CN109504753B - 遗传性耳聋相关基因检测芯片试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种遗传性耳聋相关基因检测芯片试剂盒，该试剂盒包括检测遗传性耳聋三个热点基因上20个位点变异的特异性探针和引物，所述20个位点包括：GJB2上5种突变型、SLC26A4上12种突变型以及12S rRNA(MTRNR1，属于线粒体基因)上3种突变型，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:40所示，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO:41～SEQ ID NO:60所示。本发明还公开了具体的检测方法。本发明的试剂盒是特别针对中国南方人群的遗传性耳聋基因的热点突变位点而设计，能提高针对中国南方人群的遗传性耳聋检测的准确率，克服了现有的试剂盒主要针对中国北方人群位点设计，对于南方人群的检测易造成漏检的缺陷。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，特别是涉及一种针对中国南方人群热点突变的遗传性耳聋相关基因检测的基因芯片试剂盒。
背景技术
耳聋是由遗传或/和环境因素引起的听觉传导通路障碍所致的常见听觉问题，已有的研究表明，其中约60％是遗传因素造成的。而在由遗传因素造成的听觉问题中，其中70％左右以常染色体隐性方式遗传。遗传性耳聋由单一基因突变或不同基因的复合突变引起。至今发现的耳聋相关基因已达140余个，具有较高的基因和位点遗传异质性。通过对这些基因的检测分析，可以确定遗传方式，对携带的风险基因做出科学评估，指导科学婚育，预防出生缺陷。
现有的遗传性耳聋相关基因检测方法及试剂盒，主要采用的方法包括：Sanger法测序、高通量基因测序法、毛细管电泳法、限制性酶切(PCR-RFLP)法、变性高效液相色谱分析、突变扩增系统(Amplification Refractory Mutation System，ARMS-PCR)法、高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting，HRM)分析、荧光定量PCR法、基因芯片(包括微阵列芯片)等方法。
采用测序法检测，存在费用高、通量低、检测范围小、难以实现自动化等多方面的不足；高通量基因测序法除了操作繁琐之外，测序仪价格昂贵，试剂成本高，测序成本较高，且数据分析难度较大。应用测序法的技术，如中国专利申请CN200610066222、CN201310292297.9、CN201410795636.X、CN201410625318.9等。
采用毛细管电泳法检测，其仍然存在检测通量较低，检测费用较高的问题，如中国专利申请CN201210033289.8、CN201410143676.6、CN201210033289.8等。
限制性酶切(PCR-RFLP)法检测技术操作繁琐，需要经过酶切反应，反应时间长，同时需要凝胶电泳检测，容易出现样本交叉污染，酶切位点易受基因变异影响。
高分辨溶解曲线(HRM)技术是基于DNA双链中的A、T、C、G组成不同，在加热变性时不同碱基序列的DNA双链的解链温度和熔解曲线的形状不同，根据熔解曲线的不同判断是否存在突变。但荧光熔解曲线法一管检测位点少，且受荧光染料通道限制无法满足耳聋多基因多位点的检测。其应用如中国专利申请CN201610459975.X、ZL201410583806.8。
突变扩增系统(ARMS-PCR)通过设计两个5’端引物、两个3’端引物，进行两个平行PCR来进行基因位点突变的检测，检测灵敏度较高。但四引物ARMS-PCR的一个反应只能检一个突变位点，普通ARMS-PCR产品的扩增效率仅为正常扩增的1-10％，因此扩增体系缺乏稳定性。其应用有中国专利申请201310292297.9。
利用Taqman探针进行SNP突变检测，每检测一个位点需要2条探针，且对探针特异性有较高要求。探针合成成本较高，检测的位点数目较少。而且多重PCR体系优化难度高，同时受荧光通道的限制，不容易实现多位点的同时检测。其应用如中国专利申请CN200610169639、CN200610169638、CN200610066222、CN200810200587、CN201510534781.7、CN201710128321.3。
常见的检测技术，如测序、实时荧光定量PCR等，均需对位点逐一进行检测，当位点较多时操作复杂，费用较高。微阵列芯片法采用了基因芯片杂交的原理，可同时检测多个突变位点。该方法的优点是检测时间比较快速，可以高通量筛查，实现临床快速检测或大规模的人群筛查。
基因芯片，或者微阵列芯片，检测的原理是以基因组DNA为模板，对某些已知的基因位点进行特异性扩增和荧光标记，然后与带有特异性核苷酸序列的芯片进行杂交，通过对荧光进行检测以获得某些特定基因位点的突变情况。采用基因芯片技术，可以同时检测多个基因多个位点。该方法的优点是检测时间比较快速，可以高通量筛查。
基因芯片检测的应用包括中国专利申请号201410795807.9“一种遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒”，它可同时完成21个常见的耳聋位点的检测，但是膜上的位点没有设计阳性和阴性位点，而且膜操作便利程度上较差。微阵列芯片法的应用如博奥生物公司的“九项遗传性耳聋相关基因检测试剂盒(微阵列芯片法)”(中国专利申请号201010247324.7，一种检测遗传性耳聋的试剂盒)和“十五项遗传性耳聋相关基因检测试剂盒(微阵列芯片法)”。其他应用基因芯片技术的专利还有CN200710178153、CN201010599419。
但是在实际使用中我们发现，现有的应用基因芯片(微阵列芯片)检测的各试剂盒对中国南方人群检测的准确度要远低于北方人群。鉴于聋病遗传性在地域分布上的差异，需要开发一种主要针对中国南方人群热点突变的检测芯片试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一在于，提供一种遗传性耳聋相关基因检测芯片试剂盒，能提高针对中国南方人群的遗传性耳聋检测的准确率。
本发明所要解决的技术问题之二在于，提高上述试剂盒用于检测遗传性耳聋相关基因的方法。
为解决上述技术问题之一，本发明提供一种遗传性耳聋相关基因检测芯片试剂盒，该试剂盒是检测遗传性耳聋三个热点基因上20个位点变异：包括GJB2的5种突变型、SLC26A4的12种突变型和12S rRNA(MTRNR1，属于线粒体基因)的3种突变型。该试剂盒包括检测该遗传性耳聋三个热点基因的20个位点变异的特异性探针和引物，所述20个位点分别为：
GJB2上5种突变型：GJB2 c.35delG、GJB2 c.109G>A、GJB2 c.176del16、GJB2c.235delC、GJB2 c.299_300delAT；
SLC26A4上12种突变型：SLC26A4 c.439A>G、SLC26A4 c.589G>A、SLC26A4 c.1079C>T、SLC26A4 c.1174A>T、SLC26A4 c.1226G>A、SLC26A4 c.1229C>T、SLC26A4 c.1520delT、SLC26A4 c.1975G>C、SLC26A4 c.2027T>A、SLC26A4 c.2168A>G、SLC26A4 c.916_917 insG、SLC26A4 c.919-2A>G；
12S rRNA上3种突变型：Mt-DNA m.1494C>T、Mt-DNA m.1555A>G、Mt-DNA m.3243A>G。
聋病遗传性在地域分布上有明显差异，而现有的基因芯片试剂盒在位点设计是以汉族北方人为主，对中国南方人群检测的准确度不高，易造成漏检。我们经研究发现，遗传性耳聋基因GJB3在中国人群中罕见；进一步研究发现，遗传性耳聋基因GJB2、SLC26A4、12SrRNA上的部分位点，如GJB2 c.109G>A、SLC26A4 c.439A>G、SLC26A4 c.589G>A、SLC26A4c.1079C>T、SLC26A4 c.1520delT、SLC26A4 c.916_917insG、SLC26A4 c.919-2A>G、Mt-DNAm.3243A>G，在中国南方人群中更加显著。因此，我们去除了GJB3基因位点设计，以中国南方人群中的热点突变位点设计了一种高通量、高效率、经济的基因突变检测产品，能提高针对中国南方人群的遗传性耳聋检测的准确率。
在具体的实施方式中，针对上述遗传性耳聋三个热点基因上20个位点筛选出40条能特异性杂交的探针，特异性探针的序列(5’-3’)如下所示，其中各探针的5’均进行氨基标记(NH2-T15-)。
针对GJB2 c.35delG位点的特异性探针有2条：
GJB2 c.35delG-W(SEQ ID NO:1)：CTGCAGACGATCCTGGGGGG
GJB2 c.35delG-M(SEQ ID NO:2)：TGCTGCAGACGATCCTGGGGG
针对GJB2 c.109G>A位点的特异性探针有2条：
GJB2 c.109G>A-W(SEQ ID NO:3)：GCTTCATTTTTCGCATTATGATCCTCG
GJB2 c.109G>A-M(SEQ ID NO:4)：GCTTCATTTTTCGCATTATGATCCTCA
针对GJB2 c.176del16位点的特异性探针有2条：
GJB2 c.176del16-W(SEQ ID NO:5)：AGGCTGCAAGAACGTGTGCTACGA
GJB2 c.176del16-M(SEQ ID NO:6)：TAACACCCTGCAGCCAGCTACGA
针对GJB2 c.235delC位点的特异性探针有2条：
GJB2 c.235delC-W(SEQ ID NO:7)：GTGGACACGAAGATCAGCTGCAG
GJB2 c.235delC-M(SEQ ID NO:8)：AGTGGACACGAAGATCAGCTGCA
针对GJB2 c.299_300delAT位点的特异性探针有2条：
GJB2 c.299-delAT-W(SEQ ID NO:9)：AATGCACGTGGCCTACCGGAGACAT
GJB2 c.299-delAT-M(SEQ ID NO:10)：ATGCACGTGGCCTACCGGAGAC
针对SLC26A4 c.439A>G位点的特异性探针有2条：
SLC26A4 c.439A>G-W(SEQ ID NO:11)：TACCTTTTCCAGTGGTGAGTTTAA
SLC26A4 c.439A>G-M(SEQ ID NO:12)：AACCTTTTCCAGTGGTGAGTTTAG
针对SLC26A4 c.589G>A位点的特异性探针有2条：
SLC26A4 c.589G>A-W(SEQ ID NO:13)：AGTGCCCTGACTCTGCTGGTTG
SLC26A4 c.589G>A-M(SEQ ID NO:14)：TAGTGCCCTGACTCTGCTGGTTA
针对SLC26A4 c.1079C>T位点的特异性探针有2条：
SLC26A4 c.1079C>T-W(SEQ ID NO:15)：ACATCATTTTCCATCGCTGTGGTGGC
SLC26A4 c.1079C>T-M(SEQ ID NO:16)：GACATCATTTTCCATCGCTGTGGTGGT
针对SLC26A4 c.1174A>T位点的特异性探针有2条：
SLC26A4 c.1174A>T-W(SEQ ID NO:17)：CCAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATGTT
SLC26A4 c.1174A>T-M(SEQ ID NO:18)：GCAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATGTA
针对SLC26A4 c.1226G>A位点的特异性探针有2条：
SLC26A4 c.1226G>A-W(SEQ ID NO:19)：GTGCTCTCCTGGACGGCCGTGC
SLC26A4 c.1226G>A-M(SEQ ID NO:20)：AGTGCTCTCCTGGACGGCCGTGT
针对SLC26A4 c.1229C>T位点的特异性探针有2条：
SLC26A4 c.1229C>T-W(SEQ ID NO:21)：TCCAGTGCTCTCCTGGACGGCCG
SLC26A4 c.1229C>T-M(SEQ ID NO:22)：TCCAGTGCTCTCCTGGACGGCCA
针对SLC26A4 c.1520delT位点的特异性探针有2条：
SLC26A4 c.1520delT-W(SEQ ID NO:23)：GGAGCTGGCCTTATATTTGGACTGTT
SLC26A4 c.1520delT-M(SEQ ID NO:24)：AGAGCTGGCCTTATATTTGGACTGT
针对SLC26A4 c.1975G>C位点的特异性探针有2条：
SLC26A4 c.1975G>C-W(SEQ ID NO:25)：AAAGTGCCAATCCATAGCCTTG
SLC26A4 c.1975G>C-M(SEQ ID NO:26)：AAAGTGCCAATCCATAGCCTTC
针对SLC26A4 c.2027T>A位点的特异性探针有2条：
SLC26A4 c.2027T>A-W(SEQ ID NO:27)：ACGTTGTTGGAGTGAGATCACT
SLC26A4 c.2027T>A-M(SEQ ID NO:28)：ACGTTGTTGGAGTGAGATCACA
针对SLC26A4 c.2168A>G位点的特异性探针有2条：
SLC26A4 c.2168A>G-W(SEQ ID NO:29)：AGGACACATTCTTTTTGACGGTCCA
SLC26A4 c.2168A>G-M(SEQ ID NO:30)：AGGACACATTCTTTTTGACGGTCCG
针对SLC26A4 c.916_917insG位点的特异性探针有2条：
SLC26A4 c.916_917insG-W(SEQ ID NO:31)：GTCCCTATTCCTATAGAAGTAATTG
SLC26A4 916_917insG-M(SEQ ID NO:32)：GTCCCTATTCCTATAGAAGTAATTGG
针对SLC26A4 c.919-2A>G位点的特异性探针有2条：
SLC26A4 c.919-2A>G-W(SEQ ID NO:33)：TATGAAATGGCAGTAGCAATTATCGTCT
SLC26A4 c.919-2A>G-M(SEQ ID NO:34)：TATGAAATGGCAGTAGCAATTATCGTCC
针对Mt-DNA m.1494C>T位点的特异性探针有2条：
Mt-DNA m.1494C>T-W(SEQ ID NO:35)：GTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGG
Mt-DNA m.1494C>T-M(SEQ ID NO:36)：GTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGA
针对Mt-DNA m.1555A>G位点的特异性探针有2条：
Mt-DNA m.1555A>G-W(SEQ ID NO:37)：CAGTACACTTACCATGTTACGACTTGTC
Mt-DNA m.1555A>G-M(SEQ ID NO:38)：CAGTACACTTACCATGTTACGACTTGCC
针对Mt-DNA m.3243A>G位点的特异性探针有2条：
Mt-DNA m.3243A>G-W(SEQ ID NO:39)：AAGAACAGGGTTTGTTAAGATGGCAGA
Mt-DNA m.3243A>G-M(SEQ ID NO:40)：CAAGAACAGGGTTTGTTAAGATGGCAGG
其中，M表示各检测位点的突变型探针，W代表各检测位点对应的野生型探针。
在具体的实施方式中，所述的检测上述遗传性耳聋三个热点基因上20个位点变异筛选出10对能够高效特意扩增的引物，特异性引物的序列(5’-3’)如下：
GJB2-F1(SEQ ID NO:41)：ATGCTTGCTTACCCAGAC
GJB2-F1(SEQ ID NO:42)：GATCTCCTCGATGTCCTTA
SLC-F1(SEQ ID NO:43)：ACCCTATGCAGACACATTGAACA
SLC-R1(SEQ ID NO:44)：AGCACCTGACCTAAAACAACG
SLC-F2(SEQ ID NO:45)：GGTGGTCAAATCTTCACAGCAT
SLC-R2(SEQ ID NO:46)：AACCCCTTCTTTAGCTGACACC
SLC-F3(SEQ ID NO:47)：GACCCCAAGTACCTATCA
SLC-R3(SEQ ID NO:48)：CCTTCCTCTGTTGCCATT
SLC-F4(SEQ ID NO:49)：TCACATGATGGTACCTGATACATT
SLC-R4(SEQ ID NO:50)：AGGAAGCTCAGCGTGTGTTGT
SLC-F5(SEQ ID NO:51)：GGCAAAGTTCCACAATCA
SLC-R5(SEQ ID NO:52)：ACCAGAACCTTACCACCC
SLC-F6(SEQ ID NO:53)：GCCTGGGCAATAGAATGAGACT
SLC-R6(SEQ ID NO:54)：CCCTCTTGAGATTTCACTTGGT
SLC-F7(SEQ ID NO:55)：TCCCAGTCCCTATTCCTA
SLC-R7(SEQ ID NO:56)：ATGGCTTGACGTTTATCT
MtD-F1(SEQ ID NO:57)：AAAACTACGATAGCCCTTATGAAAC
MtD-R1(SEQ ID NO:58)：AGTGTAAGTTGGGTGCTTTGTGTT
MtD-F2(SEQ ID NO:59)：GGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATC
MtD-R2(SEQ ID NO:60)：TGGCGTCAGCGAAGGGTTGT
在具体的实施方式中，本发明的试剂盒还设有阳性控制位点(P)和阴性控制位点(BLANK)。
本发明中所涉及的检测基因、检测位点及探针信息如下表所示：
本发明中所涉及的引物信息如下表所示：
为解决上述技术问题之二，本发明提供一种采用本发明的试剂盒用于检测遗传性耳聋相关基因的方法，包括以下步骤：
1)提取基因组DNA；
2)进行多重PCR扩增；
3)PCR产物的纯化和标记；
4)PCR产物与芯片杂交；
5)芯片清洗和结果扫描。
在所述步骤1)中，提取到的DNA的量应大于10ng，A260/A280的比值应该在1.6-2.0之间。
在所述步骤2)中，PCR反应体系为：1.5×PCR缓冲液终浓度，dNTPs 0.01～1.5mM，混合引物终浓度为0.01～2μM，Ex DNA聚合酶为0.01～1.0U/μL，MgCl2终浓度为0.5～3.5mM，0.5～2.0×荧光探针；PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火40s，72℃延伸50s，30个循环；72℃延伸5min；16℃保持。
在所述步骤3)中，纯化时，向PCR产物中，加入0.5～2.0U的SAP(ShrimpAlkalinePhosphatase)，2.0～8.0U的Exonuclease I；标记时，采用SBE反应对PCR产物标记。
在所述步骤4)中，将标记产物与4×SSPE和0.5％的阳性参照混合均匀后，加入到芯片上的block上面，放人湿盒中，密封，放入杂交箱或恒温水浴中，在42℃杂交1.5～2.0小时。
在所述步骤5)中，先取出芯片，移至装有A液的50mL管中，轻摇洗涤5分钟；之后将芯片移入B液，轻摇清洗5分钟；再将芯片移入C液，轻摇清洗5分钟。取出，甩干，准备扫描；所述A液为2×SSC，1％SDS；所述B液为1×SSC，0.4％SDS；所述C液为0.6×SSC。
本发明所提供的遗传性耳聋相关基因检测芯片试剂盒的有益效果在于：
1.本发明的试剂盒是特别针对中国南方人群的遗传性耳聋基因的热点突变位点而设计，能提高针对中国南方人群的遗传性耳聋检测的准确率，克服了现有的试剂盒主要针对中国北方人群位点设计，对于南方人群的检测易造成漏检的缺陷。
2.本发明的试剂盒可以同时检测20个位点，检测位点多，是一种高通量、高效率、经济的基因突变检测产品，实现了临床快速检测或大规模的人群筛查。
3.本发明的试剂盒的检测灵敏度高、特异性强和重复性好，经测试其准确性和特异性均为100％。
4.本发明的试剂盒对检测样本中的基因型进行定性分析，以检测位点出现信号与否来进行判断，并且设置了阳性位点和阴性位点，克服了假阳性的影响，重复性好。
附图说明
图1为本发明的试剂盒检测唾液样本的一实施例中对杂交芯片进行扫描的扫描图。
图2为本发明的试剂盒检测血液样本的一实施例中对杂交芯片进行扫描的扫描图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1.基因芯片设计
根据检测目标，从NCBI基因数据库中选取特异性基因序列作为探针；根据所选用的核酸序列进行探针序列及其布局设计，使所设计的探针组合对待测基因的杂交特异性强、探针之间的关联性好、探针阵列及其空间布局的优化；其主要优点是可以同时检测遗传性耳聋三个热点基因上20个位点变异：包括GJB2基因的5种突变型、SLC26A4基因的12种突变型和12S rRNA基因的3种突变型。芯片上探针排布如下表所示：
表1中，芯片采用18×8阵列排布方式，每个方格表示一种探针，且每个方格内的这种探针重复设置三个，检测同一位点的突变探针与正常对照探针于相邻方格排布，其中M表示各检测位点的突变型探针，W代表各检测位点对应的野生型探针。芯片上还设有阳性控制位点(P)和阴性控制位点(BLANK)。
2.引物、探针设计及筛选
针对GJB2基因、SLC26A4基因和12S rRNA基因序列和20个位点变异，设计PCR引物，得到PCR扩增目的DNA片段序列，同时在这些DNA片段序列上设计特异性识别20种变异的20条探针。要求各引物、探针Tm值相差不超过5℃，在同一温度下具有最适宜的杂交灵敏度和特异性。引物和探针序列确定后，合成所需引物及探针序列。根据需要稀释成所需浓度。通过大量实验筛选到10对能够高效特异扩增的引物和40条能特异杂交的探针。此引物和探针长度或位置的改变均会降低本试剂盒的灵敏度、特异性和重复性。
3.本发明试剂盒的引物、探针浓度以及反应体系其他组分浓度确定
由于本试剂盒检测位点多，导致多重PCR容易产生各扩增片段的相互抑制，而且部分基因GC含量高、同源性高且二级结构复杂，导致扩增不稳定，经过大量摸索实验，最终确定最优的PCR反应体系、反应条件如表2所示：
4.PCR产物的纯化
向PCR产物中，加入0.5～2.0U的SAP，2.0～8.0U的Exonuclease I，在37℃孵育20min，然后85℃孵育20min。
5.PCR产物的标记
采用SBE反应对PCR产物杂交，具有特异性好，准确率高的特点。
6.PCR产物的芯片杂交
将标记产物与4×SSPE和0.5％的阳性参照混合均匀后，加入到芯片上的block上面，放人湿盒中，密封，放入杂交箱或恒温水浴中，在42℃杂交1.5～2.0小时。
7.芯片清洗
芯片杂交结束后，取出芯片，移至装有A液的50mL管中，轻摇洗涤5分钟；之后将芯片移入B液，轻摇清洗5分钟；再将芯片移入C液，轻摇清洗5分钟。取出，甩干，准备扫描。
A液：2×SSC，1％SDS
B液：1×SSC，0.4％SDS
C液：0.6×SSC
8.芯片杂交结果扫描与结果判读
使用Axon 4000B(或其他类似的芯片扫描仪)对杂交芯片进行扫描，得到如下扫描图。同时可以通过GenePixPro软件提取芯片上每个点的信号强度，进行图像分析。
9.DNA提取
本试剂盒对基因组DNA的提取方法没有指定要求，一般可用实验室常规方法(酚-氯仿抽提法)或试剂盒提取基因组DNA，推荐使用QIAGEN公司的全血DNA提取试剂盒，或其他商业化的微量样本基因组DNA提取试剂盒，按照操作说明，进行样本DNA的抽提。
样本DNA抽提后，可采用NanoDrop测定DNA的浓度和质量。要求用于进行试验检测的DNA的量应该大于10ng，A260/A280的比值应该在1.6-2.0之间。
10.检测结果
芯片检测结果的判度，应首先判断芯片检测的质量：芯片上的阳性点均应给出阳性杂交信号，阴性点则不应出现杂交信号。芯片上的点至少有一半的点有阳性杂交信号。如芯片质量不合格，则检测结果无效，需要重新进行检测试验。
使用本发明“遗传性耳聋基因检测的试剂盒”检测样本中耳聋相关基因突变情况，共检测样本25例，所有样本均采用金标准测序法进行测序验证，检测结果见表3：
检测的位点包括GJB2基因的c.35delG、c.109G>A、c.176del16、c.235delC、c.299_300delAT，SLC26A4基因的c.439A>G、c.589G>A、c.1079C>T、c.1174A>T、c.1226G>A、c.1229C>T、c.1520delT、c.1975G>C、c.2027T>A、c.2168A>G、c.916_917insG、c.919-2A>G，12SrRNA的m.1494C>T、m.1555A>G、m.3243A>G，共计20个位点。
从表3中可以看到样本中各耳聋基因型分布情况，本发明试剂盒检测范围内的20种突变在一部分样本中存在，且本试剂盒检测准确性和特异性均为100％。
本试剂盒对检测样本中的基因型进行定性分析，以检测位点出现信号与否来进行判断，信号点的强弱不能提供任何定量方面的参考。
本产品可以准确检测20个位点，且目前已经公开的产品中尚未发现有本发明产品检测位点完全相同的产品。
11.下面分别对唾液样本和血液样本进行检测，来说明本发明的试剂盒的检测过程。
1)唾液样本的检测
1.1 基因组DNA的抽提：使用QIAGEN公司的DNA提取试剂盒，或其他商业化的微量样本基因组DNA提取试剂盒，按照操作说明，进行样本DNA的抽提。样本DNA抽提后，可采用NanoDrop测定DNA的浓度和质量。要求用于进行试验检测的DNA的量应该大于10ng，A260/A280的比值应该在1.6-2.0之间。
1.2 多重PCR：提取的基因组DNA按照下列体系和反应条件，进行多重PCR：
1.3 PCR产物的纯化与标记
向PCR产物中，加入1U的Shrimp Alkaline Phosphatase，5U的Exonuclease I，在37℃孵育20min，然后85℃孵育20min。之后，采用SBE反应对PCR产物标记。
1.4 PCR产物的芯片杂交
将标记产物与4×SSPE和0.5％的阳性参照混合均匀后，加入到芯片上的block上面，放人湿盒中，密封，放入杂交箱或恒温水浴中，在42℃杂交1.5～2.0小时。
1.5 芯片清洗
芯片杂交结束后，取出芯片，移至装有A液的50mL管中，轻摇洗涤5分钟；之后将芯片移入B液，轻摇清洗5分钟；再将芯片移入C液，轻摇清洗5分钟。取出，甩干，准备扫描。其中，A液：2×SSC，1％SDS；B液：1×SSC，0.4％SDS；C液：0.6×SSC。
1.6 芯片杂交结果扫描与结果判读
使用Axon 4000B(或其他类似的芯片扫描仪)对杂交芯片进行扫描，得到扫描图如图1所示。同时可以通过GenePixPro软件提取芯片上每个点的信号强度，进行图像分析。
由图1分析可知，被检测样本中，GJB2基因的c.109G>A为杂合型，12S rRNA基因的m.1494C>T为突变型。我们对此样本采用测序进行了验证，测序结果与芯片结果相符合，证实了芯片检测结果的可靠性。
2)血液样本的检测
2.1 基因组DNA的抽提：使用QIAGEN公司的DNA提取试剂盒，或其他商业化的微量样本基因组DNA提取试剂盒，按照操作说明，进行样本DNA的抽提。样本DNA抽提后，可采用NanoDrop测定DNA的浓度和质量。要求用于进行试验检测的DNA的量应该大于10ng，A260/A280的比值应该在1.6-2.0之间。
2.2 多重PCR：提取的基因组DNA按照下列体系和反应条件，进行多重PCR：
2.3 PCR产物的纯化与标记
向PCR产物中，加入1U的Shrimp Alkaline Phosphatase，5U的Exonuclease I，在37℃孵育20min，然后85℃孵育20min。之后，采用SBE反应对PCR产物标记。
2.4 PCR产物的芯片杂交
将标记产物与4×SSPE和0.5％的阳性参照混合均匀后，加入到芯片上的block上面，放人湿盒中，密封，放入杂交箱或恒温水浴中，在42℃杂交1.5～2.0小时。
2.5 芯片清洗
芯片杂交结束后，取出芯片，移至装有A液的50mL管中，轻摇洗涤5分钟；之后将芯片移入B液，轻摇清洗5分钟；再将芯片移入C液，轻摇清洗5分钟。取出，甩干，准备扫描。其中，A液：2×SSC，1％SDS；B液：1×SSC，0.4％SDS；C液：0.6×SSC。
2.6 芯片杂交结果扫描与结果判读
使用Axon 4000B(或其他类似的芯片扫描仪)对杂交芯片进行扫描，得到扫描图如图2所示。同时可以通过GenePixPro软件提取芯片上每个点的信号强度，进行图像分析。
由图2分析可知，被检测样本中，GJB2基因的c.235delC为杂合型，Mt DNA基因的m.1494C>T为杂合型，Mt DNA基因的m.1555A>G为突变型。在同一个样本中发生了多个突变，我们还采用测序进行了验证，测序结果与芯片结果相符合，证实了芯片检测结果的可靠性。
综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 上海伯豪生物技术有限公司
<120> 遗传性耳聋相关基因检测芯片试剂盒
<130> CPC-NP-17-100670
<160> 60
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctgcagacga tcctgggggg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgctgcagac gatcctgggg g 21
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcttcatttt tcgcattatg atcctcg 27
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcttcatttt tcgcattatg atcctca 27
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aggctgcaag aacgtgtgct acga 24
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
taacaccctg cagccagcta cga 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gtggacacga agatcagctg cag 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agtggacacg aagatcagct gca 23
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aatgcacgtg gcctaccgga gacat 25
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atgcacgtgg cctaccggag ac 22
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
taccttttcc agtggtgagt ttaa 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aaccttttcc agtggtgagt ttag 24
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
agtgccctga ctctgctggt tg 22
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tagtgccctg actctgctgg tta 23
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
acatcatttt ccatcgctgt ggtggc 26
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gacatcattt tccatcgctg tggtggt 27
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ccaagagaag aatcctgaga agatgtt 27
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gcaagagaag aatcctgaga agatgta 27
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gtgctctcct ggacggccgt gc 22
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
agtgctctcc tggacggccg tgt 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tccagtgctc tcctggacgg ccg 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
tccagtgctc tcctggacgg cca 23
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ggagctggcc ttatatttgg actgtt 26
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
agagctggcc ttatatttgg actgt 25
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
aaagtgccaa tccatagcct tg 22
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
aaagtgccaa tccatagcct tc 22
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
acgttgttgg agtgagatca ct 22
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
acgttgttgg agtgagatca ca 22
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
aggacacatt ctttttgacg gtcca 25
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
aggacacatt ctttttgacg gtccg 25
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gtccctattc ctatagaagt aattg 25
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gtccctattc ctatagaagt aattgg 26
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
tatgaaatgg cagtagcaat tatcgtct 28
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
tatgaaatgg cagtagcaat tatcgtcc 28
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
gtcctttgaa gtatacttga ggagg 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
gtcctttgaa gtatacttga ggaga 25
<210> 37
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
cagtacactt accatgttac gacttgtc 28
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
cagtacactt accatgttac gacttgcc 28
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
aagaacaggg tttgttaaga tggcaga 27
<210> 40
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
caagaacagg gtttgttaag atggcagg 28
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
atgcttgctt acccagac 18
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
gatctcctcg atgtcctta 19
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
accctatgca gacacattga aca 23
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
agcacctgac ctaaaacaac g 21
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
ggtggtcaaa tcttcacagc at 22
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
aaccccttct ttagctgaca cc 22
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
gaccccaagt acctatca 18
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
ccttcctctg ttgccatt 18
<210> 49
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
tcacatgatg gtacctgata catt 24
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
aggaagctca gcgtgtgttg t 21
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
ggcaaagttc cacaatca 18
<210> 52
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
accagaacct taccaccc 18
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
gcctgggcaa tagaatgaga ct 22
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
ccctcttgag atttcacttg gt 22
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
tcccagtccc tattccta 18
<210> 56
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
atggcttgac gtttatct 18
<210> 57
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
aaaactacga tagcccttat gaaac 25
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
agtgtaagtt gggtgctttg tgtt 24
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
ggagtaatcc aggtcggttt ctatc 25
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
tggcgtcagc gaagggttgt 20
Claims (1)
1.一种针对中国南方人群遗传性耳聋相关基因检测芯片试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测遗传性耳聋三个热点基因上20个位点变异的特异性探针和引物，所述20个位点分别为：
GJB2上5种突变型：GJB2 c.35delG、GJB2 c.109G>A、GJB2 c.176del16、GJB2c.235delC、GJB2 c.299_300delAT；
SLC26A4上12种突变型：SLC26A4 c.439A>G、SLC26A4 c.589G>A、SLC26A4 c.1079C>T、SLC26A4 c.1174A>T、SLC26A4 c.1226G>A、SLC26A4 c.1229C>T 、SLC26A4 c.1520delT、SLC26A4 c.1975G>C、SLC26A4 c.2027T>A、SLC26A4 c.2168A>G、SLC26A4 c.916_917 insG、SLC26A4 c.919-2A>G；
12S rRNA上3种突变型：Mt-DNA m.1494C>T、Mt-DNA m.1555A>G、Mt-DNA m.3243A>G；
所述检测遗传性耳聋三个热点基因上20个位点变异的特异性探针的序列如SEQ IDNO: 1~ SEQ ID NO: 40所示；
所述的检测遗传性耳聋三个热点基因上20个位点突变的特异性引物的序列如SEQ IDNO: 41~ SEQ ID NO: 60所示；
所述试剂盒的检测芯片设置有阳性控制位点和阴性控制位点；
所述试剂盒用于检测时的PCR反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，56℃退火40 s，72℃延伸50 s，30个循环；72℃延伸5 min；16℃保持；
所述PCR反应体系的产物纯化方式为：向所述PCR反应产物中，加入0.05-2.0U的SAP虾碱性磷酸酶，2.0-8.0U的Exonuclease I，在37℃孵育20min，然后85℃孵育20min；
所述PCR反应体系的产物标记方式为：采用SBE反应对PCR产物标记。
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| A Rapid Method for Simultaneous Screening of Multi-Gene Mutations Associated with Hearing Loss in the Korean Population;Borum Sagong等;《PLos One》;20130301;第8卷(第3期);第2页表1 * |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109504753A (zh) | 2019-03-22 |
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