CN109852704A - 一种同时检测32个y染色体基因座的复合扩增试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测32个染色体基因座的复合扩增试剂盒，其特征在于，包括56条扩增引物。本发明可提高基因多态性，用于法医学亲权鉴定及个人识别。

Description

一种同时检测32个Y染色体基因座的复合扩增试剂盒

技术领域

本发明属于法医DNA鉴定领域，尤其涉及一种同时检测32个Y染色体基因座的复合扩增试剂盒。

背景技术

短串联重复序列(short tandem repeats，STR)，也称微卫星DNA(microsatelliteDNA)，是由2～6个碱基作为核心基序，串联重复形成的一类DNA序列，广泛分布于人类基因组中，具有多态性高、信息量大以及易于检测等优点。自上世纪90年代发现以来，现已广泛应用于法医DNA鉴定、物种鉴别和遗传病诊断等领域。

Y染色体STR遗传标记是指存在于Y染色体特异区的短串联重复序列。在减数分裂时，Y染色体特异区不与X染色体进行重组交换，所以Y染色体STR遗传标记具有男性特有、父系单倍型遗传等特点。

目前，在法医领域，Y染色体STR遗传标记主要应用于家系排查和辅助个体识别。而满足上述应用的前提，则需要Y STR试剂盒具有足够高的整体多态性。而增加Y STR试剂盒位点数，是提高Y STR试剂盒的整体多态性，增加累计非父排除率和个体识别能力的有效途径。但是在现有技术条件下，Y STR试剂盒位点数的增加，具有一定的局限性。因此，当前市场上，主流的Y STR建库试剂盒均是以公安部发布的20个核心Y STR基因座为基础，然后再从公安部发布的优选和备选基因座中，选择10到20个基因座进行优化组合。此外，随着市场上差异化需求的不断增长，用户对于试剂盒包含的基因座数量、兼容性等提出了更高的要求。

发明内容

鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种同时检测32个Y染色体基因座的复合扩增试剂盒。本发明中的基因座是具有高多态性的基因座，其在实际应用过程中，不仅可用于家系排查，也可用于对主流建库试剂盒的功能进行补充，以满足客户的差异化需求。

本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：

一种同时检测32个染色体基因座的复合扩增试剂盒，其中，包括56条扩增引物，分别依次为：SEQ ID NO:1～2、SEQ ID NO:3～4、SEQ ID NO:5～6、SEQ ID NO:7～8、SEQ IDNO:9～10、SEQ ID NO:11～12、SEQ ID NO:13～14、SEQ ID NO:15～16、SEQ ID NO:17～18、SEQ ID NO:19～20、SEQ ID NO:21～22、SEQ ID NO:23～24、SEQ ID NO:25～26、SEQ IDNO:27～28、SEQ ID NO:29～30、SEQ ID NO:31～32、SEQ ID NO:33～34、SEQ ID NO:35～36、SEQ ID NO:37～38、SEQ ID NO:39～40、SEQ ID NO:41～42、SEQ ID NO:43～44、SEQ IDNO:45～46、SEQ ID NO:47～48、SEQ ID NO:49～51、SEQ ID NO:52～53、SEQ ID NO:54～56。

在一些实施例中，所述56条扩增引物对应的Y染色体基因座依次分别为：DYS531、DYS630、DYS622、DYS510、DYS533、DYF404S1a/b、DYS459a/b、DYS446、DYS443、DYS388、DYS587、DYS522、DYS626、Yindel、DYS460、Y_GATA_A10、DYS520、DYS557、DYS527a/b、DYS481、DYS508、DYS444、DYS385a/b、DYS552、DYS526a/b、DYS617和DYS713，其中，所述DYF404S1a/b、所述DYS527a/b、所述DYS385a/b和所述DYS526a/b为双等位基因基因座。

在一些实施例中，所述Y染色体基因座所对应的引物对在扩增体系中的终浓度为0.027μM～0.82μM。

在一些实施例中，所述Y染色体基因座所对应的引物对在扩增体系中的终浓度依次分别为DYS531：0.52μM、DYS630：0.08μM、DYS622：0.82μM、DYS522：0.02μM、DYS460：0.78μM、Y_GATA_A10：0.06μM、DYS520：0.8μM、DYS481：0.41μM、DYS444：0.76μM、DYS552：0.24μM、DYS526a/b：0.3μM、和DYS510：0.124μM、DYS533：0.021μM、DYF404S1a/b：0.144μM、DYS459a/b：0.7μM、DYS446：0.09μM、DYS443：0.027μM、DYS388：0.53μM、DYS557：0.071μM、DYS587：0.184μM、DYS626：0.41μM、DYS527a/b：0.051μM、DYS508：0.14μM、DYS385a/b：0.17μM、DYS617：0.15μM、DYS713：0.45μM和Yindel：0.5μM。

在一些实施例中，所述每个基因座中的至少一条引物的5’端标记有荧光染料。

在一些实施例中，所述荧光染料包括6-FAM、HEX、SUM、LYN、PUR、和/或SIZ。

在一些实施例中，所述每个Y染色体基因座对应的扩增引物的长度为90-480bp。

一种根据上述所述的试剂盒的应用，其中，所述试剂盒用于亲权鉴定、个体识别。

与现有技术相比，本发明提供的一种同时检测32个Y染色体基因座的复合扩增试剂盒，达到的技术效果是：本发明通过提供市场上未被广泛使用的新Y染色体基因座位点，如DYF404S1a/b、DYS626、DYS508、DYS713、DYS617、DYS526a/b等，与市场上主流建库试剂盒，如PathFinder、Yfiler Platinum、DNA TyperTMY36、AGCU FS Y37联用，可检测多达60个Y STR基因座，以提高Y STR试剂盒的整体多态性，和增加累计非父排除率和个体的识别能力，满足用户对Y染色体基因座的数量和高多态性的要求。

附图说明

图1是根据本申请一些实施例所示的基因座的排布示意图；

图2是根据本申请一些实施例所示的等位基因Ladder分型图；

图3是根据本申请一些实施例所示的标准DNA 9948的分型图；

图4是根据本申请一些实施例所示的试剂盒对棉签提取样本的分型图；

图5是根据本申请一些实施例所示的试剂盒对FTA血卡样本的分型图；

图6是根据本申请一些实施例所示的试剂盒对唾液卡样本的分型图。

以下便结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使技术方案更易于理解、掌握。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，下面实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本专利保护范围中。

实施例1 32个Y染色体基因座的筛选

在一些实施例中，Y染色体基因座可以基于现有文献等记载进行获取，并对其进行筛选。在一些实施例中，可以基于获取的Y染色体基因座的多态性进行调查，筛选出高多态性基因座。其中，高多态性基因座可以包括低突变的高多态性基因座，或高突变的高多态性基因座等。在一些实施例中，低突变的高多态性基因座可以指突变率低于1％，多态性高于0.6的基因座为低突变的高多态性基因座(如表1)；高突变的高多态性的基因座可以指突变率高于1％，多态性高于0.6的基因座为高突变的高多态性基因座(如表1)。

为了便于理解的目的，本实施例可以通过对DYS271、DYF380S1、DYS566、DYS611、DYF396S1、DYS441、DYS67、DYS11、DYS66、DYS551、DYS282、DYS564、DYS507、DYS148、DYS507、DYS712、DYS559、DYS512、DYS385a/b、DYS481、DYS533、DYS643、DYS460、DYS549、DYS387S1a/b、DYS449、DYS518、DYS627、DYS570、DYS 527a/b、DYS447、DYS444、DYS557、DYS596、DYS446、DYS510、DYS622、DYS443、DYS587、DYS522、Y_GATA_A10、DYS520、DYS552、DYS593、DYS531、DYS459a/b、DYS508、DYS388、DYS617、DYS645、DYS713、DYS630、DYF404S1a/b、DYS626、DYS526a/b等63个基因座，在中国人群中的多态性调查，优选出27个低突变、高多态性基因座：DYS531、DYS481、DYS510、DYS533、DYS459a/b、DYS446、DYS443、DYS388、DYS557、DYS587、DYS522、DYS520、DYS527a/b、DYS460、Y_GATA_A10、DYS508、DYS444、DYS385a/b、DYS552、DYS526a、DYS617、DYS630、DYS622、DYS713和4个高突变、高多态性基因座：DYF404S1a/b、DYS526b、DYS626以及一个Yindel。其中上述31个基因座(除Yindel)的详细信息见表1。

表1：31个Y STR基因座信息

为了进一步说明本发明优选的31个Y STR基因座和一个Yindel，与目前市场上主流的Y建库试剂盒(如表2所示的4个试剂盒)形成较好的互补，本发明将所筛选的31个Y STR基因座和一个Yindel与下述4个市场上主流的Y建库试剂盒中的基因座进行比较。详见表2，其中“+”指的是本发明可以识别的基因座，空格为本发明不能识别该STR基因座。其中，4个市场上主流的Y建库试剂盒可分别包括PathFinder、Yfiler Platinum、DNATyper^TMY36、AGCU FS Y37。

表2：本发明所提供的试剂盒与国内外试剂盒比较

实施例2：基因座排布

根据实施例1中优选的32个Y染色体基因座序列及其多态性等特征，结合荧光染料的特性，可以设计独特的基因座排布方式。

在一些实施例中，荧光染料用于将每个基因座的扩增引物对中的至少一条引物5′端进行标记。

在一些实施例中，本发明可以将32个Y染色体基因座分为五组：第一组：DYS510、DYS533、DYS531、DYS630、DYS622、DYF404S1a/b；第二组：DYS443、DYS388、DYS459a/b、DYS446、DYS557、DYS587、DYS522、DYS626；第三组：Y_GATA_A10、DYS460、DYS527a/b、DYS520、Yindel；第四组：DYS385a/b、DYS481、DYS508、DYS444、DYS552；第五组：DYS617、DYS526a/b、DYS713。

在一些实施例中，本发明可以将32个Y染色体基因座分为五组：第一组：DYS510、DYS533、DYS531、DYS630、DYS622、DYF404S1a/b，采用蓝色荧光染料；第二组：DYS443、DYS388、DYS459a/b、DYS446、DYS557、DYS587、DYS522、DYS626，采用绿色荧光染料；第三组：Y_GATA_A10、DYS460、DYS527a/b、DYS520、Yindel，采用黄色荧光染料；第四组：DYS385a/b、DYS481、DYS508、DYS444、DYS552，采用红色荧光染料；第五组：DYS617、DYS526a/b、DYS713，采用紫色荧光染料。

在一些实施例中，本发明可以将32个Y染色体基因座分为五组：第一组：DYS510、DYS531、DYS622、DYS630、DYS533、DYF404S1a/b，蓝色荧光染料为：6-FAM；第二组：DYS446、DYS557、DYS443、DYS388、DYS587、DYS459a/b、DYS522、DYS626，绿色荧光染料为：HEX；第三组：Y_GATA_A10、DYS520、DYS460、DYS527a/b、Yindel，黄色荧光染料为：SUM；第四组：DYS444、DYS385a/b、DYS481、DYS508、DYS552，红色荧光染料为：LYN；第五组：DYS617、DYS526a/b、DYS713，紫色荧光染料为PUR，如图1所示，即图1为本发明的基因座排布图。

实施例3：基因座引物设计和复合扩增体系建立

引物设计时需要注意一下几点：a、避免引物间二聚体和发卡结构，以免影响引物的扩增效率；b、确保引物序列中不包含SNP位点，特别是引物3’端序列尤为重要，如果存在SNP点可能会出现扩增丢失；c、引物序列需要利用NCBI进行blast比对，保证序列的特异性；d、确保所有引物具有相近的熔炼温度，确保同一退火温度下，具有相近的扩增效率。

随着复合扩增系统中引物数量的增加，不同基因座引物之间的相互干扰也越来越严重，反应体系的动力学变得越来越复杂，因此需要设计大量的引物序列进行复杂的测试，最终保证试剂盒的扩增特异性及效率。

便于说明的目的，本申请仅仅提供一个实施例来保证试剂盒的扩增特异性及效率。

具体的，根据NCBI Genbank中公布的上述基因座的序列信息，采用Primer 5.0软件设计引物，然后使用Oligo 7软件对设计的引物进行评价，优选扩增效率高的引物，最后，再通过NCBI数据库中的primer blast在线引物比对工具，进一步筛选高特异性引物。通过上述步骤设计的引物，再经单扩测试，作进一步优选。

将上述筛选的32个基因座引物进行混合测试，排查可能引起非特异扩增的引物，然后重新设计，直至每个基因座引物的扩增子大小为90～480bp之间，且无二聚体峰和非特异扩增现象。最后，根据每个基因座的引物扩增效率，调整复合扩增体系中的引物浓度至表3所示。

表3：32个Y染色体基因座引物信息

其中，表3中的每个基因座的扩增引物序列中，至少一条采用荧光染料标记其5′端。关于荧光染料标记引物的详细描述可以在本申请的其他地方找到，如实施例2中所述。

在确定32个基因座的复合扩增引物体系的基础上，通过大量重复实验进一步确定扩增中的其他参数，如：酶量、缓冲液离子强度、模板DNA量、复合引物量、循环参数、退火温度以及延伸温度和时间等。以期达到试剂盒的分型精准度高、均衡性好、特异性强和灵敏度优等目标要求(如表4和表5)。

在一些实施例中，本申请的试剂盒可以包括反应混合液、热启动酶、32个基因座的复合引物、32个基因座的等位基因分型标准物、DNA标准品、荧光分子内标、和/或sdH₂O。

在一些实施例中，人基因组DNA的提取方法可以包括利用Chelex法、磁珠提取法或有机抽提法。在一些实施例中，人基因组DNA可以采用免提取的滤纸、FTA卡、棉签、唾液卡、或纱布中一种或其任意组合的载体收集的含有人基因组DNA人类血液或口腔细胞。在一些实施例中，人基因组DNA的来源可以包括含有人基因组DNA的血液、血痕、精液、唾液、体液、毛发、肌肉或组织器官等中的一种或其任意组合。例如，人基因组DNA可以是1.0或1.2mm孔径的血斑；又例如，人基因组DNA可以是1.0或1.2mm孔径的唾液斑；再例如，人基因组DNA可以是采用磁珠法或者chelex-100法或者有机纯化法提取的0.1ng-2ng人基因组。

表4：PCR扩增体系及其组分

表5：PCR循环参数

实施例4试剂盒的应用

基于基因座引物设计和复合扩增体系建立，本申请的试剂盒可以应用于法医鉴定、亲权鉴定或DNA家谱构建。

本申请试剂盒具体使用步骤可以包括如下：

1、提取人基因组DNA，具体的操作方式可以参考实施例3中表4及其所述；

2、目标等位基因扩增：参照表4所示的组分，配制扩增体系，置于PCR仪上，然后参照表5的扩增程序，扩增目标等位基因，得到扩增产物；

3、扩增产物的电泳检测：取荧光分子量内标AGCU Marker SIZ-500与去离子甲酰胺，按体积比1/25的比例混合组成上样混合物；将12.5μL的上样混合物分别与1.0μL的扩增产物、32个基因座的等位基因分型标准物混合，于离心机中4000rmp离心3min，去除气泡；将其置于PCR仪上，95℃变性3min，然后转至低温冰箱中，静置3min，最后使用遗传分析仪进行电泳检测；

4、分型分析：采用片段分析软件GeneMapper ID-X分析上述遗传分析仪检测收集的数据。

实施例5：等位基因分型标准物组配

等位基因分型标准物为分型的标准，用于对个人进行分型鉴定。根据最终确定的每个基因座的引物特点，将上述收集的每个基因座的不同分型集合到一起。本发明所述的试剂盒的等位基因分型标准物的分型图，包含目前已发现的所有标准等位基因，如图2所示。

实施例6：种属特异性

试剂盒检验马、狗、猪、牛、羊、猫、鸡、鸭、鼠、兔、鱼和大肠杆菌DNA，在分型范围内，不出现特异的DNA分型，说明本发明具有较好的种属特异性。

实施例7：检材适用性

本发明检材适用性广，对人源的棉签采集提取样本、FTA血卡、唾液卡样本均能正确分型。如图4至图6所示。具体如下：

图3所示为标准DNA 9948的分型图，该图表明本发明可对阳性DNA标准品9948进行正确分型；

图4所示为试剂盒对棉签提取样本的分型图；其表明本发明可对棉签采集类样本，在提取的基础上进行正确分型；

图5所示为试剂盒对FTA血卡样本的分型图；其表明本发明可对血卡采集类样本，在不经提取的情况下进行直接检测，且能正确分型；

图6是所示的试剂盒对唾液卡样本的分型图；其表明本发明可对唾液卡采集类样本，在不经提取的情况下进行直接检测，且能正确分型。

上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 无锡市公安局刑事科学技术研究所

无锡中德美联生物技术有限公司

<120> 一种同时检测32个Y染色体基因座的复合扩增试剂盒

<141> 2019-04-04

<160> 56

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgagacgca ctggcattca aatc 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgagacgca ctggcattca aatc 24

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agagcaagac tccacctcaa aag 23

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catggatagc tgtgagttcc ataaact 27

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctgtgtatg tcccagaaat gtaggt 26

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cctcggtgat aagagtgaaa c 21

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcccttacca cagataggta agac 24

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcttatacag cagatgataa taggtat 27

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caccagttag aggagatgga aagc 24

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtctacctat tcatctaaca tctttgtcat c 31

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttgagtttcc cagaaggcct aatgcaca 28

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccaggtattc tggttgaggc t 21

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agcaagactt aatcacaccc cact 24

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cctgatatat ttgcagttaa tttgatcc 28

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

caattatttt cagtcttgtc ctgtcc 26

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

attattgctg agcttgtacc actg 24

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

agattgaatt attcagtgct tttcat 26

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ttatcttttt attagctttt tgcagcc 27

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggcggagctt ttagtgagcc a 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tctgggcagc gagtttaagg g 21

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tgatgagtaa gacacagatt tgttgta 27

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggtttcagga aaatattcaa aaatgatc 28

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aatcctttga aatcattcat aatgc 25

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ggaagacaga gtcataaaca gag 23

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

caatgaaacc atacaagagc ac 22

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cagcctgggt gacagagtgc 20

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ccaaatcaac tcaactccag tga 23

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ctgatacctt tgtttctgtt catt 24

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gttatatcat ctatcctctg cctatc 26

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

aataagaata ccagaggaat ctgaca 26

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aatggagata gtgggtggat 20

<210> 32

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gcaacctgcc atctctattt atcttgcat 29

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gtcaagcaat ttgctttcgt caac 24

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gtcgagttag agaacagcct 20

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gcccagcatg tgttttgact a 21

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

actgtcacaa tgggtcctgt a 21

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

attctaggaa gattagccac aa 22

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

cttattcgtg agccaagatc gc 22

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

tttaccagaa ggttgcaaga ctc 23

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gaatgtggct aacgctgttc 20

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

ttatacaatg gcaatcccaa att 23

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

acaaataagg tgggatggat 20

<210> 43

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

gagcccatgc cattcaaac 19

<210> 44

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

gctcattttc tctcttctcc actttaa 27

<210> 45

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

ctattccaat tacatagtcc tcc 23

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

gttgaaatga tggcactgca 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

cttcaatgtc catagtgccg 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

atcgatgttg agcaggatcc 20

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

gaaagaaagt aaacgtttgg gtta 24

<210> 50

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

tctttacctt ctggtgaact gatcc 25

<210> 51

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

tctttacctt ctgggaaact gatcc 25

<210> 52

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

tgttctttct gcttagtact gtg 23

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

tgcgggattg gggagtgata 20

<210> 54

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

actgtactcc agcctgggtg ac 22

<210> 55

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

accagaaata gatttattca cgcttg 26

<210> 56

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

accagaacta gatttattca cggttg 26

Claims (8)

1.一种同时检测32个染色体基因座的复合扩增试剂盒，其特征在于，包括56条扩增引物，分别依次为：SEQ ID NO:1～2、SEQ ID NO:3～4、SEQ ID NO:5～6、SEQ ID NO:7～8、SEQID NO:9～10、SEQ ID NO:11～12、SEQ ID NO:13～14、SEQ ID NO:15～16、SEQ ID NO:17～18、SEQ ID NO:19～20、SEQ ID NO:21～22、SEQ ID NO:23～24、SEQ ID NO:25～26、SEQ IDNO:27～28、SEQ ID NO:29～30、SEQ ID NO:31～32、SEQ ID NO:33～34、SEQ ID NO:35～36、SEQ ID NO:37～38、SEQ ID NO:39～40、SEQ ID NO:41～42、SEQ ID NO:43～44、SEQ IDNO:45～46、SEQ ID NO:47～48、SEQ ID NO:49～51、SEQ ID NO:52～53、SEQ ID NO:54～56。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述56条扩增引物对应的Y染色体基因座依次分别为：DYS531、DYS630、DYS622、DYS510、DYS533、DYF404S1a/b、DYS459a/b、DYS446、DYS443、DYS388、DYS587、DYS522、DYS626、Yindel、DYS460、Y_GATA_A10、DYS520、DYS557、DYS527a/b、DYS481、DYS508、DYS444、DYS385a/b、DYS552、DYS526a/b、DYS617和DYS713，其中，所述DYF404S1a/b、所述DYS527a/b、所述DYS385a/b和所述DYS526a/b为双等位基因基因座。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述Y染色体基因座所对应的引物对在扩增体系中的终浓度为0.027μM～0.82μM。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述Y染色体基因座所对应的引物对在扩增体系中的终浓度依次分别为DYS531：0.52μM、DYS630：0.08μM、DYS622：0.82μM、DYS522：0.02μM、DYS460：0.78μM、Y_GATA_A10：0.06μM、DYS520：0.8μM、DYS481：0.41μM、DYS444：0.76μM、DYS552：0.24μM、DYS526a/b：0.3μM、DYS510：0.124μM、DYS533：0.021μM、DYF404S1a/b：0.144μM、DYS459a/b：0.7μM、DYS446：0.09μM、DYS443：0.027μM、DYS388：0.53μM、DYS557：0.071μM、DYS587：0.184μM、DYS626：0.41μM、DYS527a/b：0.051μM、DYS508：0.14μM、DYS385a/b：0.17μM、DYS617：0.15μM、DYS713：0.45μM和Yindel：0.5μM。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述每个基因座中的至少一条引物的5’端标记有荧光染料。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光染料包括6-FAM、HEX、SUM、LYN、PUR、和/或SIZ。

7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述每个Y染色体基因座对应的扩增引物的长度为90-480bp。

8.一种根据权利要求1-7任一项所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒用于亲权鉴定、个体识别。