CN110541032A - 一种快速检测alk基因重排探针、fish试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测ALK基因重排探针、FISH试剂盒以及方法。本发明所获得的快速检测ALK基因重排探针，包括dcas9蛋白和sgRNA，dcas9蛋白由绿色或者红色荧光染料标记，sgRNA分为第一组sgRNA和第二组sgRNA，第一组sgRNA包括22条sgRNA，第一组sgRNA在ALK基因上的靶向位点序列如序列表SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.22所示，第二组sgRNA包括22条sgRNA，第二组sgRNA在ALK基因上的靶向位点序列如序列表SEQ ID NO.23‑SEQ ID NO.44所示。本发明提供的快速检测ALK基因重排FISH试剂盒采用dCas9介导的FISH技术利用CRISPR系统进行DNA快速杂交，具有检测时间短（约1小时），准确性高，特异性好、假阳性低、操作条件温和（室温和37°C，可更好地维持细胞形态和DNA结构）、操作简便灵活、成本低等优点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物医学领域，尤其涉及一种快速检测ALK基因重排探针、FISH试剂盒及方法。
背景技术
ALK 基因编码的间变性淋巴瘤激酶 (anaplasticlymphoma kinase，ALK) ，首先发现于间变性大细胞淋巴瘤中。ALK基因位于2号染色体上(位置为2p23)，长度为728kb，全长cDNA含有29个外显子,全长ALK蛋白含有1620个氨基酸，分子量为177千道尔顿(kDa)，254个氨基酸激酶结构域由1123至1376位氨基酸残基组成，在此之前是一个由氨基酸组成的短跨膜区。ALK基因发生重排后多具有生物学功能，其表达产物为嵌合酪氨酸激酶，通过Coiled Coil结构域形成多聚体，引起组成性的ALK激活，ALK信号可通过激活RAS-MEK-ERK,JAK3-STAT3和 PI3K-AKT 等下游信号通路持续地促进细胞增殖，导致肿瘤的产生和转移。
临床研究表明，针对ALK基因开发的靶向药物克唑替尼，对于 ALK 基因重排阳性的 NSCLC 患者，表现出显著的治疗活性，并可延长患者的生存期。目前，克唑替尼已获得国家食品药品监督管理总局(CFDA)的批准，在中国用于治疗间变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性的NSCLC患者。因此，与克唑替尼治疗配套的ALK基因重排检测具有明确的临床意义与检测必要性。
常用的 ALK 基因重排检测方法分为以下三种 ：荧光原位杂交 (FISH) 技术、免疫组织化学 (IHC) 和基于 PCR 的方法 ( 包括 qRT-PCR、RACE-PCR 或特异性 RT-PCR 联合测序技术 )。但上述技术尚存在一些不足，如传统荧光原位杂交FISH探针主要使用人工染色体制备，由于在人工染色体中重复序列在整个基因组中不断出现，从而导致非特异性的荧光信号，大大降低了 FISH 检测的特异性和灵敏度，同时传统FISH操作需要加热和甲酰胺处理使得双链DNA变性进行杂交，该方法需要数小时或更长时间；常规 IHC 的阳性标准判定尚未统一 ；RT-PCR 法检测 ALK融合基因虽然快速、简便易行、能同时明确 ALK 已知的融合变体的类型，但无法检测未知的融合型是其最大的不足之处。
CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR-Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是目前用于基因编辑中前沿的方法。CRISPR-Cas9 是基因组调控技术中灵活性最强的系统之一。Cas9 的核酸酶剪切活性取决于两个结构域:RuvC和HNH。这两个结构域分别负责切割 DNA链的两条链，并且这两个结构域能够单独地被人工点突变失活。当 RuvC 和HNH 同时处于失活状态时 ( D10A＆H840A; RuvC-＆HNH-)，Cas9 将不具有核酸酶活性，成为 dCas9(deadCas9) 。dCas9 虽然没有剪切 DNA 的能力，但仍然可以在gRNA 的引导下与特定的 DNA 序列结合。根据CRISPR-Cas9原理，将已标记的dcas9蛋白与sgRNA组装后进行特异性识别杂交染色体中目标检测片段，开发快速检测ALK基因重排探针及FISH试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于采用最新技术dcas9蛋白介导sgRNA作用于ALK靶基因，设计出一种快速检测ALK基因重排探针，该探针具有高特异性和高准确性。
本发明获得的快速检测ALK基因重排探针，包括dcas9蛋白和sgRNA，dcas9蛋白由绿色或者红色荧光染料标记，sgRNA分为第一组sgRNA和第二组sgRNA，第一组sgRNA包括22条sgRNA，第一组sgRNA在ALK基因上的靶向位点序列如序列表SEQ ID NO.1 -SEQ ID NO.22所示，第二组sgRNA包括22条sgRNA，第二组sgRNA在ALK基因上的靶向位点序列如序列表SEQID NO.23 -SEQ ID NO.44 所示。
进一步的，第一组sgRNA针对ALK基因10号断裂点上游设计，第二组sgRNA针对ALK基因20号断裂点下游设计。
进一步的，绿色荧光染料为HaloTag ® Alexa Fluor ® 488，红色荧光染料为Janelia Fluor ®646。
进一步的，绿色荧光染料标记的dcas9蛋白与第一组sgRNA结合后组成第一组探针；红色荧光染料标记的dcas9蛋白与第二组sgRNA结合后组成第二组探针；其中dcas9蛋白与sgRNA组装的摩尔比例为1:1-1:4。
本发明的另一目的在于提供一种快速检测ALK基因重排FISH试剂盒，该试剂盒可快速检测ALK基因重排，且特异性和准确性高。
本发明快速检测ALK基因重排FISH试剂盒包括第一组探针和第二组探针，还包括Bloking/Reacting Buffer 、复染液和对照dcas9蛋白。
本发明的另一目的在于提供一种快速检测ALK基因重排的方法。
利用上述的快速检测ALK基因重排FISH试剂盒进行检测，包括以下步骤：
（1）洗涤：PBST摇晃洗涤样品5min；
（2）Bloking/Reacting Buffer 37℃孵育样品15min；
（3）将探针加入样品中，37℃孵育15min，其中对照组仅加入dcas9蛋白，sgRNA用Bloking/Reacting Buffer代替；
（4）PBST洗涤样品，3次，每次5min；
（5）DAPI复染样品，室温，5min，洗涤，封片；
（6）在荧光显微镜下观察采集图像。
本发明的有益效果在于：
本发明dcas9蛋白介导的FISH方法具有快速、经济、操作方便等优点：
（1）传统FISH操作需要加热和甲酰胺处理使得双链DNA变性进行杂交，该方法需要数小时或更长时间。本发明dCas9蛋白介导的FISH技术利用CRISPR系统进行DNA快速杂交，本方法在优化的条件下仅需要约1小时；同时本发明sgRNA-dcas9酶探针比核酸探针准确性更高，特异性更好、假阳性低等优点。
（2）本发明dcas9蛋白介导的FISH技术操作条件温和(室温37°C)，因此可以更好地维持细胞形态和DNA结构。
（3）传统FISH每条探针均需要荧光标记，操作繁琐，成本高；而本发明dcas9蛋白介导的FISH技术操作简便，成本低：一个标记荧光染料的dCas9蛋白（标记染料可变）可以与ALK基因断裂两端设计未标记的多条sgRNA灵活组装。
附图说明
图1 ALK基因sgRNA设计示意图
图2 ALK基因重排检测
具体实施方式
为了充分了解本发明的目的、特征及功效，下面结合附图、实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的保护范围不局限于下面的实施例。
实施例 1
一、探针准备
1、 dcas9蛋白的表达和纯化
将质粒pET302-6His-dCas9-Halo（addgene，72269）转化入E. coli BL21 (DE3)，进行原核表达并纯化蛋白。其中His tag利于蛋白纯化；Halo tag用于荧光对蛋白的标记,具体操作如下：
（1）质粒转化BL21（DE3）感受态细胞，涂板后37℃倒置培养过夜；
（2）选取单克隆于5ML LB培养液37℃培养过夜；
（3） 次日1:50接种到新LB培养基扩大培养至1L，至菌体OD600为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为1 mM，16°C培养16h后离心，收集菌体；
（4）根据Takara NI his标签纯化柱protocol洗脱并收集蛋白；
（5）将洗脱蛋白透析至Buffer[50 mM Hepes (pH 7.5), 100 mM KCl, 1 mM TCEP]中，并用50,000-MWCO超滤管（Millipore）超滤后收集纯化蛋白；
（6）将已纯化蛋白加入甘油（含量20%），-80°C储存，备用。
、dcas9蛋白荧光标记
将染料（HaloTag ® Alexa Fluor ® 488和Janelia Fluor ®646，promega）按照以下步骤将1中备用dcas9蛋白进行标记：
（1）染料：蛋白样品按照如下体系混匀后室温孵育30min，随后4°C孵育过夜，体系为Lysate 20ul，Ligand(50uM) 1ul，1×50mM HEPES(pH7.5）9ul，共30ul；
（2） 50,000-MWCO超滤管（Millipore）超滤除去未结合的染料；
（3）用Buffer[50 mM Hepes (pH 7.5), 100 mM KCl, 1 mM TCEP，10%甘油]洗脱蛋白，分装，-80°C储存，备用。
、 sgRNA合成
3.1 sgRNA设计
ALK 基因位于2号染色体上（位置为2p23），ALK基因重排的断裂点常见于 19，20 号外显子，少量见于10号外显子，根据 ALK 基因的特点，利用麻省理工大学张锋教授实验室提供的在线网站（http : //crispr.mit.edu /）分析可能的 sgRNA位点（PAM 序列为NGG），分别设计两组sgRNA （图1）：针对10号断裂点上游设计22条sgRNA，即第一组sgRNA，其在ALK基因上的靶向位点序列为SEQ ID NO.1 -SEQ ID NO.22（表1）；针对20号断裂点下游设计22条sgRNA，即第二组sgRNA，其在ALK基因上的靶向位点序列为SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.44（表1）。第一组sgRNA与HaloTag ® Alexa Fluor ® 488标记的dcas9蛋白结合后组成第一组探针，第二组sgRNA与Janelia Fluor ®646标记的dcas9蛋白结合后组成第二组探针。根据CRISPR-Cas9原理，将已标记的dcas9蛋白与sgRNA组装后进行特异性识别杂交染色体中ALK目标检测片段。
表1
| SEQ ID NO. | 序列 |
| 1 | CAGTCCACCTGGTACATGCC |
| 2 | TCAGGTCCCAACTAAGTGTC |
| 3 | CAGTCCCTTGGTAGTCTACC |
| 4 | GGTAGACCACTCTGGGACTA |
| 5 | ATGGGACTGAGGGAAAGTTC |
| 6 | GGAAAGTTCTGGCATGTACC |
| 7 | GTGGTAGAACTCCAGACCTG |
| 8 | TCACTCTCCAGAGTCAGCTA |
| 9 | CTTCTGGGGGACTCACGGAA |
| 10 | AGCCTTTCCCATCTCCAGCA |
| 11 | GGTGAAGAAGAGGTTGCTTC |
| 12 | TCAGGTAAAGACACACAACC |
| 13 | TCAGGTTTCCCTACTTTCGA |
| 14 | CCTGATGCCCACTCTGTCTC |
| 15 | CAGAAAAGAGCCTCCTAGAT |
| 16 | CCACAGACCCCATTCCTAGA |
| 17 | GGACAAAGGTGAGCTGCTGA |
| 18 | GGCTGCAGGGAAGGGACAGT |
| 19 | CATGGGGGAGGGTTGGCCCA |
| 20 | GGGTGGCCCCGGGTGGACAG |
| 21 | CGCAGAGCACTTTAGAAACT |
| 22 | GAAACCATTCCAGCCTCAGC |
| 23 | TGACCATTGTCATGAGTCCC |
| 24 | AATCCTTCTTACCAGTTTTC |
| 25 | TGCATAGCAAAGCCATGTTG |
| 26 | GTCCACTAAATGTGACGCCC |
| 27 | CCCCAGCTGCCTCATTATTG |
| 28 | TCTTGTCTTCTCCTTTGCAC |
| 29 | GGGCCATGGCGCCTTTGGGG |
| 30 | CGACCCAAGCCCCCTGCAAG |
| 31 | CTCACTCTTGAGCCTGCCCT |
| 32 | AGAAGGGGAGGGTGGGGAGG |
| 33 | TCCTGTTCAGAGCACACTTC |
| 34 | GTGGCTTTACCTGATGATCA |
| 35 | CCCTCTGCCCCCAAAGAACC |
| 36 | TAACAGATCGATATCTCCAA |
| 37 | CATGTCCCCTTTTCTCCAGT |
| 38 | CTAGACACTTCTTACCAGAA |
| 39 | TGTTTCTGAAACAACCATCA |
| 40 | GTATCCCTGCTGTTATCCAC |
| 41 | CCATTTCTTAAGAAAAAGTG |
| 42 | CATATTAGAAGCACAATTAC |
| 43 | ATCCTAGGCTCCCATCAGCA |
| 44 | TGGCTGCACCTTTTGACTTG |
3.2 sgRNA序列合成
（1）通用生物合成sgRNA序列，sgRNA序列连入pUC57-simple质粒；
（2）模板制备：将带有目标序列的质粒PCR后获得模板；
操作如下：
上游引物：TAATACGACTCACTATAGG（SEQ ID NO.45）
下游引物：GCACCGACTCGGTGCC（SEQ ID NO.46）
反应体系如下：
| 质粒模板 | 1ul |
| 上游引物 | 1ul |
| 下游引物 | 1ul |
| 2xPCRmix | 25 |
| H2O | to 50ul |
每个sgRNA序列反应5管，每管50ul，共计250ul。充分混匀放置PCR进行反应，设计程序如下：95℃ 5min；95℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 30sec，共进行35个循环。
3.3 T7体外转录
操作过程中采用无RNA酶的吸头及离心管操作，并注意避免RNA酶污染。
3.3.1模板纯化
（1）将250μl扩增产物收集到1个1.5ml微量离心管。加入250μl酚氯仿异戊醇，混匀。静置3-5min；
（2）4℃ 12000rpm 离心5min；
（3）小心吸取_上层液体到新管，加入3M NaAc25μl,冰乙醇500μl。混匀，冰上放置5-10min；
（4）4℃ 12000rpm离心10min；
（5）弃上清，加入1ml 70%乙醇，震荡洗涤沉淀；
（6）4℃ 12000rpm离心5min；
（7）用移液器尽量吸净液滴，室温放置2-3min,挥发残留乙醇；
（8）加入10μl无RNA酶水，轻弹管壁溶解沉淀；
（9）定量DNA,冻存到-20℃备用。
3.3.2 体外转录试剂盒T7 Transcription Kit（Thermo Fisher，AM1322）体外转录
（1）配制体系为：5×TranscriptAid Reaction Buffer 4ul，ATP/CTP/GTP/UTP mix*8ul，Template DNA 1ug**，TranscriptAid Enzyme Mix 2ul，DEPC-treated water to20ul；共20ul；
（2）充分混匀，37℃反应4h。
3.4转录产物纯化
3.4.1去除模板DNA
操作如下：
（1）添加2 u DNaseI（RNase-free）混匀后37°C孵育15min；
（2）然后加入2µl 0.5M EDTA（ pH值8.0）混匀后65°C孵育10min终止反应。
3.4.2 RNA纯化
（1）向反应混合物中加入115 ul DEPC水，15 ul 3 M醋酸钠溶液（pH 5.2）。充分混匀；
（2）取等量苯酚(pH 4.7)/氯仿混合物（1:1体积配制），充分混匀，12000rpm离心收集上层液体，并转移到新的EP管中。再按等量氯仿以相同方法萃取两次；
（3）加入2倍体积的无水乙醇沉淀RNA。-20℃孵育30分钟，4℃,12000rpm离心10min，收集沉淀；
（4）用500 ul 70%的预冷乙醇充分震荡洗涤沉淀1min，4℃,12000rpm离心5min，尽量吸尽乙醇，打开管盖，室温放置2-3min挥发残留乙醇；
（5）加入30ul DEPC水溶解沉淀，定量；
（6）将纯化的RNA储存于-20℃或-80℃。
二、探针组装
探针组装：绿色荧光染料标记的dcas9蛋白与第一组22条sgRNA结合后组成第一组探针，红色荧光染料标记的dcas9蛋白与第二组22条sgRNA结合后组成第二组探针；其中dcas9蛋白:sgRNA摩尔比例为1：1-1:4，在Bloking/Reacting Buffer中室温孵育10min后置于冰上。
实施例2 ALK基因重排检测
对人肺癌细胞（A549）ALK基因重排进行检测，首先制备A549爬片，并按照以下步骤进行检测：
（1）洗涤：PBST摇晃洗涤样品5min；
（2）Bloking/Reacting Buffer 37℃孵育样品15min；
（3）将探针加入样品中，37℃孵育15min，其中对照组仅加入dcas9蛋白，sgRNA用Bloking/Reacting Buffer代替；
（4）PBST洗涤样品，3次，每次5min；
（5）DAPI复染样品，室温，5min，洗涤，封片；
（6）在荧光显微镜下观察采集图像（图2）。
实验结果：结果见图2，图2D中三角形所指为融合信号，箭头所指为断裂信号；而阴性对照组则没有特异性的标记点（图2d）。结果表明：本发明探针准确性高，特异性好；同时本发明快速检测ALK基因重排FISH试剂盒，可快速检测ALK基因重排，且特异性和准确性高。
序列表
<110> 重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司
<120> 一种快速检测ALK基因重排探针、FISH试剂盒及方法
<160> 46
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 29
gggccatggc gcctttgggg 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 30
cgacccaagc cccctgcaag 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 31
ctcactcttg agcctgccct 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 32
agaaggggag ggtggggagg 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 33
tcctgttcag agcacacttc 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 34
gtggctttac ctgatgatca 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 35
ccctctgccc ccaaagaacc 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 36
taacagatcg atatctccaa 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 37
catgtcccct tttctccagt 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 38
ctagacactt cttaccagaa 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 39
tgtttctgaa acaaccatca 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 40
gtatccctgc tgttatccac 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 41
ccatttctta agaaaaagtg 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 42
catattagaa gcacaattac 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 43
atcctaggct cccatcagca 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 44
tggctgcacc ttttgacttg 20
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 45
taatacgact cactatagg 19
<210> 47
<211> 16
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 47
gcaccgactc ggtgcc 16
Claims (7)
1.一种快速检测ALK基因重排探针，包括dcas9蛋白和sgRNA，所述dcas9蛋白由绿色或者红色荧光染料标记，所述sgRNA分为第一组sgRNA和第二组sgRNA，所述第一组sgRNA包括22条sgRNA，所述第一组sgRNA在ALK基因上的靶向位点序列如序列表SEQ ID NO.1 -SEQ IDNO.22 所示，所述第二组sgRNA包括22条sgRNA，所述第二组sgRNA在ALK基因上的靶向位点序列如序列表SEQ ID NO.23 -SEQ ID NO.44 所示。
2.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述第一组sgRNA针对ALK基因10号断裂点上游设计，所述第二组sgRNA针对ALK基因20号断裂点下游设计。
3.如权利要求2所述的探针，其特征在于，所述绿色荧光染料为HaloTag ® AlexaFluor ® 488，所述红色荧光染料为Janelia Fluor ®646。
4.如权利要求3所述的探针，其特征在于，所述绿色荧光染料标记的dcas9蛋白与所述第一组sgRNA结合后组成第一组探针；所述红色荧光染料标记的dcas9蛋白与所述第二组sgRNA结合后组成第二组探针；其中dcas9蛋白与sgRNA组装的摩尔比例为1:1-1:4。
5.一种快速检测ALK基因重排FISH试剂盒，其特征在于，包括权利要求4所述的第一组探针和第二组探针。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：Bloking/ReactingBuffer、复染液和对照dcas9蛋白。
7.一种快速检测ALK基因重排方法，其特征在于，利用权利要求6所述的快速检测ALK基因重排FISH试剂盒进行检测，包括以下步骤：
（1）洗涤：PBST摇晃洗涤样品5min；
（2）Bloking/Reacting Buffer 37℃孵育样品15min；
（3）将探针加入样品中，37℃孵育15min，其中对照组仅加入dcas9蛋白，sgRNA用Bloking/Reacting Buffer代替；
（4）PBST洗涤样品，3次，每次5min；
（5）DAPI复染样品，室温，5min，洗涤，封片；
（6）在荧光显微镜下观察采集图像。
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2019
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