KR101247999B1 - 흡충의 피낭유충 감염을 진단하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 중간 숙주인 어패류의 흡충 감염을 진단하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 PCR 진단방법으로서, 상세하게는 간흡충, 참굴큰입흡충, 표주박이형흡충, 긴이형흡충 및 요코가와흡충의 감염을 진단하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 PCR 진단방법에 관한 것으로서, 정방향 프라이머(F):5' -GATAACGGGTAACGGGGAAT-3' 및 역방향 프라이머(R):5' -AACCTCTGACTTTCGCTCCA-3'로 이루어진 것을 특징으로 하는 흡충 감염 진단을 위한 프라이머 및 이를 이용한 PCR 진단 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 tre-18s primer set은 기생충만의 18s rRNA에서 반응이 일어나도록 디자인된 primer set로서, 기생충의 DNA에만 붙도록 하고, 숙주의 DNA에는 되도록 붙지 않도록 제작이 된 Primer이다. 따라서 본 발명에 의하면 정확하고 감도가 높은 진단이 가능하다.

Description

흡충의 피낭유충 감염을 진단하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 진단방법{Primer for diagnosis of Trematoda infection and diagnosis method using the primer}

본 발명은 중간 숙주인 어패류의 흡충 감염을 진단하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 PCR 진단방법으로서, 상세하게는 간흡충, 참굴큰입흡충, 표주박이형흡충, 긴이형흡충 및 요코가와흡충의 감염을 진단하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 PCR 진단방법에 관한 것이다.

편형동물에 속하는 흡충(Trematoda)은 몸은 좌우 대칭으로 편평하고 끝에 입이 있고 항문은 없으며, 입이나 배에 빨판 또는 갈고리가 있어서 어패류의 중간 숙주를 거쳐 사람 등 척추동물의 소화 기관 등에 붙어서 기생하여 폐디스토마, 간디스토마 등과 같은 질환을 일으킨다.

그러므로 중간 숙주인 어패류에서 감염 여부를 진단하는 것은 매우 중요하나, 어패류 매개성 기생충의 감염 형태인 피낭유충이나 무낭유충의 경우 전문가의 현미경에 의한 육안 검사에 의존하였으며, 실제로 피낭유충의 형태를 감별할 수 있는 전문가는 국내에도 거의 없는 수준이다.

그러나 진단 프로토콜이 제시되면, 전문가가 아닌 연구자들도 쉽게 기생충을 분리 및 동정이 가능하기 때문에 이러한 프로토콜 개발이 시급한 과제로 남아 있다.

대한민국 특허 공개 공보 에서도 확인할 수 있듯이 보통 기생충의 감염 여부는 프라이머를 이용한 PCR법이 많이 이용되는 바 본 발명 역시 흡충 진단을 위한 새로운 프라이머를 개발하고 이를 통한 PCR 진단 방법을 확립하여 완성된 것이다.

따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 중간숙주인 어패류의 흡충에 대한 감염 여부를 진단할 수 있는 프라이머와 이를 이용한 PCR 진단 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은

정방향 프라이머(F):5' -GATAACGGGTAACGGGGAAT-3' 및

역방향 프라이머(R):5' -AACCTCTGACTTTCGCTCCA-3'

로 이루어진 것을 특징으로 하는 흡충 감염 진단을 위한 프라이머 및 이를 이용한 PCR 진단 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 흡충은 간흡충, 참굴큰입흡충, 표주박이형흡충, 긴이형흡충 및 요코가와흡충로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명에 따른 tre-18s primer set은 기생충의 18s rRNA에서만 반응이 일어나도록 디자인된 primer set로서, 기생충의 DNA에만 붙도록 하고, 숙주의 DNA에는 되도록 붙지 않도록 제작이 된 Primer이다. 따라서 본 발명에 의하면 정확하고 감도가 높은 진단이 가능하다.

도 1은 본 발명에 따른 primer set(tre-18s primer)를 이용한 PCR 조건을 상세하게 도시한 도면이다.
도 2는 도 1의 조건에 따라 PCR을 실시한 결과는 도시한 도면이다.

이하 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 상세하게 설명하기로 한다.

1. 검사할 기생충의 피낭유충 및 무낭유충의 확보

각각의 기생충의 피낭유충 및 무낭유충을 감염된 숙주로부터 분리하였다. 간흡충은 붕어에서, 참굴큰입흡충은 참굴에서, 가숭어와 숭어에서는 각각 표주박이형흡충과 긴이형흡충 그리고 은어에서는 요코가와흡충을 분리하여 확인하였다. 얻어진 충체는 -80℃ 냉동실에서 20마리 혹은 50마리씩 분주하여 보관하였다.

2. 기생충 5종의 18s rRNA의 염기서열 분석

5가지 target 기생충인, 간흡충, 참굴큰입흡충, 표주박이형흡충, 긴이형흡충, 요코가와흡충의 18s rRNA의 염기서열을 확보된 피낭유충과 무낭유충을 이용하여 분석하였다.. 각각의 염기서열에 대한 정확성을 높이기 위해서 Forward sequencing과 Reverse sequencing을 각각 3번 이상 실시하여, 염기서열 분석을 실시하였으며, 그 결과는 다음과 같다.

[간흡충의 18s rRNA]

[참굴큰입흡충 18s rRNA]

[표주박이형흡충 18s rRNA]

[요코가와흡충 18s rRNA]

[긴이형흡충 18s rRNA]

3. BLAST를 실시하여 염기서열의 오염 확인 및 계통수 분석

BLAST는 이용하여 얻어진 gene sequences에 대한 검증과정은 필수적이다. 물론 GenBank에 upload를 하는 과정에서도 요구하는 것이 BLAST이다. 보통의 경우에는 BLAST에서 확인하는 주요한 반응은, bacterial gene의 contamination을 보기도 하지만, Gene에 대한 계통적인 분류를 하는데 더 초점이 맞추어 진다. 본 연구에서는 기생충 5종에 대한 BLAST를 완료였다. 그 결과 bacteria gene에 대한 contamination은 없는 것이 확인되었고, 18s rRNA를 통해서 계통수를 완성할 수 있었다.

또한 하기 표에서 보는 바와 같이 기생충 5종의 BLAST 결과, 현재까지 18s rRNA가 등록되어 있는 장흡충이 없는 관계로, 가장 비슷한 종류의 흡충류과의 연관성이 90.8％∼91.3％까지 보였다. 이를 통하여 Bacterial gene이 아닌 trematode의 gene임을 확인할 수 있다.

＜계통수＞

＜표＞

4. 새로운 primer set(tre-18s primer) 제작 완성

확보된 기생충의 염기서열을 중심으로 새로운 primer를 제작하였다. 이는 기존에 사용하였던 해양 trematode의 primer에서 primer의 template의 binding이 확실한 primer design이 중요하여, conserved region과 variable region과의 차이를 고려하여 tre-18s primer set을 만들었으며, 이는 간흡충, 참굴큰입흡충, 표주박이형흡충, 요코가와흡충, 긴이형흡충 특이 공통 primer를 이었다.

＜primer set(tre-18s primer)＞

정방향(F):5' -GATAACGGGTAACGGGGAAT-3'

역방향(R):5' -AACCTCTGACTTTCGCTCCA-3'

5. 새로운 primer set(tre-18s primer) 이용한 PCR 조건

상술한 새로운 primer set(tre-18s primer)를 이용한 PCR 조건은 도 1에 상세하게 과정을 도시하여 첨부하였으며, 도 1의 조건에 따라 PCR을 실시한 결과는 도 2에 나타냈다.

도 2를 보면 본 발명에 따른 새로운 primer set(tre-18s primer)를 이용한 PCR을 실시한 결과 replicon의 발현 정도가 일정한 것을 확인할 수 있었다.

삭제

<110> Korea Center for Disease Control & Prevention <120> Primer for diagnosis of Trematoda infection and diagnosis method <130> gnp3154 <140> 10-2012-0110462 <141> 2012-10-05 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Trematoda <400> 1 gataacgggt aacggggaat 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Trematoda <400> 2 aacctctgac tttcgctcca 20

Claims (4)

1. 정방향 프라이머(F):5' -GATAACGGGTAACGGGGAAT-3' 및
   역방향 프라이머(R):5' -AACCTCTGACTTTCGCTCCA-3'
   로 이루어진 것을 특징으로 하는 중간 숙주인 어패류의 흡충 감염 진단을 위한 프라이머 세트.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 흡충이 간흡충, 참굴큰입흡충, 표주박이형흡충, 긴이형흡충 및 요코가와흡충로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 중간 숙주인 어패류의 흡충 감염 진단을 위한 프라이머 세트.
3. 정방향 프라이머(F):5' -GATAACGGGTAACGGGGAAT-3' 및
   역방향 프라이머(R):5' -AACCTCTGACTTTCGCTCCA-3'
   로 이루어진 프라이머 세트를 이용한 중간 숙주인 어패류의 PCR 흡충 감염 진단 방법.
4. 제 3항에 있어서,
   상기 흡충이 간흡충, 참굴큰입흡충, 표주박이형흡충, 긴이형흡충 및 요코가와흡충로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 중간 숙주인 어패류의 PCR 흡충 감염 진단 방법.

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