CN106434910A - 一种冬虫夏草鉴别用引物、扩增体系及鉴别方法 - Google Patents

一种冬虫夏草鉴别用引物、扩增体系及鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药材分子鉴别领域，具体涉及一种冬虫夏草鉴别用ISSR‑PCR引物SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2，所述引物用于冬虫夏草、中国被毛孢菌丝体、虫草花、兰坪虫草和/或古尼虫草的鉴别；及一种包含所述的引物的冬虫夏草鉴别用ISSR‑PCR扩增体系；及一种利用所述ISSR‑PCR扩增体系的冬虫夏草ISSR鉴别方法；及一种本发明所述ISSR鉴别方法应用于鉴定冬虫夏草复方产品中是否含有正品冬虫夏草的用途。本发明所述的鉴定方法准确可靠，重复性好、分辨率高，操作快捷，成本较低。

Description

一种冬虫夏草鉴别用引物、扩增体系及鉴别方法
技术领域
本发明属于中药材分子鉴别领域，具体涉及利用ISSR分子标记方法对冬虫夏草及其相似种进行鉴别。
技术背景
冬虫夏草[Cordyceps sinensis(Berk)Sacc]，鳞翅目蝙蝠蛾科蝠蛾属幼虫被中国被毛孢(Hirsutella sinensis)寄生后形成的虫菌复合体，为国家二级保护濒危物种，具有补肺益肾，止血，化痰的功效。因其极高的临床药用价值与滋补保健作用，冬虫夏草日益受到人们的青睐，但由于其资源被过度采挖和气候的变化，产量连年下滑，价格不断攀升，不良商家为牟取暴利，使用冬虫夏草相似品种的伪品，包括中国被毛孢菌丝体、虫草花、兰坪虫草和古尼虫草等替代和冒充冬虫夏草，严重的扰乱了冬虫夏草市场秩序，也给市场管理带来了一定的挑战。
市场上很多由冬虫夏草粉碎后制成的冬虫夏草胶囊和片剂产品很难通过传统的外观、显微等常规手段被鉴别。加之冬虫夏草中尚未发现特征性小分子成分，而常用的化学分析方法存在一定问题，如检测不够精确，对于含量较低的冬虫夏草复方产品也很难鉴定，所需检测的样品量大，进而对珍贵濒危中药造成一定浪费。而分子标记技术具有灵敏度高、重复性好、所需检测的样品量少等优点，现已被广泛用于中药原料的质量检测和鉴定。
目前，使用分子生物学方法对冬虫夏草进行鉴别的技术文献较多，但都存在一定的局限性。如论文《冬虫夏草与5种人工发酵菌丝体的DNA分子鉴别方法》公开了一种方法，利用ITS序列(5.8S rDNA和28S rDNA基因间隔序列)能够对冬虫夏草和多种人工发酵虫草菌丝粉进行鉴别，但PCR扩增之后需要对产物进行DNA测序，耗时较长。专利《一种冬虫夏草分子身份证及鉴定方法》(申请号：201510117046.6)公开了一种分子身份证和方法可以准确的将冬虫夏草与形态特征相似的伪品区分开，同样需要测序。专利《一种快速检测冬虫夏草的方法》(申请号：201610270920.4)公开了一种鉴别冬虫夏草的方法，无需DNA测序，能够鉴别冬虫夏草、蛹虫草、古尼虫草、凉山虫草和/或蝉花，但不能有效的鉴别中国被毛孢菌丝体，且公开实施例中冬虫夏草样品仅为四川一个产地样品，对不同青海、西藏省份样品适应性不明确。论文《青海省冬虫夏草的遗传变异及亲缘关系的形态性状和ISSR分析》公开了一种ISSR分析标记方法，提供了多条ISSR引物，该文献从不同产地冬虫夏草间的差异，实现区分不同产地的冬虫夏草真品，但却没有提供与冬虫夏草伪品区分的方法，即真品与伪品之间的差异与不同产地真品之间的差异的比较，无法用于分辨真伪品。
因此，研究真品冬虫夏草之间的共同点，寻找可靠的引物，开发一种无需对扩增产物进行测序，同时便捷、灵敏、稳定且实验重复性好的分子鉴别方法来分辨真品冬虫夏草和伪品冬虫夏草成为一个重要的研究内容。
发明内容
本发明所要解决的技术难题是克服现有技术的不足，提供一种冬虫夏草鉴别用ISSR-PCR引物，该引物不但可以用于冬虫夏草的真伪鉴定，还可以用于中国被毛孢菌丝体、虫草花、兰坪虫草及古尼虫草的鉴定；同时提供了含有该引物的用于ISSR-PCR鉴定用的扩增体系；结合使用该扩增体系，本发明公开了一种基于ISSR-PCR技术的快速、准确鉴定冬虫夏草、中国被毛孢菌丝体、虫草花、兰坪虫草及古尼虫草的方法。
一方面，本发明提供了一种冬虫夏草鉴别用ISSR-PCR引物，所述引物用于冬虫夏草、中国被毛孢菌丝体、虫草花、兰坪虫草和/或古尼虫草的鉴别，其特征在于，所述引物的核苷酸序列表示如下：
SEQ ID NO.1：5’-AGAGAGAGAGAGAGGC-3’或
SEQ ID NO.2：5’-AGTGTGTGTGTGTGT-3’。
另一方面，本发明提供了一种冬虫夏草鉴别用ISSR-PCR扩增体系，其特征在于，所述ISSR-PCR扩增体系包括如权利要求1所述的引物SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2。
在一些实施例中，本发明所述冬虫夏草鉴别用ISSR-PCR扩增体系本发明所述的引物SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2、rTaq酶、Mg2+、dNTPs、PCR缓冲液。
在一些实施例中，在本发明所述的ISSR-PCR扩增体系中，其特征在于，所述rTaq酶为5U/μL、Mg2+为25mM、dNTPs为2.5mM、10倍的PCR缓冲液；引物SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2为10μM。
在一些实施例中，本发明所述的ISSR-PCR扩增体系总体积为50μL，含有0.5μL的5U/μL rTaq酶、3.0μL的25mM Mg2+、2.0μL的2.5mM dNTPs、1.0μL的10μM引物SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2、2.0μL的10倍PCR缓冲液、0.2μL的25ng/L模板DNA、其余为水。
另一方面，本发明提供了一种冬虫夏草ISSR鉴别方法，其特征在于包括如下步骤：
1)提取对照品基因组DNA；所述对照品为冬虫夏草、中国被毛孢菌丝体、虫草花、兰坪虫草或古尼虫草；
2)利用本发明所述的ISSR-PCR扩增体系对步骤1)中的对照品基因组DNA进行扩增；
3)进行琼脂糖凝胶电泳；
4)构建ISSR分子标记的图谱；
5)按照步骤1)至3)相同条件处理供试品得到供试品电泳图谱，比对供试品电泳图谱与步骤4)构建的ISSR分子标记图谱进行鉴别。
在一些实施例中，本发明所述冬虫夏草ISSR鉴别方法的步骤1)中所述提取对照品基因组DNA包括：分别称取正品冬虫夏草、中国被毛孢菌丝体、虫草花、兰坪虫草和古尼虫草这五种对照品0.2g，分别研磨至粉状，然后用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液分别裂解，再加入饱和醋酸钠溶液，混匀，冰浴，离心，取上清液与异丙醇混匀，静置后离心，弃去上清液，用70％乙醇洗涤沉淀，进行除盐，自然晾干至乙醇完全挥发；最后加TE缓冲液溶解，即得5个对照品基因组DNA，-20℃保存备用。
在一些实施例中，本发明所述冬虫夏草ISSR鉴别方法的步骤1)中所述提取对照品基因组DNA包括：分别称取正品冬虫夏草、中国被毛孢菌丝体、虫草花、兰坪虫草和古尼虫草这五种对照品0.2g，分别在预冷陶瓷研钵中加入液氮研磨至粉状，然后迅速转移样品至离心管，加入3mL的65℃预热的CTAB提取缓冲液，65℃水浴裂解30-40min，中间每隔10min翻转混匀1次；加入1/10体积预冷的饱和醋酸钠溶液，混匀，冰浴5min，4℃下12000rpm离心5min；取上清液与等体积异丙醇混匀，静置60s，4℃下12000rpm离心5min；弃去上清液，用预冷的70％乙醇洗涤沉淀，进行除盐，自然晾干至乙醇完全挥发；最后加入100-300μL的TE缓冲液溶解，即得5个对照品品基因组DNA，-20℃保存备用。
在一些实施例中，本发明所述冬虫夏草ISSR鉴别方法步骤1)中所述CTAB提取缓冲液组成成分包含2％体积重量比例的CTAB、1.4M NaCl、20mM EDTA(乙二胺四乙酸)、100mMpH＝8.0的Tric-HCl、2％巯基乙醇。
在一些实施例中，本发明所述冬虫夏草ISSR鉴别方法步骤2)中所述扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性45s，48.2℃退火1min，72℃延伸2min，扩增35个循环，最后72℃延伸10min。
在一些实施例中，本发明所述冬虫夏草ISSR鉴别方法步骤3)琼脂糖凝胶电泳条件为：扩增产物采用1.6％琼脂糖凝胶电泳，使用GelRed核酸染料，电压为5V/cm，时间为1h。
另一方面，本发明提供了一种本发明所述冬虫夏草ISSR鉴别方法的应用，其用于鉴定冬虫夏草复方产品中是否含有正品冬虫夏草。
本发明的优益之处在于：
(1)本发明成功构建的冬虫夏草分子标记图谱与其他分子生物学鉴定方法相比较，更具有操作快捷、重复性、稳定性、特异性好的优点，不需要经过测序，节约经济与时间成本。
(2)本发明构建的ISSR分子标记图谱具有多态性高、基因分型能力强、稳定性好的特征，对不同产地冬虫夏草真品都有较好的适应性，同时对包括中国被毛孢菌丝体在内的多个相似种伪品有较好的差异性。
(3)本发明能够准确鉴别冬虫夏草复方片剂和胶囊产品中是否真正含有正品冬虫夏草，即使含有少量的冬虫夏草也能很灵敏的检测。
附图说明：
图1所示是正品冬虫夏草与4种伪品以引物SEQ ID NO.1进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳的显影图，其中泳道1为青海冬虫夏草、泳道2为中华被毛孢菌丝体、泳道3为虫草花、泳道4为兰坪虫草、泳道5为古尼虫草，泳道M为100bp DNA Marker。
图2所示是不同产地冬虫夏草样品以引物SEQ ID NO.1进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳的显影图，其中泳道1为青海冬虫夏草、泳道2为西藏冬虫夏草、泳道3为四川冬虫夏草、泳道M为100bp DNA Marker。
图3所示是正品冬虫夏草与4种伪品以引物SEQ ID NO.2进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳的显影图，其中泳道1为青海冬虫夏草、泳道2为中华被毛孢菌丝体、泳道3为虫草花、泳道4为兰坪虫草、泳道5为古尼虫草，泳道M为100bp DNA Marker。
图4所示是不同产地冬虫夏草样品以引物SEQ ID NO.2进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳的显影图，其中泳道1为青海冬虫夏草、泳道2为西藏冬虫夏草、泳道3为四川冬虫夏草、泳道M为100bp DNA Marker。
图5所示为构建得到的冬虫夏草及4种相似种伪品的ISSR分子标记图谱，其中，泳道1-5根据引物SEQ ID NO.1进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳描绘，分别为青海冬虫夏草、中国被毛孢菌丝体、虫草花、兰坪虫草、古尼虫草；泳道6-10根据引物SEQ ID NO.2进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳描绘，分别为青海冬虫夏草、中国被毛孢菌丝体、虫草花、兰坪虫草、古尼虫草；泳道M为100bp DNA Marker。
图6所示是市售冬虫夏草复方产品以引物SEQ ID NO.1进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳的显影图，其中泳道1为供试品、泳道M为100bp DNA Marker。
图7所示是市售冬虫夏草复方产品以引物SEQ ID NO.2进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳的显影图，其中泳道1为供试品、泳道M为100bp DNA Marker。
具体实施方式
实施例1
取正品冬虫夏草、中国被毛孢菌丝体、虫草花、古尼虫草、兰坪虫草5个对照品，分别提取其基因组DNA，然后加入引物SEQ ID NO.1进行PCR扩增反应，最后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，具体操作步骤如下：
1)提取对照品基因组DNA：
分别称取正品冬虫夏草、中国被毛孢菌丝体、虫草花、兰坪虫草和古尼虫草这五种对照品0.2g，分别在预冷陶瓷研钵中加入液氮研磨至粉状，然后迅速转移样品至离心管，加入3mL在65℃预热的CTAB提取缓冲液，65℃水浴裂解30-40min，中间每隔10min翻转混匀1次；加入1/10体积预冷的饱和醋酸钠溶液，混匀，冰浴5min，4℃下12000rpm离心5min；取上清液与等体积异丙醇混匀，静置60s，4℃下12000rpm离心5min；弃去上清液，用预冷的70％乙醇洗涤沉淀，除盐，自然晾干至乙醇完全挥发；最后加入100-300μL TE缓冲液溶解，即得5个对照品基因组DNA；
上述CTAB提取缓冲液组成成分包含2％体积重量比例的CTAB、1.4M NaCl、20mMEDTA、100mM pH＝8.0的Tric-HCl、2％巯基乙醇。
2)进行ISSR-PCR扩增反应：
分别以步骤1)中5个对照品基因组DNA为模板，再加入引物SEQ ID NO.1、rTaq酶、Mg2+、dNTPs、PCR缓冲液在PCR仪进行扩增；
其中50μL供试样品ISSR-PCR扩增体系的组成为：5U/μL rTaq酶0.5μL、25mM Mg2+3.0μL、2.5mM dNTPs 2.0μL、10μM引物SEQ ID NO.1 1.0μL、10倍PCR buffer 2.0μL、25ng/L模板DNA 0.2μL、其余为水。
扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性45s，48.2℃退火1min，72℃延伸2min，扩增35个循环，最后72℃延伸10min。
3)进行琼脂糖凝胶电泳：
将步骤2)中扩增产物进行凝胶电泳检测，电泳条件为：扩增产物采用1.6％琼脂糖凝胶电泳，使用GelRed核酸染料，电压为5V/cm，时间为1h。用凝胶成像仪记录扩增产物的凝胶电泳结果如图1。
由图1可知，通过引物SEQ ID NO.1扩增获得的冬虫夏草与4种伪品(中国被毛孢菌丝体、虫草花、尼古虫草、兰坪虫草)的PCR分子图谱有明显不同，可以有效进行鉴别。
实施例2
采集来自于青海、西藏、四川3个不同产地的野生冬虫夏草，分别提取其基因组DNA，然后加入引物SEQ ID NO.1进行PCR扩增反应，最后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，具体操作步骤同实施例1。用凝胶成像仪记录扩增产物的凝胶电泳结果如图2。
由图2可知，通过引物SEQ ID NO.1扩增获得的三个不同省份的冬虫夏草样品分子图谱基本一致，表明该引物和方法对不同产地冬虫夏草有很好的适应性。
实施例3
取正品冬虫夏草、中国被毛孢菌丝体、虫草花、古尼虫草、兰坪虫草5个对照品，分别提取其基因组DNA，然后加入引物SEQ ID NO.2进行PCR扩增反应，最后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。除引物SEQ ID NO.1换成SEQ ID NO.2，其他具体操作步骤同实施例1。用凝胶成像仪记录扩增产物的凝胶电泳结果如图3。
由图3可知，通过引物SEQ ID NO.2扩增获得的冬虫夏草与4种伪品(中国被毛孢菌丝体、虫草花、尼古虫草、兰坪虫草)的PCR分子图谱有明显不同，可以有效进行鉴别。
实施例4
采集来自于青海、西藏、四川3个不同产地的野生冬虫夏草，分别提取其基因组DNA，然后加入引物SEQ ID NO.2进行PCR扩增反应，最后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。除引物SEQ ID NO.1换成SEQ ID NO.2，具体操作步骤同实施例1。用凝胶成像仪记录扩增产物的凝胶电泳结果如图4。
由图4可知，通过引物SEQ ID NO.2扩增获得的三个不同省份的冬虫夏草样品分子图谱基本一致，表明该引物和方法对不同产地冬虫夏草有很好的适应性。
根据以上实施例1-4构建ISSR-PCR分子标记图谱
根据实施例1和实施例3结果呈现的凝胶电泳条带建立图谱，采用软件Bandscan，扩增条带的有无以总亮度值作为选择依据，选取扩增条带亮度值≥0.2的条带记录为特征条带，有扩增带的用“▁”表示，没有扩增带的不做标记，构建正品冬虫夏草、中国被毛孢菌丝体、虫草花、兰坪虫草、古尼虫草5个样品的分子标记图谱，如图5所示。
实施例5
取市售冬虫夏草复方胶囊产品，提取其基因组DNA，然后加入引物SEQ ID NO.1进行PCR扩增反应，最后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，具体操作步骤同实施例1。用凝胶成像仪记录扩增产物的凝胶电泳结果如图6。
将市售产品由引物SEQ ID NO.1扩增获得的凝胶电泳图谱6与已构建的分子标记图谱5进行比对，其特征条带与图5中的冬虫夏草特征条带一致，表明该产品中含有正品冬虫夏草。
实施例6
取市售冬虫夏草复方胶囊产品，提取其基因组DNA，然后加入引物SEQ ID NO.2进行PCR扩增反应，最后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，具体操作步骤同实施例1。用凝胶成像仪记录扩增产物的凝胶电泳结果如图7。
将市售产品由引物SEQ ID NO.2扩增获得的凝胶电泳图谱7与已构建的分子标记图谱5进行比对，其特征条带与图5中的冬虫夏草特征条带一致，表明该产品中含有正品冬虫夏草。
需要注意的是，上述仅以优选实施例对本发明进行说明，并不能局限本发明的权利范围，因此不脱离本发明思想的情况下，凡运用本发明说明书和附图部分的内容所进行的等效变化，均理同包含在本发明的权利要求范围内。

Claims (10)

1.一种冬虫夏草鉴别用ISSR-PCR引物，所述引物用于冬虫夏草、中国被毛孢菌丝体、虫草花、兰坪虫草和/或古尼虫草的鉴别，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下：
SEQ ID NO.1：5’-AGAGAGAGAGAGAGGC-3’或
SEQ ID NO.2：5’-AGTGTGTGTGTGTGT-3’。
2.一种冬虫夏草鉴别用ISSR-PCR扩增体系，其特征在于，所述ISSR-PCR扩增体系包含如权利要求1所述的引物SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2。
3.根据权利要求2所述的ISSR-PCR扩增体系，其特征在于，所述ISSR-PCR扩增体系还包括5U/μL的rTaq酶、25mM的Mg2+、2.5mM的dNTPs、10倍的PCR缓冲液；其中引物SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2为10μM。
4.根据权利要求2所述的ISSR-PCR扩增体系，其特征在于，所述ISSR-PCR扩增体系总体积为50μL，含有0.5μL的5U/μL rTaq酶、3.0μL的25mM Mg2+、2.0μL的2.5mM dNTPs、1.0μL的10μM引物SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2、2.0μL的10倍PCR缓冲液、0.2μL的25ng/L模板DNA、其余为水。
5.一种冬虫夏草ISSR鉴别方法，其特征在于包括如下步骤：
1)提取对照品基因组DNA；所述对照品为冬虫夏草、中国被毛孢菌丝体、虫草花、兰坪虫草或古尼虫草；
2)利用权利要求2-4任一项所述的ISSR-PCR扩增体系对步骤1)中的对照品基因组DNA进行扩增；
3)进行琼脂糖凝胶电泳；
4)构建ISSR分子标记的图谱；
5)按照步骤1)至3)相同条件处理供试品得到供试品电泳图谱，比对供试品电泳图谱与步骤4)构建的ISSR分子标记图谱进行鉴别。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述提取对照品基因组DNA包括：分别称取正品冬虫夏草、中国被毛孢菌丝体、虫草花、兰坪虫草和古尼虫草这五种对照品0.2g，分别在预冷陶瓷研钵中加入液氮研磨至粉状，然后迅速转移样品至离心管，加入3mL的65℃预热的CTAB提取缓冲液，65℃水浴裂解30-40min，中间每隔10min翻转混匀1次；加入1/10体积预冷的饱和醋酸钠溶液，混匀，冰浴5min，4℃下12000rpm离心5min；取上清液与等体积异丙醇混匀，静置60s，4℃下12000rpm离心5min；弃去上清液，用预冷的70％乙醇洗涤沉淀，除盐，自然晾干至乙醇完全挥发；最后加入100-300μL的TE缓冲液溶解，即得5个对照品基因组DNA，-20℃保存备用。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述CTAB提取缓冲液组成成分包含2％体积重量比例的CTAB、1.4M NaCl、20mM EDTA、100mM pH＝8.0的Tric-HCl、2％巯基乙醇。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性45s，48.2℃退火1min，72℃延伸2min，扩增35个循环，最后72℃延伸10min。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)琼脂糖凝胶电泳条件为：扩增产物采用1.6％琼脂糖凝胶电泳，使用GelRed核酸染料，电压为5V/cm，时间为1h。
10.一种权利要求5-9任一项所述的方法的应用，其用于鉴定冬虫夏草复方产品中是否含有正品冬虫夏草。
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