CN103575727B - 一种检测硫醇的试剂和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测硫醇的试剂，它是马来酰亚胺衍生物:2-（2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基）-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3（2H）-二酮。此试剂由1,8-萘二甲酸酐肼和顺丁烯二酸酐在冰乙酸回流4小时制得，原料便宜，反应条件简单，易于生产。本发明提供了硫醇的定量检测方法，是基于2-（2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基）-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3（2H）-二酮，在pH为7.4的HEPES溶液中定量地检测硫醇的含量。该检测方法，对硫醇显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。
Description
技术领域
本发明涉及硫醇检测技术，具体涉及一种试剂及其合成方法，以及这种试剂在检测硫醇中的应用。
背景技术
半胱氨酸（Cys），同型半胱氨酸（Hcy），谷胱甘肽（GSH），三种含巯基的小分子硫醇在生物体中发挥着重要的作用。半胱氨酸水平的异常可能会导致皮肤损伤和肝功能损害；同型半胱氨酸是阿尔茨海默氏症和心血管疾病的一个危险因素。谷胱甘肽（GSH），维持细胞氧化还原动态平衡、异型生物质的新陈代谢、细胞内的信号传导以及基因调节。因此，检测生物和环境样品中的生物硫醇引起了极大的关注。近年来，利用硫醇的巯基具有强的亲核性，通过Michael加成反应识别硫醇的研究尤其有其独特的优势。在本发明中，合成了一种基于马来酰亚胺的化合物，通过硫醇和化合物在Michael加成反应前后荧光强度的变化，实现硫醇的检测。
发明内容：
本发明的目的是提供一种合成简单、操作方便、选择性高、水溶性好的定量检测硫醇的试剂，以及该试剂在硫醇检测中的应用。
本发明提供的快速检测硫醇的试剂和方法，是基于一种马来酰亚胺衍生物2-（2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基）-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3（2H）-二酮(2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)-1H-benzo[de]isoquinoline-1,3(2H)-dione），在pH为7.4的HEPES溶液中定量地检测硫醇的含量。该检测方法，对硫醇显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。
该试剂的结构是：
该试剂的合成方法，步骤包括：1,8-萘二甲酸酐肼和顺丁烯二酸酐按摩尔比1︰1完全溶解在冰乙酸中，回流4小时，停止反应；浓缩、冷却后抽滤，并用碳酸钠溶液洗涤，最后用苯重结晶得到土黄色固体。
用该试剂检测硫醇的方法，步骤为：
（1）、配制pH=7.4、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，配制2mM的2-（2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基）-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3（2H）-二酮的乙腈溶液；
（2）、按体积比4000:1，将HEPES缓冲溶液和2-（2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基）-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3（2H）-二酮的乙腈溶液加到干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入,392nm的荧光强度逐渐增强；
（3）、把2mL的HEPES缓冲溶液、0.5μL的2-（2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基）-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3（2H）-二酮乙腈溶液加到另一个荧光比色皿中，分别在加入Hcy溶液的体积为0.1、0.5、1.5、3.0、5.0、10.0μL时，在荧光分光光度仪上测定392nm对应的荧光强度F为60、65、77、95、119、199，以Hcy浓度为横坐标，以相对荧光强度F－F0为纵坐标绘制图，F0﹦48，得到Hcy浓度的工作曲线；线性回归方程为：F－F0=10.86+12.01c，c的单位为μM；
（4）、将HEPES缓冲溶液2000uL和2-（2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基）-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3（2H）-二酮乙腈溶液0.5uL加到干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取V ul待测样品溶液，加入到此干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，将测得的荧光强度代入（3）的线性回归方程，得到浓度c，待测样品C待测样=2000uL×c×10-6/VuL,即可求得硫醇的浓度。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：1、检测体系成本低廉，试剂由1,8-萘二甲酸酐肼和顺丁烯二酸酐一步反应得到；2、本发明的检测方法，对硫醇显示了高的灵敏性和选择性；3、检测过程在水相中进行；4、检测手段简单，只需要借助荧光分光光度仪即可实现。
附图说明：
图1实施例1制备的试剂的核磁H谱
图2实施例1制备的试剂的核磁C谱
图3实施例1制备的试剂的质谱
图4实施例2试剂与Hcy作用的荧光发射图
图5实施例3试剂与各种氨基酸的荧光柱状图
图6实施例4测定Hcy的工作曲线
图7实施例5试剂与Cys作用的荧光发射图
图8实施例6试剂与GSH作用的荧光发射图
图9实施例7测定样品的荧光发射图
具体实施方式：
实施例1
试剂制备：0.424g，1,8-萘二甲酸酐肼和0.196g，完全溶解在10mL冰乙酸中，回流4小时，停止反应；浓缩、冷却后抽滤，并用20mL碳酸钠饱和溶液洗涤，最后用30mL苯重结晶得到土黄色固体。
试剂表征：
1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.65(d,1H),8.34(d,1H),7.82(m,1H),7.02(d,1H),（见图1）；1C NMR(CDCl3,75MHz):δ122.2,127.6,128.8,132.4,133.0,134.3,135.9,161.6,166.3（见图2）；Elemental analysis(calcd.%)for C16H8N2O4:C,65.76;H,2.76,N,9.59,Found:C,65.78;H,2.75;N,9.58.ESI-MS m/z:[试剂+Na]+，315.17（见图3）；元素分析(calcd.%)forC16H8N2O4:C,65.76;H,2.76;N,9.59;Found:C,65.70;H,2.78;N,9.63。
实施例2
配制pH=7.4、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，并用乙腈配制2mM的2-（2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基）-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3（2H）-二酮溶液；把2mL的HEPES缓冲溶液及0.5μL的2-（2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基）-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3（2H）-二酮乙腈溶液加到干净的荧光比色皿中，取Hcy的溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在荧光分光光度仪上检测，随着硫醇的加入，392nm处荧光强度逐渐增强。荧光发射图见图4。
实施例3
配制pH=7.4、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，并用乙腈配制2mM的2-（2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基）-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3（2H）-二酮溶液；在21个荧光比色皿中，各加入2mL的HEPES缓冲溶液和0.5μL的2-（2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基）-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3（2H）-二酮乙腈溶液，再分别加入20摩尔当量的Hcy，以及100摩尔当量的各种氨基酸：Hcy，Ala,Arg,Asn,Asp,Gln,Glu,Gly,His,IIe,Leu，Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr,Val在荧光分光光度仪上检测，绘制不同分析物对应的392nm相对荧光强度的柱状图，（见图5）。Hcy使得2-（2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基）-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3（2H）-二酮的荧光强度由48变到199，其它的分析物基本没有引起2-（2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基）-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3（2H）-二酮荧光强度的变化。
经实验证明，其它分析物不干扰体系对Hcy的测定。
实施例4
配制pH=7.4、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，并用乙腈配制2mM的2-（2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基）-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3（2H）-二酮溶液，用蒸馏水配制2mM的硫醇溶液；把2mL的HEPES缓冲溶液和0.5μL的2-（2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基）-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3（2H）-二酮乙腈溶液加到荧光比色皿中，分别在加入Hcy溶液的体积为0.1、0.5、1.5、3.0、5.0、10.0μL时，在荧光分光光度仪上测定392nm对应的荧光强度F为60、65、77、95、119、199，以Hcy浓度为横坐标，以相对荧光强度F－F0为纵坐标绘制图，F0﹦48，得到硫醇浓度的工作曲线（见图6）；线性回归方程为：F－F0=10.86+12.01c，c的单位为μM。
实施例5
配制pH=7.4、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，并用乙腈配制2mM的2-（2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基）-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3（2H）-二酮溶液；把2mL的HEPES缓冲溶液及0.5μL的2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)-1H-benzo[de]isoquinoline-1,3(2H)-dione乙腈溶液加到干净的荧光比色皿中，取Cys的溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在荧光分光光度仪上检测，随着硫醇的加入，392nm处荧光强度逐渐增强。荧光发射图见图7。
实施例6
配制pH=7.4、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，并用乙腈配制2mM的2-（2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基）-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3（2H）-二酮溶液；把2mL的HEPES缓冲溶液及0.5μL的2-（2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基）-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3（2H）-二酮乙腈溶液加到干净的荧光比色皿中，取GSH的溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在荧光分光光度仪上检测，随着硫醇的加入，392nm处荧光强度逐渐增强。荧光发射图见图8。
实施例7
配制pH=7.4的的HEPES（10mM）缓冲溶液，配制2mM的Hcy水溶液，并用乙腈配制2mM的2-（2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基）-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3（2H）-二酮溶液；把2mL的HEPES缓冲溶液和0.5μL的2-（2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基）-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3（2H）-二酮乙腈溶液加到干净的荧光比色皿中，取Hcy的溶液7.5μL，用微量进样器加到此比色皿中，同时在荧光光谱仪上测定392nm的对应的荧光强度F为148，相对荧光强度F﹣F0﹦100，通过实施例4的线性回归方程，求得c=7.42×10-6mol/L，偏差为0.99%。见图9。
Claims (3)
1.一种试剂：特征在于它是2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3(2H)-二酮,其结构式为：
2.如权利要求1所述的一种试剂的合成方法，其特征在于步骤为：1,8-萘二甲酸酐肼和顺丁烯二酸酐按摩尔比1:1完全溶解在冰乙酸中，回流4小时，停止反应；浓缩、冷却后抽滤，并用碳酸钠溶液洗涤，最后用苯重结晶得到土黄色固体。
3.一种检测硫醇的方法：其特征在于，步骤为：
(1)、配制pH＝7.4、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，配制2mM的2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3(2H)-二酮的乙腈溶液；
(2)、按体积比4000:1，将HEPES缓冲溶液和2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3(2H)-二酮的乙腈溶液加到干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入,392nm的荧光强度逐渐增强；
(3)、把2mL的HEPES缓冲溶液、0.5μL的2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3(2H)-二酮乙腈溶液加到另一个荧光比色皿中，分别在加入Hcy溶液的体积为0.1、0.5、1.5、3.0、5.0、10.0μL时，在荧光分光光度仪上测定392nm对应的荧光强度F为60、65、77、95、119、199，以Hcy浓度为横坐标，以相对荧光强度F－F0为纵坐标绘制图，F0﹦48，得到Hcy浓度的工作曲线；线性回归方程为：F－F0＝10.86+12.01c，c的单位为μM；
(4)、将HEPES缓冲溶液2000μL和2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-1H-苯并〔de〕异喹啉-1,3(2H)-二酮乙腈溶液0.5μL加到干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取VμL待测样品溶液，加入到此干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，将测得的荧光强度代入(3)的线性回归方程，得到浓度c，待测样品中硫醇的浓度C待测样＝2000μL×c×10-6/VμL,即可求得硫醇的浓度。
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