CN104630207A - 一种海洋动物标本保存与dna提取一体化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种海洋动物标本保存与DNA提取一体化方法，其步骤如下：将海洋动物处死后的全体或者部分放入标本瓶，或者同时按每份动物组织0.05-1g分装到2mL EP管中；向标本瓶与/或2mL EP管中加入标本固定与DNA提取一体化试剂；将标本瓶中的组织样本取0.05-1g移入2mL EP管，并吸取原标本瓶中的固定液0.6mL，或者直接取分装并加入试剂的2mL EP管，在55℃下消化1-4h，然后按照常规的酚－氯仿法提取DNA。本发明方法设计合理，操作方便，可以实现海洋动物标本保存与DNA提取一体化操作。
Description
技术领域
本发明涉及海洋动物标本保存和DNA提取的方法，特别是海洋动物标本保存与DNA提取一体化方法。
背景技术
海洋生物遗传育种、系统发生与多样性评估与保护都离不开分子生物学作为先进的手段，而最为基础的工作就是组织样品中DNA的获得。标本DNA能否成功提取，跟标本的保存条件有很大关系。目前常用的海洋动物标本固定主要是用乙醇和福尔马林来保存和固定，但不管用多高浓度的酒精固定，都会导致后期DNA提取得率较低，无法完成一些DNA完整性较高的研究如DNA文库构建、稀有基因的获得、微卫星开发等。因此，一般DNA质量较高的试验都是用新鲜样本现场提取DNA，这就对于野外调查和一些不能及时提取DNA的试验造成了困难，而开发一种可以长期保存，又可以进行DNA提取的方法将具有很大的优势和应用前景。
由于海洋动物长期生活在海洋环境中，形成了有别于陆生动物的一些特殊性组织结构和成分，最典型的表现为含水量大、无机盐离子成分复杂，含量大、一些种类的多糖含量高，这导致用常规的动物标本固定和DNA提取非常困难，且长期固定后不易获得高质量的DNA。陆生动物基因组DNA提取方法中常规的为酚-氯仿法，常用乙醇保存动物标本是最常用且最有效的一种方法，而海洋生物用酒精固定后，经过长期保存用常规的酚-氯仿法很难提取高质量的DNA，这极大的限制了研究领域，特别是基因组文库的构建，一些稀有基因的扩增、单拷贝基因、线粒体基因等，很难完成此类研究任务。
已有学者对如何提高福尔马林固定鱼类标本DNA提取质量进行了研究,提出了一些改进的方法,但是尚未有一整套完整的方案能够得到学术界的普遍认同，发表的一些文献也有一些经过长期固定后得到扩增的事例，但依然对于高质量DNA的获得是一种挑战。通过对大量甲醛-乙醇固定的贝类标本DNA的提取及扩增的尝试，仅有小部分标本能够提取出DNA，而这小部分的标本DNA中，又只有少数能够进行ITS的扩增。原因可能是由于标本保存时间过长、密封不够完好所致。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种快速、经济、操作简便的方法，可以采用一体化试剂来完成海洋动物标本固定与DNA提取的过程，获得高质量DNA，从而提高海洋动物分子生物学的研究效率。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种海洋动物标本保存与DNA提取一体化方法，其特点是，其步骤如下：
(1)样本固定：
a.将海洋动物处死后的全体或者部分放入标本瓶，或者同时按每份动物组织0.05-1g分装到2mL EP管中；
b.向标本瓶与/或2mL EP管中加入标本固定与DNA提取一体化试剂，完全让试剂浸没动物组织，动物组织与试剂的质量体积比为1g：1.2mL；所述的试剂配方为：
pH＝8.0的10mmol/L Tris.Cl，pH＝8.0的0.1mmol/L EDTA，0.5％SDS，Protease K 0.33g/L；
(2)样本保存：样本保存条件温度为-80℃-35℃；
(3)DNA提取：将标本瓶中的组织样本取0.05-1g移入2mL EP管，并吸取原标本瓶中的固定液0.6mL，或者直接取分装并加入试剂的2mL EP管，在55℃下消化1-4h，以消解液透明为准，然后按照常规的酚－氯仿法提取DNA；当固定的是小型海洋动物，样本组织溶解而无法取得固定组织时，直接将原标本瓶固定液旋涡后取固定液0.6mL直接在55℃下消化1-4h，以消解液透明为准，然后按照常规的酚－氯仿法提取DNA。
本发明所述的一种海洋动物标本保存与DNA提取一体化方法的步骤(1)中：所述的海洋动物优选自鱼类、虾类、蟹类、贝类、腔肠动物，也可以为其它的海洋动物。在步骤(2)中：样本保存条件温度优选为-20℃至35℃。在-20℃至35℃可保存至少7个月以上，不影响DNA的提取效率。
以下对发明人所作的研究试验进行阐述。
一、试验过程
(1)取连云港海产海洋生物中，学界认为因多糖含量高、容易降解、最难提取DNA的贝类中的青蛤为代表，100个体分成5组，20℃、35℃、4℃和-20℃这4个保存温度为试验组，以只在以75％酒精固定后的20℃保存样本为对照组。样本大小为2龄蛤随机样本。
(2)配制标本固定与DNA提取一体化试剂1L，青蛤配方为：10mmol/LTris.Cl(pH＝8.0)，0.1mmol/L EDTA(pH＝8.0)，0.5％SDS，Protease K0.33g/L。
(3)活体处死去壳后用超纯水清洗肌肉，吸水纸吸干后取肌肉约1g,加入1.2ml组织固定与DNA提取一体化试剂。每组固定30支，长期放在各自恒温箱内，其中4℃和-20℃在冰箱冷藏和冷冻温度，20℃和35℃为恒温培养箱内完成。
(4)每个月每组取3-8支进行DNA的提取，以评价贝类肌肉组织固定和保存后DNA的提取效果。试验持续时间为2012年7月1日-2013年1月30日，每月30日取样，提取DNA。
(5)DNA提取：将加过固定液的组织样本取0.05g,移入2ml EP管，并吸取原标本瓶中的固定液0.6ml,在55℃水浴摇床下消化1-4h(消化时间以固定液变透明为准),然后按照常规的酚－氯仿法提取DNA。部分固定的样本组织溶解，特别是在35℃下保存的样本，无法取得固定组织，直接将原标本瓶固定液旋涡后取固定液0.6ml直接在55℃下消化1-4h(消化时间以固定液变透明为准),然后按照常规的酚－氯仿法提取DNA，具体为裂解完毕后每只离心管加入600μl Tris饱和酚，轻轻振荡摇匀，颠倒45-55次，室温静置10～15min，12000rpm，4℃离心10min，取上清液，加入600μl氯仿异戊醇混合液，轻轻振荡摇匀，颠倒45-55次，室温静置10～15min，12000rpm，离心10min，取上清液，加入1200μl冷冻无水乙醇，颠倒45-55次，室温静置10～15min，8000rpm，离心10min，弃上清，即得DNA，在离心管中加入1500μl 70％的乙醇，洗涤两次，然后8000rpm，离心8min，弃上清，室温风干，直至乙醇挥发完毕，加入50μlTE，溶解DNA，4℃保存，制备0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。
(6)提取的DNA电泳检测：图1为经过固定7个月的保存后提取DNA的电泳检测效果由图可知，酒精固定后的样本经过7个月出现了降解，拖尾现象明显，DNA提取的得率较低，而其余温度下每组均获得了高质量的DNA，证明了这种固定和提取一体化方法是成功的。
(7)提取的DNA PCR验证检测
利用GenBank中青蛤的微卫星标记QG9-157(登录号：JQ768829)进行PCR验证。
引物序列F:GTCCTGTCCCAATAAACG；R:
TAGCATTCCTTCGCATAA，反应条件：
15μl体系：
PCR反应程序：
产物经常规的8％聚丙烯酰胺凝胶电泳2.5h，银染显色后扫描仪成像。图2为经过固定7个月的保存后提取的DNA进行PCR后的银染显色效果，说明DNA模板不存在问题，30个样本除一个样本略弱外，其余均获得了理想的扩增产物。
附一聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染试剂配制的方法
取PCR产物2μl用8％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,电泳缓冲液为1×TBE。电泳完毕后,硝酸银染色10min,然后Na2CO3显色液显色。
(1)制胶：12％变性聚丙烯酰胺凝胶(30ml量)
而其中30％丙烯酰胺配方为
丙烯酰胺 29g
N',N'二甲基双丙烯酰胺 1g
加水至100ml,将溶液加热至37℃(水浴)，使药品溶解，室温下避光保存，每隔数月重新配置。
(2)0.1％硝酸银染色液(1000ml)
1g硝酸银加去离子水1000ml溶解。棕色瓶中保存，可以反复利用至少两次，如溶液变红且有黑色沉淀产生，则应立即更换新溶液。
(3)Na2CO3显色液(1000ml)
20g NaOH,0.4g Na2CO3,4ml甲醛,定容至1000ml。如不能立即于4℃冰箱保存。
(4)银染方法及注意事项
①取下凝胶，蒸馏水冲洗胶板30s,之后放入0.1％硝酸银染色10min。
②取出胶板，回收染色液(可以多次重复利用)，再用蒸馏水冲洗胶板1min。
③倒少量显色液显色15s，之后放入新配制的显色液中，显清条带为止。
④倒掉显色液，蒸馏水冲洗胶板，停止显色。扫描成像。
与现有技术相比：本发明的优点是提取DNA省去了样本单独固定过程，使样本固定和DNA提取一步完成。且经过本方法处理的海洋动物样本可以大大提高DNA的提取效率，较之前用福尔马林或酒精固定的海洋生物样本的DNA提取得率有很大的提高。此外，本方法用来保存海洋生物标本的方法基本不受环境温度的限制，低温和常温甚至高达35℃都可以保存至少7个月，满足了大部分海洋动物分子生物学研究所用的DNA。
附图说明
图1应用海洋动物标本固定和DNA提取一体化试剂固定7个月时的DNA提取效果图；图中：M：DL2000 Marker；不同的固定保存温度下DNA：1-4,-20℃；5-9：4℃；10-16：20℃；17-18：对照组20℃下酒精固定样本；19-24：35℃
图2为经过固定7个月的保存后提取的DNA进行PCR后的银染显色效果图；
图3为实施例5提取DNA的检测结果图；
图4为实施例6提取DNA的检测结果图。
具体实施方式
以下参照进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1，一种海洋动物标本保存与DNA提取一体化方法，其步骤如下：
(1)样本固定：
a.将海洋动物处死后的全体或者部分放入标本瓶，或者同时按每份动物组织0.05g分装到2mL EP管中；
b.向标本瓶与/或2mL EP管中加入标本固定与DNA提取一体化试剂，完全让试剂浸没动物组织，动物组织与试剂的质量体积比为1g：1.2mL；所述的试剂配方为：
pH＝8.0的10mmol/L Tris.Cl，pH＝8.0的0.1mmol/L EDTA，0.5％SDS，Protease K 0.33g/L；
(2)样本保存：样本保存条件温度为-80℃；
(3)DNA提取：将标本瓶中的组织样本取0.05g移入2mL EP管，并吸取原标本瓶中的固定液0.6mL，或者直接取分装并加入试剂的2mL EP管，在55℃下消化1h，然后按照常规的酚－氯仿法提取DNA；当固定的是小型海洋动物，样本组织溶解而无法取得固定组织时，直接将原标本瓶固定液旋涡后取固定液0.6mL直接在55℃下消化1-4h，然后按照常规的酚－氯仿法提取DNA。
实施例2，一种海洋动物标本保存与DNA提取一体化方法，其步骤如下：
(1)样本固定：
c.将海洋动物处死后的全体或者部分放入标本瓶，或者同时按每份动物组织1g分装到2mL EP管中；
d.向标本瓶与/或2mL EP管中加入标本固定与DNA提取一体化试剂，完全让试剂浸没动物组织，动物组织与试剂的质量体积比为1g：1.2mL；所述的试剂配方为：
pH＝8.0的10mmol/L Tris.Cl，pH＝8.0的0.1mmol/L EDTA，0.5％SDS，Protease K 0.33g/L；
(2)样本保存：样本保存条件温度为35℃；
(3)DNA提取：将标本瓶中的组织样本取1g移入2mL EP管，并吸取原标本瓶中的固定液0.6mL，或者直接取分装并加入试剂的2mL EP管，在55℃下消化1-4h，以消解液透明为准，然后按照常规的酚－氯仿法提取DNA；当固定的是小型海洋动物，样本组织溶解而无法取得固定组织时，直接将原标本瓶固定液旋涡后取固定液0.6mL直接在55℃下消化1-4h，以消解液透明为准，然后按照常规的酚－氯仿法提取DNA。
实施例3，一种海洋动物标本保存与DNA提取一体化方法，其步骤如下：
(1)样本固定：
a.将海洋动物处死后的全体或者部分放入标本瓶，或者同时按每份动物组织0.5g分装到2mL EP管中；
b.向标本瓶与/或2mL EP管中加入标本固定与DNA提取一体化试剂，完全让试剂浸没动物组织，动物组织与试剂的质量体积比为1g：1.2mL；所述的试剂配方为：
pH＝8.0的10mmol/L Tris.Cl，pH＝8.0的0.1mmol/L EDTA，0.5％SDS，Protease K 0.33g/L；
(2)样本保存：样本保存条件温度为-20℃；
(3)DNA提取：将标本瓶中的组织样本取0.5g移入2mL EP管，并吸取原标本瓶中的固定液0.6mL，或者直接取分装并加入试剂的2mL EP管，在55℃下消化1-4h，以消解液透明为准，然后按照常规的酚－氯仿法提取DNA；当固定的是小型海洋动物，样本组织溶解而无法取得固定组织时，直接将原标本瓶固定液旋涡后取固定液0.6mL直接在55℃下消化1-4h，以消解液透明为准，然后按照常规的酚－氯仿法提取DNA。
实施例4，实施例1或2或3所述的一种海洋动物标本保存与DNA提取一体化方法的步骤(1)中：所述的海洋动物选自鱼类、虾类、蟹类、贝类、腔肠动物。
实施例5，海洋动物标本保存与DNA提取一体化方法，其步骤如下，
(1)取得海洋生物活体，以牙鲆为例，取新鲜活鱼3尾；
(2)配制标本固定与DNA提取一体化试剂1L，配方为：10mmol/L Tris.Cl(pH＝8.0)，0.1mmol/L EDTA(pH＝8.0)，0.5％SDS，Protease K 0.33g/L；
(3)活体用超纯水清洗肌肉，吸水纸吸干后取肌肉约1g,加入1.2ml组织固定与DNA提取一体化试剂入样本EP管中，室温保存；
(4)半年内随时均可提取DNA；
(5)DNA提取：将加过固定液的组织样本，经6个月20天常温保存后的样本取0.05g,移入2ml EP管，并吸取原标本瓶中的固定液0.6ml,在55℃水浴摇床下消化1-4h(消化时间以固定液变透明为准),然后按照常规的酚—氯仿法提取DNA。部分固定的样本组织溶解，无法取得固定组织，直接将原标本瓶固定液旋涡后取固定液0.6ml直接在55℃下消化1-2h(消化时间以固定液变透明为准),然后按照常规的酚—氯仿法提取DNA。并在0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。提取DNA的检测结果见图3。
实施例6，海洋动物标本保存与DNA提取一体化方法，其步骤如下，
(1)取得海洋生物活体，以青蛤为例，取新鲜青蛤3枚，均为商品规格；
(2)配制标本固定与DNA提取一体化试剂1L，配方为：10mmol/L Tris.Cl(pH＝8.0)，0.1mmol/L EDTA(pH＝8.0)，0.5％SDS，Protease K 0.33g/L；
(3)活体用超纯水清洗肌肉，吸水纸吸干后取肌肉约1g,加入1.2ml组织固定与DNA提取一体化试剂入样本EP管中，室温保存；
(4)半年内随时均可提取DNA；
(5)DNA提取：将加过固定液的组织样本，经7个月常温保存后的样本取0.05g,移入2ml EP管，并吸取原标本瓶中的固定液0.6ml,在55℃水浴摇床下消化1-4h(消化时间以固定液变透明为准),然后按照常规的酚—氯仿法提取DNA；部分固定的样本组织溶解，无法取得固定组织，直接将原标本瓶固定液旋涡后取固定液0.6ml直接在55℃下消化1-2h(消化时间以固定液变透明为准),然后按照常规的酚—氯仿法提取DNA；并在0.8％琼脂糖凝胶电泳检测；提取DNA的检测结果见图4，M为DNA Marker，1-5为提取的DNA样本。
Claims (3)
1.一种海洋动物标本保存与DNA提取一体化方法，其特征在于，其步骤如下：
（1）样本固定：
将海洋动物处死后的全体或者部分放入标本瓶，或者同时按每份动物组织0.05-1g分装到2mL EP管中；
向标本瓶与/或2mL EP管中加入标本固定与DNA提取一体化试剂，完全让试剂浸没动物组织，动物组织与试剂的质量体积比为1 g：1.2 mL；所述的试剂配方为：
pH=8.0的10mmol/L Tris.Cl，pH=8.0的0.1mmol/L EDTA，0.5％SDS，
Protease K 0.33g/L；
（2）样本保存：样本保存条件温度为-80℃-35℃；
（3）DNA提取：将标本瓶中的组织样本取0.05-1g移入2mL EP管，并吸取原标本瓶中的固定液0.6mL，或者直接取分装并加入试剂的2mL EP管，在55℃下消化1-4h，以消解液透明为准，然后按照常规的酚－氯仿法提取DNA；当固定的是小型海洋动物，样本组织溶解而无法取得固定组织时，直接将原标本瓶固定液旋涡后取固定液0.6mL直接在55℃下消化1-4h，以消解液透明为准，然后按照常规的酚－氯仿法提取DNA。
2.根据权利要求1所述的一种海洋动物标本保存与DNA提取一体化方法，其特征在于，步骤（1）中：所述的海洋动物选自鱼类、虾类、蟹类、贝类、腔肠动物。
3.根据权利要求1所述的一种海洋动物标本保存与DNA提取一体化方法，其特征在于，步骤（2）中：样本保存条件温度为-20℃至35℃。
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