CN105695582B - 一种非综合征耳聋基因检测膜条以及pcr引物 - Google Patents

一种非综合征耳聋基因检测膜条以及pcr引物 Download PDF

Info

Publication number
CN105695582B
CN105695582B CN201610137106.5A CN201610137106A CN105695582B CN 105695582 B CN105695582 B CN 105695582B CN 201610137106 A CN201610137106 A CN 201610137106A CN 105695582 B CN105695582 B CN 105695582B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
mutation
membrane strip
sites
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610137106.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105695582A (zh
Inventor
陆小梅
黎四平
彭琪
李文瑞
马强
何晓光
马可泽
廖生赟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Yilifang Biotechnology Co ltd
Dongguan Institute Of Pediatrics
Original Assignee
Shenzhen Yilifang Biotechnology Co ltd
Dongguan Institute Of Pediatrics
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Yilifang Biotechnology Co ltd, Dongguan Institute Of Pediatrics filed Critical Shenzhen Yilifang Biotechnology Co ltd
Priority to CN201610137106.5A priority Critical patent/CN105695582B/zh
Publication of CN105695582A publication Critical patent/CN105695582A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105695582B publication Critical patent/CN105695582B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种可用于医学上诊断人遗传性非综合征耳聋的杂交膜条，具体涉及一种非综合征耳聋基因检测膜条以及用于扩增待检样品基因片段的PCR引物，所述基因检测膜条包括基底以及在所述基底上固定有正常对照探针和特异性的突变检测探针，共包括用于检测20个基因突变位点的20条突变检测探针和10条正常对照探针。本发明的基因检测膜条可以检测20个基因突变位点共20种突变类型，应用基因检测膜条进行检测，能直接对待检者的基因型进行确诊，具有准确性高、特异性强，能检出基因隐性携带者等优点。

Description

一种非综合征耳聋基因检测膜条以及PCR引物
技术领域
本发明涉及一种可用于医学上诊断人遗传性非综合征耳聋的杂交膜条，具体涉及一种非综合征耳聋基因检测膜条以及用于扩增待检样品基因片段的PCR引物。
背景技术
耳聋是一种最常见的人类感觉系统缺陷，因其病因复杂、发生率高和治疗困难等原因而长久地困扰着广大患者及其周围人群，极大地影响着相互交流和生活质量。重度耳聋在新生儿中发生率高达1/800~1/1000，全世界将近有七千万人罹患55分贝以上的听力减退。
耳聋病因是多方面的，60%以上的新生聋儿是由遗传因素导致的。耳聋可以由单一基因突变或不同基因的复合突变引起。也可由环境因素、或基因与环境两者共同作用而致。遗传性耳聋具有广泛的遗传异质性，根据是否伴有耳外组织的异常或病变可将其分为综合征型和非综合征型，伴随有其他组织器官的病变的耳聋属于综合征型听力缺损(syndromichearing impairment，SHI)，不伴有其他症状的耳聋属于非综合征型听力缺损(nonyndromic hearing impairment，NSHI)，NSHI占70％以上。至2011年1月1日止，与非综合征耳聋相关的25个常染色体隐性基因、36个常染色体显性基因、2个X连锁基因已被克隆，而每个基因中又散在数目众多的耳聋突变位点，因而具有较高的基因和位点遗传异质性。最近，在国内开展的大规模耳聋分子流行病学研究表明，相当一部分非综合征性耳聋仅由为数不多的几个基因突变引起，如GJB2、SLC26A4，mtDNA 12s rRNA及GJB3等，这为我们大规模开展耳聋基因筛查及诊断提供了理论依据。
目前，传统基因诊断方法包括酶切，限制性片段长度多态性分析（restrictionfragment length polymorphism，RFLP)，直接测序等，这些方法或者不能定性，或者耗时费力、所需设备和耗材昂贵，更重要的是这些方法难以同时对不同基因的多个突变位点进行检测。而基因芯片法虽然能同时对不同基因位点进行检测，但它所需设备和耗材昂贵，不适用于在临床大规模推广，应用受到限制。因此有必要建立一种高通量、高效率、价格低廉、使用方便的基因突变检测方法，以实现临床快速检测和大规模人群筛查。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种非综合征耳聋基因检测膜条，该基因检测膜条可以检测20个基因突变位点共20种突变类型，应用基因检测膜条进行检测，能直接对待检者的基因型进行确诊，具有准确性高、特异性强，能检出基因隐性携带者等优点。
本发明还提供了一种非综合征耳聋基因检测膜条的制备方法。
本发明的另一目的在于针对现有技术中的不足，提供一种用于扩增待检样品基因片段的PCR引物，该PCR引物能满足20个基因突变位点在同一个反应体系和反应条件下扩增，引物特异性好，准确率高，与探针的结合性能好，扩增速率快，对于临床检测具有很强的临床指导意义。
本发明还提供了一种采用上述所述的PCR引物扩增待检样品基因片段的方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：一种非综合征耳聋的基因检测膜条，包括基底以及在所述基底上固定有正常对照探针和特异性的突变检测探针，共包括用于检测20个基因突变位点的20条突变检测探针和10条正常对照探针，所述20个基因突变位点分别为35delG、167delT、176-191del16、235delC、299-300delAT、538C>T、547G>A、1555A>G、1494C>T、281C>T、589G>A、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T和2168A>G。
本发明的基因检测膜条可以检测20个基因突变位点共20种突变类型，应用基因检测膜条进行检测，能直接对待检者的基因型进行确诊，具有准确性高、特异性强，能检出基因隐性携带者等优点。
优选的，所述20条突变检测探针分别为：176M、235M、299M、538M、35M 1497M、1555M、IVS7-2M、2168M、167M、281M、1174M、1229M、1975M、2162M、547M、589M、1226M、IVS15+5M和2027M，所述20条突变检测探针的3’端或5’端均带有氨基标记。
更为优选的，所述突变检测探针的具体序列分别为：
35M CGATCCTGGGGGTGTGA
176M CCTGCAGCCAGCTACGATCAC
235M CTATGGGCCTGCAGCTG
299M CTACCGGAGACGAGAAGAAGA
538M CTACATTGCCTGACCTACCG
1497M CCGTCACCCTTCTCAAGTATAC
1555M TAGAGGAGGCAAGTCGTAACA
IVS7-2M TTATTTCGGACGATAATTGCT
2168M TGACGGTCCGTGATGCTA
167M GCAGCCAGCTACGATCAC
281M CGGGAGTTAGTATTGGGC
1174M GATCAGCTACATCTTCTCAGGA
1229M GCTCTTTCCCGCATGGC
1975M GCCTTCTGCTTGACTGTG
2162M ACATTCTTTTTGATGGTCC
547M ATTTTCTTCTTGGTAGGTCG
589M CTGACTCTGCTGGTTAGAAT
1226M CACTGCTCTTTCCCACACG
IVS15+5M AAGTCCACAGTAAATATTTTATCC
2027M AGTGAGATCACAGCGGGT。
优选的，所述10条正常对照探针分别为：35N、176N、235N、299N、538N、1497N、1555N、IVS7-2N和 2168N和1226/1229N，所述10条正常对照探针的3’端或5’端均带有氨基标记。
更为优选的，所述正常对照探针的具体序列分别为：
35N GATCCTGGGGGGTGTGA
176N CAGGCTGCAAGAACGTGTGCTAC
235N CTATGGGCCCTGCAGCT
299N CTACCGGAGACATGAGAAGAAG
538N CTACATTGCCCGACCTACC
1497N CCGTCACCCTCCTCAAGTAT
1555N GAGGAGACAAGTCGTAACATGG
IVS7-2N GTTTTATTTCAGACGATAATTGCT
2168N TGACGGTCCATGATGCTATAC
1226/1229N CTCTTTCCCGCACGGCC。
优选的，所述检测膜条上的探针阵列具体从左至右包括3行10列依次排列，共30个探针位点，第一行的探针排列为：35N、176N、235N、299N、538N、1494N、1555N、IVS7-2N、1226/1229N和2168N；第二行的探针排列为：35M、176M、235M、299M、538M、1494M、1555M、IVS7-2M、1226M和2168M；第三行的探针排列为：167M、281M、589M、IVS15+5M、547M、1975M、2027M、1174M、1229M和2162M。
一种非综合征耳聋的基因检测膜条的制备方法，包括如下步骤：
a.用打印机在基底上打印位点阵列，并标明相应位点的探针名称；
b.用EDAC溶液泡膜30min，以活化尼龙膜表面的羧基；
c.分别用探针稀释液将30条探针稀释至5μmol/L；
d.按尼龙膜条上打印的位点阵列，将30条探针按探针名称对应分别点加在尼龙膜相应位点上，探针上的氨基与尼龙膜表面的羧基发生交联反应；
e.待尼龙膜条干燥后，用0.1mol/L的NaOH泡膜5分钟，以封闭尼龙膜表面未反应的羧基；
f.纯水洗涤膜条，干燥后即可。
本发明的制备方法通过固定探针的膜条表面带有羧基集团，能与探针中的氨基发生反应，将探针用探针稀释液稀释后，点加于膜条表面相应的位置上，构成检测阵列。
本发明的另一目的通过以下技术方案实现：一种用于扩增待检样品基因片段的PCR引物，包括分别用于扩增上述所述的20个基因突变位点的10对共20条引物，分别简写为HL1F、HL1R、HL2F、HL2R、HL3F、HL3R、HL4F、HL4R、HL5F、HL5R、HL6F、HL6R、HL7F、HL7R、HL8F、HL8R、HL9F、HL9R、HL10F、HL10R，其中，HL1F和HL1R的扩增位点为35delG、167delT、176-191del16、235delC、299-300delAT，HL2F和HL2R的扩增位点为538C>T、547G>A，HL3F和HL3R的扩增位点为1555A>G、1494C>T，HL4F和HL4R的扩增位点为281C>T，HL5F和HL5R的扩增位点为589G>A，HL6F和HL6R的扩增位点为IVS7-2A>G，HL7F和HL7R的扩增位点为1174A>T、1226G>A、1229C>T，HL8F和HL8R的扩增位点为IVS15+5G>A，HL9F和HL9R的扩增位点为1975G>C、2027T>A，HL10F和HL10R的扩增位点为2162C>T、2168A>G。。
本发明的PCR引物能满足20个基因突变位点在同一个反应体系和反应条件下扩增，引物特异性好，准确率高，与探针的结合性能好，扩增速率快，对于临床检测具有很强的临床指导意义。
优选的，所述20条引物的5’端均带有生物素标记或荧光素标记，所述20条引物的序列分别为：
HL1F：5’- CCAGAGCAAACCGCCCAGAGTA -3’
HL1R：5’- GGGAGCCTTCGATGCGGACCTTC -3’
HL2F：5’- ATTGAGTTCCTCTTCCTCTACCTG -3’
HL2R：5’- CAGAGCTCACAGATGGTGAGTA -3’
HL3F：5’- GCCCATGAGGTGGCAAGAAATG -3’
HL3R：5’- TAGTAAGGTGGAGTGGGTTTGG -3’
HL4F：5’- GGCTCCCCAAATACCGAGTC -3’
HL4R：5’- TGGTAGCTGGGGAGAAGTGT -3’
HL5F：5’- AGATACAGCTAGAGTCCTGATT -3’
HL5R：5’- AGTGAGCCTTAATAAGTGGGGTC -3’
HL6F：5’- GCTGATTTCACTGCTGGATTGCTC -3’
HL6R：5’- CCACACTCACCCCCTTGGGATGG -3’
HL7F：5’- GGACCACCACGCAGAGTAGG -3’
HL7R：5’- TGCCATTCCTCGACTTGTTCTCT -3’
HL8F：5’- CAGTCCTATTTTCTATGGCAATGT -3’
HL8R：5’- TGCCCTACACAAAGGGAAGAGG -3’
HL9F：5’- CGTTTAGAATGGCATCATAAGTGA -3’
HL9R：5’- AGCCCATGTATTTGCCCTGTTGC -3’
HL10F：5’- GAGCAATGCGGGTTCTTTGACG -3’
HL10R：5’- TGGAACCTTGACCCTCTTGAGA -3’。
一种采用上述所述的PCR引物扩增待检样品基因片段的方法，包括如下步骤：
步骤1：合成10对引物，配制成25μL的PCR反应液，PCR反应液含有各成份及浓度分别为：10对引物浓度分别为0.2μmol/L、Taq酶为0.1U/μL、1×PCR Buffer、MgCl2为1.5mmol/L、dNTP为0.2mmol/L、模板DNA 1~10ng/μL。
步骤2：将步骤1配制好的反应液经过以下程序反应：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃ ℃延伸45秒，循环35次；72℃再延伸5分钟即可。
本发明的扩增方法通过PCR产物与膜条的杂交，最终经显色反应，通过肉眼判断，以各位点显色信号的有无来判断待检样品是还存在基因突变，以及是突变纯合子还是杂合子。
本发明的有益效果：本发明的基因检测膜条可以检测20个基因突变位点共20种突变类型，应用基因检测膜条进行检测，能直接对待检者的基因型进行确诊，具有准确性高、特异性强，能检出基因隐性携带者等优点。
本发明的PCR引物能满足20个基因突变位点在同一个反应体系和反应条件下扩增，引物特异性好，准确率高，与探针的结合性能好，扩增速率快，对于临床检测具有很强的临床指导意义。
本发明是基于PCR-反向点杂交技术的基因检测方法，能直接对待检者的基因型进行确诊，具有准确性高、特异性强，能检出基因隐性携带者等优点。本发明进行检测不需要贵重的专用仪器，只需要PCR实验室常规的设备即可，适用于在国内医院大范围推广使用。
附图说明
图1是本发明实施例的未检出非综合征耳聋基因突变样品结果示例，基因型：未检出突变；
图2是本发明实施例的非综合征耳聋基因突变杂合子样品结果示例，基因型：176M/N；
图3是本发明实施例的非综合征耳聋基因突变纯合子样品结果示例，基因型：1494M；
图4是本发明实施例的非综合征耳聋基因突变纯合子样品结果示例，基因型：1555M；
图5是本发明实施例的非综合征耳聋基因双重突变杂合子样品结果示例，基因型：235M/IVS7-2M；
图6是本发明实施例的非综合征耳聋基因双重突变杂合子样品结果示例，基因型：IVS7-2M/2168M；
图7是本发明实施例的非综合征耳聋基因罕见突变样品结果示例，基因型：2162M/N或2162M/2162M；
图8是本发明实施例的非综合征耳聋基因罕见突变样品结果示例，基因型：IVS15+5M/N或IVS15+5M/IVS15+5M。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1-8对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
一种非综合征耳聋的基因检测膜条，包括基底以及在所述基底上固定有正常对照探针和特异性的突变检测探针，共包括用于检测20个基因突变位点的20条突变检测探针和10条正常对照探针，所述20个基因突变位点分别为35delG、167delT、176-191del16、235delC、299-300delAT、538C>T、547G>A、1555A>G、1494C>T、281C>T、589G>A、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T和2168A>G。
本发明的基因检测膜条可以检测20个基因突变位点共20种突变类型，应用基因检测膜条进行检测，能直接对待检者的基因型进行确诊，具有准确性高、特异性强，能检出基因隐性携带者等优点。
所述20条突变检测探针分别为：176M、235M、299M、538M、35M 1497M、1555M、IVS7-2M、2168M、167M、281M、1174M、1229M、1975M、2162M、547M、589M、1226M、IVS15+5M和2027M，所述20条突变检测探针的3’端或5’端均带有氨基标记。
所述突变检测探针的具体序列分别为：
35M CGATCCTGGGGGTGTGA
176M CCTGCAGCCAGCTACGATCAC
235M CTATGGGCCTGCAGCTG
299M CTACCGGAGACGAGAAGAAGA
538M CTACATTGCCTGACCTACCG
1497M CCGTCACCCTTCTCAAGTATAC
1555M TAGAGGAGGCAAGTCGTAACA
IVS7-2M TTATTTCGGACGATAATTGCT
2168M TGACGGTCCGTGATGCTA
167M GCAGCCAGCTACGATCAC
281M CGGGAGTTAGTATTGGGC
1174M GATCAGCTACATCTTCTCAGGA
1229M GCTCTTTCCCGCATGGC
1975M GCCTTCTGCTTGACTGTG
2162M ACATTCTTTTTGATGGTCC
547M ATTTTCTTCTTGGTAGGTCG
589M CTGACTCTGCTGGTTAGAAT
1226M CACTGCTCTTTCCCACACG
IVS15+5M AAGTCCACAGTAAATATTTTATCC
2027M AGTGAGATCACAGCGGGT。
所述10条正常对照探针分别为：35N、176N、235N、299N、538N、1497N、1555N、IVS7-2N和 2168N和1226/1229N，所述10条正常对照探针的3’端或5’端均带有氨基标记。
所述正常对照探针的具体序列分别为：
35N GATCCTGGGGGGTGTGA
176N CAGGCTGCAAGAACGTGTGCTAC
235N CTATGGGCCCTGCAGCT
299N CTACCGGAGACATGAGAAGAAG
538N CTACATTGCCCGACCTACC
1497N CCGTCACCCTCCTCAAGTAT
1555N GAGGAGACAAGTCGTAACATGG
IVS7-2N GTTTTATTTCAGACGATAATTGCT
2168N TGACGGTCCATGATGCTATAC
1226/1229N CTCTTTCCCGCACGGCC。
所述检测膜条上的探针阵列具体从左至右包括3行10列依次排列，共30个探针位点，第一行的探针排列为：35N、176N、235N、299N、538N、1494N、1555N、IVS7-2N、1226/1229N和2168N；第二行的探针排列为：35M、176M、235M、299M、538M、1494M、1555M、IVS7-2M、1226M和2168M；第三行的探针排列为：167M、281M、589M、IVS15+5M、547M、1975M、2027M、1174M、1229M和2162M。
一种非综合征耳聋的基因检测膜条的制备方法，包括如下步骤：
a.用打印机在基底上打印位点阵列，并标明相应位点的探针名称；
b.用EDAC溶液泡膜30min，以活化尼龙膜表面的羧基；
c.分别用探针稀释液将30条探针稀释至5μmol/L；
d.按尼龙膜条上打印的位点阵列，将30条探针按探针名称对应分别点加在尼龙膜相应位点上，探针上的氨基与尼龙膜表面的羧基发生交联反应；
e.待尼龙膜条干燥后，用0.1mol/L的NaOH泡膜5分钟，以封闭尼龙膜表面未反应的羧基；
f.纯水洗涤膜条，干燥后即可。
本发明的制备方法通过固定探针的膜条表面带有羧基集团，能与探针中的氨基发生反应，将探针用探针稀释液稀释后，点加于膜条表面相应的位置上，构成检测阵列。
本发明的另一目的通过以下技术方案实现：一种用于扩增待检样品基因片段的PCR引物，包括分别用于扩增上述所述的20个基因突变位点的10对共20条引物，分别简写为HL1F、HL1R、HL2F、HL2R、HL3F、HL3R、HL4F、HL4R、HL5F、HL5R、HL6F、HL6R、HL7F、HL7R、HL8F、HL8R、HL9F、HL9R、HL10F、HL10R，其中，HL1F和HL1R的扩增位点为35delG、167delT、176-191del16、235delC、299-300delAT，HL2F和HL2R的扩增位点为538C>T、547G>A，HL3F和HL3R的扩增位点为1555A>G、1494C>T，HL4F和HL4R的扩增位点为281C>T，HL5F和HL5R的扩增位点为589G>A，HL6F和HL6R的扩增位点为IVS7-2A>G，HL7F和HL7R的扩增位点为1174A>T、1226G>A、1229C>T，HL8F和HL8R的扩增位点为IVS15+5G>A，HL9F和HL9R的扩增位点为1975G>C、2027T>A，HL10F和HL10R的扩增位点为2162C>T、2168A>G。。
本发明的PCR引物能满足20个基因突变位点在同一个反应体系和反应条件下扩增，引物特异性好，准确率高，与探针的结合性能好，扩增速率快，对于临床检测具有很强的临床指导意义。
所述20条引物的5’端均带有生物素标记或荧光素标记，所述20条引物的序列分别为：
HL1F：5’- CCAGAGCAAACCGCCCAGAGTA -3’
HL1R：5’- GGGAGCCTTCGATGCGGACCTTC -3’
HL2F：5’- ATTGAGTTCCTCTTCCTCTACCTG -3’
HL2R：5’- CAGAGCTCACAGATGGTGAGTA -3’
HL3F：5’- GCCCATGAGGTGGCAAGAAATG -3’
HL3R：5’- TAGTAAGGTGGAGTGGGTTTGG -3’
HL4F：5’- GGCTCCCCAAATACCGAGTC -3’
HL4R：5’- TGGTAGCTGGGGAGAAGTGT -3’
HL5F：5’- AGATACAGCTAGAGTCCTGATT -3’
HL5R：5’- AGTGAGCCTTAATAAGTGGGGTC -3’
HL6F：5’- GCTGATTTCACTGCTGGATTGCTC -3’
HL6R：5’- CCACACTCACCCCCTTGGGATGG -3’
HL7F：5’- GGACCACCACGCAGAGTAGG -3’
HL7R：5’- TGCCATTCCTCGACTTGTTCTCT -3’
HL8F：5’- CAGTCCTATTTTCTATGGCAATGT -3’
HL8R：5’- TGCCCTACACAAAGGGAAGAGG -3’
HL9F：5’- CGTTTAGAATGGCATCATAAGTGA -3’
HL9R：5’- AGCCCATGTATTTGCCCTGTTGC -3’
HL10F：5’- GAGCAATGCGGGTTCTTTGACG -3’
HL10R：5’- TGGAACCTTGACCCTCTTGAGA -3’。
一种采用上述所述的PCR引物扩增待检样品基因片段的方法，包括如下步骤：
步骤1：合成10对引物，配制成25μL的PCR反应液，PCR反应液含有各成份及浓度分别为：10对引物浓度分别为0.2μmol/L、Taq酶为0.1U/μL、1×PCR Buffer、MgCl2为1.5mmol/L、dNTP为0.2mmol/L、模板DNA 1~10ng/μL。
步骤2：将步骤1配制好的反应液经过以下程序反应：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃ ℃延伸45秒，循环35次；72℃再延伸5分钟即可。
本发明的扩增方法通过PCR产物与膜条的杂交，最终经显色反应，通过肉眼判断，以各位点显色信号的有无来判断待检样品是还存在基因突变，以及是突变纯合子还是杂合子。
采用本发明的基因检测膜条检测非综合征耳聋的具体步骤如下：
1、杂交膜条的制备
a.用打印机在基底（本实施例中为尼龙膜）上打印位点阵列，并标明相应位点的探针名称；
b.用5%的EDAC溶液泡膜30分钟，以活化尼龙膜表面的羧基；
c.分别用探针稀释液（10mmol/L Tris，pH8.0）将30条探针稀释至5μmol/L；
d.按尼龙膜条上打印的位点阵列（如表1所示），将30条探针按探针名称对应分别点加在尼龙膜相应位点上，探针上的氨基与尼龙膜表面的羧基发生交联反应；
e.待尼龙膜条干燥后，用0.1mol/L的NaOH泡膜5分钟，以封闭尼龙膜表面未反应的羧基；
f.纯水洗涤尼龙膜，干燥后备用。
表1
35N 176N 235N 299N 538N 1494N 1555N IVS7-2N 12269N 2168N
35M 176M 235M 299M 538M 1494M 1555M IVS7-2M 1226M 2168M
167M 281M 589M IVS15+5M 547M 1975M 2027M 1174M 1229M 2162M
注：“M”代表突变检测探针，“N”代表正常对照探针，12269N表示正常对照探针1226/1229N（图1-8中同理）。
根据本发明待检的20个突变位点的位置关系，我们设计了10对引物分别进行扩增，引物序列如表2所示。
表2
引物名称 序列（5’－3’） 引物名称 序列（5’－3’）
HL1F CCAGAGCAAACCGCCCAGAGTA HL6F GCTGATTTCACTGCTGGATTGCTC
HL1R GGGAGCCTTCGATGCGGACCTTC HL6R CCACACTCACCCCCTTGGGATGG
HL2F ATTGAGTTCCTCTTCCTCTACCTG HL7F GGACCACCACGCAGAGTAGG
HL2R CAGAGCTCACAGATGGTGAGTA HL7R TGCCATTCCTCGACTTGTTCTCT
HL3F GCCCATGAGGTGGCAAGAAATG HL8F CAGTCCTATTTTCTATGGCAATGT
HL3R TAGTAAGGTGGAGTGGGTTTGG HL8R TGCCCTACACAAAGGGAAGAGG
HL4F GGCTCCCCAAATACCGAGTC HL9F CGTTTAGAATGGCATCATAAGTGA
HL4R TGGTAGCTGGGGAGAAGTGT HL9R AGCCCATGTATTTGCCCTGTTGC
HL5F AGATACAGCTAGAGTCCTGATT HL10F GAGCAATGCGGGTTCTTTGACG
HL5R AGTGAGCCTTAATAAGTGGGGTC HL10R TGGAACCTTGACCCTCTTGAGA
其中，HL1F、HL2F、HL3F、HL4F、HL5F、HL6F、HL7F、HL8F、HL9F、HL10F是上游引物；HL1R、HL2R、HL3R、HL4R、HL5R、HL6R、HL7R、HL8R、HL9R、HL10R是下游引物；该表中，引物HL1F和HL1R扩增GJB2基因的cDNA35、cDNA176、cDNA176-191、cDNA235、cDNA299-300位点，引物HL2F和HL2R扩增GJB3基因的cDNA538、cDNA547位点，引物HL3F和HL3R扩增12S rRNA基因的cDNA1555、cDNA1494位点，引物HL4F和HL4R扩增SLC26A4基因的281位点，引物HL5F和HL5R扩增SLC26A4基因的589位点，引物HL6F和HL6R扩增SLC26A4基因的IVS7-2位点，引物HL7F和HL7R扩增SLC26A4基因的1174、1226、1229位点，引物HL8F和HL8R扩增SLC26A4基因的IVS15+5位点，引物HL9F和HL9R扩增SLC26A4基因的1975、2027位点，引物HL10F和HL10R扩增SLC26A4基因的2162、2168位点。
上游引物和/或下游引物的5’端带有生物素或荧光素（如Cy3、Cy5等）标记。本发明实施例为对下游引物（HL1R、HL2R、HL3R、HL4R、HL5R、HL6R、HL7R、HL8R、HL9R、HL10R）进行生物素标记，其PCR扩增后的产物可与本发明实施例中的探针杂交。
2、DNA提取和PCR扩增
2.1、提取模板DNA：使用其它商业化试剂盒从病人的血液中提取模板DNA。
2.2、合成10条引物：合成的方法为现有的常规的DNA合成法。
2.3、配制PCR反应液：配制成25μL/人份的PCR反应液，每人份的PCR反应液中各成份及浓度分别为：10条引物浓度分别为0.2μmol/L、Taq酶为0.1U/μL、1×PCR Buffer、MgCl2为1.5mmol/L、dNTP为0.2mmol/L、模板DNA 1~10ng/μL 。
2.4、PCR扩增：PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃ ℃延伸45秒，循环35次；72℃再延伸5分钟。PCR扩增后的产物包含待测病人的DNA片段。
3、杂交及显色
3.1. 杂交
将PCR扩增后的产物与步骤2中的尼龙膜条加入到12mL 的杂交液（2×SSC、0.1%SDS，pH7.4）中，在杂交箱中42℃杂交2~4小时以上。
3.2. 洗膜
将尼龙膜条转移到预热至42℃的洗液（0.5×SSC、0.1%SDS，pH7.4）中，于42℃洗涤15分钟。
c.过氧化物酶（Peroxidase，缩略词为POD）孵育
将膜条放入新鲜配制的0.25U/mL的链霉亲合素-POD（streptin-POD）溶液中，37℃孵育15分钟，使链霉亲合素与PCR产物中的生物素结合，POD连接到PCR产物上，洗去多余的streptin-POD。
d. 显色
现配显色液（0.1mol/L柠檬酸钠、0.1mg/mL TMB、0.0015% H2O2），将膜条放入显色液中避光显色15分钟，有杂交产物的膜条相应探针位置处会显蓝色斑点。
4、结果判断
4.1 信号判断标准和依据
本产品采用人工观察的方式进行判读。通过探针位点上蓝色斑点的有无作为是否发生杂交的定性判断依据，颜色的深浅不能作为定量判定依据。若个别位点有弱信号时，应与其对应的对照点信号作对比，明显弱于对照信号时，应判为非特异信号；对应的对照位点不显色或与对照位点信号相当时，应判为阳性信号。
4.2 阴性判断依据
由于本产品是检测人基因突变的产品，即无论正常人还是发生了遗传性耳聋基因突变的人，检测结果10个正常对照点都应该至少9个位点出现信号。产品规定：10个N位点均显色阳性，20个M位点均为显色阴性，表示该样品结果为阴性，基因简写为N/N（如图1所示）。
4.3 阳性判断依据
在检测过程正常的前提下，任何M位点显色阳性都表示该样品为M位点类型的突变阳性。
见图1-8，若有一个突变位点显色，且其相应的正常位点和其他正常位点都显色，则该样品可判断为突变杂合子，基因型简写为M/N，并在M前加上发生突变的位点（如图2所示）。若有一个突变位点显色，且其相对应的正常位点不显色，则该样品可判断位突变纯合子，基因型简写为M/M，并在两个M前都加上发生突变的位点（如图3-4所示）。若有两个突变位点显色，且其相对应的两个正常位点也都显色，则该样品可判断为双重突变杂合子，基因型简写为M/M，并在两个M前分别加上两个突变位点（不分先后）（如图5-6所示）。若有一个突变位点显色，且所有正常位点都显色，但是这个位点没有设置正常探针，则须根据其双亲的基因型，或者将该样本的测序结果，判断该患者为杂合突变还是纯合突变（如图7-8所示）。
本发明实施例中的以上所述5种情况为绝大多数病例可能出现的情况，若结果超出上述4种情况，在确认实验操作无误的情况下，应每个病例具体分析结果。
针对中国人中最常见的20种遗传性非综合征耳聋基因突变类型，通过将含有20种遗传性非综合征耳聋基因突变位点的突变检测探针固定在膜条上，与待检者相应片段的PCR产物杂交，可同时检测导致遗传性非综合征耳聋的35delG、167delT、176-191del16、235delC、299-300delAT、538C>T、547G>A、1555A>G、1494C>T、281C>T、589G>A、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G这20种突变类型。本发明是基于PCR-膜条杂交技术的基因检测方法，能直接对待检者的基因型进行确诊，具有准确性高、特异性强，能检出基因隐性携带者等优点。因此，应在婚检或孕检中使用该方法对准父母进行基因检测，然后根据情况，必要时对胎儿进行产前检测，这样就可以大大减少遗传性非综合征耳聋患儿的出生。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (1)

1.一种用于扩增非综合征耳聋基因突变位点的PCR引物，其特征在于：包括分别用于扩增20个基因突变位点的10对共20条引物，20个基因突变位点分别为35delG、167delT、176-191del16、235delC、299-300delAT、538C>T、547G>A、1555A>G、1494C>T、281C>T、589G>A、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T和2168A>G；20条引物分别简写为HL1F、HL1R、HL2F、HL2R、HL3F、HL3R、HL4F、HL4R、HL5F、HL5R、HL6F、HL6R、HL7F、HL7R、HL8F、HL8R、HL9F、HL9R、HL10F、HL10R，其中，HL1F和HL1R的扩增位点为35delG、167delT、176-191del16、235delC、299-300delAT，HL2F和HL2R的扩增位点为538C>T、547G>A，HL3F和HL3R的扩增位点为1555A>G、1494C>T，HL4F和HL4R的扩增位点为281C>T，HL5F和HL5R的扩增位点为589G>A，HL6F和HL6R的扩增位点为IVS7-2A>G，HL7F和HL7R的扩增位点为1174A>T、1226G>A、1229C>T，HL8F和HL8R的扩增位点为IVS15+5G>A，HL9F和HL9R的扩增位点为1975G>C、2027T>A，HL10F和HL10R的扩增位点为2162C>T、2168A>G；
所述20条引物的序列分别为：
HL1F：5’- CCAGAGCAAACCGCCCAGAGTA -3’
HL1R：5’- GGGAGCCTTCGATGCGGACCTTC -3’
HL2F：5’- ATTGAGTTCCTCTTCCTCTACCTG -3’
HL2R：5’- CAGAGCTCACAGATGGTGAGTA -3’
HL3F：5’- GCCCATGAGGTGGCAAGAAATG -3’
HL3R：5’- TAGTAAGGTGGAGTGGGTTTGG -3’
HL4F：5’- GGCTCCCCAAATACCGAGTC -3’
HL4R：5’- TGGTAGCTGGGGAGAAGTGT -3’
HL5F：5’- AGATACAGCTAGAGTCCTGATT -3’
HL5R：5’- AGTGAGCCTTAATAAGTGGGGTC -3’
HL6F：5’- GCTGATTTCACTGCTGGATTGCTC -3’
HL6R：5’- CCACACTCACCCCCTTGGGATGG -3’
HL7F：5’- GGACCACCACGCAGAGTAGG -3’
HL7R：5’- TGCCATTCCTCGACTTGTTCTCT -3’
HL8F：5’- CAGTCCTATTTTCTATGGCAATGT -3’
HL8R：5’- TGCCCTACACAAAGGGAAGAGG -3’
HL9F：5’- CGTTTAGAATGGCATCATAAGTGA -3’
HL9R：5’- AGCCCATGTATTTGCCCTGTTGC -3’
HL10F：5’- GAGCAATGCGGGTTCTTTGACG -3’
HL10R：5’- TGGAACCTTGACCCTCTTGAGA -3’。
CN201610137106.5A 2016-03-11 2016-03-11 一种非综合征耳聋基因检测膜条以及pcr引物 Active CN105695582B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610137106.5A CN105695582B (zh) 2016-03-11 2016-03-11 一种非综合征耳聋基因检测膜条以及pcr引物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610137106.5A CN105695582B (zh) 2016-03-11 2016-03-11 一种非综合征耳聋基因检测膜条以及pcr引物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105695582A CN105695582A (zh) 2016-06-22
CN105695582B true CN105695582B (zh) 2023-12-22

Family

ID=56220200

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610137106.5A Active CN105695582B (zh) 2016-03-11 2016-03-11 一种非综合征耳聋基因检测膜条以及pcr引物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105695582B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106636438A (zh) * 2017-02-17 2017-05-10 深圳市亿立方生物技术有限公司 用于诊断pah基因突变的杂交膜条、pcr引物及试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102220434A (zh) * 2011-05-27 2011-10-19 危梅娟 用于诊断非综合征耳聋的杂交膜条、pcr引物及试剂盒
CN104498609A (zh) * 2014-12-18 2015-04-08 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102220434A (zh) * 2011-05-27 2011-10-19 危梅娟 用于诊断非综合征耳聋的杂交膜条、pcr引物及试剂盒
CN104498609A (zh) * 2014-12-18 2015-04-08 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
飞行时间质谱检测技术在非综合征型耳聋基因检测中的应用;曾云等;《中华耳鼻咽喉头颈外科杂志》;20131231;第986页右栏倒数第3段、第988页右栏-第989页左栏第1段 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105695582A (zh) 2016-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102220434B (zh) 用于诊断非综合征耳聋的杂交膜条、pcr引物及试剂盒
CN109706232B (zh) 用于检测人类alk基因融合突变的引物、探针及试剂盒及其检测方法
US10745764B2 (en) Methods to detect and genotype Cryptococcus species
US20150361502A1 (en) Method for screening cancer
CN113614246A (zh) 用于鉴别肿瘤模型的方法和组合物
CN113502335B (zh) 一种与绵羊生长性状相关的分子标记及其应用
WO2024027569A1 (zh) 一种不依赖于先证者的单体型构建方法
US20100248239A1 (en) Methods and materials for detecting fragile x mutations
CN1810989B (zh) 一种等温反应检测具序列特异性的dna和rna的方法
CN101555528B (zh) 一种染色体22q11.2区微缺失、微重复的测定方法
CN105695582B (zh) 一种非综合征耳聋基因检测膜条以及pcr引物
WO2018040320A1 (zh) 一种人果糖二磷酸醛缩酶b基因检测方法及试剂盒
CN107841552B (zh) 一种检测先天性心脏病微缺失或/和微重复的引物组合、mlpa探针、基因芯片及试剂盒
KR101890810B1 (ko) 피코액적 디지탈 pcr을 이용한 상염색체 열성질환의 비침습적 산전 진단 방법 및 그를 위한 키트
KR20110034297A (ko) 내인성 아토피 피부염 진단용 마커 및 그의 용도
CN106636438A (zh) 用于诊断pah基因突变的杂交膜条、pcr引物及试剂盒
CN111334568A (zh) 一种先天性心脏病基因拷贝数变异及易感者筛选的多重连接探针扩增探针组合及试剂盒
CN104531866B (zh) 用于结肠直肠癌中使用的生物标志物
CN104152570B (zh) 一种基底细胞癌易感基因snp多态性检测试剂盒
CN110484627B (zh) 用于监控a/j近交系小鼠遗传质量的方法、引物组及其应用
CN111304323A (zh) 一组评估nk/t细胞淋巴瘤发病风险相关的snp标志物及其应用
KR101728023B1 (ko) Ｐｃｒ―ｌｄｒ을 이용한 ａｔｐ７ｂ 유전자의 돌연변이 검출
CN109457019B (zh) Kcnh2基因scd相关snp检测试剂盒及检测方法
Wang et al. Establishment of a gene detection system for hotspot mutations of hearing loss
CN112725432B (zh) 一种检测Citrin缺乏症基因的引物、探针及其试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant