CN107699614A - 乌梢蛇毛细管电泳dna指纹图谱及鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种涉及中药材乌梢蛇DNA鉴定技术,该方法具体是SSR荧光标记乌梢蛇DNA毛细管电泳指纹图谱及鉴定方法。具有分辨率高、操作简便、快速、结果准确等特点,能够用于乌梢蛇样品的鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及中药材鉴定技术,具体是SSR荧光标记乌梢蛇DNA毛细管电泳指纹图谱及鉴定方法。
背景技术
乌梢蛇是我国传统名贵药材,《中国药典》(2015年版)规定其正品为游蛇科动物乌梢蛇Zaocysdhumnades (Cantor)的干燥体。多于夏、秋二季捕捉,剖开腹部或先剥皮留头尾,除去内脏,盘成圆盘状,干燥。有祛风,通络,止痉等功效。用于风湿顽痹,麻木拘挛,中风口眼哨斜,半身不遂,破伤风等。由于其养殖成本高、价格昂贵,而需求量极大,因此市售药材中常有混伪品充斥。
乌梢蛇的现行质量评价方法有很多,传统鉴别是通过性状差异、理化方法进行区分,但主观性强,鉴别时间长、成本高。并且,乌梢蛇在干燥和制成饮片过程中性状的可塑性很大,导致理化性状鉴别效果不理想,难以满足对乌梢蛇鉴定的准确、快速和客观的要求。因此,为乌梢蛇的真伪鉴别提供一种简便实用、准确性高的方法尤为重要。
DNA指纹鉴定是以DNA分子为标记的中药分子鉴定方法。生物体无论是在生长过程发育过程还是经过人为加工,DNA序列均不会变,并且特定的物种具有特定的DNA序列,因此这种方法特别适用。近年来,以SSR标记为基础的DNA指纹鉴定技术已趋成熟,并被广泛应用。SSR标记具有以下优点:(1)数量丰富,覆盖整个基因组,揭示的多态性高;(2)具有多等位基因的特性,提供的信息量高;(3)以孟德尔方式遗传,呈共显性。
发明内容
本发明的目的是提供一种SSR荧光标记乌梢蛇DNA毛细管电泳指纹图谱及鉴定方法,以解决现有技术的缺陷。本方法分辨率高、灵敏度高、操作简便、快速、安全、结果准确,能够用于乌梢蛇样品的鉴定。
本发明的目的是由以下技术方案来实现的:
一种SSR荧光标记乌梢蛇DNA毛细管电泳指纹图谱的建立方法,其特征是,它包含下述步骤:
1)DNA提取:取乌梢蛇片,按盐析法提取其DNA;
2)PCR扩增:PCR总体积为10μl,包含1.0 μl模板DNA、1.5 mM Mg2+、0.2 mM dNTPs、正反向引物各0.5 μM、5*SSR缓冲液2.0 μl和Taq DNA聚合酶0.5U。对上述DNA进行扩增;
3)PCR产物纯化:吸取稀释后的PCR产物1.0 μl注入进样板,加灭菌双蒸水9.0 μl使总体积至10 μl,离心。再加入30 μl乙醇乙酸钠,8℃、3600r/min离心30 min。弃上清液,加入50 μl 70%乙醇漂洗1次,置于室温晾干。
4)PCR产物鉴定:扩增产物进行毛细管电泳分析,记录电泳图谱;并构建乌梢蛇DNA指纹图谱。
一种乌梢蛇DNA指纹鉴定方法,其特征是,它包含下述步骤:
1)先建立乌梢蛇DNA标准指纹图谱,方法如下:
(a)DNA提取:取乌梢蛇对照药材,按盐析法提取DNA;
(b)PCR扩增:PCR总体积为10μl,包含1.0 μl模板DNA、1.5 mM Mg2+、0.2 mM dNTPs、正反向引物各0.5 μM、5*SSR缓冲液2.0 μl和Taq DNA聚合酶0.5U。对上述DNA进行扩增;
(c)PCR产物鉴定:扩增产物进行毛细管电泳分析,记录电泳图谱;并构建乌梢蛇DNA指纹图谱。;
2)测定样品DNA指纹图谱:以上述相同的方法测定待测乌梢蛇样品,得样品DNA指纹图谱;
3)结果鉴定:利用相似度分析软件比较样品DNA指纹图谱与乌梢蛇DNA标准指纹图谱的相似度,根据相似度对乌梢蛇样品进行真伪鉴定。
本发明与现有技术相比,具有以下优点:
1.本发明将SSR荧光标记技术数量丰富、多态性高的特点和高效毛细管电泳快速、分辨率高、灵敏度高的特点结合起来,并将其用于中药材乌梢蛇的DNA指纹图谱及指纹鉴定方法的建立,这在乌梢蛇鉴定的应用方面属于首创。
2.本发明采用高效毛细管电泳技术分析PCR扩增产物,与目前常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳相比,高效毛细管电泳具有灵敏度高、分辨率高、分析速度快、重复性和稳定性好、样品用量小、成本低、不使用放射性同位素和剧毒试剂等优点。
3.本发明以乌梢蛇对照药材的原始电泳图谱构建乌梢蛇DNA标准指纹图谱,不进行人为的删减或修改,保证了指纹图谱的完整性,使鉴定结果更准确和客观。
4.由于本发明DNA指纹图谱以图的形式表示,看起来比较直观、易懂;并由于对样品进行鉴定时利用相似度分析软件,根据相似度对乌梢蛇样品进行真伪鉴定,更容易实现自动化分析。
附图说明
图1 乌梢蛇DNA标准指纹图谱
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明,下面实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。
实施例 1
乌梢蛇毛细管电泳DNA指纹图谱的建立
1.DNA提取
取本品0.5g,置乳钵中,充分研磨使成粉末,取0.lg置1.5 m l离心管中,加入消化液275μl,在55℃水浴保温1小时,加入裂解缓冲液250μl,混匀,加到DNA纯化柱中,离心(10000转/1分钟)3分钟;弃去过滤液,加人洗脱液 800μl,离心(10000转/1分钟)1分钟;弃去过滤液,用上述洗脱液反复洗脱 3 次,每次离心(10000转/1分钟)1分钟;弃去过滤液,再离心2分钟,将DNA 纯化柱转移人另一离心管中,加入无菌双蒸水100μl,室温放置2分钟后,离心(10000转/1分钟)2分钟,取上清液,作为供试品溶液,置-20℃保存备用。
2.PCR扩增
PCR总体积为10μl,包含1.0 μl模板DNA、1.5 mM Mg2+、0.2 mM dNTPs、正反向引物各0.5 μM、5*SSR缓冲液2.0 μl和Taq DNA聚合酶0.5U。对上述DNA进行扩增;循环参数设置为:94℃预变性5min,94℃变性80sec,36℃退火1min,72℃延伸2min,45个循环后72℃延伸10min。
3.PCR产物鉴定
将步骤2中的PCR扩增产物进行毛细管电泳分析,具体步骤如下:
3.1仪器、试剂
ABI 3130XLDNA测序仪、乙酸钠(CH3COONa)、乙二胺四乙酸(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸二氢钠、氢氧化钠为分析纯、灭菌双蒸水。乌梢蛇对照药材(中国食品药品检定研究院121591-201201),市售乌梢蛇(吉林市各大药店随机采购随机采购),常见伪品乌梢蛇(吉林市药检所鉴定提供并坚定)。
3.2电泳条件
15 kV下3 min;电进样1.6 kV下23 s;正式毛细管电泳15 kV下25 min.
4.记录乌梢蛇的电泳图谱,作为乌梢蛇 DNA 标准指纹图谱,此标准指纹图谱可用于乌梢蛇样品的鉴定(见图 1)。
实施例 2
将本发明的乌梢蛇DNA指纹鉴定方法用于某个乌梢蛇样品的鉴定
假设现有一批乌梢蛇样品不能确定是否是真正的乌梢蛇,因此,按照如下方法对它进行鉴定。乌梢蛇DNA标准指纹图谱建立以后,要对某个样品进行鉴定时,首先用盐析法提取其线粒体DNA;用提取的DNA作为模板,用SSR引物对其进行PCR扩增;扩增产物进行毛细管电泳分析并记录电泳图谱,即得该批待测样品的DNA指纹图谱;利用相似度分析软件比较待测样品DNA指纹图谱与乌梢蛇DNA标准指纹图谱的相似度,根据相似度对待测样品进行鉴定。鉴定结果:若二者相似度大于90%(含90%),这批样品就是真正的乌梢蛇;若二者相似度小于90%,那么这批样品就不是真正的乌梢蛇。
Claims (2)
1.一种中药材乌梢蛇DNA鉴定方法,其特征在于:所述方法利用SSR荧光标记与乌梢蛇DNA相结合,可以快速准确的鉴别乌梢蛇及其真伪。
2.一种如权利要求1中所述中药材乌梢蛇DNA鉴定方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)DNA提取:取乌梢蛇片,按盐析法提取其DNA;
2)PCR扩增:PCR总体积为10μl,包含1.0 μl模板DNA、1.5 mM Mg2+、0.2 mM dNTPs、正反向引物各0.5 μM、5*SSR缓冲液2.0 μl和Taq DNA聚合酶0.5U;
对上述DNA进行扩增;
3)PCR产物纯化:吸取稀释后的PCR产物1.0 μl注入进样板,加灭菌双蒸水9.0 μl使总体积至10 μl,离心;
再加入30 μl乙醇乙酸钠,8℃、3600r/min离心30 min;弃上清液,加入50 μl 70%乙醇漂洗1次,置于室温晾干;
4)PCR产物鉴定:扩增产物进行毛细管电泳分析,记录电泳图谱;并构建乌梢蛇DNA指纹图谱。
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