CN108531547A - 一种用于假肉监测的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及食品检测领域，公开了一种用于假肉监测的检测方法，其包括以下步骤：(1)样品DNA的提取；(2)根据牛、山羊、猪、鸡的线粒体基因，应用CLUSTALW1.83软件和BLAST软件进行序列比较，用Primer Premier 5.0设计一条公用上游引物，再根据种属间的差异设计各自的特异下游引物，建立反应体系，其反应体系为：25μL由10×SYBR Green I，3.0μL DNA模板，15μL Isothermal MasterMix Iso‑001，上游引物与4条下游引物各0.5μL组成。本发明的检测方法具有简便、高效、快速的特点。

Description

一种用于假肉监测的检测方法
技术领域
本发明涉及食品检测领域，尤其涉及了一种用于假肉监测的检测方法。
背景技术
中国畜禽肉品的消费市场庞大，六十年来我国年人均肉类消费量增长了近13倍。随着需求的不断增大，交易市场不规范、市场管理水平低下等为不法分子的不法行为提供了可乘之机，肉类尤其是牛肉、羊肉、驴肉等高价肉品掺假利润丰厚，掺假肉主要集中在注水、注胶肉；牛、羊肉中掺杂鸭肉或猪肉；牛、羊肉与狗肉等肉类食品中掺杂植物源型蛋白；再有，肉制品中掺杂狐狸肉、貉子肉等经济动物肉等形式。
传统对肉品质的鉴别方法主要是依赖于感官判断和形态学检验。但感官判断和形态学检验的局限性较大，尤其不适用于肉类来源鉴别和加工产品的鉴别。
目前对肉类成分的鉴别方法主要包括：基于蛋白的检测方法，如免疫学方法和液相色谱方法；以及基于核酸的方法，主要包括利用PCR技术对肉源性成分鉴别的方法。由于食品前处理过程易使得蛋白变性或降解，同时对肉类食品的原材料来自何种组织或器官无法了解，而许多蛋白在不同组织不同器官中的表达情况都存在不同，因此基于蛋白的肉类检测方法存在一定的局限性。基于核酸检测的荧光定量PCR技术由于其灵敏度高，操作简易，检测过程短，因而在日常肉类成分鉴别中有着普遍的应用，常用的荧光定量PCR法包括TaqManTM和SYBR Green两种。TaqManTM方法由于需要合成荧光标记的特异性引物，对不同的肉类成分需要合成不同的特异性探针，导致检测成本高。而SYBR Green方法则是将荧光染料加在反应体系中，无需合成荧光标记的特异性探针，因而更加简便且检测成本较低。在利用核酸对肉类成分检测的方法中，由于一些深加工肉制品，DNA损失的程度在90％以上，同时由于不同食品的配料和生产方式不同，因此有可能存在抑制PCR的成分，容易导致对肉类成分鉴定的PCR反应不成功，从而出现假阴性样品的结果。因此，畜肉及深加工肉制品掺假亟待需开发一种简便、高效、快速的检测方法。
发明内容
本发明针对现有技术中样品预处理繁杂、检测成本较高和易出现假阳性等缺点，提供了一种简便、高效、快速的用于假肉监测的检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：
一种用于假肉监测的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，样品DNA提取
50mg肉组织用液氮研磨成粉，加入1mL细胞裂解液；样品在55℃恒温过夜；溶解产物转移至离心管，加入1mL的Tris饱和酚和1mL的8-羟基喹啉，混匀轻摇10min后进行第一次离心后取第一水相，用1/2第一水相体积的Tris饱和酚萃取后进行第二次离心后取第二水相，加入1/2第二水相体积的氯仿，混匀30s后进行第三次离心取第三水相；将第三水相转移至另一离心管，用均为1/20第三水相体积、浓度为3mol/L的醋酸钠和无水乙醇沉淀后进行第四次离心，弃上清，得到的沉淀物用70％的乙醇清洗，干燥后溶于100μL TE缓冲液中得到DNA提取物，该提取物即为DNA模板，用超微量核酸蛋白分析仪测定模板DNA的质量和浓度；
细胞裂解液为Tris-HCI、EDTA、NaCl、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠(SDS)、核糖核酸酶(RNase酶)组成的混合液，其中Tris-HCI的浓度为50mmol/L、pH为8.0，乙二胺四乙酸的浓度为10mmol/L、pH为8.0，NaCl的浓度为100mmol/L，蛋白酶K的浓度150μg/mL，十二烷基硫酸钠的质量分数为2％，核糖核酸酶的体积为10μL；TE缓冲液：10mL浓度为1mol/L、pH为8.0的Tris-HCl和2mL浓度为500mmol/L、pH为8.0的EDTA混合，之后加水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min；
步骤二，根据猪(GenBank登录号：GU135833.1)、牛(GenBank登录号：HQ184045.1)、山羊(GenBank登录号：AB044308.1)、鸡(GenBank登录号：GU261717.1)线粒体细胞色素b基因序列，应用CLUSTALW1.83软件和BLAST软件进行序列比较，用Primer Premier 5.0设计一条公用上游引物，再根据种属间的差异设计各自的特异下游引物，建立反应体系，反应体系为：25μL由10×SYBR Green I，3.0μL DNA模板，15μLIsothermal Master Mix Iso-001，上游引物与7条下游引物各0.5μL组成。
作为优选，第一次离心、第二次离心的离心条件：温度为15℃、转速为10000rpm，离心时间为10min；第三次离心、第四次离心的离心条件：相对离心场为1200g，离心时间为15min。
作为优选，上游引物序列为5'-GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'，下游引物序列为：牛5'-CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG-3'；山羊5'-CTCGACAAATGTGAGTTACAGAGGAA-3'；猪5'-GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA-3'；鸡5'-AAGATACAGATGAAGAAGAATGAGGCG-3'。
作为优选，牛、山羊、猪、鸡的特异性扩增产物片段分别为274bp，157bp，398bp，227bp。
经复杂加工的熟肉制品提取的DNA片段有时会破碎断裂，因而选取了扩增效果最稳定、扩增片段小的引物，避免了肉因高温高压处理DNA被破坏而引起的假阴性结果。
作为优选，反应体系的反应条件为95℃预变性3min；40个循环：95℃变性30s，58～68℃退火30～50s，72℃延伸30s。
作为优选，反应体系的反应条件为95℃预变性3min；40个循环：95℃变性30s，59℃退火31s，72℃延伸30s。
本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：采用液氮研磨，防止了因研磨过程中发热而导致的DNA降解和断裂，从而保证DNA的完整性，且节省时间；去除蛋白质常用酚/氯仿提取，但酚类物质具有高度腐蚀性，易引起严重烧伤，并且易被氧化产生醌、二酸等破坏核酸的二酯键，并引起DNA链的交联，因此在离心时同时加入Tris饱和酚和8-羟基喹啉，以减少酚氧化，并提供颜色指示；现有一般采用醋酸钠和无水乙醇沉淀DNA，但无水乙醇容易将醋酸钠一起沉淀，在DNA沉淀中无水乙醇难以挥发除去，且实验的重复性差，加入无水乙醇可以使DNA沉淀完全；经复杂加工的熟肉制品提取的DNA片段有时会破碎断裂，因而选取了扩增效果最稳定、扩增片段小的引物，避免了肉因高温高压处理DNA被破坏而引起的假阴性结果；可以根据需要灵活组合鉴定的肉制品种类和检测样本的份数。
附图说明
图1为引物灵敏度电泳图谱，M：1000bp ladder DNAmarker；C：鸡；B：牛；S：山羊；P：猪。
图2为本发明实施例1引物特异性电泳谱图。
图3为本发明实施例2引物特异性电泳谱图。
图4为本发明实施例3引物特异性电泳谱图。
图5为本发明实施例4引物特异性电泳谱图。
具体实施方式
下面实施例是对本发明进一步详细描述，但不是限制本发明的范围。
实施例1
一种用于假肉监测的检测方法，包括以下步骤：
步骤一，样品DNA提取
50mg肉组织用液氮研磨成粉，加入1mL细胞裂解液；样品在55℃恒温过夜；溶解产物转移至离心管，加入1mL的Tris饱和酚和1mL的8-羟基喹啉，混匀轻摇10min后进行第一次离心后取第一水相，用1/2第一水相体积的Tris饱和酚萃取后进行第二次离心后取第二水相，加入1/2第二水相体积的氯仿，混匀30s后进行第三次离心取第三水相；将第三水相转移至另一离心管，用均为1/20第三水相体积、浓度为3mol/L的醋酸钠和无水乙醇沉淀后进行第四次离心，弃上清，得到的沉淀物用70％的乙醇清洗，干燥后溶于100μL TE缓冲液中得到DNA提取物，该提取物即为DNA模板，用超微量核酸蛋白分析仪测定模板DNA的质量和浓度；
细胞裂解液为Tris-HCI、EDTA、NaCl、蛋白酶K、SDS、RNase酶组成的混合液，其中Tris-HCI的浓度为50mmol/L、pH为8.0，乙二胺四乙酸的浓度为10mmol/L、pH为8.0，NaCl的浓度为100mmol/L，蛋白酶K的浓度150μg/mL，十二烷基硫酸钠的质量分数为2％，核糖核酸酶的体积为10μL；TE缓冲液：10mL浓度为1mol/L、pH为8.0的Tris-HCl和2mL浓度为500mmol/L、pH为8.0的EDTA混合，之后加水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min；
步骤二，根据牛、山羊、猪、鸡线粒体基因，应用CLUSTALW1.83软件和BLAST软件进行序列比较，用PrimerPremier 5.0设计一条公用上游引物，再根据种属间的差异设计各自的特异下游引物，建立反应体系，反应体系为：25μL由10×SYBR Green I，3.0μL DNA模板，15μLIsothermal MasterMix Iso-001，Isothermal Master Mix Iso-001购自英国的Optigene公司；上游引物与4条下游引物各0.5μL组成。
第一次离心、第二次离心的离心条件：温度为15℃、转速为10000rpm，离心时间为10min；第三次离心、第四次离心的离心条件：相对离心场为1200g，离心时间为15min。
上游引物序列为5'-GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'，下游引物序列为：牛5'-CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG-3'；山羊5'-CTCGACAAATGTGAGTTACAGAGGAA-3'；猪5'-GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA-3'；鸡5'-AAGATACAGATGAAGAAGAATGAGGCG-3'。
牛、山羊、猪、鸡的特异性扩增产物片段分别为274bp，157bp，398bp，227bp。
经复杂加工的熟肉制品提取的DNA片段有时会破碎断裂，因而选取了扩增效果最稳定、扩增片段小的引物，避免了肉因高温高压处理DNA被破坏而引起的假阴性结果。
反应体系的反应条件为95℃预变性3min；40个循环：95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s。
实施例2
与实施例1相同，不同之处在于，反应体系的反应条件为95℃预变性3min；40个循环：95℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸30s。
实施例3
与实施例1相同，不同之处在于，反应体系的反应条件为95℃预变性5min；40个循环：95℃变性40s，65℃退火50s，72℃延伸30s。
实施例4
与实施例1相同，不同之处在于，反应体系的反应条件为95℃预变性5min；40个循环：95℃变性40s，68℃退火30s，72℃延伸30s。
实施例5
与实施例1相同，不同之处在于，反应体系的反应条件为95℃预变性3min；40个循环：95℃变性30s，59℃退火31s，72℃延伸30s。
实验结果
1、DNA提取方法对浓度与OD260/280值的影响
表1 DNA提取方法对浓度与OD260/280值的影响
实施例2、实施例3、实施例4、实施例5与实施例1的检测结果相同，CTAB-蛋白酶K法由于对肌肉组织消化效果较差，因此，DNA的提取效率低，实施例1中对样品DNA的提取因为在离心时同时加入饱和酚和8-羟基喹啉，以减少酚氧化，并提供颜色指示；现有一般采用醋酸钠和无水乙醇沉淀DNA，但无水乙醇容易将醋酸钠一起沉淀，在DNA沉淀中无水乙醇难以挥发除去，且实验的重复性差，加入70％的乙醇可以使DNA沉淀完全。因此，相对于试剂盒法，实施例1-5的提取效率高，而且无蛋白质、酚的污染。
2、肉样检测
表2肉样检测结果
3、退火温度及时间对反应特异性的影响
退火温度是引物与模板结合的温度，是影响反应特异性的重要因素，退火温度过低会产生非特异性扩增，退火温度过高扩增不出目的片段，对退火温度的控制可以保证整个目的片段的完整扩增。将100ng·μL-1猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉来源的DNA模板原液进行10倍梯度稀释，使用引物对之进行检测以考察方法的灵敏度，结果如图1所示。实施例1、实施例2、实施例3及实施例4对反应特异性的影响如图2-5所示，实施例5与实施例4一致，实施例1的扩增电泳带最为清晰，实施例3的最为不清晰。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种用于假肉监测的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，样品DNA提取
50mg肉组织用液氮研磨成粉，加入1mL细胞裂解液；样品在55℃恒温过夜；溶解产物转移至离心管，加入1mL的Tris饱和酚和1mL的8-羟基喹啉，混匀轻摇10min后进行第一次离心后取第一水相，用第一水相1/2体积的Tris饱和酚萃取后进行第二次离心后取第二水相，加入第二水相1/2体积的氯仿，混匀30s后进行第三次离心取第三水相；将第三水相转移至另一离心管，用均为第三水相1/20体积、浓度为3mol/L的醋酸钠和无水乙醇沉淀后进行第四次离心，弃上清，得到的沉淀物用70％的乙醇清洗，干燥后溶于100μL TE缓冲液中得到DNA提取物，该提取物即为DNA模板，用超微量核酸蛋白分析仪测定模板DNA的质量和浓度；
细胞裂解液为Tris-HCl、乙二胺四乙酸、NaCl、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠、核糖核酸酶组成的混合液，其中Tris-HCI的浓度为50mmol/L、pH为8.0，乙二胺四乙酸的浓度为10mmol/L、pH为8.0，NaCl的浓度为100mmol/L，蛋白酶K的浓度150μg/mL，十二烷基硫酸钠的质量分数为2％，核糖核酸酶的体积为10μL；TE缓冲液的组成为10mL、浓度为1mol/L、pH为8.0的Tris-HCl和2mL、浓度为500mmol/L、pH为8.0的乙二胺四乙酸混合，之后加水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min；
步骤二，根据牛、山羊、猪、鸡线粒体基因，应用CLUSTALW1.83软件和BLAST软件进行序列比较，用Primer Premier 5.0设计一条公用上游引物，再根据种属间的差异设计各自的特异下游引物，建立反应体系，反应体系为：25μL由10×SYBR Green I，3.0μL DNA模板，15μL Isothermal MasterMix Iso-001，上游引物与4条下游引物各0.5μL组成。
2.根据权利要求1所述的用于假肉监测的检测方法，其特征在于：第一次离心、第二次离心的离心条件：温度为15℃、转速为10000rpm，离心时间为10min；第三次离心、第四次离心的离心条件：相对离心场为1200g，离心时间为15min。
3.根据权利要求1所述的用于假肉监测的检测方法，其特征在于：上游引物序列为5'-GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'，下游引物序列为：牛5'-CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG-3'；山羊5'-CTCGACAAATGTGAGTTACAGAGGAA-3'；猪5'-GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA-3'；鸡5'-AAGATACAGATGAAGAAGAATGAGGCG-3'。
4.根据权利要求1所述的用于假肉监测的检测方法，其特征在于：牛、山羊、猪、鸡的特异性扩增产物片段分别为274bp，157bp，398bp，227bp。
5.根据权利要求1所述的用于假肉监测的检测方法，其特征在于：反应体系的反应条件为95℃预变性3min；40个循环：95℃变性30s，58～68℃退火30～50s，72℃延伸30s。
6.根据权利要求5所述的用于假肉监测的检测方法，其特征在于：反应体系的反应条件为95℃预变性3min；40个循环：95℃变性30s，59℃退火31s，72℃延伸30s。
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