有固体析出，将所得固体抽滤、干燥。即得到荧光素酰肼，产量3.2 g，产率90%。

m.p.：283—284 ℃

E.A. (%): H: 4.05, C: 69.39, N: 8.08. 理论值：H: 4.07, C: 68.36, N: 8.09.

IR (KBr, υ/cm^-1)：3310.0, 1690.9, 1611.8, 1506.1, 1467.9, 1368.0, 1320.2, 1237.5, 1182.1, 1110.8, 1043.7, 994.9, 842.6, 758.3, 690.0.

¹H NMR (400 MHz, DMSO, TMS): δ: 9.82 (s, 2H), 7.78 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 7.48 (s, 2H), 6.99 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.59 (s, 2H), 6.43 (dd, J = 20.9, 8.6 Hz, 4H).

¹³C NMR (100 MHz, DMSO, TMS): δ: 165.8, 158.4, 152.6, 151.7, 132.8, 129.5, 128.3, 123.6, 122.6, 112.2, 110.1, 102.6, 64.9.

MS: 347.1011 [M+H]⁺. 理论值：346.3362。

于100ml圆底烧瓶中加入3.46 g (0.01 mol) 荧光素酰肼，50 mL无水乙醇，加热回流。待荧光素酰肼全部溶解后，向其中加入1.35 ml (0.01 mol) 苯甲酰基异硫氰酸酯，继续回流反应12 小时。反应结束后，将反应液冷却至室温，有淡黄色固体析出，抽滤出其中固体，所得固体用乙酸乙酯重结晶，即得淡黄色粉末状目标产物。产量3.06 g，产率60%。

m.p.：262—263 ℃

E.A.: H: 3.75, C: 66.03, N: 8.24. 理论值：H: 3.76, C: 66.00, N: 8.25

IR (KBr, υ/cm^-1)：3442.9, 2970.3, 2873.9, 1685.7, 1608.6, 1508.3, 1462.0, 1442.7, 1345.4, 1307.7, 1224.8, 1176.6, 1110.9, 997.2, 925.8, 850.6, 761.9, 725.3, 694.4

¹H NMR (400 MHz, DMSO, TMS): δ = 11.73 (d, J = 18.4 Hz, 2H), 9.98 (s, 2H), 7.94 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.71 – 7.59 (m, 3H), 7.47 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.17 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 6.56 (dd, J = 40.5, 18.2 Hz, 6H).

¹³C NMR (100 MHz, DMSO, TMS): δ = 182.40, 168.36, 163.12, 158.90, 152.69, 150.69, 134.11, 133.37, 131.48, 129.27, 128.85, 128.35, 124.16, 123.27, 112.32, 107.83, 102.28, 65.40, 65.00.

MS: 508.1176 [M-H]^-. 理论值：509.5326.

单晶结构(图1)：单斜晶系，P2(1)/n空间点群，晶胞参数：a = 11.068(3) Å, (11), b = 17.328(5) Å, c = 15.262(5) Å ; α = 90.00°, β = 92.205(5)°, γ = 90.00°。

实施例2：探针的离子选择性测定

以EtOH-H₂O (2:8, v/v)为溶剂准确配置探针浓度为10 μM，分别与2倍当量的各种金属离子混合后的溶液，测定其在490 nm激发波长下的荧光发射光谱，测定结果如图2所示。可以看出，该探针只对Ag⁺表现出明显的选择性响应，对其他离子均无明显响应，特别是对Hg²⁺和Zn²⁺没有表现出明显响应。

以CH₃CN-H₂O (2:8, v/v)为溶剂准确配置探针浓度为10 μM，分别与5倍当量的各种金属离子混合后的溶液，测定其在490 nm激发波长下的荧光发射光谱，测定结果如图3所示。可以看出，该探针只对Zn²⁺表现出明显的选择性响应，对其他离子包括Ag⁺在内均无明显响应。

实施例3：探针的抗干扰能力测定

以EtOH-H₂O (2:8, v/v)为溶剂准确配置探针浓度为10 μM，先与2倍当量的Ag⁺混合，再分别与2倍当量的各种干扰离子混合后的溶液，测定其在490 nm激发波长下的荧光发射光谱，测定结果如图4。其中1, blank; 2, Li⁺; 3, Na⁺; 4, K⁺; 5, Ba²⁺; 6, Ca²⁺; 7, Mg²⁺; 8, Cu²⁺; 9, Hg²⁺; 10, Ni²⁺; 11, Co²⁺; 12, Mn²⁺; 13, Pb²⁺; 14, Zn²⁺; 15, Cd²⁺; 16, Fe³⁺; 17, Cr³⁺; 18, Al³⁺; 19, Sn⁴⁺; 20, Ag⁺。可以看出，除Cu²⁺和Fe³⁺因其天然顺磁性引起的荧光淬灭外，该探针对Ag⁺的测定基本不受其他共存离子的干扰。

以CH₃CN-H₂O (2:8, v/v)为溶剂准确配置探针浓度为10 μM，先与5倍当量的Zn²⁺混合，再分别与5倍当量的各种干扰离子混合后的溶液，测定其在490 nm激发波长下的荧光发射光谱，测定结果如图5。其中1, blank; 2, Li⁺; 3, Na⁺; 4, K⁺; 5, Ba²⁺; 6, Ca²⁺; 7, Mg²⁺; 8, Cu²⁺; 9, Hg²⁺; 10, Ni²⁺; 11, Co²⁺; 12, Mn²⁺; 13, Pb²⁺; 14, Ag⁺; 15, Cd²⁺; 16, Fe³⁺; 17, Cr³⁺; 18, Al³⁺; 19, Sn⁴⁺; 20, Zn²⁺。可以看出，同样除Cu²⁺和Fe³⁺因其天然顺磁性引起的荧光淬灭外，该探针对Zn²⁺的测定也基本不受其他共存离子的干扰。

实施例4：探针的检测范围测定

以EtOH-H₂O (2:8, v/v)为溶剂准确配置探针浓度为10 μM，分别与0-2.0倍当量的Ag⁺混合后的溶液，测定其在490 nm激发波长下的荧光发射光谱，测定结果如图6所示。可以看出，该探针荧光发射强度与Ag⁺浓度的增加而逐渐增强，在1 nM-20 μM的范围内表现出明显的线性关系，检测限为1 nM (图8)。

以CH₃CN-H₂O (2:8, v/v)为溶剂准确配置探针浓度为10 μM，分别与0-5.0倍当量的Zn²⁺混合后的溶液，测定其在490 nm激发波长下的荧光发射光谱，测定结果如图7所示。可以看出，该探针荧光发射强度与Zn²⁺浓度的增加而逐渐增强，在1 μM-50 μM的范围内表现出明显的线性关系，检测限为1 μM (图9)。

实施例5：探针的适用pH范围测定

以EtOH-H₂O (2:8, v/v)为溶剂分别准确配置在不同pH值下，探针浓度为10 μM的纯探针和探针与2倍当量的Ag⁺混合的两组溶液，测定其在490 nm激发波长下的荧光发射光谱，测定结果如图10所示。可以看出，该探针适用于pH值为6-9的体系中Ag⁺的检测。

以CH₃CN-H₂O (2:8, v/v)为溶剂分别准确配置在不同pH值下，探针浓度为10 μM的纯探针和探针与5倍当量的Zn²⁺混合的两组溶液，测定其在490 nm激发波长下的荧光发射光谱，测定结果如图11所示。可以看出，该探针同样适用于pH值为6-9的体系中Zn²⁺的检测。

实施例6：探针与离子的配位比测定

以EtOH-H₂O (2:8, v/v)为溶剂准确配置探针与Ag⁺浓度之和为20 μM，[Ag⁺]/([ Ag⁺]+[探针])分别为0.1-0.9的溶液，测定其在490 nm激发波长下的荧光发射光谱，测定结果如图12所示。可以看出，该探针与Ag⁺的配位比为1:2。

以CH₃CN-H₂O (2:8, v/v)为溶剂准确配置探针与Zn²⁺浓度之和为20 μM，[Zn²⁺]/([Zn²⁺]+[探针])分别为0.1-0.9的溶液，测定其在490 nm激发波长下的荧光发射光谱，测定结果如图13所示。可以看出，该探针与Zn²⁺的配位比为1:1。

实施例7：探针响应时间测定

以EtOH-H₂O (2:8, v/v)为溶剂分别准确配置浓度为10 μM的探针和2倍当量的Ag⁺的混合溶液，测定其在490 nm激发波长下的荧光发射光谱随时间的变化情况，测定结果如图14所示。可以看出，探针对Ag⁺的响应时间在1 s内，且随着时间推移探针荧光强度并未减弱。

以CH₃CN-H₂O (2:8, v/v)为溶剂分别准确配置浓度为10 μM的探针和5倍当量的Zn²⁺的混合溶液，测定其在490 nm激发波长下的荧光发射光谱随时间的变化情况，测定结果如图15所示。可以看出，探针对Zn²⁺的响应时间也在1 s内，且随着时间推移探针荧光强度并未减弱。

实施例8：探针对Zn²⁺的可逆性测定

以CH₃CN-H₂O (2:8, v/v)为溶剂分别准确配置浓度为10 μM的探针和5倍当量的Zn²⁺的混合溶液，然后向其中加入0-2.0倍当量的EDTA溶液，测定其在490 nm激发波长下的荧光发射光谱，测定结果如图16所示。可以看出，随着EDTA的加入，探针荧光强度逐渐减弱，当EDTA加入量为Zn²⁺1倍当量时，溶液荧光完全消失，说明探针对Zn²⁺的测定具有可逆性。

实施例9：探针在人成骨肉瘤细胞(MG-63)中的荧光共聚焦成像

图17表示探针在MG-63细胞中对Ag⁺(图17，a1-d1)和Zn²⁺(图17，a2-d2)离子的荧光共聚焦成像。将MG-63细胞37 ºC的恒温培养箱中培养4 h，向培养皿中加入10 μmol/L的探针溶液培养30 min。共聚焦未呈现出明显的荧光发射(图17-a)。然后向体系中2倍浓度Ag⁺和8%乙醇或5倍浓度Zn²⁺离子溶液和8%乙腈并在37 ºC的恒温培养箱内培养30 min。细胞中出现明显的荧光发射(图17-b)，明视场图片(图17-c)表明在成像过程中细胞始终保持活性，证明该系列探针对细胞的毒性较小。上述实验结果表明，该系列探针可用于MG-63细胞中Ag⁺或Zn²⁺的检测和成像。

实施例10：探针在细菌-胞外聚合物-矿物聚集体中的荧光成像

图18表示探针在细菌-胞外聚合物-矿物聚集体中对Ag⁺(图18，a1-a6)和Zn²⁺(图18，b1-b6)离子的荧光共聚焦成像。在具有低磷酸盐含量的淡水性矿物质培养基中持续光照培育光营养的Fe(II)-氧化性细菌Rhodobacter sp. SW2菌株。然后将其与2倍浓度Ag⁺和8%乙醇或5倍浓度Zn²⁺离子溶液和8%乙腈共同培养30 min。向其中分别加入探针(10 µmol/L)、SYTO® 9绿色核酸染色剂(1:500)和多聚糖特异性识别的小麦胚芽凝集素Alexa Fluor® 633 共聚物 (1:200) 11和15。成像结果表明探针可用于水溶性的微生物-胞外聚合物-矿物聚集体中Ag⁺或Zn²⁺的检测。该结果还可证实Ag⁺或Zn²⁺可吸附到细菌细胞和云状的胞外聚合物表面，说明有机物表明为Ag⁺或Zn²⁺提供了相应的结合位点使其结合为微生物成像和微生物冶金提供良好的探索依据。

Claims

1.结构式 (I)所示的化合物，

。

2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

（1）在乙醇溶剂中，荧光素和水合肼反应得到荧光素酰肼；

（2）在乙醇溶剂中，荧光素酰肼和苯甲酰异硫氰酸酯反应得到目标产物。

3.权利要求1所述化合物在检测Ag⁺和Zn²⁺方面的应用。