CN102086474B

CN102086474B - 多重基因拷贝数检测试剂盒和方法

Info

Publication number: CN102086474B
Application number: CN 201010180551
Authority: CN
Inventors: 姜正文; 马瑞晓
Original assignee: Shanghai Genesky Bio-Tech Co Ltd
Current assignee: Tianhao Gene Technology Suzhou Co ltd
Priority date: 2010-05-24
Filing date: 2010-05-24
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2030-05-24
Also published as: CN102086474A; WO2011147309A1

Abstract

本发明公开一种多重基因拷贝数检测试剂盒，主要包括有：针对待测的目标基因设计的多重PCR引物；定量的针对不同待测的目标基因的内对照DNA片段；至少一对参照基因的多重PCR引物；定量的参照基因的内对照DNA片段；上述同种荧光标记的多重PCR引物对应扩增产物的长度有差异，以至于扩增产物在毛细管电泳分析中任意两个产物条带不重叠。本发明还公开了一种多重基因拷贝数检测方法。本发明多重基因拷贝数检测试剂盒和检测方法，不仅能多个基因位点同时快速检测，而且具有很高的精确性。

Description

多重基因拷贝数检测试剂盒和方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，应用于生物科学研究和临床分子诊断，具体地，是涉及到一种多重基因拷贝数检测试剂盒和方法。

背景技术

基因拷贝数是指单个细胞或单个基因组内所含目标基因片段的数目。基因拷贝数的变化如缺失或重复可能会改变目标基因的正常功能从而导致相关疾病发生或相关表型的变化，因此基因拷贝数的快速而准确的检测将有助于相关基因的科学研究。具体检测方法可以分为两大类，一类是全基因组水平上的基因拷贝数变化区域筛选，另一类是对目标区域进行拷贝数测定。前者包括细胞核型分析、比较基因组杂交以及全基因组SNP芯片杂交技术等(Jacobs etal.，1978；Solinas-Toldo et al.，1997；Barrett et al.，2004；Zhao et al.，2004)，这些技术主要用于发现新变异区域，但普遍存在检测分辨率、准确性偏低、检测周期长以及检测成本高等缺点，而后者主要针对有限目标区段的检测，包括实时定量PCR技术(Bieche etal.，1998)、多重可扩增探针杂交(MAPH)(Armour et al，2000)、短荧光片断定量多重PCR(QMPSF)(Charbonnier et al.，2000)、多重连接依赖探针扩增(MLPA)(Schouten et al.，2002)以及MassArray绝对拷贝数检测技术(Sequenom Inc.，San Diego，CA)。

实时定量PCR技术主要是基于在PCR指数扩增期，其扩增产物的量与原始模板量成指数关系的原理发展而来的。如果固定PCR指数扩增期产物的量，那么原始模板量(N0)对数值与PCR循环数(Ct)成线性关系。利用该技术进行目标基因拷贝数检测时，需要选取至少一个在所有待检样品中拷贝数保持稳定的参照基因(通常每个基因组仅含一个拷贝)以及目标基因/参照基因分子数量已知的标准样品。对标准样品进行梯度稀释后与待检样品一起进行目标基因/参照基因的实时定量PCR反应，收集与PCR产物量成正相关的荧光信号，分析每个反应在指数扩增期某一固定荧光值对应的Ct值，利用标准样品基因分子数对数值与Ct值的线性关系曲线获取待检样品的目标基因以及参照基因的绝对分子数，在参照基因拷贝数已知情况下，将目标基因绝对分子数除以参照基因的绝对分子数即可估计出目标基因的拷贝数。这种技术由于其操作简单以及反应体系易优化而获得广泛应用，但由于目标基因与参照基因在不同体系中进行反应，最后结果的方差较大，不适合高拷贝数的区分如5个与6个拷贝之间，而且通常情况下每个反应只能检测一个基因，因此检测通量较小。

短荧光片断定量多重PCR(QMPSF)是一个多重基因拷贝数检测技术。通过一个多重荧光PCR反应同时扩增不同长度的多个目标基因和参照基因片断，然后利用毛细管电泳分析各个片断的扩增量。每个目标基因的扩增量先用参照基因扩增量进行校正，然后通过比较待检样品与已知各个基因拷贝数的对照样品在这些校正值上的差异即可估计出待检样品每个目标基因的拷贝数。该方法操作简单快速而且能够实现多重基因检测从而大大提高检测通量并有效降低检测成本，但是由于不同基因片断扩增采用的是不同扩增引物而且不同PCR片断的碱基组成和分子结构不尽相同，因此不同基因片断的扩增效率会随着模板量、模板质量以及PCR扩增微环境的不同发生非同步变化，而且PCR平台效应可能会减弱不同拷贝数的基因片断间差异，这样最后的检测值的准确性会大大下降，同样该方法由于方差偏大不利于高拷贝数的准确确定。

多重可扩增探针杂交(MAPH)也是一种能同时实现多基因拷贝数检测的技术，其主要原理是将一批含共同扩增引物序列但长度不同的对应不同基因片段的过量探针与固定在尼龙膜上的样本DNA进行杂交，杂交后将未结合上的探针洗脱，然后分离出结合探针，以这些结合探针为模板用通用引物进行PCR扩增，扩增产物用毛细管电泳进行片段分离和荧光信号收集，比较参照样本以及检测样本的扩增谱形可以确定缺失或重复的基因位点。这种方法由于采用了通用引物，不同片段间的扩增一致性较QMPSF大为提高，但该操作过程时间长，体系复杂不利于高通量运行，而且不同探针的结合效率会因为杂交条件的改变发生非同步改变或者不同基因片断的扩增效率也会随PCR扩增微环境的不同发生非同步变化，PCR平台效应也可能会减弱不同拷贝数的基因片断间差异，从而导致检测方差偏大，准确度下降，而且也不利于高拷贝数的准确确定。

多重连接依赖探针扩增(MLPA)是目前使用较为广泛的一种多重基因拷贝数检测技术，是MRC-Holland公司产品的主要技术基础。该技术的操作过程如下：针对每个位点设计两个探针，一个是上游探针，另一个是下游探针(其5’端须磷酸化)，这对探针可杂交到目标序列紧邻位置上，所有位点的上游探针5’端和下游探针3’端分别含一段共同序列，这对共同序列使得随后连接产物可以用通用引物扩增；对应多个目标基因的探针对与变性后的样本DNA的目标序列进行杂交；紧邻配对的上下游探针对被连接酶连接；连接产物被作为模板用通用引物进行PCR扩增；扩增产物用毛细管电泳进行片段分离和荧光信号收集，比较参照样本以及检测样本的扩增谱形可以确定缺失或重复的基因位点。MLPA与MAPH都能实现同时分析几十位点的能力，而且都采用了通用引物扩增，不同片段间的扩增一致性较QMPSF大为提高，但操作上MLPA较MAPH简单。虽然MLPA技术是目前较为稳定而且被广泛使用的商业化技术，但其整个过程完成仍然需要2个工作日，而且不同探针的杂交连接效率会因为杂交连接条件以及样本DNA质量差异发生非同步改变或者不同基因片断的扩增效率也会随PCR扩增微环境的不同发生波动，PCR平台效应也可能会减弱不同拷贝数的基因片断间差异，从而导致检测方差偏大，准确度下降，而且也不利于高拷贝数的准确确定。

MassArray绝对拷贝数检测技术是美国Sequenom公司基于Massarray SNP分型平台，综合多重竞争性PCR，单碱基延伸SNP分型以及端片段质谱分离技术开发而成的。竞争性PCR最早是由Wang等人于1989发明用于目标基因表达量的确定，其基本原理是人工合成一段RNA序列，其两侧序列分别与目标基因序列相同，但中间序列与目标基因存在长度上的差异，然后将梯度稀释的该RNA序列作为内对照分别与等量样本mRNA混合用共同引物反转录后用共同引物同时扩增目标基因mRNA和内对照RNA反转录产物；两种扩增产物由于在长度上存在差异所以可以用琼脂糖电泳分开，由于PCR引物相同，目标基因片段以及对照基因片段的扩增效率类似，因此两种扩增产物对应电泳条带的亮度比可以真实反映掺入内对照RNA与目标基因mRNA的量比，这样根据电泳条带的亮度比以及内对照RNA的掺入量可以很好的估计目标基因mRNA的量。随后，该技术经改进后被广泛应用于检测样本中目标病原微生物的定量(Hobsonet al.，1997；Li and Drake，2001)。MassArray绝对拷贝数检测基本流程如下：合成一段与参照/目标基因仅有一个碱基差异的内对照DNA，然后将各个内对照DNA一起与样本DNA混合在一起；通过多重PCR反应将多个参照/目标基因片段以及对应的内对照DNA片段一起扩增；将PCR扩增产物进行纯化；利用紧挨样本参照/目标基因DNA与内对照DNA差异位点处的延伸引物以多重PCR扩增产物为模板在仅含ddNTP体系中进行单碱基延伸；延伸产物纯化后用质谱分离；分析每个位点样本峰与内对照峰的比例，目标基因比值除以参照基因比值进行校正，其校正值通过除以参照样本的校正值后乘以参照样本目标基因拷贝数后即得检测样本目标基因的拷贝数。该技术由于采用了内对照竞争性PCR技术，降低了片段扩增效率差异以及实验操作和检测环境/仪器等外界环境的影响，从而降低了检测结果方差，提高了检测结果的准确性，对高拷贝数多态也会有很好的区分。但该技术由于采用质谱平台，延伸产物质谱峰普遍比较低，如果不能很好控制背景噪音以及样本/内对照DNA量比，结果的准确性会大大下降，而且整个过程设计多次PCR以及纯化过程，实验操作有待进一步简化。

发明内容

本发明的目的之一在于克服现有技术的缺陷，提供一种多重基因拷贝数检测试剂盒，该试剂盒可以对多个目标基因同时进行拷贝数检测。

实现上述目的的技术方案如下：

一种多重基因拷贝数检测试剂盒，主要包括有：

(A)针对待测的目标基因设计的多重PCR引物，每对引物中的一条具有荧光标记；

(B)定量的针对不同待测的目标基因的内对照DNA片段，该内对照DNA片段与(A)中对应的多重PCR引物的扩增产物高度一致，为对应扩增产物的序列缺失或插入少数1-50个碱基的序列；

(C)至少一对参照基因的多重PCR引物，每对引物中的一条具有荧光标记；

(D)定量的参照基因的内对照DNA片段，该内对照DNA片段与(C)中对应的参照基因高度一致，为参照基因的序列缺失或插入少数1-50个碱基的序列；

上述同种荧光标记的多重PCR引物对应扩增产物的长度有差异，以至于扩增产物在毛细管电泳分析中任意两个产物条带不重叠。

本发明的另一目的是提供一种多重基因拷贝数检测方法，该方法是基于竞争性PCR原理并结合多重荧光PCR扩增以及毛细管电泳长度差异片段分离技术对参照基因和多个目标基因同时进行定量，并利用参照基因对检测结果进行校正后获取多个目标基因的正确拷贝数，

一种多重基因拷贝数检测方法，主要包括以下步骤：

(1)针对待测的目标基因，设计对应的多重PCR引物，每对引物中的一条具有荧光标记；设计至少一对参照基因的多重PCR引物；每对引物中的一条具有荧光标记；上述同种荧光标记的多重PCR引物对应扩增产物的长度有差异；

(2)设计针对不同待测的目标基因和参照基因的内对照DNA片段，所述内对照DNA片段与(1)中对应的多重PCR引物的扩增产物高度一致，为对应扩增产物的序列缺失或插入少数1-50个碱基的序列；

(3)对所有内对照DNA片段严格定量；

(4)将每种内对照DNA片段等量混合，与所述多重PCR引物对待测样品进行多重荧光PCR扩增；

(5)扩增产物通过变性毛细管电泳将不同长度的片段分开，得到每个条带的位置信息以及荧光强度。

优选的，步骤(5)之后还包括以下步骤：计算每个基因位点的样本条带/内对照DNA条带的荧光峰高或面积比，然后将目标基因的该比值除以参照基因的该比值再乘以参照基因的拷贝数即得目标基因的相对拷贝数。

如果存在目标基因拷贝数已知的参照样本，可以将待测样本目标基因的相对拷贝数除以参照样本对应目标基因的相对拷贝数再乘以参照样本该目标基因拷贝数即得待测样本该目标基因的精确拷贝数。

本技术发明是在认真总结现有技术中各种多重检测方法的优缺点的基础上再经过自主创新后开发成功的，它综合了QMPSF一步PCR一步检测的简单快速以及MassArray绝对拷贝数检测技术中多重竞争性PCR的高精度，是一种简单快速、高通量、高精确的先进基因拷贝数检测技术，在对疾病致病基因研究等领域将会有广泛的应用前景。

本发明所述的多重基因拷贝数检测试剂盒和检测方法，主要具有以下优点：

1、快速检测：在获得内对照DNA后，只要将样本DNA与内对照DNA混匀后进行多重PCR，然后将PCR产物直接上毛细管荧光电泳仪(如ABI测序仪)即可，整个实验过程仅需要一步PCR循环和一步毛细管电泳，耗时不到4个小时；

2、多个基因位点同时检测：由于采用了多重PCR体系，一个反应通常可以同时扩增12个位点以上，也就意味着如果选用2个参照基因，那么一个反应可以同时检测10个以上目标基因位点；

3、高精确性：由于目标基因片段与其内对照DNA之间仅有少数几个碱基差别，这两个模板的扩增效率将体现高度一致性，因此最后的扩增产物真实的反应了扩增前两个模板浓度比例，根据我们预测试结果，一个竞争性PCR反应重复3次的标准方差在5％之内，而且如果将目标基因片段与内对照DNA按不同稀释梯度混合进行竞争性PCR，我们发现样本峰与内对照峰面积之比与两个模板的原始浓度比的相关性达到99.9％以上。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明所述检测方法的原理示意图；

图2是本发明实施例1中样品1检测结果示意图；

图3是本发明实施例1中样品2检测结果示意图。

具体实施方式

本发明所述的多重基因拷贝数检测方法，参见图1，主要包括以下步骤：

1)针对多个目标基因以及参照基因进行多重PCR引物设计，每对引物中一条将标上荧光引物，同种荧光引物对应扩增产物长度必须有差别；

2)针对每个基因的扩增片段，合成或克隆获得与对应引物扩增产物序列对比缺失或插入1-50个碱基的DNA片段作为内对照DNA，并进行精确定量；在图1中，内对照DNA相对于样本DNA片段缺2个碱基；

3)将适量样本DNA与适量内对照DNA混匀，混入的每种内对照DNA的分子数量相等并估计与样本DNA中参照基因的分子数量一致；

4)对样本/内对照DNA混合物进行多重荧光PCR扩增；

5)扩增产物通过变性毛细管电泳将不同长度的片段分开，收集每个条带的位置信息以及荧光强度；这一步通常在测序仪上完成如美国应用生物公司的测序仪ABI3130以及ABI3730等；

6)由于不同基因的扩增产物在长度以及荧光标记上不同，而且同一基因位点上样本DNA以及内对照DNA扩增产物长度也不同(附图中为2bp差异)，因此根据毛细管电泳峰形图可以明确每个基因位点上样本DNA以及对照DNA各自扩增产物量。由于样本DNA以及对照DNA在每个基因位点上扩增引物一致而且序列上仅有微量差异，因此样本与内对照DNA的扩增量比可以估计为反应前样本DNA与内对照DNA的分子数量比。计算每个基因位点的样本DNA峰(S峰)与内对照DNA峰(I峰)的峰高或面积比(S/I)。

7)将每个目标基因位点的S/I比值分别除以参照基因的S/I比值然后乘以参照基因的拷贝数即可获得目标基因的相对拷贝数(附图中参照基因拷贝数为2)。

8)如果存在目标基因拷贝数已知的参照样本，7)中的结果可以用参照样本对应基因的检测结果进行进一步的校正，获取目标基因的精确拷贝数。

实施例1

利用本发明所述多重基因拷贝数检测方法对两个21三体患者进行21号染色体、X染色体以及Y染色体的拷贝数检测。

一：构建多重基因拷贝数检测试剂盒：

目标基因序列及内对照DNA序列信息：

选取了3个目标基因和1个参照基因做检测，参照基因为核糖核酸酶P亚基(POP1)，3个目标基因为唐氏综合症关键区钙调磷酸1调控子(RCAN1)、Y染色体上性别决定区(SRY)以及X染色体上高多样同源框(HDX)。这些基因对应扩增序列的原序列与内对照DNA序列信息见下面描述(黄色背景蓝色字体处为人参照序列与内对照序列差别处)。内对照DNA由上海生工进行克隆合成。

POP1基因(参照基因)

人标准序列，253bp (SEQ ID NO：1)

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内对照DNA序列，251bp(SEQ ID NO：2)

actaTCtggggaccttccagggccagacattgtgtaagatgctgggatagatgacttagatgtggtcaaagaagtacagg

gcactcaggaaacctctagaaggggtactgagctcagatgagaaaaatgaggccagcctcctgatggaagagcaggcatt

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HDX基因(目标基因)

人标准序列，278bp(SEQ ID NO：3)

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内对照DNA序列，276bp(SEQ ID NO：4)

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gtttctataaataccttgaacacacagaaacccttg

SRY基因(目标基因)

人标准序列，350bp(SEQ ID NO：5)

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内对照DNA序列，348bp(SEQ ID NO：6)

gtgagttttggatagtaaaataagtttcgaactctggcacctttcaattttgtcgcactctccttgttttTCaatgcaat

catatgcttctgctatgttaagcgtattcaacagcgatgattacagtccagctgtgcaagagaatattcccgctctccgg

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RCAN1基因(目标基因)

人标准序列，354bp(SEQ ID NO：7)

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cttggttcccctctcagctcaatctgctgtcacc

内对照DNA序列，352bp(SEQ ID NO：8)

gtttcTCtctaaaatcagatgtttttcacatccagagctgctttaaatcctcctcaccactccaccccctaacaactgct

tggttcccctctcagctcaatctgctgtcacc

引物序列：其中，[FAM]表示为荧光标记。

POP1F：[FAM]TGAAATGATGATCTCATGGTTGAAA(SEQ ID NO：9)

POP1R：GAGTCAGTTCAAATGCCTGCTCTT(SEQ ID NO：10)

HDXF：GTAAAAATTGCTTTCAGCTCATATTACAGTG(SEQ ID NO：11)

HDXR：[FAM]CAAGGGTTTCTGTGTGTTCAAGGTATTT(SEQ ID NO：12)

SRYF GCAAGTAGTCAACGTTACTGAATTACCA(SEQ ID NO：13)

SRYR：[FAM]TTTCAGTGCAAAGGAAGGAAGAGC(SEQ ID NO：14)

RCAN1F：[FAM]GCACTGGAAAATCCAGGCAGTT(SEQ ID NO：15)

RCAN1R：GGTGACAGCAGATTGAGCTGAGA(SEQ ID NO：16)

二：检测样本：样本A为临床核型分析为21三体的男性，样本B为临床核型分析为21三体的女性。

三：检测方法

主要包括以下步骤：

(1)将临床上已经证明是21三体综合症的2个分别为男性和女性样本的DNA用Biophotomerterplus(Eppendor)进行精确定量，然后稀释至10ng/μl作为待测DNA样本待用。

(2)配置PCR引物混合液，分别含4对PCR引物POP1F/R、HDXF/R、RCAN1F/R和SRYF/R，每条引物浓度各2μM。

(3)内对照DNA用Biophotomerterplus(Eppendor)进行多次定量后取平均值，然后配置4个内对照DNA混合液，终浓度均为1ng/μl，然后将此混合液再梯度稀释200,000倍(标为iDNA)。

(4)多重PCR体系(20μl)配置：

10xBuffer(Qiagen) 2μl

PCR引物混合液 2μl

MgCl₂(25mM) 0.8μl

dNTP(10mM) 0.4μl

样本DNA 1μl

iDNA 1μl

HotstarTaq(5U/μl，Qiagen) 0.2μl

ddH2O 12.6μl

PCR程序：

95℃ 15min

60℃ 60min

4℃ for ever

(5)取1μlPCR产物用ddH₂O稀释10倍，然后取1μl加入到8.8μl的Hi-Di(ABI)和0.2μll的LIZ500分子内标(ABI)中，95℃5min变性后，置于3130XL测序仪上进行毛细管电泳。

(6)结果使用GeneMapper4.0软件进行数据分析，读取峰高等数据。

数据分析表

图2和图3分别为样品A和样品B的峰形图，其中，I表示内对照DNA，S表示样本DNA，Chr表示染色体，黄色峰为分子内标。

四：结论

样本A含1个拷贝ChrX和ChrY以及3个拷贝Chr21，为21三体男性，与临床检测结果一致。

样本B含2个拷贝ChrX，不含ChrY以及3个拷贝Chr21，为21三体女性，与临床检测结果一致。

序列表

<110>上海天昊生物科技有限公司

<120>一种多重基因拷贝数检测试剂盒和方法

<160>16

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>253

<212>DNA

<213>人核糖核酸酶P亚基

<400>1

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<210>2

<211>251

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

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<210>3

<211>278

<212>DNA

<213>人X染色体上高多样同源框

<400>3

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<210>4

<211>276

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

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<210>5

<211>350

<212>DNA

<213>人Y染色体上性别决定区

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<211>248

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

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<210>7

<211>354

<212>DNA

<213>人唐氏综合症关键区钙调磷酸1调控子

<400>7

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<210>8

<211>352

<212>DNA

<213>人工序列

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gcaagtagtc aacgttactg aattaccatg ttttgcttga gaatgaatac attgtcaggg 60

gcactggaaa atccaggcag ttttaggcca ttttcacttt tcaccctagt gtgagggtga 60

ggcatgcggt ttctcagatt taaattctga ataaaatttc cccttaaatg atcttatctc 120

caatatggta tagagtttaa tttatttggg aaggttcaga atgttgtaca tttttgaaag 180

ctacatgtta catatgtgcg aagtttattt tcagttttcc actatttctc taattttagg 240

gtttcTCtct aaaatcagat gtttttcaca tccagagctg ctttaaatcc tcctcaccac 300

tccaccccct aacaactgct tggttcccct ctcagctcaa tctgctgtca cc 352

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

tgaaatgatg atctcatggt tgaaa 25

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

gagtcagttc aaatgcctgc tctt 24

<210>11

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

gtaaaaattg ctttcagctc atattacagt g 31

<210>12

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

caagggtttc tgtgtgttca aggtattt 28

<210>13

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

gcaagtagtc aacgttactg aattacca 28

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

tttcagtgca aaggaaggaa gagc 24

<210>15

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

gcactggaaa atccaggcag tt 22

<210>16

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

ggtgacagca gattgagctg aga 23

Claims

1.一种多重基因拷贝数检测试剂盒，其特征是，主要包括有：

(B)定量的针对不同待测的目标基因的内对照DNA片段，该内对照DNA片段与(A)中对应的多重PCR引物的扩增产物高度一致，为对应扩增产物的序列缺失或插入1-50个碱基的序列；

(D)定量的参照基因的内对照DNA片段，该内对照DNA片段与(C)中对应的参照基因高度一致，为参照基因的序列缺失或插入1-50个碱基的序列；

同种荧光标记的多重PCR引物对应扩增产物的长度有差异，以至于扩增产物在毛细管电泳分析中任意两个产物条带不重叠。

2.根据权利要求1所述的多重基因拷贝数检测试剂盒，其特征是，所述缺失或插入的碱基的个数为1-5。

3.根据权利要求2所述的多重基因拷贝数检测试剂盒，其特征是，所述缺失或插入的碱基的个数为2个。

4.根据权利要求1-3任一项所述的多重基因拷贝数检测试剂盒，其特征是，还包含有多重PCR反应缓冲液及热稳定DNA聚合酶或两者预混和液。

5.一种非诊断目的的多重基因拷贝数检测方法，其特征是，主要包括以下步骤：

(1)针对多个目标基因以及参照基因进行多重PCR引物设计，每对引物中一条标上荧光标记，同种荧光引物对应扩增产物长度有差别；

(2)针对每个基因的扩增片段，合成或克隆获得与对应引物扩增产物序列对比缺失或插入1-50个碱基的DNA片段作为内对照DNA，并进行精确定量；

(3)将适量样本DNA与适量内对照DNA混匀，混入的每种内对照DNA的分子数量相等并与样本DNA中参照基因的分子数量一致；

(4)对样本/内对照DNA混合物进行多重荧光PCR扩增；

(5)扩增产物通过变性毛细管电泳将不同长度的片段分开，收集每个条带的位置信息以及荧光强度。

6.根据权利要求5所述的多重基因拷贝数检测方法，其特征是，步骤(5)之后还包括以下步骤：计算每个基因位点的样本条带/内对照DNA条带的荧光峰高或面积比，然后将目标基因的该比值除以参照基因的该比值再乘以参照基因的拷贝数即得目标基因的相对拷贝数。

7.根据权利要求5所述的多重基因拷贝数检测方法，其特征是，所述缺失或插入的碱基的个数为1-5。

8.根据权利要求7所述的多重基因拷贝数检测方法，其特征是，所述缺失或插入的碱基的个数为2。