CN104498609B - 一种遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒 - Google Patents

一种遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN104498609B
CN104498609B CN201410795807.9A CN201410795807A CN104498609B CN 104498609 B CN104498609 B CN 104498609B CN 201410795807 A CN201410795807 A CN 201410795807A CN 104498609 B CN104498609 B CN 104498609B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
primer
test kit
test
hearing impairment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410795807.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104498609A (zh
Inventor
刘晶晶
梁少明
危林耿
向筑
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
YANENG BIOTECHNOLOGY (SHENZHEN) CO Ltd
Original Assignee
YANENG BIOTECHNOLOGY (SHENZHEN) CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by YANENG BIOTECHNOLOGY (SHENZHEN) CO Ltd filed Critical YANENG BIOTECHNOLOGY (SHENZHEN) CO Ltd
Priority to CN201410795807.9A priority Critical patent/CN104498609B/zh
Publication of CN104498609A publication Critical patent/CN104498609A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104498609B publication Critical patent/CN104498609B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒。所述核酸膜条包括一基底和固定于所述基底上的特异性寡核苷酸探针，所述特异性寡核苷酸探针序列如：SEQ ID NO：1‑42。本发明的另一技术方案为提供一种遗传性耳聋基因检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述的遗传性耳聋基因检测试剂盒检测的核酸膜条、PCR反应液I和PCR反应液II。本发明有益效果在于：本发明遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒包括8对能够高效特异扩增的引物和42条能特异杂交的探针。本发明检测位点较全，做到了2管反应液1张膜条就能够同时完成21个常见的耳聋位点的检测。

Description

一种遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒。
背景技术
听觉系统中传音、感音及其听觉传导通路中的听神经和各级中枢发生病变，引起听功能障碍，产生不同程度的听力减退，统称为耳聋。耳聋是严重影响人类健康和生活质量的最常见的疾病之一，估计全世界现有7亿多人有中度以上(55dB)的听力损失。据我国2006年第二次全国残疾人抽样调查显示，听力语言残疾者达2780万人，其中单纯听力残疾2004万，占全国8296万残疾人的24.16％。在这些听力残疾者人群中0～6岁听障儿童80万，6～14岁听障儿童11万，每年新生聋儿3万(不包括迟发性聋以及药物性聋)。据统计，约60％耳聋由遗传因素导致的，其中约70％为非综合征型耳聋。非综合征型耳聋具有高度的遗传异质性，可以多种方式遗传给下一代，包括：常染色体显性遗传(DFNA)，占20％～25％；常染色体隐性遗传(DFNB)，占75％～80％；X连锁遗传(DFN)，占1％；线粒体突变母系遗传，约为1％；Y连锁遗传(相关染色体位点命名为DFNY)，目前只有王秋菊等报道过一个中国耳聋相关家系；其中，常染色体隐性遗传性耳聋，多表现为学语前耳聋；常染色体显性遗传性耳聋则多表现为学语后的进行性发展的耳聋。
遗传性耳聋可由多种基因导致。根据症状可分为非综合征型耳聋(nonsyndromichearingloss，NSHL)和综合征型耳聋(syndromic hearing loss，SHL)。至2014年10月为止共定位NSHL基因位点有145个，包括DFNA位点57个，DFNB位点80个，DFN位点5个，DFNY位点1个，修饰基因位点2个。近期在我国国内开展的大规模耳聋分子流行病学研究表明：我国非综合征性耳聋主要由以下几个基因引起，如GJB2、GJB3、SLC26A4、mtDNA 12srRNA。
耳聋的高发生率及高度的遗传异质性，要求建立切实有效的基因检测方法，有效的基因检测和预防措施对于减少耳聋的发生具有重大的作用。目前，基因诊断方法包括：聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、限制酶切指纹-单链构象多态性分析(REF-SSCP)、变性高效液相色谱分析(DHPLC)、基因芯片、直接测序(DS)等。
采用基因检测方法的耳聋检测产品有博奥生物集团的九项遗传性耳聋基因检测试剂盒(微阵列芯片法)和十五项遗传性耳聋相关基因检测试剂盒(微阵列芯片法)、济南英盛生物技术有限公司的耳聋基因GJB2235delC检测试剂盒(荧光PCR法)、智海生物工程(北京)有限公司的药物性耳聋基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)、中生北控生物科技股份有限公司的四项耳聋基因检测试剂盒(ARMS-PCR法)、山东三月三基因技术有限公司的线粒体DNA A1555G突变检测试剂盒(PCR-酶切法)，这些产品各有其优点，但是都有一定的缺点，或者不能定性，或者耗时费力、所需设备昂贵，最重要的是这些产品大部分难以同时对不同基因的多个突变位点进行检测。鉴于遗传性耳聋基因突变异质性强，涉及的基因多，位点多，以及人群携带致病基因比例高等特点，因此有必要建立一种高通量、高效率、经济的基因突变检测方法及产品，以实现临床快速检测或大规模的人群筛查。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高通量、高效率、经济的遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒。
本发明的技术方案为提供一种遗传性耳聋基因检测的核酸膜条，包括一基底和固定于所述基底上的特异性寡核苷酸探针，所述特异性寡核苷酸探针序列如：SEQ ID NO：1-42。
本发明的另一技术方案为提供一种遗传性耳聋基因检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述的遗传性耳聋基因检测试剂盒检测的核酸膜条、PCR反应液I和PCR反应液II；所述PCR反应液I包括如下4对引物：引物GJB2F：SEQ ID NO：43；引物GJB2R：SEQ ID NO：44；引物mtDNAF：SEQ ID NO：45；引物mtDNAR：SEQ ID NO：46；引物2168F：SEQ ID NO：47；引物2168R：SEQ ID NO：48；引物IVS7F：SEQ ID NO：49；引物IVS7R：SEQ ID NO：50；所述PCR反应液II包括如下4对引物：引物GJB3F：SEQ ID NO：51；引物GJB3R：SEQ ID NO：52；引物1174F：SEQ IDNO：53；引物1174R：SEQ ID NO：54；引物1975F：SEQ ID NO：55；引物1975R：SEQ ID NO：56；引物IVS15F：SEQ ID NO：57；引物IVS15R：SEQ ID NO：58。
本发明有益效果在于：本发明遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒包括8对能够高效特异扩增的引物和42条能特异杂交的探针，此引物和探针长度或位置均经过精心设计，其中，特异性寡核苷酸探针中的突变探针及其正常对照探针分别设在两条不同的链上，防止杂合子突变位点的两条探针竞争产物。在位点较多的片段，所述特异性寡核苷酸正常对照探针尽量均分在正、负链上。在GC含量高的位点，所述特异性寡核苷酸探针人为引入错配碱基，提高探针的结合的特异性。在探针跟产物结合效率不高的位点，所述特异性寡核苷酸探针设计成锁核酸探针(LNA)，提高探针的结合效率。
本发明试剂盒可以一次试验检测非综合征遗传性耳聋四个热点基因上21个位点突变，检测位点多，检测灵敏度高、特异性强和重复性好。且做到了2管反应液1张膜条就能够同时完成21个耳聋位点的检测。可以肉眼直接判读结果，仪器要求只需要一台普通的PCR仪和一台杂交仪就可满足实验检测，检测时间短、成本低、操作方便。本发明试剂盒是一种高通量、高效率、经济的基因突变检测产品，实现了临床快速检测或大规模的人群筛查，实现早发现、早干预，控制聋哑残疾的发生，具有重大的社会效益。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。
本发明最关键的构思在于：本发明遗传性耳聋基因检测的试剂盒的引物和探针长度、位置和标记方式均经过精心设计，可以一次试验检测21个位点突变，且在2管反应液1张膜条就能够完成检测。
实施例1
本发明具体实施方式如下：
1、技术基础
根据非综合征遗传性耳聋流行病调查结果来确定要检测的基因及其具体位点。根据确定的区域设计PCR引物以扩增获得GJB2、GJB3、SLC26A4和12S rRNA上的各目的DNA片段；根据所需检测的基因序列特点设计特异的杂交探针；通过PCR产物与探针杂交、信号显色和结果判读来进行耳聋基因的诊断。
1.1基因芯片设计
根据DNA芯片检测目标，从相关基因数据库中选取特异性基因序列作为探针；根据所选用的核酸序列进行探针序列及其布局设计，针对个别探针的序列特殊性，进行特殊标记或设计，使所设计的探针组合对待测基因的杂交特异性强、探针之间的关联性好、探针阵列及其空间布局的优化；其主要优点是可以同时检测非综合征遗传性耳聋四个热点基因上21个位点突变，包括GJB2上6种突变型、GJB3上2种突变型、SLC26A4上10种突变型和12SrRNA上3种突变型。简便易行，技术要求低，并且探针不受探针分子大小种类的限制，能根据使用者的要求简便地制出符合目的的芯片。
膜条上的探针排列顺序如表1所示，由斑点显现的位置即可判断结果。经由芯片阅读仪扫描读取分析结果，必要时可进行DNA序列分析，以证实结果的准确性。
根据选择的非综合征遗传性耳聋四个热点基因上21个位点突变，包括GJB2上6种突变型、GJB3上2种突变型、SLC26A4上10种突变型、和12S rRNA上3种突变型，设计探针阵列(14×3)如表1。
表1本发明试剂盒的膜条阵列
35N 176N 235N 299N IVS7-2N IVS15+5N 1174N 1226N 1229N 1238N 1975N 2027N 2162N 2168N
35M 176M 235M 299M IVS7-2M IVS15+5M 1174M 1226M 1229M 1238M 1975M 2027M 2162M 2168M
167N 230N 538N 547N 1095N 1494N 1555N 167M 230M 538M 547M 1095M 1494M 1555M
以上表1中内容具体说明：1、每一个方格代表一种探针，用以检测诊断不同的耳聋基因型。2、M代表各检测位点的突变探针，N代表各检测位点对应的正常对照探针。
表2为膜条上各位点代表的意义及其与正常对照的关系。
表2
2、具体技术实施方案
2.1、引物、探针设计及筛选
在Genebank数据库中调取GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12S rRNA基因序列，用DNAStar和Oligo6.0设计引物，PCR扩增获取目的DNA片段，同时在这些片段上设计特异性识别待检的21种突变42条探针，要求各探针Tm值相差不超过5℃，在同一温度下具有最适宜的杂交灵敏度和特异性，针对个别探针的序列特殊性，进行特殊标记或设计。引物和探针均为人工合成寡聚核苷酸，由上海英骏生物技术有限公司合成。序列合成完毕后由公司人员核对，然后根据需要稀释成所需浓度。通过大量实验筛选到8对能够高效特异扩增的引物和42条能特异杂交的探针。此引物和探针长度或位置的改变均会降低本试剂盒的灵敏度、特异性和重复性。
表3为本发明遗传性耳聋基因检测的探针序列。
表3
探针生产代号 探针名称 探针序列(5’>3’)
P1-1 35N TCCTGGGGGGTGTGAACA(SEQ ID NO：1)
P1-2 176N GGCTGCAAGAACGTGTGCTA(SEQ ID NO：2)
P1-3 235N AGCTGCAGGGCCCATA(SEQ ID NO：3)
P1-4 299N TTCTTCTCATGTCTCCGGT(SEQ ID NO：4)
P1-5 IVS7-2N TTTATTTCAGACGATAAT(SEQ ID NO：5)
P1-6 IVS15+5N CCACAGTAAGTATTTTATCC(SEQ ID NO：6)
P1-7 1174N AGAAGATGTTGCTGATCCC(SEQ ID NO：7)
P1-8 1226N ACTGCTCTTTCCCGCACG(SEQ ID NO：8)
P1-9 1229N CTCCTGGACGGCCGTGC(SEQ ID NO：9)
P1-10 1238N CGGCCGTCCAGGAGAGCA(SEQ ID NO：10)
P1-11 1975N ACAGTCAAGCACAAGGCTATG(SEQ ID NO：11)
P1-12 2027N TGAGATCACTGCGGGTG(SEQ ID NO：12)
P1-13 2162N ACATTCTTTTTGACGGTCCA(SEQ ID NO：13)
P1-14 2168N TAGCATCATGGACCGTCA(SEQ ID NO：14)
P2-1 35M GTTCACACCCCCAGGAT(SEQ ID NO：15)
P2-2 176M ATCGTAGCTGGCTGCAG(SEQ ID NO：16)
P2-3 235M GGCTATGGGTCTGCAGCT(SEQ ID NO：17)
P2-4 299M TACCGGAGACGAGAAGAAGA(SEQ ID NO：18)
P2-5 IVS7-2M TGTTTTATTTCGGACGATAATTG(SEQ ID NO：19)
P2-6 IVS15+5M GTCCACAGTAAATATTTTATCCCTAG(SEQ ID NO：20)
P2-7 1174M GGATCAGCTACATCTTCT(SEQ ID NO：21)
P2-8 1226M GTGTGGGAAAGAGCAGT(SEQ ID NO：22)
P2-9 1229M GCATGGCCGTCCAGG(SEQ ID NO：23)
P2-10 1238M TGCTCTCCCGGACGGCC(SEQ ID NO：24)
P2-11 1975M CCATAGCCTTCTGCTTGACTG(SEQ ID NO：25)
P2-12 2027M ACCCGCTGTGATCTCACT(SEQ ID NO：26)
P2-13 2162M TGGACCATCAAAAAGAATGTG(SEQ ID NO：27)
P2-14 2168M TGACGGTCCGTGATGCTA(SEQ ID NO：28)
P3-1 167N CTGGCTGCAGGGTGTTGC(SEQ ID NO：29)
P3-2 230N CACATCCGGCTATGGGC(SEQ ID NO：30)
P3-3 538N GGTAGGTCGGGCAATGT(SEQ ID NO：31)
P3-4 547N GACCTACCGAGAAGAAAATC(SEQ ID NO：32)
P3-5 1095N CCACTATGCTTAGCCCTAAACC(SEQ ID NO：33)
P3-6 1494N TTGAGGAGGGTGACGGGC(SEQ ID NO：34)
P3-7 1555N GAGGAGACAAGTCGTAAC(SEQ ID NO：35)
P3-8 167M GCAACACCCGCAGCCAG(SEQ ID NO：36)
P3-9 230M GCCTATAGCCGGATGTG(SEQ ID NO：37)
P3-10 538M CTACATTGCCTGACCTAC(SEQ ID NO：38)
P3-11 547M GATTTTCTTCTTGGTAGGTC(SEQ ID NO：39)
P3-12 1095M CCACTATGCTCAGCCCTAAAC(SEQ ID NO：40)
P3-13 1494M CGCCCGTCACTCTCCTCAAG(SEQ ID NO：41)
P3-14 1555M ATAGAGGAGGCAAGTCGTA(SEQ ID NO：42)
上述表3中所有的探针的3’端均进行氨基标记。
表4为本发明遗传性耳聋基因检测的引物序列。
表4
上述表4中所有的引物的5’端均进行生物素标记，方便正、负链的探针都能有效结合、显色。
2.2、本发明试剂盒的引物、探针浓度以及反应体系其他组分浓度确定
利用正交试验方法，通过大量实验对比，最终确定最优的PCR反应体系见表5PCR反应液I配方和表6PCR反应液II配方。由于本试剂盒检测位点多，若采用ARMS-PCR单管扩增各个位点则需要分21管，分管太多，操作繁琐且易出错，所需的DNA量大，所需仪器多。为了克服这些缺点，本发明试剂盒采用多重PCR进行扩增。但是多重PCR容易产生各扩增片段的相互抑制，而且部分基因GC含量高、同源性高且二级结构复杂，导致扩增不稳定，经过大量摸索实验，在反应液中添加PCR增强剂2％甘油可以改善这一情况。
表5
表6
试剂 1人份(μL)
水 13.24
10×PCR buffer(Promega) 2.5
25mM MgCl2(Promega) 2
2.5mM dN(U)TP 2
25％甘油 2
100μM GJB3F 0.04
100μM GJB3R 0.04
100μM 1174F 0.06
100μM 1174R 0.06
100μM 1975F 0.05
100μM 1975R 0.05
100μM IVS15F 0.08
100μM IVS15R 0.08
1U/μL UNG 0.3
5U/μL Taq DNA聚合酶(Promega) 0.5
总量 23
上述PCR反应液的DNA加样量为2μL，总反应体积为25μL。所述的PCR反应液I和PCR反应液II均采用了2’-脱氧-5'-三磷酸尿苷-尿嘧啶-N-糖苷酶(dUTP-UNG)防污染体系。
通过大量实验对比，最终确定探针的最优点膜浓度为5μM和杂交体系。通过大量的摸索实验，确定突变探针及其正常对照探针错开模板链设计较好。针对个别探针的序列特殊性，进行特殊标记或设计。
2.3、PCR反应条件的确定
经过大量实验对比优化，最终确定的最佳反应条件为：
退火温度和退火时间对PCR扩增效率和特异性扩增影响较大，上述条件优化结果显示退火温度偏低会有非特异性扩增信号导致假阳性结果；温度偏高扩增效率偏低，灵敏度下降。本实验通过控制退火温度和退火时间可以做到特异性好，扩增效率高，灵敏度可达3ng/μL。
PCR反应液I和II同程序扩增，减少了PCR仪的需求量。
2.4、杂交条件的确定
杂交温度对最后结果的判读影响很大，杂交温度偏低会导致PCR产物与膜条上的探针非特异结合，从而有可能误判为阳性；杂交温度偏高会导致目的产物与目的探针的结合效率下降，杂交信号强度减弱，从而有可能误判为阴性。洗膜时间和显色时间的长短对杂交结果也会有类似的影响。通过一系列优化实验，最终确定的杂交、洗膜和显色等最适条件如下：
2.4.1、杂交
取15mL塑料离心管，放入标有样品编号的膜条(应在膜条的一角用铅笔标记)，加入A液(2×SSC、0.1％SDS)8-10mL及PCR反应液I、II中所有(两管共50μL)PCR产物，拧紧管盖，再回旋一圈稍拧松。将离心管放入沸水浴中加热10分钟(确保杂交液液面完全位于沸水浴液面之下)，取出拧紧盖子，放入杂交箱44℃杂交1.5小时以上，但不超过4小时。
取50mL塑料管，加入40mL B液(0.5×SSC、0.1％SDS)于杂交箱中进行预热至44℃。
2.4.2、洗膜
取出膜条，移至装有预热B液的50mL管中，于44℃轻摇洗涤15分钟(每管40mL溶液，最多可同时洗涤4张膜)。
2.4.3、显色
按A液：POD＝2000:1配制孵育液(单做两张膜只需4μLPOD母液，配制成8mL使用液，做四张膜可用6μLPOD母液，配制成12mL使用液)，室温轻摇浸泡30分钟，弃去POD溶液。用A液室温轻摇洗两次，每次5分钟。用C液(0.1mol/L柠檬酸钠，pH5.0)室温洗膜1-2分钟，同时配制显色液(各成份比例：19mL C液，1mL TMB，2μL 30％的H2O2)。将膜条浸泡于显色液中避光显色15分钟左右即可观察结果。
3、本发明遗传性耳聋基因检测的试剂盒的特点
3.1、本发明试剂盒的PCR试剂由PCR反应液I和PCR反应液II组成，其中PCR反应液I由4对常见突变基因型引物、Taq酶等组分组成；PCR反应液II由4对非常见突变基因型引物、Taq DNA聚合酶等组成，其特征在于4对常见突变基因型引物分别为GJB2F和GJB2R，mtDNAF和mtDNAR，2168F和2168R，IVS7F和IVS7R；4对非常见突变基因型引物为GJB3F和GJB3R，1174F和1174R，1975F和1975R，IVS15F和IVS15R。为了方便正链或负链的探针都能跟扩增产物有效结合并发生显色反应，各扩增片段的正、反向引物均进行生物素标记，具体序列见表4。
3.2、本发明试剂盒采用多重PCR扩增技术克服分管太多的缺点。但是多重PCR容易产生各扩增片段的相互抑制，而且部分基因GC含量高、同源性高且二级结构复杂，导致扩增不稳定，经过大量摸索实验，本发明试剂盒在反应液中添加PCR增强剂2％甘油改善了这一情况。
3.3、低密度芯片由带负电荷的尼龙膜和点在膜上能检测耳聋42条特异性探针组成，为了防止杂合子突变位点的两条探针竞争产物，信号下降，本发明的突变探针及其正常对照探针分别设在两条不同的链上。不过，由于药物致聋的几个突变位点报道为均质性的，突变探针及其正常对照探针可设在同一条链。此外，为了保证各探针的信号强度，位点较多的片段，N探针尽量均分在正、负链上。具体序列详见表3。
3.4、部分位点由于GC含量高，错配严重，非特异明显，为了提高探针的特异性结合，部分探针人为引入错配碱基，详见表3中斜体加粗字体的碱基。
3.5、部分位点的探针跟产物结合效率不高，信号强度偏弱，设计锁核酸探针(LNA)(加下划线的碱基)解决这一问题，详见表3中加下划线的字体碱基。
3.6、本试剂盒反应液采用了2’-脱氧-5'-三磷酸尿苷-尿嘧啶-N-糖苷酶(dUTP-UNG)防污染体系来克服产物污染对扩增系统的影响。
4、使用本发明遗传性耳聋基因检测的试剂盒检测临床样本中耳聋发生情况
利用本试剂盒检测临床有耳聋症状样本120例，所有样本均采用金标准测序法进行测序验证，检测结果见表7，两种方法对比结果统计分析见表8。
表7
上述表8测序结果中阳性是指本发明试剂盒检测范围内基因型阳性，阴性是指本发明试剂盒检测范围之外的其他基因型样本阳性或者阴性。
本发明试剂盒检测120例临床样本和金标准测序结果对比，准确性为100％；对非本试剂盒检测范围的其他位点的突变阳性(GJB2：79G>A杂合和109G>A杂合，)和阴性样本，本试剂盒检测结果均为阴性，阴性符合率为100％，特异性为100％。
本发明试剂盒检测120例临床样本各阳性基因型结果和金标准测序结果对比分析统计，见表9。
表9
从表9可以看到120例有耳聋症状样本各耳聋基因型分布情况，本发明试剂盒检测范围内的21种突变均有存在，且本试剂盒检测准确性和特异性均为100％，说明仅检测10种或者更少基因型是不能满足临床耳聋筛查需求的，检测本试剂盒包含的21种突变是有必要的。
另外本试剂盒检测其他同类专利未见报道的GJB2基因的230G>A、SLC26A4基因的1238A>G和12S rRNA的1095T>C位点分别有2例、7例和1例，说明230G>A、1238A>G和1095T>C位点在有耳聋症状的样本中是存在的，更进一步验证了检测230G>A、1238A>G和1095T>C位点的必要性。至于测序法额外检出来的两例阳性样本79G>A杂合和109G>A杂合，据报道为均正常多态位点，不致病。因此本试剂盒检测21种耳聋突变位点，能满足耳聋临床筛查的需求。
5、本发明的遗传性耳聋基因检测的试剂盒的性能指标：
5.1、分析灵敏度：本品能稳定检出的基因组DNA的最低浓度为3ng/μL；
5.2、测定准确性：用本产品检测已知突变或缺失类型的样本，结果各基因突变准确性为100％；
5.3、分析特异性：检测非遗传性耳聋的DNA样品，结果显示全部为正常，特异性为100％；
5.4、稳定性：本品在有效期内使用完全可满足以上各指标。
实施例2
本实施例提供一种遗传性耳聋基因检测的试剂盒(PCR-反向点杂交法)
1、用途
用于检测中国人群耳聋临床患者、婚前或新生儿样本中的全血基因组DNA，能够定性检出中国人群常见的非综合征遗传性耳聋四个基因上21个位点突变，包括GJB2上6种突变型(35del G、167delT、A176-191del 16、230G>A、235del C、299-300del AT)、GJB3上2种突变型(538C>T、547G>A)、SLC26A4上10种突变型(IVS7-2A>G、2168A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1238A>G、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T)、和12S rRNA上3种突变型(1095T>C、1494C>T、1555A>G)。
2、原理
PCR和DNA反向点杂交：设计特异的PCR引物且其5′端用生物素进行标记，扩增获得一定长度的DNA片段，该片段包含了所要检测的各个位点。根据检测位点碱基差异，按照碱基互补配对原则，设计特异性识别某种基因型的寡核苷酸探针组合，分别固定在尼龙膜的特定位置上，制成检测膜条。PCR扩增产物与探针通过分子杂交反应及显色反应，观察检测膜条上各位点蓝色信号的有无，判断该探针是否与PCR产物杂交，从而确定待检样品的基因型。
3、组成
3.1、试剂盒主要成份如表10。
表10
说明：本发明试剂盒中不同批号的各组份可以互换使用。本检测需要用到的其它主要试剂(盒)，全血基因组提取试剂，推荐选用：QIAGEN公司的全血DNA提取试剂盒或酚-氯仿试剂。
4、储存条件及有效期
储存条件：试剂盒Ⅰ置于-18℃以下保存；试剂盒Ⅱ置于2-8℃保存。如果打开包装各组分分开保存时，除了满足各自的温度保存条件之外，需特别注意TMB应该避光保存。
有效期：6个月
5、适用仪器
PCR仪(黑马9600、AB9700)、分子杂交箱(FinePCR Combi-D24、Combi-H12)。
6、样本要求
本试剂盒样本来源为抗凝全血，所用抗凝剂为枸橼酸钠或EDTA，不能使用肝素抗凝。
样本采集：抽取静脉血5mL，放入含有抗凝剂的管中，标记好样本的姓名和编号等样本信息。
血样保存：抗凝全血在室温放置不超过24小时，2-8℃保存不超过一个月，-18℃以下冰箱保存不超过两年，-70℃冰箱可长期保存，冷冻保存时应避免反复冻融。
血样运输：抗凝全血运输时需用冰壶或泡沫箱加冰袋密封，应保证冰袋不化冻。
7、检验方法
7.1、DNA获取
本试剂盒对人基因组DNA的提取方法没有指定要求，一般可用实验室常规方法(酚-氯仿抽提法)或试剂盒提取人基因组DNA，推荐使用QIAGEN公司的全血DNA提取试剂盒或亚能公司的微量样本基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)。
若采用试剂盒，直接按说明书加样；若用酚－氯仿或其它方法提取DNA，则要测定DNA浓度并进行浓缩或稀释后才能进行检测实验；本产品要求待检基因组DNA的浓度为3-100ng/μL。
7.2、PCR扩增
取出PCR反应液，在管壁上做好标记，于5000rpm离心2秒，而后向PCR反应液I、II中分别加入已提取的待测样品DNA 2μL，反应总体系为25μL。
每次实验另取2管PCR反应液，1管以2μL纯水为模板，作空白对照；1管以2μL阳性质控品为模板，监控整个实验操作。
PCR按以下条件进行扩增：
取15mL塑料离心管，放入标有样品编号的膜条(应在膜条的一角用铅笔标记)，加入A液(2×SSC、0.1％SDS)8-10mL及PCR反应液I、II中所有(两管共50μL)PCR产物，拧紧管盖，再回旋一圈稍拧松。将离心管放入沸水浴中加热10分钟(确保杂交液液面完全位于沸水浴液面之下)，取出拧紧盖子，放入杂交箱44℃杂交1.5小时以上，但不超过4小时。
取50mL塑料管，加入40mL B液(0.5×SSC、0.1％SDS)于杂交箱中进行预热至44℃。
7.4、洗膜
取出膜条，移至装有预热B液的50mL管中，于44℃轻摇洗涤15分钟(每管40mL溶液，最多可同时洗涤4张膜)。
7.5、显色
按A液：POD＝2000:1配制孵育液(单做两张膜只需4μLPOD母液，配制成8mL使用液，做四张膜可用6μLPOD母液，配制成12mL使用液)，室温轻摇浸泡30分钟，弃去POD溶液。用A液室温轻摇洗两次，每次5分钟。用C液(0.1mol/L柠檬酸钠，pH5.0)室温洗膜1-2分钟，同时配制显色液(各成份比例：19mL C液，1mL TMB，2μL 30％的H2O2)。将膜条浸泡于显色液中避光显色15分钟左右即可观察结果。
8、结果判读
8.1、膜条上的探针排列顺序如表1
8.2、结果分析
本试剂盒对检测对象进行定性分析，以检测位点出现信号与否来进行判断，信号点的强弱不能提供任何定量方面的参考。
1)空白对照的膜条结果应为所有位点都不显色，否则本次实验可能发生污染，应全部重做。阳性质控品应所有正常对照位点和235M都有蓝色斑点出现，否则可能实验异常。
2)所有临床样品21个正常位点应至少有20个位点有蓝色斑点出现，否则可能实验不成功，该样品应重检；若重检结果还是如此，则应与试剂盒生产厂家技术人员联系解决。
3)局限性
本试剂盒能检测中国人群常见的四个耳聋基因上21个位点突变，包括GJB2上6种突变型(35del G、167delT、A176-191del 16、230G>A、235del C、299-300del AT)、GJB3上2种突变型(538C>T、547G>A)、SLC26A4上10种突变型(IVS7-2A>G、2168A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1238A>G、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T)、和12S rRNA上3种突变型(1095T>C、1494C>T、1555A>G)。还有一些罕见的突变类型或正常多态位点在本试剂盒检测范围之外，可能造成漏检，这类样本可用测序法进一步验证。
4)产品性能指标
分析灵敏度：本品能稳定检出的基因组DNA的最低浓度为3ng/μL；
测定准确性：用本产品检测已知突变类型的样本，结果各基因型的准确性为100％；
分析特异性：检测非耳聋的DNA样品，结果显示全部为正常，特异性为100％；
稳定性：本品在有效期内使用完全可满足以上各指标。
10、根据膜条上斑点显现的位置，读取相应位置上标注的基因型信息。参见以下本试剂盒膜条检测结果的示意图例：
正常(N/N)如表11。
表11
GJB2基因突变杂合子(例235del C杂合)如表12。
表12
GJB3基因突变杂合子(例538C>T杂合)如表13。
表13
SLC26A4基因突变杂合子(例IVS7-2A>G杂合)如表14。
表14
12S rRNA基因突变纯合子(例1555A>G纯合)如表15。
表15
GJB2和SLC26A4基因突变双重杂合子(例235del C杂合/IVS7-2A>G杂合)如表16。
表16
GJB2基因突变纯合子(例235del C纯合)如表17。
表17
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.一种遗传性耳聋基因检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括遗传性耳聋基因检测的核酸膜条、PCR反应液I和PCR反应液II；所述核酸膜条包括一基底和固定于所述基底上的特异性寡核苷酸探针，所述特异性寡核苷酸探针序列如：SEQ ID NO：1-42；
所述PCR反应液I包括如下4对引物：
引物GJB2F：SEQ ID NO：43；
引物GJB2R：SEQ ID NO：44；
引物mtDNAF：SEQ ID NO：45；
引物mtDNAR：SEQ ID NO：46；
引物2168F：SEQ ID NO：47；
引物2168R：SEQ ID NO：48；
引物IVS7F：SEQ ID NO：49；
引物IVS7R：SEQ ID NO：50；
所述PCR反应液II包括如下4对引物：
引物GJB3F：SEQ ID NO：51；
引物GJB3R：SEQ ID NO：52；
引物1174F：SEQ ID NO：53；
引物1174R：SEQ ID NO：54；
引物1975F：SEQ ID NO：55；
引物1975R：SEQ ID NO：56；
引物IVS15F：SEQ ID NO：57；
引物IVS15R：SEQ ID NO：58。
2.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因检测的试剂盒，其特征在于，所述基底为尼龙膜。
3.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因检测的试剂盒，其特征在于，所述特异性寡核苷酸探针的3’端进行氨基标记。
4.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因检测的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应液I和PCR反应液II均采用了2’-脱氧-5'-三磷酸尿苷和尿嘧啶-N-糖苷酶防污染体系。
5.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因检测的试剂盒，其特征在于，所述引物5’端均标记生物素。
6.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因检测的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应液I各组分含量为：
所述dNTP包括dATP、dCTP、dGTP和dUTP；
所述的PCR反应液II各组分含量为：
所述dNTP包括dATP、dCTP、dGTP和dUTP；
CN201410795807.9A 2014-12-18 2014-12-18 一种遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒 Active CN104498609B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410795807.9A CN104498609B (zh) 2014-12-18 2014-12-18 一种遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410795807.9A CN104498609B (zh) 2014-12-18 2014-12-18 一种遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104498609A CN104498609A (zh) 2015-04-08
CN104498609B true CN104498609B (zh) 2016-08-31

Family

ID=52940059

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410795807.9A Active CN104498609B (zh) 2014-12-18 2014-12-18 一种遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104498609B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105695582B (zh) * 2016-03-11 2023-12-22 东莞市儿科研究所 一种非综合征耳聋基因检测膜条以及pcr引物
CN106957902B (zh) * 2016-11-01 2020-12-04 复旦大学 一种用于检测药物性耳聋相关位点的非标记探针
CN107988357A (zh) * 2017-12-26 2018-05-04 北昊干细胞与再生医学研究院有限公司 遗传性和易感性线粒体耳聋基因检测的试剂盒
CN109371120A (zh) * 2018-11-30 2019-02-22 广东腾飞基因科技股份有限公司 一种用于检测遗传性耳聋的试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101445799A (zh) * 2007-11-27 2009-06-03 韩东一 中国人群遗传性耳聋基因slc26a4的突变类型和突变频率及其用途
CN102220434A (zh) * 2011-05-27 2011-10-19 危梅娟 用于诊断非综合征耳聋的杂交膜条、pcr引物及试剂盒
CN102409089A (zh) * 2011-10-08 2012-04-11 深圳华大基因科技有限公司 检测dna样品中预定位点的突变的试剂盒、方法及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101445799A (zh) * 2007-11-27 2009-06-03 韩东一 中国人群遗传性耳聋基因slc26a4的突变类型和突变频率及其用途
CN102220434A (zh) * 2011-05-27 2011-10-19 危梅娟 用于诊断非综合征耳聋的杂交膜条、pcr引物及试剂盒
CN102409089A (zh) * 2011-10-08 2012-04-11 深圳华大基因科技有限公司 检测dna样品中预定位点的突变的试剂盒、方法及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Clinical evaluation and sequence analysis of the complete mitochondrial genome of three Chinese patients with hearing impairment associated with the 12S rRNA T1095C mutation;Lidong zhao etal;《Biochemical and Biophysical Research Communications》;20041111;第325卷;第1503-1508页，参见摘要 *
人工耳蜗植入者连接蛋白26基因（GJB2）突变分析;陈东野等;《中华医学杂志》;20061031;第86卷(第44期);第3114-3117页，参见表1 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104498609A (zh) 2015-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chow et al. Application of isothermal helicase-dependent amplification with a disposable detection device in a simple sensitive stool test for toxigenic Clostridium difficile
Winchell et al. Rapid identification and discrimination of Brucella isolates by use of real-time PCR and high-resolution melt analysis
Kozubíková et al. Re-examination of the prevalence of Aphanomyces astaci in North American crayfish populations in Central Europe by TaqMan MGB real-time PCR
CN104498609B (zh) 一种遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒
CN106811533A (zh) 一种遗传性耳聋基因检测试剂盒
Zhou et al. Pyrosequencing, a high-throughput method for detecting single nucleotide polymorphisms in the dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthetase genes of Plasmodium falciparum
CN107841537A (zh) 一种全预混mthfr和mtrr多重pcr基因多态性检测试剂盒和方法
CN104164491A (zh) 用于幽门螺杆菌23S rDNA基因突变分型的ARMS-qPCR的检测方法及试剂盒
CN102618625B (zh) 一种检测结核分枝杆菌耐药性的方法和试剂盒
Nakatani et al. Development of hepatitis C virus genotyping by real-time PCR based on the NS5B region
CN105385780A (zh) 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌快速检测的试剂盒及其应用
CN109355376A (zh) 脆性x综合征fmr1基因检测引物、试剂盒及检测方法
CN109504753A (zh) 遗传性耳聋相关基因检测芯片试剂盒
Palomba et al. A novel nuclear marker and development of an ARMS-PCR assay targeting the metallopeptidase 10 (nas 10) locus to identify the species of the Anisakis simplex (sl) complex (Nematoda, Anisakidae)
CN103484532A (zh) 检测和分析艰难梭菌菌株的组合物和试剂盒及用该组合物和试剂盒检测艰难梭菌菌株的方法
CN107385028B (zh) 一种检测β珠蛋白基因点突变的靶序列互补淬灭探针及其试剂盒
CN108330201A (zh) 鉴定番茄花叶病毒抗性基因的分子标记及其应用
Cellier et al. Tube-wise diagnostic microarray for the multiplex characterization of the complex plant pathogen Ralstonia solanacearum
US20100112563A1 (en) Multiplex analysis of nucleic acids
Havryliuk et al. Plasmodium vivax: microsatellite analysis of multiple-clone infections
CN105624315A (zh) 一种ALDH2基因c.1510位点多态性检测的引物和试剂盒
CN104232774A (zh) 用于检测乳腺癌易感基因snp的引物、荧光探针及应用
CN103757110B (zh) 一种霍乱弧菌分析分型试剂盒
Ahlstrom et al. Relative frequency of 4 major strain types of Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis in Canadian dairy herds using a novel single nucleotide polymorphism-based polymerase chain reaction
CN107245528A (zh) 一种针对中国人群常见地贫突变基因的快速检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant