CN111334561A - 基于pcr-rflp的家栖鼠常见鼠种快速鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于PCR‑RFLP的家栖鼠常见鼠种快速鉴定方法，属于遗传工程技术领域。包括以下步骤：(1)采集鼠类动物组织或排泄物标本；(2)提取标本总核酸；(3)扩增鼠线粒体Cyt‑b基因的完整片段，包含上下游非编码序列，其目的片段长度为1242bp；(4)同时采用两种限制性核酸内切酶BamH1和EcoRI对上述PCR产物进行快速酶切；(5)将酶切产物1.5％琼脂糖凝胶电泳后在荧光成像系统中进行图谱分析。本发明方法具备快速、准确和廉价的优势，对人员技术、设备和试剂的成本要求较低。可以同时鉴定常见的三种鼠种，遗传物质来源广，具有很大的应用推广价值。

Description

基于PCR-RFLP的家栖鼠常见鼠种快速鉴定方法
技术领域
本发明涉及家栖鼠鼠种的鉴定方法，属于遗传工程技术领域。
背景技术
鼠类动物，作为哺乳动物中繁殖最块、生存能力超强的有害动物，不仅给农业和畜牧业造成直接影响，还因其可携带、传播多种病原体，给公众健康带来巨大威胁。我国北方三大家栖鼠主要包括褐家鼠(Rattus norvegicus)、小家鼠(Mus musculus)和黄胸鼠(Rattus tanezumi)，鼠种的鉴定对于鼠的来源地追踪、种群进化分析，以及药物种类和药物投放地的选择等至关重要，从而直接影响防鼠灭鼠的效果。传统形态学的鼠种鉴定方法虽然经典但也存在诸多局限性，对鉴定人员的知识储存和鼠形态完整度均有着较高要求，而鼠的形态特征也可能随着生态学的不断变化而发生变化，给鼠种的鉴定提出了更高的要求。因此迫切需要一种准确的分子生物学鉴定方法来作为传统形态学鉴定方法的补充。随着分子生物学的不断发展和应用，其在鼠种鉴定中可发挥重要作用，如在只有鼠排泄物的条件系即可通过分子鉴定的手段快速获得鼠种的准确信息。
中国专利CN105177153A公开了一种黄胸鼠PCR鉴定引物及鉴定方法，其公开了一组PCR鉴定引物及鉴定方法，但是该方法只适用于黄胸鼠鼠种的鉴定，不能同时鉴定常见的三种鼠种；其所利用的遗传物质来源为鼠尾部末端组织，遗传物质来源受限。
中国专利CN109943644A公开了一种鼠种的分子鉴定方法，同时用特异引物分别扩增两组线粒体基因：但是该方法的PCR产物需要经过纯化回收，且经测序公司测序并进行核酸序列比对后，才能判断鼠种，过程较为复杂繁琐，对实验条件和设备要求较高，在应用中有其局限性。
中国专利CN105385699A公开了三峡库区沿江口岸4种鼠类Cyt-b基因的特异性序列及分子鉴定方法，4种鼠类包括黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠和黑线姬鼠，然而，该发明同样需要进行基因测序和序列比对，过程较为复杂繁琐，对实验条件和设备要求较高。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明拟通过利用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)联合限制性片段长度多态性(Restriction fragmentlength polymorphism,RFLP)的分子生物学手段，建立我国三大家栖鼠(褐家鼠、黄胸鼠和小家鼠)鼠种快速鉴定的方法。可克服传统形态学鉴定方法的局限性，且对鉴定人员的专业分类知识要求不高，用于形态相似或外形难以判别的家栖鼠的鉴定；此外，该方法对于鼠的来源地追踪、种群进化分析，以及药物种类和药物投放地的选择均有重要作用。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案为：
基于PCR-RFLP的家栖鼠常见鼠种快速鉴定方法，包括以下步骤：(1)采集鼠类动物组织或排泄物标本；(2)提取标本总核酸；(3)PCR扩增鼠线粒体Cyt-b基因的完整片段，包含上下游非编码序列，其目的片段长度为1242bp；(4)同时采用两种限制性核酸内切酶BamH1和EcoRI对上述PCR产物进行酶切；(5)将酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，在荧光成像系统中进行图谱分析；
步骤(3)中，用于扩增Cyt-b基因的引物对的序列如下：
序列为SEQ ID NO.1的H6：5’-TCTTCATTTYTGGTTTACAAGACCA-3’；
序列为SEQ ID NO.2的L7：5’-ACYAATGACATGAAAAATCATCGTTG-3’。
步骤(1)中，鼠类标本为内脏、血液、肌肉组织、排泄物或其他富含鼠类遗传物质的标本。
步骤(3)中，用于基因扩增的PCR反应体系为：DNA模板2μL，H6和L7引物各2μL，TaqMaster Mix 25μL，ddH2O 19μL。
步骤(3)中，用于基因扩增的PCR反应条件为：94℃预变性3～5min，94℃变性1min，52～55℃退火1min，72℃延伸1min，32～35个循环，最后再72℃延伸5～10min。
步骤(4)中，酶切反应体系为：步骤(3)所得PCR产物10μL，限制性内切酶BamH1和EcoRI各1μL，酶切缓冲液2μL，ddH2O 16μL；37℃水浴5min。
Cyt-b基因位于线粒体基因组上，线粒体基因组具有重组率低、进化速率适中等特征，同时也包含少量的遗传物质信息，是进行物种鉴定和遗传进化分析相关研究的良好靶标。本发明所述分子鉴定技术主要是通过对线粒体基因组上的一个DNA片段进行序列特异性分析来鉴定鼠种，为其他鼠类研究者提供了更有效的分类学手段。
本发明的关键技术在于扩增线粒体Cyt-b基因的引物序列设计和两种限制性核酸内切酶的联合应用；
引物：在NCBI基因数据库中，查找三种家栖鼠的线粒体Cyt-b基因序列，用引物设计软件Primer根据核心片段两端相似序列设计引物。本发明选取三种家栖鼠共有的Cyt-b基因序列来设计引物。
内切酶：采用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的DNA片段，然后利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，限制性内切酶识别并切割特异的序列位点，然后将酶切后的产物进行电泳，由片段的多样性来比对不同来源基因序列的差异性。不同等位基因的限制性酶切位点数量或分布不同，酶切后会产生不同数量或不同长度的DNA片段条带。
BamH1限制性内切酶识别位点是G GATCC或CCTAG G，在G和G之间进行切割。EcoRI限制性内切酶能专一识别G AATTC序列，在G和A之间将序列切开。
扩增褐家鼠的线粒体Cyt-b基因，经BamH1和EcoRI限制性内切酶酶切后产生2个DNA片段，分别是362bp和880bp；扩增黄胸鼠线粒体Cyt-b基因酶切后，则产生长度大小分别为216bp、362bp和664bp的三条DNA片段；小家鼠的Cyt-b基因片段不具有两种限制性内切酶酶切位点，因此酶切后仍保留长度为1242bp的一条DNA片段，如附图1所示。因此，在同一实验中可以完成三种家栖鼠的同时鉴定。
PCR引物与限制性内切酶相结合，即可完成序列多态性的分析，达到鼠种快速鉴定的目的，而且操作简便、成本低廉，无需再对整条基因片段进行序列测定。
本发明的有益效果在于：
本发明兼具快速、准确和廉价的优势，对人员技术、设备和试剂的成本要求较低，具有很大的应用推广价值。通过采用两种限制性核酸内切酶BamH1和EcoRI对线粒体基因PCR产物进行酶切，读取酶切图谱，即可同时鉴定常见的三种鼠种；且所需鉴定材料遗传物质来源广泛，包含鼠类组织标本即可。
附图说明
图1为三种家栖鼠Cyt-b基因酶切位点及产物条带大小示意图
图2为对捕获的三种家栖鼠采用本发明方法进行鼠种验证的酶切电泳图
图3为采用本发明方法对捕获的家栖鼠进行鼠种鉴定的酶切电泳图
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
采用本发明方法对在河北省石家庄、保定、邯郸和沧州居民区捕获的家栖鼠进行鉴定。
1标本采集与保存：在河北省四个地市的居民区采用黏鼠板捕获鼠类动物5只，现场进行形态学鉴定后，每只鼠取约1-2克肌肉组织冷冻保存。
2总核酸的提取：取出收集的肝脏或肌肉标本，剪碎置于干净的1.5mL离心管中进行震荡研磨，按照Total DNA Isolation Kit试剂盒(Thermo Fisher)使用说明书提取总核酸，获得DNA模板，于-20℃保存备用。
3采用前述引物(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2)扩增Cyt-b基因。PCR反应扩增体系：Taq Mix(2×)25μL，L7、H6引物(浓度为10μmol/L)各2μL，DNA模板2μL，加dd H2O至50μL。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min、53℃退火1min、72℃延伸1min进行35个循环，最后72℃延伸10min。
4采用两种限制性核酸内切酶BamH1和EcoRI对上述PCR产物进行快速酶切。反应体系：10×酶切缓冲液2μL，PCR产物10μL，限制性内切酶BamHI、EcoRI各1μL，加dd H2O 16μL，置37度水浴5min。
5琼脂糖凝胶电泳检测：取20μL酶切产物，1.5％琼脂糖凝胶电泳(120V电压，电泳50min)，GoldView核酸染料染色，荧光成像系统检测，根据图谱进行鼠种快速鉴定(附图2)。鉴定结果为褐家鼠3只、黄胸鼠1只和小家鼠1只，与形态学鉴定结果保持一致。
实施例2
采用本发明方法对在河北省石家庄市赞皇县居民区捕获的家栖鼠进行鉴定。
1标本采集与保存：在居民区采用黏鼠板捕获鼠类动物28只，每只鼠取约1-2克肺组织冷冻保存。
2总核酸的提取：取出收集的肺组织标本，剪碎置于干净的1.5mL离心管中进行震荡研磨，按照Total DNA Isolation Kit试剂盒(Thermo Fisher)使用说明书提取总核酸，获得DNA模板，于-20℃保存备用。
3采用前述引物(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2)扩增Cyt-b基因。PCR反应扩增体系：Taq Mix(2×)25μL，L7、H6引物(浓度为10μmol/L)各2μL，DNA模板2μL，加dd H2O至50μL。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min、53℃退火1min、72℃延伸1min进行35个循环，最后72℃延伸10min。
4采用两种限制性核酸内切酶BamH1和EcoRI对上述PCR产物进行快速酶切。反应体系：10×酶切缓冲液2μL，PCR产物10μL，限制性内切酶BamHI、EcoRI各1μL，加dd H2O 16μL，置37度水浴5min。
5琼脂糖凝胶电泳检测：取20μL酶切产物，1.5％琼脂糖凝胶电泳(120V电压，电泳50min)，GoldView核酸染料染色，荧光成像系统检测，根据图谱进行鼠种快速鉴定(附图3)。鉴定结果为褐家鼠8只、黄胸鼠11只和小家鼠7只。
6结果验证：将剩余的Cyt-b基因的PCR产物送生物公司进行序列测定，经序列比对后进行鼠种分子鉴定，结果与上述PCR-RFLP的鉴定结果完全一致。从而说明本方法可成功鉴定北方广泛分布的三大家栖鼠，在弥补形态学鉴定局限性的同时，达到与序列测定相当的特异性。
序列表
<110> 河北省疾病预防控制中心
<120> 基于PCR-RFLP的家栖鼠常见鼠种快速鉴定方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcttcattty tggtttacaa gacca 25
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acyaatgaca tgaaaaatca tcgttg 26

Claims (5)

1.基于PCR-RFLP的家栖鼠常见鼠种快速鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)采集鼠类动物组织或排泄物标本；(2)提取标本总核酸；(3)PCR扩增鼠线粒体Cyt-b基因的完整片段，包含上下游非编码序列，其目的片段长度为1242bp；(4)同时采用两种限制性核酸内切酶BamH1和EcoRI对上述PCR产物进行酶切；(5)将酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，在荧光成像系统中进行图谱分析；
步骤(3)中，用于扩增Cyt-b基因的引物对的序列如下：
序列为SEQ ID NO.1的H6：5’-TCTTCATTTYTGGTTTACAAGACCA-3’；
序列为SEQ ID NO.2的L7：5’-ACYAATGACATGAAAAATCATCGTTG-3’。
2.根据权利要求1所述的鼠种快速鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中，鼠类标本为内脏、血液、肌肉组织、排泄物或其他富含鼠类遗传物质的标本。
3.根据权利要求1所述的鼠种快速鉴定方法，其特征在于：步骤(3)中，用于基因扩增的PCR反应体系为：DNA模板2μL，H6和L7引物各2μL，Taq Master Mix 25μL，ddH2O19μL。
4.根据权利要求1所述的鼠种快速鉴定方法，其特征在于：步骤(3)中，用于基因扩增的PCR反应条件为：94℃预变性3～5min，94℃变性1min，52～55℃退火1min，72℃延伸1min，32～35个循环，最后再72℃延伸5～10min。
5.根据权利要求1所述的鼠种快速鉴定方法，其特征在于：步骤(4)中，酶切反应体系为：步骤(3)所得PCR产物10μL，限制性内切酶BamH1和EcoRI各1μL，酶切缓冲液2μL，ddH2O16μL；37℃水浴5min。
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