CN103951673B - 一种试剂及其在硫醇检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测硫醇的试剂，它是荧光素马来酰亚胺。此试剂由荧光素胺和顺丁烯二酸酐在冰乙酸回流5小时制得，反应只需一步进行，且反应条件简单，易于生产。本发明提供了硫醇的定量检测方法，是基于荧光素马来酰亚胺，在DMSO和HEPES(pH7.0)的混合溶液中定量地检测硫醇的含量。该检测方法，对硫醇显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。

Description

一种试剂及其在硫醇检测中的应用
技术领域
本发明涉及硫醇的检测技术，具体涉及一种试剂及其合成方法，以及这种试剂在检测硫醇中的应用。
背景技术
小分子硫醇谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)在维持细胞氧化还原环境起着重要的作用，硫醇缺乏关系许多疾病，如儿童生长缓慢、肝损伤、艾滋病等等。然而，高浓度的硫醇会导致其他综合症，如心血管疾病、阿尔茨海默氏病等。因此发展定量检测硫醇的方法显得尤为重要。近年来，分子探针检测硫醇的方法尤为盛行，其中尤其是加成反应用于硫醇识别更为活跃，马来酰亚胺因为含有不饱和基团，能被硫醇的巯基进行亲核加成反应。在本发明中，我们选择荧光素为荧光团，马来酰亚胺为键合点，设计为硫醇的荧光探针，实现了硫醇的定量检测，且用于细胞成像。
发明内容
本发明的目的是提供一种选择性高、定量检测硫醇的新的试剂，以及该试剂在硫醇检测中的应用。
本发明提供的快速检测硫醇的试剂和方法，是基于一种荧光素马来酰亚胺，在pH为7.0的HEPES溶液和DMSO混合溶液中定量地检测硫醇的含量。该检测方法，对硫醇显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。
该试剂的结构式是：
该试剂的合成方法，步骤为：将荧光素胺和顺丁烯二酸酐按摩尔比1︰1完全溶解在冰乙酸中，回流5小时，停止反应；浓缩、冷却后抽滤，并用碳酸钠溶液洗涤，最后用苯重结晶得到橘黄色固体。
用该试剂检测硫醇的方法，步骤为：
(1)、配制2mM的荧光素马来酰亚胺DMSO溶液；
(2)、按体积比150:50:1，将DMSO溶液、pH7.0的HEPES水溶液、荧光素马来酰亚胺的DMSO溶液加到干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入,533nm的荧光强度逐渐增强；
(3)、配制2mM的GSH蒸馏水溶液，把1.5mL的DMSO溶液、0.5mL的pH7.0的HEPES溶液、10μL的荧光素马来酰亚胺DMSO溶液加到另一个荧光比色皿中，分别在加入GSH蒸馏水溶液的体积为75、150、225、300、375、450、525、600μL时，在荧光分光光度仪上测定533nm对应的荧光强度F为133、269、389、511、629、729、834、929，以GSH浓度为横坐标，以相对荧光强度F－F0为纵坐标绘制图，F0﹦39，得到GSH浓度的工作曲线；线性回归方程为：F－F0＝-59.5+2.05c，c的单位为μM；
(4)、将DMSO溶液1500μL、HEPES缓冲溶液500μL和荧光素马来酰亚胺溶液10uL加到干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取VμL待测样品溶液，加入到此干净的荧光比色皿中，
在荧光分光光度仪上检测，将测得的荧光强度代入步骤(3)的线性回归方程，得到浓度c，
待测样品C待测样＝(2000+V待测)μL×c×10-6/VuL,即可求得GSH的浓度。
本发明具有如下优点和效果：1、合成了一种新的荧光素马来酰亚胺；2、本发明的检测方法，对硫醇显示了高的灵敏性和选择性；3、检测过程通过硫醇和马来酰亚胺的加成反应实现；4、检测手段简单，只需要借助荧光分光光度仪即可实现。
附图说明
图1a实施例1制备得到的试剂的核磁1HNMR图谱
图1b实施例1制备得到的试剂的核磁13CNMR图谱
图1c实施例1制备得到的试剂的质谱图
图2实施例2试剂与GSH作用的荧光发射图
图3实施例3试剂与各种分析物的作用的荧光发射图
图4实施例4测定GSH的工作曲线
图5实施例5细胞成像图
具体实施方式
实施例1
0.427g5-氨基荧光素和0.098g马来酸酐在10mL冰乙酸中回流5小时，冷却并抽滤，并用20mL碳酸钠饱和溶液洗涤，最后用30mL苯重结晶得到橘黄色固体即为该试剂。
1HNMR(DMSO-d6):δ10.15(s,2H),7.99(s,1H),7.78(d,J＝8.0Hz,2H),7.42(d,J＝7.1Hz,2H),7.28(s,2H),6.65(m,J＝19.0Hz,2H),6.54(m,J＝22.1Hz,2H)(图1a).13CNMR(DMSO-d6):δ169.0,167.4,159.0,151.2,150.5,134.3,132.9,128.5,126.2,124.1,121.4,112.2,108.6,82.8(图1b).元素分析(calcd.％)forC24H13NO7:C,67.45；H,3.07；N3.28,Found:C,64.46；H,3.05；N3.26.ESI-MSm/z:[试剂-H]+，426.67(图1c).
实施例2
配制pH＝7.0、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，并用DMSO配制2mM的荧光素马来酰亚胺溶液；把0.5mL的HEPES缓冲溶液、1.5mL的DMSO溶液及10μL的荧光素马来酰亚胺DMSO溶液加到干净的荧光比色皿中，取GSH的溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在荧光分光光度仪上检测，随着GSH的加入，533nm处荧光强度逐渐增强。荧光发射图见图2。
实施例3
配制pH＝7.4、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，并用甲醇配制2mM的荧光素马来酰亚胺溶液；把0.5mL的HEPES缓冲溶液、1.5mL的DMSO溶液及10μL的荧光素马来酰亚胺DMSO溶液加到干净的荧光比色皿中，再分别加入60摩尔当量的GSH，Cys,Hcy,巯基乙醇(ME),巯基丙酸(MPA)以及600摩尔当量的各种分析物：Ala,Arg,Asn,Asp,Gln,Glu,Gly,His,IIe,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr,Val在荧光分光光度仪上检测，得到荧光发射图，(见图3)。
经实验证明，其他氨基酸不干扰体系对硫醇的测定。
实施例4
配制pH＝7.0、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，并用DMSO配制2mM的荧光素马来酰亚胺溶液，用蒸馏水配制2mM的GSH溶液；把0.5mL的HEPES缓冲溶液、1.5mL的DMSO溶液和10μL的荧光素马来酰亚胺DMSO溶液加到荧光比色皿中，分别在加入GSH溶液的体积为75、150、225、300、375、450、525、600μL时，在荧光分光光度仪上测定533nm对应的荧光强度F为133、269、389、511、629、729、834、929，以GSH浓度为横坐标，以相对荧光强度F－F0为纵坐标绘制图，F0﹦39，得到GSH浓度的工作曲线；线性回归方程为：F－F0＝-59.5+2.05c，c的单位为μM；
实施例5
用DMSO配制2mM的荧光素马来酰亚胺溶液；将荧光素马来酰亚胺DMSO溶液加入肝癌细胞培养液中，使得其浓度为10μM，与肝癌细胞HepG2在37℃下，反应30min，体系在荧光共聚焦成像仪下无荧光发射；将荧光素马来酰亚胺DMSO溶液加入肝癌细胞培养液中，使得其浓度为10μM，与肝癌细胞HepG2在37℃下，反应30min，再加入外源的GSH(500μM)，在37℃下，再反应30min，体系在荧光共聚焦成像仪下发出黄色的荧光。图5为荧光共聚焦成像仪下与荧光素马来酰亚胺反应的细胞a(无荧光发射)、c(a的明场)以及先荧光素马来酰亚胺作用再与外源的GSH作用的细胞b(黄色荧光)、d(b的明场)成像图。

Claims (1)

1.一种检测硫醇的方法：其特征在于，步骤为：
(1)、配制2mM的荧光素马来酰亚胺DMSO溶液；
(2)、按体积比150:50:1，将DMSO溶液、pH7.0的HEPES水溶液、荧光素马来酰亚胺的DMSO溶液加到干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，533nm的荧光强度逐渐增强；
(3)、配制2mM的GSH蒸馏水溶液，把1.5mL的DMSO溶液、0.5mL的pH7.0的HEPES溶液、10μL的荧光素马来酰亚胺DMSO溶液加到另一个荧光比色皿中，分别在加入GSH蒸馏水溶液的体积为75、150、225、300、375、450、525、600μL时，在荧光分光光度仪上测定533nm对应的荧光强度F为133、269、389、511、629、729、834、929，以GSH浓度为横坐标，以相对荧光强度F－F0为纵坐标绘制图，F0﹦39，得到GSH浓度的工作曲线；线性回归方程为：F－F0＝-59.5+2.05c，c的单位为μM；
(4)、将DMSO溶液1500μL、HEPES缓冲溶液500uL和荧光素马来酰亚胺溶液10uL加到干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取VμL待测样品溶液，加入到此干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，将测得的荧光强度代入步骤(3)的线性回归方程，得到浓度c，待测样品C待测样＝(2000+V待测)μL×c×10-6/VμL，即可求得GSH的浓度。
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