CN105385763A - 一种同时分析人基因组dna 24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种同时分析人基因组dna 24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时分析人基因组DNA？24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其应用；所述的24个基因座为：D16S539、D6S477、D15S659、D10S1248、D1S1656、D21S2055、D4S2366、D2S441、D3S1744、D22-GATA198B05、D3S3045、D11S2368、D17S1290、D10S2325、D14S608、D8S1132、D7S3048、D5S2500、D7S1517、D18S535、D10S1435、D13S325、D19S253及性别基因座Amelogenin。本发明将24个基因座分为4组，共涉及5种颜色的荧光标记；本发明的荧光标记复合扩增系统的灵敏度高，在DNA模板量为0.12？ng的条件下，可检出全部24个基因座；适用于血滤纸、FTA卡采集样本的直接扩增。

Description

一种同时分析人基因组DNA 24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种24个基因座的荧光标记复合扩增检验系统，具体是涉及一种同时分析人基因组DNA24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其应用。
背景技术
短串联重复序列基因座(STR)是目前普遍应用的遗传标记。STR标记与其他遗传标记物相比，STR基因座片段小、容易扩增，更适用于微量和降解检材，各基因座的扩增条件相近而能够复合扩增，因而具有快速、高效、准确、灵敏、信息量大等优点。尤其是在建立DNA数据库方面，与以往RFLP等技术相比，STR复合扩增技术具有极大的优越性。因此美国FBI进行了大量研究，选择了13个STR基因座用于建立DNA数据库——CODIS(CombinedDNAIndexSystem)：CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TPOX、vWA。这些STR基因座通常被称为13个核心基因座。
正是因为STR基因座具备以上优点和应用前景，法医界以及一些公司均对其进行了大规模的开发性研究。90年代中后期以美国ABI(AppliedBiosystems,USA)为代表的技术型公司建立起复合扩增和荧光检测体系，并诞生了最具代表性的是ABI公司的IdentifilerTM和Promega(USA)公司的PowerPlex-16荧光检测试剂盒。
为了提供一种新的荧光标记复合扩增检验系统，使其更适合于中国人群在个体识别和亲子鉴定等方面的应用，进一步提高系统的累积个体识别率和累积非父排除率，该检验系统中必须包含数目更多的、在中国人群中具有高度遗传多态性的STR基因座。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种同时分析人基因组DNA24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其应用，所述试剂盒是包含24个基因座的复合扩增系统，同时通过五色荧光检测体系检测，来进行个体识别和亲子鉴定的STR复合检验系统。涉及检测人基因组中具有多态性的STR遗传标记。本发明特别涉及用聚合酶链式反应在一个体系中同时扩增多个短串联重复基因座。该系统可以应用于公安部门日常检案、个体识别、亲子鉴定以及考古等方面，有助于解决公安部打拐数据库一子多父母问题和亲子鉴定中突变和近亲鉴定问题。
为了实现本发明的目的，采用如下技术方案：
一种同时分析人基因组DNA24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒，所述的24个基因座为：D16S539、D6S477、D15S659、D10S1248、D1S1656、D21S2055、D4S2366、D2S441、D3S1744、D22-GATA198B05、D3S3045、D11S2368、D17S1290、D10S2325、D14S608、D8S1132、D7S3048、D5S2500、D7S1517、D18S535、D10S1435、D13S325、D19S253及性别基因座Amelogenin；该试剂盒包括的24个基因座对应的引物及其浓度见表1。
表1
所述的每个基因座对应的引物中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记。
所述的荧光染料标记物为蓝色荧光染料6-FAM、绿色荧光染料HEX、黄色荧光染料TAMRA、红色荧光染料标记ROX中的一种；内标选用橙色荧光SIZ。
将所述24个基因座分组，具体为：D16S539、D6S477、D15S659、D10S1248、D1S1656和D21S2055为第一组；D4S2366、D2S441、D3S1744、D22-GATA198B05、D3S3045、D11S2368和D17S1290为第二组；D10S2325、D14S608、D8S1132、D7S3048、D5S2500，以及性别基因座Amelogenin为第三组；D7S1517、D18S535、D10S1435、D13S325和D19S253为第四组；各组基因座对应的引物采用荧光染料标记，荧光标记物为6-FAM、HEX、TEMRA和ROX中的任意一种且各组互不相同，内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。引物合成和标记用ABI394合成仪完成。
所述的试剂盒还包括反应混合物(ReactionMix)、基因组DNA、热启动Taq酶和sdH2O，所述的反应混合物为：MgCl27.5mM,Tris-HClbuffer125mM,KCl125mM,dNTPs7.5mM,BSA2mg/mL。各组分及其含量见表2。
表2：
其中所述的ReactionMix为：.MgCl27.5mM,Tris-HClbuffer125mM,KCl125mM,dNTPs7.5mM,BSA2mg/ml。
所述同时分析人基因组DNA24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒在个体识别、亲子鉴定以及考古中的应用。包括如下步骤：收集基因组DNA，进行PCR扩增，分析扩增产物；其中PCR扩增程序为：变性95℃2min，循环94℃15s，60℃45s，65℃90s30个循环，终止延伸60℃30min，4℃维持。
所述基因组DNA来源于精斑、唾液斑、组织、血痕或血液。
一种同时分析人基因组DNA24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒的应用，具体步骤如下：
A、按照表2的组分配置扩增体系。
B、扩增热循环
(l)将PCR扩增管置于热循环仪上；
(2)选择表3推荐的程序进行扩增；
(3)扩增后的样品应避光保存；
表3：热循环仪的扩增程序
C、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCUMarkerSIZ-500组成上样混合物〔(0.5μlAGCUMarkerSIZ-500(无锡中德美联生物技术有限公司))×(进样数)+(12μl去离子甲酰胺)×(进样数)〕。将12.5μl上样混合物与1μl扩增产物或系统中等位基因分析标准物23+1AllelicLadder(无锡中德美联生物技术有限公司)混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析。
D、分型分析
用片段分析软件GeneMapper分析步骤C中遗传分析仪检测收集的数据。电泳采用多道或单道毛细管电泳。
其中基因组DNA样品来源于精斑、唾液斑、组织、血痕或血液。
基因座的确定
采用STR分型技术进行个体识别和亲子鉴定，一方面是因为STR基因座具有高度多态性，所用的STR基因座都有较多等位基因，具有较高的非父排除率；但另一方面其突变率也很高，往往会对结果分析及最后作出判断带来许多困难。在实践中，往往可以发现一些案例，在检测的STR基因座中有1-2个出现矛盾现象，此时就需要增加检测的STR基因座数目。
对于三联体亲子鉴定案：①最少检测15个STR基因座，若没有发现矛盾基因座，父权指数达10000，可以作出“肯定亲生关系”的结论。②若出现1个矛盾基因座，要增加检测基因座至17个；若发现有2个矛盾基因座，要增加检测至24个，没有新矛盾基因座发现时，父权指数达10000，可以作出“肯定亲生关系”的结论；如果出现3个矛盾STR基因座，则要继续增加检测STR基因座或其他遗传标记，再没出现新的矛盾现象，父权指数超过10000以后，亦可以作出“肯定亲生关系”的结论。③若有4个矛盾STR基因座，则作出“否定亲生关系”的结论。
对于二联体亲子鉴定案：①至少检测17个STR基因座，没有发现矛盾基因座时，作“不排除亲生关系”的结论。②若发现有1矛盾基因座，增加检测至26个以上；若有2个矛盾基因座，要增加检测至36个以上，没有发现新的矛盾基因座，可作出“不排除亲生关系”的结论。③如果出现3个或3个以上矛盾STR基因座，则应作出“否定亲生关系”的结论。
由上述内容可知，在单亲亲权鉴定以及存在有基因座突变等情况时，仅检测13个CODIS基因座，或只单独使用现常用的商品化试剂盒进行检测，在许多情况下都是远远不够的。因此，开发一系列非CODIS基因座的STR分型检测产品，增加检测基因座位点数目，来达到认定的目的，以期为法医学个体识别、亲权鉴定和群体遗传学研究提供基础数据。
在进行生物学全同胞关系鉴定时，目前亲缘关系鉴定常用的19个常染色体STR基因座(vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、TH01、TPOX、PentaE、PentaD、D2S1338、D19S433、D12S391、D6S1043)为必检基因座。生物学全同胞关系鉴定实施规范鼓励在19个必检STR基因座基础上增加更多的、经过验证的、与19个必检STR基因座不存在连锁的其它常染色体STR基因座，以提高检测系统效能。以下22个常染色体STR为部分可供选择的补充基因座：D1S1656、D2S441、D3S1744、D3S3045、D4S2366、D5S2500、D6S477、D7S1517、D7S3048、D8S1132、D10S1248、D10S1435、D10S2325、D11S2368、D13S325、D14S608、D15S659、D17S1290、D18S535、D19S253、D21S2055、D22-GATA198B05。考虑到和现常用商品化试剂盒的补充性，对这22个STR基因座在中国人群的遗传多态性开展调查研究，对3000多名个体进行基因型检测，根据各基因座等位基因的分布频率计算个体识别能力(DP)、杂合度(H)、非父排除率(PE)等数据，表明在22个STR基因座中，各基因座的DP值均接近0.9，H均大于0.7，PE值大都在0.5以上，这表明它们在法医分型上有较好的应用价值。
在考虑到与现有数据库兼容的基础上，最终确立了STR基因座构成，即D16S539、D6S477、D15S659、D10S1248、D1S1656、D21S2055、D4S2366、D2S441、D3S1744、D22-GATA198B05、D3S3045、D11S2368、D17S1290、D10S2325、D14S608、D8S1132、D7S3048、D5S2500、D7S1517、D18S535、D10S1435、D13S325、D19S253，另加上Amelogenin。该基因座构成突破了现有13个核心基因座的模式，包含了生物学全同胞关系鉴定实施规范中的22个常染色体补充基因座加上1个核心基因座D16S539，提供了24个基因座的分型结果，提高了系统的累计个体识别能力和累积非父排除率，单独或联合现常用商品化试剂盒使用(见表:4)，有助于解决公安部打拐数据库一子多父母问题和亲子鉴定中突变和近亲鉴定问题。
表4本发明与商品化的CODIS位点试剂盒联合使用信息列表
荧光标记复合扩增体系的基因座组合方案设计
本研究对荧光染料进行了鉴别、遴选，选用了蓝、绿、黄、红、橙五种荧光标记物，优选了5色荧光组合方案。
在确定5色荧光组合方案的基础上，通过大量反复实验，以下为其中一种产品组合方式：D16S539、D6S477、D15S659、D10S1248、D1S1656和D21S2055为第一组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为6-FAM、HEX、TEMRA和ROX的任意一种；D4S2366、D2S441、D3S1744、D22-GATA198B05、D3S3045、D11S2368和D17S1290为第二组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为与第一组不同的荧光染料标记物；D10S2325、D14S608、D8S1132、D7S3048、D5S2500，以及性别基因座Amelogenin为第三组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为与第一组和第二组都不同的荧光染料标记物；D7S1517、D18S535、D10S1435、D13S325和D19S253为第四组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为与第一组、第二组和第三组都不同的荧光染料标记物；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。这种独创的基因座组合方式使得仅需标记四种荧光就可实现这24个基因座的同时检测分析。
在组合方案的基础上，根据24个基因座所在位置的侧翼序列进行引物设计，实现24个基因座在同一反应中的复合扩增。
荧光标记STR复合扩增体系的优化及建立
在设计引物时，需要通过反复试验，保证引物的长度适中，具有相似的物理特性和反应动力学特点、Tm值相近、GC含量、引物之间不能形成二聚体；同时也要保证引物扩增的特异性，有些基因座之间的同源性比较高，所以在引物设计上，要充分考虑到其特异性；同时也要考虑到复合扩增中，引物对不同扩增检材的适用性，保证不同检材扩增时，都要满足试剂盒均衡性要求。
1、基因座之间平衡度的调配
随着复合扩增体系中基因座数目的增加，由于竞争的影响，各基因座的相对平衡控制难度加大，通过多次反复实验，调节引物浓度与配比，终达到平衡。各基因座引物序列及引物浓度见表5。
表5：
以表格中的引物浓度，配置成复扩引物混合物。
2、复合扩增条件的建立
先对24个基因座的单一扩增条件进行优化，在成功地建立了单个基因座扩增条件的基础上，研究24个基因座复合扩增PCR反应条件，通过大量的反复实验确定了复合扩增中的各个参数，如，循环参数、退火温度、缓冲液离子强度、酶量、复合扩增反应体积的变化以及模板DNA量等，使扩增产物达到平衡、特异的要求，建立起复合扩增体系，同时扩增出24个基因座。
对照例
在进行24个基因座复合扩增体系优化时，采用如表6所示的引物，对采集的DNA样本进行扩增，扩增后结果如图1所示(该图中所对应的引物是D22-GATA198B05(2219805F1、2219805R1))。从图中可以看出，HEX色D22-GATA198B05基因座对应的位置除了样本自身分型(18,21)外，在24号bin上还出现了一个很大的非特异扩增峰，说明对照例中的引物会导致结果的误判。在采用D22-GATA198B05(2219805F2、2219805R2)、D22-GATA198B05(2219805F3、2219805R3)、D22-GATA198B05(2219805F4、2219805R4)所示的引物进行扩增时，同样也出现了非特异性扩增峰。经引物排查发现D22-GATA198B05引物与D16S539引物易形成非特异扩增峰，由于D16S539核心区侧翼区存在一个低多态性[ACAG]4结构，导致该引物结合位点可改变性不大，只能通过修改D22-GATA198B05引物来解决此非特异，通过引物的反复设计与实验验证，最终采用一种发卡结构式引物解决了该处非特异性扩增峰。
同理，采用表7中D1S1656的引物，对采集的DNA样本进行扩增，在FAM色D1S165611号bin上也出现了一个非特异扩增峰。扩增结果如图2所示(该图中所对应的引物是D1S1656(11656F1、11656R1))。说明对照例中的引物会导致结果的误判。在采用D1S1656(11656F2、11656R2)、D1S1656(11656F3、11656R3)所示的引物进行扩增时，也同样出现了非特异性扩增峰。用D1S1656的序列在NCBI数据库中BLAST发现，其与很多常染色体的同源性较高，导致该基因座引物设计时，较难找到合适的扩增位点，通过基因座序列比对与引物的反复设计，将引物3’端设计在扩增核心区侧翼特异的碱基点上，重复实验验证，才找到该位点的特异性结合引物。
表6D22-GATA198B05基因座扩增中出现非特异峰的引物表
表7D1S1656基因座扩增中出现非特异峰的引物表
类似地，加入D17S1290与D10S2325基因座发现受PCR抑制剂影响较大，难以找到合适的引物位点，同时D17S1290与体系中其他基因座引物在HEX色易引起多处非特异扩增，反复修改这两对引物，最终找到合适的引物，确定了该试剂盒基因座排布。
有益效果
1、本发明所采用的24个基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩增，其中每对引物中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记；本发明的系统中包括每个基因座所对应的等位基因标准物的混合物，以确定DNA样品中各个基因座的等位基因；本发明的系统中包含的用于鉴别DNA样品性别的基因座是Amelogenin基因座；本发明的荧光标记复合扩增系统扩增多个基因座采用聚合酶链式反应进行，检测方法采用多道或单道毛细管电泳。
2、本发明还涉及一种采用该荧光标记复合扩增检验系统对DNA样品进行分析的方法；其中，本发明适用的DNA样品来源于精斑、唾液斑、组织、血痕或血液等。
3、本发明中23个STR基因座构成为：D16S539、D6S477、D15S659、D10S1248、D1S1656、D21S2055、D4S2366、D2S441、D3S1744、D22-GATA198B05、D3S3045、D11S2368、D17S1290、D10S2325、D14S608、D8S1132、D7S3048、D5S2500、D7S1517、D18S535、D10S1435、D13S325、D19S253。本发明对上述23个短串联重复序列基因座及其等位基因遗传特征进行了深入的研究，表明这23个短串联重复序列基因座在人群中具有高度的遗传多态性和良好的等位基因频率分布。上述23个短串联重复序列基因座加上用于鉴别人性别的Amelogenin基因座构成本发明的复合扩增检验系统。
4、本发明提供了一种通过复合扩增24个基因座来进行个体识别和亲子鉴定的检验试剂盒。该基因座构成，突破了现有13个核心基因座的模式，更加符合法医学DNA检验的技术要求与中国人群的群体遗传学特征，并兼顾了国际数据交流与共享的需求。
5、本发明24个基因座物理定位距离大于10Mb或不在同一染色体上，相互之间独立性好，不存在连锁效应；系统包含1个CODIS位点D16S539，在与CODIS试剂盒联合使用时可作为参照位点；系统选择的位点与市场上常用CODIS位点试剂盒所采用的STR位点均无连锁效应。
6、本发明提供的检验系统达到目前国际上STR荧光标记复合扩增试剂盒的最高水平。
附图说明
图1：D22-GATA198B05基因座出现非特异扩增的分型图谱。
图2：D1S1656基因座出现非特异扩增的分型图谱。
图3：对DNA标准品9948的STR分型结果。
图4：等位基因分型标准物。
图5：对实施例2样品中的STR分型结果；其中F代表父，M代表母，N代表女孩。
具体实施方式
下面的实施例用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。
实施例1一种同时分析人基因组DNA24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒，由如下组成：
组分 体积
Reaction Mix 10.0μL
基因组DNA Xμl含量为0.125-5ng
如上的24个基因座对应的引物 5.0μL
热启动Taq酶(5U/μL) 0.5μL
sdH2O 补足至25.0μL
其中所述的ReactionMix为MgCl27.5mM,Tris-HClbuffer125mM,KCl125mM,dNTPs7.5mM,BSA2mg/mL。
其中24个基因座对应的引物及其引物浓度为：
所述的每个基因座对应的引物中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记。
所述的荧光染料标记物为6-FAM、HEX、TAMRA或ROX。
将所述24个基因座分组，以下为其中一种产品组合方式：D16S539、D6S477、D15S659、D10S1248、D1S1656和D21S2055为第一组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为6-FAM；D4S2366、D2S441、D3S1744、D22-GATA198B05、D3S3045、D11S2368和D17S1290为第二组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为HEX；D10S2325、D14S608、D8S1132、D7S3048、D5S2500，以及性别基因座Amelogenin为第三组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为TAMRA；D7S1517、D18S535、D10S1435、D13S325和D19S253为第四组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为ROX；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。这种独创的基因座组合方式使得仅需标记五种荧光就可实现这24个基因座的同时检测分析。一种同时分析人基因组DNA24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒的使用方法，按如下步骤实现：
A、扩增体系为：
组分 体积
Reaction Mix 10.0μL
基因组DNA Xμl含量为0.125-5ng
如上的24个基因座对应的引物 5.0μL
热启动Taq酶(5U/μL) 0.5μL
sdH2O 补足至25.0μL
B、扩增热循环
(l)将PCR扩增管置于热循环仪上；
(2)选择下面推荐的程序进行扩增；
(3)扩增后的样品应避光保存；
热循环仪的扩增程序
C、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCUMarkerSIZ-500组成上样混合物〔(0.5μlAGCUMarkerSIZ-500(无锡中德美联生物技术有限公司))×(进样数)+(12μl去离子甲酰胺)×(进样数)〕。将12.5μl上样混合物与1μl扩增产物或系统中等位基因分析标准物23+1AllelicLadder(无锡中德美联生物技术有限公司)混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析。
D、分型分析
用片段分析软件GeneMapper分析步骤C中遗传分析仪检测收集的数据，将样品分析数据和等位基因分型标准物的分型结果进行比较，得到实际样品的分型数据。对标准品9948(Promega公司美国)进行扩增，分型结果如图3示。对等位基因分型标准物的分型结果如图4示。从图中可以看出，对标准品9948的检测结果与其基因型一致，分型标准物的分型结果也与各个等位基因的分型一致，且无非特异性扩增物出现。
实施例2
应用24个基因座的荧光标记复合扩增检验系统进行三联体亲子鉴定
1、收集亲子鉴定案件中的血样：本实验中样品由XX亲子鉴定机构提供。DNA提取采用Chelex-100法分别提取3个全血样本的基因组DNA：取0.5～5μl全血置于灭菌的1.5ml离心管中，加入sdH2O1ml于管中，振荡数秒；置于室温10分钟后，振荡数秒，12,000rpm离心3分钟，弃上清液，保留足够上清液盖没沉淀，勿搅起沉淀；加入200μl5％的Chelex-100，振荡数秒；于56℃保温30分钟，振荡数秒；沸水浴10分钟，振荡数秒；12,000rpm离心5分钟，上清为提取得到的基因组DNA。基因组DNA的提取参考《GA/T383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》进行。也可以直接以血样检测，通过1.2mm孔径血滤纸片或FTA卡血样片实行。
2、扩增检测
按照实施例1进行PCR扩增、遗传分析仪检测并最终获得分型结果，结果见附图5。
3、结论
结果显示(见表8)，被检父、母、女在检测的23个基因座中均符合遗传规律，计算相对亲权概率(RCP)大于99.9999999％，可以认定亲子关系。
表8AGCU23+1的检测结果
亲子鉴定的基本原理为：根据孟德尔遗传定律，亲代基因型决定子代基因型。在没有基因突变、分型差错的前提下：①孩子的一对等位基因必定是一个来自父亲，一个来自母亲；②孩子不可能带有双亲均没有的等位基因。
PI＝X/Y＝∑f×c/∑f×p
f表示生母给孩子必需等位基因机会；
c表示父亲给孩子必需等位基因机会；
p表示随机男人给孩子必需等位基因机会，等于必需等位基因频率；
相对亲权概率(RCP)＝(CPI/(CPI+1))×100％；其中CPI，为各个不连锁基因座PI的乘积；
根据上述计算，本实验中父—女—母三联体亲子鉴定RCP值为大于99.9999999％，，认定亲子关系。
<110>无锡中德美联生物技术有限公司
<120>一种同时分析人基因组DNA
24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒及其应用
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Claims (10)

1.一种同时分析人基因组DNA24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒，其特征在于，所述的24个基因座为：D16S539、D6S477、D15S659、D10S1248、D1S1656、D21S2055、D4S2366、D2S441、D3S1744、D22-GATA198B05、D3S3045、D11S2368、D17S1290、D10S2325、D14S608、D8S1132、D7S3048、D5S2500、D7S1517、D18S535、D10S1435、D13S325、D19S253及性别基因座Amelogenin。
2.根据权利要求1所述的同时分析人基因组DNA24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒，其特征在于，所述24个基因座对应的引物为：D16S539SEQIDNO.1~2、D6S477SEQIDNO.3~4、D15S659SEQIDNO.5~6、D10S1248SEQIDNO.7~8、D1S1656SEQIDNO.9~10、D21S2055SEQIDNO.11~12、D4S2366SEQIDNO.13~14、D2S441SEQIDNO.15~16、D3S1744SEQIDNO.17~18、D22-GATA198B05SEQIDNO.19~20、D3S3045SEQIDNO.21~22、D11S2368SEQIDNO.23~24、D17S1290SEQIDNO.25~26、D10S2325SEQIDNO.27~28、D14S608SEQIDNO.29~30、D8S1132SEQIDNO.31~32、D7S3048SEQIDNO.33~34、D5S2500SEQIDNO.35~36、D7S1517SEQIDNO.37~38、D18S535SEQIDNO.39~40、D10S1435SEQIDNO.41~42、D13S325SEQIDNO.43~44、D19S253SEQIDNO.45~46及性别基因座AmelogeninSEQIDNO.47~48。
3.根据权利要求2所述的同时分析人基因组DNA24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒，其特征在于，所述24个基因座对应的引物浓度为：D16S539SEQIDNO.1~20.03μM、D6S477SEQIDNO.3~40.03μM、D15S659SEQIDNO.5~60.06μM、D10S1248SEQIDNO.7~80.04μM、D1S1656SEQIDNO.9~100.03μM、D21S2055SEQIDNO.11~120.06μM、D4S2366SEQIDNO.13~140.05μM、D2S441SEQIDNO.15~160.05μM、D3S1744SEQIDNO.17~180.04μM、D22-GATA198B05SEQIDNO.19~200.08μM、D3S3045SEQIDNO.21~220.04μM、D11S2368SEQIDNO.23~240.04μM、D17S1290SEQIDNO.25~260.05μM、D10S2325SEQIDNO.27~280.10μM、D14S608SEQIDNO.29~300.08μM、D8S1132SEQIDNO.31~320.12μM、D7S3048SEQIDNO.33~340.15μM、D5S2500SEQIDNO.35~360.15μM、D7S1517SEQIDNO.37~380.15μM、D18S535SEQIDNO.39~400.15μM、D10S1435SEQIDNO.41~420.2μM、D13S325SEQIDNO.43~440.2μM、D19S253SEQIDNO.45~460.2μM、性别基因座AmelogeninSEQIDNO.47~480.04μM。
4.根据权利要求2所述的同时分析人基因组DNA24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒，其特征在于，还包括反应混合物、基因组DNA、热启动Taq酶和sdH2O，所述的反应混合物为：MgCl27.5mM,Tris-HClbuffer125mM,KCl125mM,dNTPs7.5mM,BSA2mg/mL。
5.根据权利要求3所述的同时分析人基因组DNA24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒，其特征在于，所述的每个基因座对应的引物中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记。
6.根据权利要求5所述的同时分析人基因组DNA24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒，其特征在于，将24个基因座分组进行荧光染料标记，具体为：D16S539、D6S477、D15S659、D10S1248、D1S1656和D21S2055为第一组，D4S2366、D2S441、D3S1744、D22-GATA198B05、D3S3045、D11S2368和D17S1290为第二组，D10S2325、D14S608、D8S1132、D7S3048、D5S2500，以及性别基因座Amelogenin为第三组，D7S1517、D18S535、D10S1435、D13S325和D19S253为第四组，各组荧光标记物互不相同。
7.根据权利要求5所述的同时分析人基因组DNA24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增体系为：反应混合物10.0μL，基因组DNA0.125-5ng，引物混合物5μL，热启动Taq酶0.5μL，sdH2O补足至25.0μL。
8.权利要求1至7中任意一项所述同时分析人基因组DNA24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒在个体识别、亲子鉴定以及考古中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：收集基因组DNA，进行PCR扩增，分析扩增产物；其中PCR扩增程序为：变性95℃2min，循环94℃15s，60℃45s，65℃90s30个循环，
终止延伸60℃30min，4℃维持。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述基因组DNA来源于精斑、唾液斑、组织、血痕或血液。
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