CN107699614A - 乌梢蛇毛细管电泳dna指纹图谱及鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种涉及中药材乌梢蛇DNA鉴定技术，该方法具体是SSR荧光标记乌梢蛇DNA毛细管电泳指纹图谱及鉴定方法。具有分辨率高、操作简便、快速、结果准确等特点，能够用于乌梢蛇样品的鉴定。

Description

乌梢蛇毛细管电泳DNA指纹图谱及鉴定方法

技术领域

本发明涉及中药材鉴定技术，具体是SSR荧光标记乌梢蛇DNA毛细管电泳指纹图谱及鉴定方法。

背景技术

乌梢蛇是我国传统名贵药材，《中国药典》(2015年版)规定其正品为游蛇科动物乌梢蛇Zaocysdhumnades (Cantor)的干燥体。多于夏、秋二季捕捉，剖开腹部或先剥皮留头尾，除去内脏，盘成圆盘状，干燥。有祛风，通络，止痉等功效。用于风湿顽痹，麻木拘挛，中风口眼哨斜，半身不遂，破伤风等。由于其养殖成本高、价格昂贵，而需求量极大，因此市售药材中常有混伪品充斥。

乌梢蛇的现行质量评价方法有很多，传统鉴别是通过性状差异、理化方法进行区分，但主观性强，鉴别时间长、成本高。并且，乌梢蛇在干燥和制成饮片过程中性状的可塑性很大，导致理化性状鉴别效果不理想，难以满足对乌梢蛇鉴定的准确、快速和客观的要求。因此，为乌梢蛇的真伪鉴别提供一种简便实用、准确性高的方法尤为重要。

DNA指纹鉴定是以DNA分子为标记的中药分子鉴定方法。生物体无论是在生长过程发育过程还是经过人为加工，DNA序列均不会变，并且特定的物种具有特定的DNA序列，因此这种方法特别适用。近年来，以SSR标记为基础的DNA指纹鉴定技术已趋成熟，并被广泛应用。SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性。

发明内容

本发明的目的是提供一种SSR荧光标记乌梢蛇DNA毛细管电泳指纹图谱及鉴定方法，以解决现有技术的缺陷。本方法分辨率高、灵敏度高、操作简便、快速、安全、结果准确，能够用于乌梢蛇样品的鉴定。

本发明的目的是由以下技术方案来实现的：

一种SSR荧光标记乌梢蛇DNA毛细管电泳指纹图谱的建立方法，其特征是，它包含下述步骤：

1)DNA提取：取乌梢蛇片，按盐析法提取其DNA；

2)PCR扩增：PCR总体积为10μl，包含1.0 μl模板DNA、1.5 mM Mg2+、0.2 mM dNTPs、正反向引物各0.5 μM、5*SSR缓冲液2.0 μl和Taq DNA聚合酶0.5U。对上述DNA进行扩增；

3)PCR产物纯化：吸取稀释后的PCR产物1.0 μl注入进样板，加灭菌双蒸水9.0 μl使总体积至10 μl，离心。再加入30 μl乙醇乙酸钠，8℃、3600r/min离心30 min。弃上清液，加入50 μl 70％乙醇漂洗１次，置于室温晾干。

4)PCR产物鉴定：扩增产物进行毛细管电泳分析，记录电泳图谱；并构建乌梢蛇DNA指纹图谱。

一种乌梢蛇DNA指纹鉴定方法，其特征是，它包含下述步骤：

1)先建立乌梢蛇DNA标准指纹图谱，方法如下：

(a)DNA提取：取乌梢蛇对照药材，按盐析法提取DNA；

(b)PCR扩增：PCR总体积为10μl，包含1.0 μl模板DNA、1.5 mM Mg2+、0.2 mM dNTPs、正反向引物各0.5 μM、5*SSR缓冲液2.0 μl和Taq DNA聚合酶0.5U。对上述DNA进行扩增；

(c)PCR产物鉴定：扩增产物进行毛细管电泳分析，记录电泳图谱；并构建乌梢蛇DNA指纹图谱。；

2)测定样品DNA指纹图谱：以上述相同的方法测定待测乌梢蛇样品，得样品DNA指纹图谱；

3)结果鉴定：利用相似度分析软件比较样品DNA指纹图谱与乌梢蛇DNA标准指纹图谱的相似度，根据相似度对乌梢蛇样品进行真伪鉴定。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1.本发明将SSR荧光标记技术数量丰富、多态性高的特点和高效毛细管电泳快速、分辨率高、灵敏度高的特点结合起来，并将其用于中药材乌梢蛇的DNA指纹图谱及指纹鉴定方法的建立，这在乌梢蛇鉴定的应用方面属于首创。

2.本发明采用高效毛细管电泳技术分析PCR扩增产物，与目前常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，高效毛细管电泳具有灵敏度高、分辨率高、分析速度快、重复性和稳定性好、样品用量小、成本低、不使用放射性同位素和剧毒试剂等优点。

3.本发明以乌梢蛇对照药材的原始电泳图谱构建乌梢蛇DNA标准指纹图谱，不进行人为的删减或修改，保证了指纹图谱的完整性，使鉴定结果更准确和客观。

4.由于本发明DNA指纹图谱以图的形式表示，看起来比较直观、易懂；并由于对样品进行鉴定时利用相似度分析软件，根据相似度对乌梢蛇样品进行真伪鉴定，更容易实现自动化分析。

附图说明

图1 乌梢蛇DNA标准指纹图谱

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，下面实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。

实施例 1

乌梢蛇毛细管电泳DNA指纹图谱的建立

1.DNA提取

取本品0.5g，置乳钵中，充分研磨使成粉末，取0.lg置1.5 m l离心管中，加入消化液275μl，在55℃水浴保温1小时，加入裂解缓冲液250μl，混匀，加到DNA纯化柱中，离心（10000转/1分钟）3分钟；弃去过滤液，加人洗脱液 800μl，离心(10000转/1分钟）1分钟；弃去过滤液，用上述洗脱液反复洗脱 3 次，每次离心(10000转/1分钟)1分钟；弃去过滤液，再离心2分钟，将DNA 纯化柱转移人另一离心管中，加入无菌双蒸水100μl，室温放置2分钟后，离心（10000转/1分钟）2分钟，取上清液，作为供试品溶液，置-20℃保存备用。

2.PCR扩增

PCR总体积为10μl，包含1.0 μl模板DNA、1.5 mM Mg2+、0.2 mM dNTPs、正反向引物各0.5 μM、5*SSR缓冲液2.0 μl和Taq DNA聚合酶0.5U。对上述DNA进行扩增；循环参数设置为：94℃预变性5min，94℃变性80sec，36℃退火1min，72℃延伸2min，45个循环后72℃延伸10min。

3.PCR产物鉴定

将步骤2中的PCR扩增产物进行毛细管电泳分析，具体步骤如下：

3.1仪器、试剂

ABI 3130XLDNA测序仪、乙酸钠（CH₃COONa）、乙二胺四乙酸(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸二氢钠、氢氧化钠为分析纯、灭菌双蒸水。乌梢蛇对照药材(中国食品药品检定研究院121591-201201)，市售乌梢蛇(吉林市各大药店随机采购随机采购)，常见伪品乌梢蛇(吉林市药检所鉴定提供并坚定)。

3.2电泳条件

15 kV下3 min；电进样1.6 kV下23 s；正式毛细管电泳15 kV下25 min.

4.记录乌梢蛇的电泳图谱，作为乌梢蛇 DNA 标准指纹图谱，此标准指纹图谱可用于乌梢蛇样品的鉴定(见图 1)。

实施例 2

将本发明的乌梢蛇DNA指纹鉴定方法用于某个乌梢蛇样品的鉴定

假设现有一批乌梢蛇样品不能确定是否是真正的乌梢蛇，因此，按照如下方法对它进行鉴定。乌梢蛇DNA标准指纹图谱建立以后，要对某个样品进行鉴定时，首先用盐析法提取其线粒体DNA；用提取的DNA作为模板，用SSR引物对其进行PCR扩增；扩增产物进行毛细管电泳分析并记录电泳图谱，即得该批待测样品的DNA指纹图谱；利用相似度分析软件比较待测样品DNA指纹图谱与乌梢蛇DNA标准指纹图谱的相似度，根据相似度对待测样品进行鉴定。鉴定结果：若二者相似度大于90％(含90％)，这批样品就是真正的乌梢蛇；若二者相似度小于90％，那么这批样品就不是真正的乌梢蛇。

Claims (2)

1.一种中药材乌梢蛇DNA鉴定方法，其特征在于：所述方法利用SSR荧光标记与乌梢蛇DNA相结合，可以快速准确的鉴别乌梢蛇及其真伪。

2.一种如权利要求1中所述中药材乌梢蛇DNA鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)DNA提取：取乌梢蛇片，按盐析法提取其DNA；

2)PCR扩增：PCR总体积为10μl，包含1.0 μl模板DNA、1.5 mM Mg2+、0.2 mM dNTPs、正反向引物各0.5 μM、5*SSR缓冲液2.0 μl和Taq DNA聚合酶0.5U；

对上述DNA进行扩增；

3)PCR产物纯化：吸取稀释后的PCR产物1.0 μl注入进样板，加灭菌双蒸水9.0 μl使总体积至10 μl，离心；

再加入30 μl乙醇乙酸钠，8℃、3600r/min离心30 min；弃上清液，加入50 μl 70％乙醇漂洗1次，置于室温晾干；

4)PCR产物鉴定：扩增产物进行毛细管电泳分析，记录电泳图谱；并构建乌梢蛇DNA指纹图谱。