CN106834460A - 一种鸡胚蛋性别快速鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新的鸡胚蛋性别快速鉴定方法：种蛋孵化至16、17或18日龄，通过1ml注射器于胚蛋尖端无菌获取尿囊液（10μL），取样后石蜡封口进行正常孵化；以取得的尿囊液为模板，设计CDH‑W特异性引物进行PCR扩增，通过凝胶电泳检测扩增产物并进行性别鉴定：雄性扩增为双带（600bp和450bp），雌性为单带（450bp）；正常孵化出雏后统计孵化率和死亡率并与对照组进行生物统计学分析；对比性别鉴定的结果和出雏后仔鸡的剖检结果，进行关联分析，统计性别鉴定的准确率（准确率达99%，视为100%有效）。

Description

一种鸡胚蛋性别快速鉴定方法
技术领域
本发明涉及家禽养殖、性别鉴定、发育生物学和组织与细胞工程等领域，具体涉及一种鸡胚蛋性别快速鉴定方法。
背景技术
鸡性别鉴定在养殖业和发育生物学研究中具有十分重要的意义，在蛋用鸡群中，母鸡的经济价值要高于公鸡；而在肉用鸡群中，公鸡的经济价值高于母鸡。同时家鸡也是鸟类基础研究和发育生物学的模式动物。因此，在鸡出壳之前对鸡进行性别鉴定能够在很大程度上减少成本，节约人力物力；也能为相关研究提供实验基础。目前国内外对鸡胚性别鉴定的方法已有大量报道。目前主要有形态学方法、细胞生物学方、DNA含量方法和激素含量测定法等多种方法，但是在多种方法中，PCR方法以其易于取材，操作简便，准确率高等特点具有明显的优越性。Clinton等报道了一种快速的PCR鉴定方法，利用提取的4.5天胚蛋的组织提取DNA进行鉴定。李治利等则利用PCR技术对12和16天胚蛋进行全血采集后提取血液基因组进行鉴定。王嘉利等改进样本采集方法，对12.5胚蛋采集的尿囊液和羊水进行处理后进行PCR鉴定。虽然大量研究表明PCR方法在鸡胚性别鉴定中可行性较高，但是在样本采集后仍需要进一步处理，且存在各种各样的问题而难以进行推广，还需要进一步的优化和改进。
发明内容
本发明目的在于提供一种新的鸡胚蛋性别快速鉴定方法，采用本方法，能够实现在鸡胚胎时期快速取样进行性别鉴定，鉴定准确率100％，本方法无需对样本进行处理，鉴定步骤更为简便可行，且对鸡胚正常孵化和发育无影响，这是目前在其他方法中没有提及的一种新方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现的，一种鸡胚蛋性别快速鉴定方法，包括以下步骤：
(1)16，17，18天胚龄胚蛋尿囊液采集
胚蛋正常孵化至16，17，18日胚龄，使用1ml注射器通过胚蛋尖端位置取尿囊液(取样量：10μL)，取样前用酒精擦拭胚蛋取样位置，取样后使用石蜡封口后继续进行孵化。
(2)CDH-W特异引物性别鉴定
根据CDH-W在鸡NCBI数据库中CDS序列设计引物，分别扩增ZW染色体不同片段，雄性扩增为双带(600bp和450bp)，雌性为单带(450bp)。引物序列为：上游Forward:5’-TGCAGAAGCAATATTACAAG-3’；下游Reward:5’–AATTCATTATCATCTGGTGG-3’。以取得的尿囊液为模板，直接进行PCR扩增，通过凝胶电泳检测扩增产物，通过扩增产物大小对胚蛋的性别进行鉴定。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
第一，不同日龄尿囊液获取对孵化率影响：种蛋分别孵化至16、17、18日龄，使用1ml注射器通过胚蛋尖端位置取尿囊液(取样量：10μL)后石蜡封口正常孵化至出雏，统计孵化率和死亡率并与对照组进行生物统计学分析。
第二，性别鉴定准确率检测：对比性别鉴定的结果和出雏后仔鸡的剖检结果，进行关联分析，统计性别鉴定的准确率(准确率达99％，视为100％有效)
第三，本方法为改进性发明，主要为了提供一种新的鸡胚蛋性别快速鉴定方法。采用本方法，能够实现在鸡胚胎时期快速取样进行性别鉴定，鉴定准确率100％，本方法无需对样本进行处理，鉴定步骤更为简便可行，且对鸡胚正常孵化和发育无影响，这是目前在其他方法中没有提及的一种新方法。
第四，本发明的优越性在于：1、取样方法简单易行，无需对采样样本进行处理，能够较快的在的鸡胚特定阶段鉴定鸡胚的性别。2.鉴定准确率高，可重复性强，在普通实验室即可进行。3.鉴定对胚蛋的正常孵化和孵化率无影响。4.该方法适用于家鸡，开辟了一条新的在不影响孵化率基础上准确率高的快速性别鉴定方法。
附图说明
图1是胚蛋取样位置示意图。利用1ml注射器针头于胚蛋尖端正上方打孔，针头伸入胚蛋3-5mm，取样10μL，取样后石蜡封口，正常孵化。
图2是性别鉴定结果图。A:PCR性别鉴定结果，雄性扩增为双带(600bp和450bp)，雌性为单带(450bp)；B:两性剖检结果，雌性右侧性腺退化，左侧性腺膨大成海绵状；雄性两侧性腺为对称颗粒状。
图3是孵化后雏鸡发育状况对比图，取样后对雏鸡发育无影响。A:对照组与16天取样组发育对比图；B:对照组与17天取样组发育对比图；C:对照组与18天取样组发育对比图。
图4a、4b、4c是性别鉴定结果，与剖检结果一致，准确率达100％。其中，图4a:16天取样鉴定结果与剖检结果；图4b:17天取样鉴定结果与剖检结果；图4c:18天取样鉴定结果与剖检结果。
图5是性别鉴定流程图。
具体实施方式
如图5所示，一种鸡胚蛋性别快速鉴定方法，包括如下步骤：
(1)16，17，18天胚龄胚蛋尿囊液采集
如图1所示，胚蛋正常孵化至16，17，18日胚龄，使用1ml注射器通过胚蛋尖端位置取尿囊液(取样量：10μL)，取样前用酒精擦拭胚蛋取样位置，取样后使用石蜡封口后继续进行孵化。
(2)CDH-W特异引物性别鉴定
根据CDH-W在鸡NCBI数据库中CDS序列设计引物，分别扩增ZW染色体不同片段，雄性扩增为双带(600bp和450bp)，雌性为单带(450bp)。引物序列为：上游Forward:5’-TGCAGAAGCAATATTACAAG-3’；下游Reward:5’–AATTCATTATCATCTGGTGG-3’。以取得的尿囊液为模板，直接进行PCR扩增，通过凝胶电泳检测扩增产物，通过扩增产物大小对胚蛋的性别进行鉴定，见图2。
(3)不同日龄尿囊液获取对孵化率影响
种蛋分别孵化至16、17、18日龄，使用1ml注射器通过胚蛋尖端位置取尿囊液(取样量：10μL)后石蜡封口正常孵化至出雏，统计孵化率和死亡率并与对照组进行生物统计学分析。
(4)性别鉴定准确率检测
对比性别鉴定的结果和出雏后仔鸡的剖检结果，进行关联分析，统计性别鉴定的准确率，见图3、图4a、图4b、图4c(准确率达99％，视为100％有效)。
实施例1
(1)16，17，18天胚龄胚蛋尿囊液采集
胚蛋正常孵化至16，17，18日胚龄，使用1ml注射器通过胚蛋尖端位置(如附图1所示)取尿囊液(取样量：10μL)，取样前用酒精擦拭胚蛋取样位置，取样后使用石蜡封口(如附图2所示)后继续进行孵化。
(2)CDH-W特异引物性别鉴定
根据CDH-W在鸡NCBI数据库中CDS序列设计引物，分别扩增ZW染色体不同片段，雄性扩增为双带(600bp和450bp)，雌性为单带(450bp)。引物序列为：上游Forward:5’–TGCAGAAGCAATATTACAAG-3’；下游Reward:5’–AATTCATTATCATCTGGTGG-3’。以取得的尿囊液为模板，直接进行PCR扩增，通过凝胶电泳检测扩增产物，通过扩增产物大小对胚蛋的性别进行鉴定，雄性扩增为双带(600bp和450bp)，雌性为单带(450bp)。
步骤如下：
a.PCR扩增程序：鉴定体系为20μL，体系成分如下：
混合后进行PCR反应，PCR反应程序如下：
35个循环，72℃延伸10mins。
b.凝胶电泳鉴定性别
扩增得到的产物，经与loading bufeer混合后，在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，所用电泳缓冲液为TAE Buffer，电泳时使用marker对其大小进行比对，雌性为双带，雄性为单带。
(3)不同日龄尿囊液获取对孵化率影响
种蛋分别孵化至16、17、18日龄，使用1ml注射器通过胚蛋尖端位置取尿囊液(取样量：10μL)后石蜡封口正常孵化至出雏，统计孵化率和死亡率并与对照组进行生物统计学分析。
分组情况如下：
对照组1：正常孵化，未作如何处理；对照组2：正常孵化，仅打孔不取样；实验组1：16天胚龄胚蛋尿囊液取样；实验组2：17天胚龄胚蛋尿囊液取样；实验组3：18天胚龄胚蛋尿囊液取样。所有分组取样小孔用石蜡封口后继续孵化。
(4)性别鉴定准确率检测
对比性别鉴定的结果和出雏后仔鸡的剖检结果，进行关联分析，统计性别鉴定的准确率。
SEQ ID NO.1
<110>扬州大学
<120>一种鸡胚蛋性别快速鉴定方法
<160>2
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>上游引物
<400>1
TGCAGAAGCA ATATTACAAG 20
SEQ ID NO.2
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>下游引物
<400>2
AATTCATTAT CATCTGGTGG 20

Claims (2)

1.一种鸡胚蛋性别快速鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法包括以下步骤：
（1）16、17或18天胚龄胚蛋尿囊液采集
胚蛋正常孵化至16、17或18日胚龄，使用1ml注射器通过胚蛋尖端位置取尿囊液；
（2）CDH-W特异引物性别鉴定
根据CDH-W在鸡NCBI数据库中CDS序列设计引物，引物序列为：上游Forward: 5’-TGCAGAAGCAATATTACAAG-3’；下游 Reward: 5’–AATTCATTATCATCTGGTGG-3’； 以取得的尿囊液为模板，直接进行PCR扩增，通过凝胶电泳检测扩增产物，通过扩增产物大小对胚蛋的性别进行鉴定分别扩增ZW染色体不同片段，雄性扩增为双带，即600bp和450bp，雌性为单带，即450bp。
2.根据权利要求1所述的鸡胚蛋性别快速鉴定方法，其特征在于：所述尿囊液的取样量为10μL，取样前用酒精擦拭胚蛋取样位置，取样后使用石蜡封口后继续进行孵化，鉴定无需对样品进行处理。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111690594A (zh) * 2020-07-16 2020-09-22 扬州大学 一种鸡两性cef的体外分离和培养方法
CN111925981A (zh) * 2020-08-26 2020-11-13 扬州大学 一种分离鸡雌雄原始生殖细胞的方法
CN112746070A (zh) * 2021-01-28 2021-05-04 江苏省家禽科学研究所 用于鸡早期性别鉴定的引物对、试剂盒以及它们的应用
CN115521984A (zh) * 2021-06-25 2022-12-27 华中农业大学 利用胫色遗传与透射光谱在鸡胚胎中期无损雌雄鉴别的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2473030B1 (en) * 2009-09-02 2013-11-13 Visser 's-Gravendeel Holding B.V. Method for preparing an invasive test of an egg and for determining a gender of an embryo in an egg
CN105191831A (zh) * 2015-09-25 2015-12-30 中国农业大学 一种鸡胚蛋性别鉴定方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2473030B1 (en) * 2009-09-02 2013-11-13 Visser 's-Gravendeel Holding B.V. Method for preparing an invasive test of an egg and for determining a gender of an embryo in an egg
CN105191831A (zh) * 2015-09-25 2015-12-30 中国农业大学 一种鸡胚蛋性别鉴定方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘宏祥 等: "快速鉴定主要禽类性别的一对新的通用引物", 《农业生物技术学报》 *
吴丽丽 等: "基于CHD基因利用PCR技术进行鸡早期性别鉴定", 《热带农业工程》 *
桑润滋 等: "《动物繁殖生物技术》", 31 July 2006, 中国农业出版社 *
王嘉力 等: "家鸡CHD1基因PCR快速性别鉴定方法的建立及其在早期鸡胚中的应用", 《家禽科学》 *
魏泽辉 等: "家鸡早期胚胎性别鉴定体系的建立", 《第十四届全国家禽科学学术讨论会》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111690594A (zh) * 2020-07-16 2020-09-22 扬州大学 一种鸡两性cef的体外分离和培养方法
CN111925981A (zh) * 2020-08-26 2020-11-13 扬州大学 一种分离鸡雌雄原始生殖细胞的方法
CN112746070A (zh) * 2021-01-28 2021-05-04 江苏省家禽科学研究所 用于鸡早期性别鉴定的引物对、试剂盒以及它们的应用
CN115521984A (zh) * 2021-06-25 2022-12-27 华中农业大学 利用胫色遗传与透射光谱在鸡胚胎中期无损雌雄鉴别的方法

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