CN104988150B - 用于扩增粉虱科昆虫线粒体coi基因的特异性引物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于扩增粉虱科昆虫线粒体细胞色素c氧化酶I(cytochrome c oxidase I，COI)基因序列的特异性引物，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。采用本发明的扩增引物，可以快速有效地扩增出粉虱科多个物种的COI基因，为粉虱科昆虫的种类鉴定，粉虱科的系统发育关系和特定种昆虫的种群遗传分化和遗传结构等研究提供可靠分析的材料。

Description

用于扩增粉虱科昆虫线粒体COI基因的特异性引物

技术领域

本发明属于应用生物技术领域，具体地说涉及一对用于扩增粉虱科昆虫线粒体细胞色素c氧化酶I(cytochrome c oxidase I；COI)基因的特异性引物。

背景技术

粉虱科(Aleyrodidae)，隶属于半翅目Hemiptera、胸喙亚目Sternorrhyncha。粉虱科昆虫分布于世界各大动物区，寄主植物广泛，部分种类是农业上的重要害虫。如重大农业害虫烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)，其在世界各地广泛分布传播，对农业生产造成了极大的经济损失。

在我国，对农业造成危害的粉虱种类有烟粉虱Bemisia tabaci、温室白粉虱Trialeurodes vaporariorum、黑刺粉虱Aleurocanthus spiniferus、柑桔粉虱Dialeurodes citri、桑粉虱Pealius mori、稻粉虱Vasdavidius indicus还有近年来入侵海南的螺旋粉虱Aleurodicus dispersus等。粉虱类害虫主要以下三种方式危害寄主植物：(1)直接危害：成虫、若虫均能刺吸植物韧皮部的汁液。由于其发育快、繁殖力高，往往短时间内种群就可达到很高密度，从而吸取大量的汁液，导致植物衰弱。(2)间接危害：成虫、若虫分泌蜜露及蜡质物污染植物器官和果实，诱发煤烟病的发生，使植物光合作用受阻，导致叶片萎缩、枯萎和提前落叶，同时使农作物品质及质量下降。(3)部分粉虱是许多病毒病的重要传毒介体，所传播的植物病毒可引致植物畸形和果实败育，造成严重损失。例如B型烟粉虱可以传播多种植物病毒。

由于粉虱科昆虫体型微小，可塑性强，其形态特征会因环境条件、寄主植物差异等存在不同程度的变异，快速鉴定粉虱种类对于非粉虱研究专业人士来说比较困难。其次，目前鉴定粉虱还采用传统意义上的分类方法，及通过形态进行鉴定。但粉虱科昆虫较为特殊，很多粉虱的成虫特征上无明显差别，能用于分类的特征特别少。目前的粉虱科昆虫的分类在科和亚科的水平上依据于成虫和第四龄若虫(伪蛹)的特征，而在族、属和种的水平上则主要利用第四龄若虫(伪蛹)的特征。所以，对于异地采集保存在酒精中的粉虱害虫，采集的粉虱为其成虫，或者是保存不完整的标本等情况，仅仅通过形态鉴定显得十分困难。而分子鉴定技术相对准确、快速，且对于样品的保存相对简单，与样本的完整与否无关，因此，有必要发展其快速分子鉴定技木。随着分子生物学的发展，近年来分子生物学技术发展迅速，利用分子标记技术只需要少量的DNA就可以快速准确地鉴定出昆虫种类，该类技术不仅可以检测成虫，对其它各虫态亦具有同样的检测效能。所以，研究建立一种高效、快速、准确、灵敏且专一性强的粉虱科鉴别方法仍然十分必要。此外，也急需通过成熟的分子方法探讨鉴定昆虫的生物型，如烟粉虱等；建立粉虱科昆虫的系统发育关系和研究特定种的种群遗传分化和遗传结构等。

发明内容

本发明目的是提供一种粉虱科昆虫线粒体COI基因扩增的特异性引物，它能满足现有技术的上述需求。

一对用于粉虱科昆虫线粒体COI基因序列扩增的引物，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明还公开了一种粉虱科昆虫线粒体COI基因序列扩增方法，是采用上述的引物，用50μl PCR体系在特定PCR扩增条件下进行目标片段扩增。

所述的50μl PCR体系是：5μl 10×buffer(+Mg2+)，2.5μl dNTP(2.5mM)，3μl上游引物(10μM)，3μl下游引物(10μM)，0.5μl rTaq酶(5U/μl)，2μl DNA模板(100ng)，34μl双蒸水。

所述的PCR扩增条件是：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟15秒，51℃退火温度1分钟15秒，72℃延伸1分钟5秒，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。

本发明根据粉虱科COI基因序列变异度较高和非特异性扩增引物扩增效率低的特性，通过比对粉虱科不同科物种COI基因序列设计出扩增引物。采用本发明的粉虱科线粒体COI基因的扩增引物，可以有效地扩增出粉虱科不同科物种的COI基因序列，为我国粉虱科昆虫的种类鉴定、系统发育、种群遗传结构、群口演化历史和地理种群鉴别提供了重要工具。本发明涉及的扩增引物较过去通用引物有较大的优势，具体表现为：本引物能有效扩增出1200bp的COI基因片段，长度接近COI基因全长，而过去通用引物有效扩增长度一般为500-750bp，且扩增片段大多为保守区域，不利于上述研究的数据分析；同时，该引物的扩增产物可以直接进行测序，且测序峰图良好，无需借助载体连接，转化和克隆等繁琐程序，对典型粉虱科昆虫进行大规模的遗传背景分析，能显著降低实验成本，缩短实验周期，提高实验的准确性。

附图说明

图1是本发明引物对典型粉虱科昆虫扩增效果图。1、2为杜鹃棒粉虱Aleuroclavarhododendri(Takahashi)；3、4为木通皮粉虱Pealius akebiae(Kuwana)；5、6为扶桑辛氏粉虱Singhius hibisci(Kotinsky)；7、8为温室白粉虱Trialeurodes vaporariorum(Westwood)；9、10为黑刺粉虱Aleurocanthus spiniferus(Quaintance)；11、12为螺旋粉虱Aleurodicus dispersus Russell；13、14为-刺桐粉虱Tetraleurodes acaciae(Quaintance)；15、16为扁担杆褶粉虱Aleurotrachelus grewiae Takahashi；17、18为构骨褶粉虱Crenidorsum micheliae(Takahashi)；19、20为欧洲甘蓝粉虱Aleyrodesproletella(Linnaeus)；21、22为柑橘粉虱Dialeurodes citri(Ashmead)；23、24为桑粉虱Pealius mori(Takahashi)。M为Marker DL 2000。

图2是本发明引物扩增产物部分测序结果峰谱图。

图3是通用引物扩增粉虱科昆虫COI基因扩增效果图。

图4是通用引物扩增产物部分测序结果峰谱图。

具体实施方式

本发明的粉虱科COI基因的扩增引物筛选方法共分两个步骤：1.以已经测得的粉虱科昆虫的线粒体基因组序列中COI基因的序列为基础，通过比对找出COI基因相对保守的序列片段，设计引物；2.将合成的引物对粉虱科昆虫COI基因进行扩增，检测其在粉虱科中的通用性和扩增效率。

下面结合实例对发明做进一步说明：

1.样品采集：2010-2014年在我国江苏、浙江、福建、江西、陕西、湖北、广西、广东、海南等省采集的标本。

2.DNA提取：用解剖针挑取单头烟粉虱成虫，用超纯水(ddH2O)充分洗涤后置于1.5mL离心管中，加入5μL提取裂解液(1％SDS，500mmol·L^-1Tris-HCl，20mmol·L^-1NaCl，1mmol·L^-1EDTA，200mg·mL^-1蛋白酶K溶液)，用封口枪头充分研磨成匀浆，再用25μL提取裂解液冲洗枪头；用微型涡旋混合仪将匀浆充分混匀，放入56℃恒温水浴锅中温浴2～3h；将水浴调到95℃10min使蛋白酶K失活；将离心管在离心机上短暂离心，放入-20℃冰箱中保存备用.

3.数据来源：数据来源于美国国立生物技术信息中心(NCBI,http:/www.ncbi.nlm.gov/)。

4.序列比对：利用BioEdit软件将粉虱科昆虫的线粒体基因组全序列中COI基因的序列进行比对，找出比较保守、碱基变异度最小的序列片段。

5.引物合成：根据上述的比对结果，利用引物设计软件Primer Premier 5在碱基变异度最小的序列片段设计出1对引物。引物序列为SEQ ID NO.1:5’ACTAAYCAYAARGATATTGG3’；SEQ ID NO.2:5’CCCATAGAWAGDACATAATG3’。为了验证本发明引物的特异性，我们同时合成了过去mtDNA COI的通用引物作为对照。其具体序列为：forward：5’-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3’(SEQ ID NO.3)；reword：5’-TCCATGCACTAATCTGCCATATTA-3’(SEQ ID NO.4)。

6.引物扩增：将上述扩增引物分别应用于PCR扩增所采集的样本。设置PCR热循环退火温度范围为50-60℃。

7.扩增结果检测：扩增引物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果显示，该引物可以有效地扩增粉虱科昆虫的线粒体COI基因，扩增效率达100％。利用此对引物扩增出的DNA片段长度约为1200bp(图1)，接近粉虱科昆虫线粒体COI基因的全长(全长为1500bp左右)，且琼脂糖凝胶电泳检测条带较为单一，测序峰图较好(图2)。相反，通用引物扩增出的DNA片段长度约为1000bp(图3)，小于本发明引物的扩增长度，而且，琼脂糖凝胶电泳检测条带大多数为多条带，测序峰谱图较乱(图4)。很明显，该通用引物不适合用于部分粉虱科昆虫COI基因的扩增，且结果不准确。而本发明引物可以有效地扩增出粉虱科不同科物种的COI基因序列，且测序结果较准确。

8.引物扩增条件：上述引物50μl PCR体系为：5μl 10×buffer(+Mg²⁺)，2.5μl dNTP(2.5mM)，3μl上游引物(10μM)，3μl下游引物(10μM)，0.5μl rTaq酶(5U/μl)，2μl DNA模板(100ng)，34μl双蒸水。

Claims (4)

1.一对用于粉虱科昆虫线粒体COI基因序列扩增的引物，其特征在于，其序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.一种粉虱科昆虫线粒体COI基因序列扩增方法，其特征是采用权利要求1所述的引物，用50μl PCR体系在特定PCR扩增条件下进行目标片段扩增。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的50μl PCR体系是：5μl含Mg2+的10×buffer，2.5μl 2.5mM的dNTP，3μl 10μM的上游引物，3μl 10μM的下游引物，0.5μl 5U/μl的rTaq酶，2μl 100ng的DNA模板，34μl双蒸水。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的特定的PCR扩增条件是：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟15秒，51℃退火温度1分钟15秒，72℃延伸1分钟5秒，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。