KR100681825B1 - Ｐｃｒ―ｒｆｌｐ법을 이용한 아나플라스마타케의 검출방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PCR-RFLP법을 이용하여 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균을 동정하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 PCR을 이용하여 증폭된 groEL 유전자 단편을 NIaⅢ 제한효소로 처리하는 것을 특징으로 하는 PCR-RFLP법에 의한 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균의 동정 및 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 배양이 까다로와 검출과 동정이 어려웠던 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균을 배양과정 없이 검출 및 동정할 수 있으며, 기존 groESL 유전자 비교 분석보다 빠르고 간편하게 동정, 검출, 분류 및 진단할 수 있다.
Anaplasmataceae, 동정방법, groEL, PCR-RFLP

Description

ＰＣＲ―ＲＦＬＰ법을 이용한 아나플라스마타케의 검출방법{Method for Detecting Anaplasmataceae Using PCR-RFLP}
도 1은 본 발명에 따른 groEL 유전자 단편을 NIaⅢ 제한효소에 의해 절단한 산물을 전기영동한 결과를 나타낸 사진이다. M은 25/100bp Ladder, 레인 1은 Ehrlichia chaffeensis Arkansas, 레인 2는 Anaplasma phagocytophilum Webster, 레인 3은 MS173, 레인 4는 MS186, 레인 5는 MS295 및 레인 6은 MS297을 나타낸다.
본 발명은 PCR-RFLP법을 이용하여 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균을 동정하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 PCR을 이용하여 증폭된 groEL 유전자 단편을 NIaⅢ 제한효소로 처리하는 것을 특징으로 하는 PCR-RFLP법에 의한 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균의 동정 및 검출방법에 관한 것이다.
아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 Ehrlichia 속과 Anaplasma 속은 그람 음성의 편성 세포내 기생 세균으로 말초 혈액의 단핵세포나 과립백혈구에 기생하여 여러 가지의 기생충공포증을 유발한다. 아나플라스마타케는 수의학적 질병의 주요한 원인으로 널리 알려져 있으며, 최근들어 몇몇의 새로운 Ehrlichia 속과 Anaplasma 속의 균종들이 tick-borne의 주요 원인균으로서 환자로부터 분리되었다. 미국에서 새로운 환자 병원균을 알아내었는데, 1986년에는 Human monocytic ehrlichiosis (HME)의 원인균인 Ehrlichia chaffeensis이 발견되었으며, 1994년에는 Humna granulocytic ehrlichiosis(HGE)의 원인균인 Anaplasma phagocytophilum이 발견되었다.
종래 아나플라스마타케(Anaplasmataceae)의 진단은 간접면역형광법(indirect fluorescent antibody assay(IFA))와 면역분석법과 같은 혈청학적 진단을 하였지만, 아나플라스마타케는 세포내에서만 생존하는 성질때문에 배양이 어려워, 시간과 비용이 많이 드는 단점이 있었다. 게다가 혈청학적 진단에서는 비슷한 ehrlichiae 내에서 교차 반응이 일어난다는 보고가 있다. 따라서, 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균주의 동정에 있어서 DNA-based를 이용한 다양한 기술의 개발이 필요하게 되었다.
16S rRNA 유전자 염기서열 분석법은 가장 많이 사용되고 있는 DNA-based 동정법이지만, 16S rRNA의 염기서열은 매우 잘 보존되어 있으며, 약 1,400 bp의 염기서열이 필요하기 때문에, 빠른 진단 방법의 개발이 불가능하다. 또한, 계통분석으로 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균의 동정 및 분류하기 위하여 heat shock operon (groESL)을 상용하고 있으나, groESL 유전자 염기서열 분석은 최소한 1,200 bp의 염기서열을 필요로 하기 때문에 빠른 종의 동정이 어렵다. 따라서 이러한 단점을 보완 할 수 있는 새로운 동정법이 필요하게 되었다.
이에 본 발명자들은 기존의 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균의 분류·동정법의 단점을 보완할 수 있는 새로운 유전학적 분류법을 개발하고자 노력한 결과, 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균주들의 진화를 잘 반영하고 있는 groEL 유전자의 염기서열을 이용하여 PCR-RFLP방법으로 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균주들을 빠르게 동정할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균의 groEL 유전자를 NIaⅢ 제한효소로 처리하는 것을 특징으로 하는 PCR-RFLP법을 이용한 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균의 동정·분류·검출 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또다른 목적은, 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균의 groEL 유전자를 NIaⅢ 제한효소로 처리하는 것을 특징으로 하는 PCR-RFLP법을 이용하여 인간을 제외한 동물에서 에를리히증(ehrlichiosis)을 진단하는 방법을 제공하는데 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균의 감염 의심 동물에서 추출된 임상 샘플의 DNA를 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균의 groEL 유전자 염기서열에서 유래된 프라이머 쌍을 이용하여 증폭하는 단계; 및 (b) 상기 증폭된 산물을 NIaⅢ 제한효소로 처리하여 DNA 단편의 크기를 확인하는 단계를 포함하는 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균의 검출방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머인 것을 특징으로 할 수 있고, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 증폭하는 단계는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭한 다음, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균의 groEL 유전자 또는 그 단편을 제한효소 NlaIII로 처리하여 수득된 단편의 크기를 비교하는 것을 특징으로 하는 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균의 분류방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균의 groEL 유전자 단편을 제한효소 NlaIII로 처리하여 절단된 단편의 크기를 비교하는 것을 특징으로 하는 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균의 분류 및 동정방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균의 감염의심 동물(단, 인간은 제외) 유래의 샘플에서 추출된 DNA를 아나플라스마타케(Anaplasmataceae)균의 groEL 유전자 단편 유래 프라이머를 이용하여 증폭한 다음, 제한효소 NlaIII로 처리하여 절단된 단편의 크기를 비교하는 것을 특징으로 하는 에를리히증(ehrlichiosis)의 진단방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 groEL 유전자 단편은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭된 DNA 단편인 것을 특징으로 할 수 있고, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭된 DNA 단편인 것을 특징으로 할 수 있으며, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭한 다음, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭한 것임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 서열번호 1과 서열번호 2 및 서열번호 3과 서열번호 4의 염기서열을 가지는 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균의 검출·진단·동정용 프라이머 쌍을 제공한다.
본 발명에서는 생물체에서 잘 보존되어 있고, 세포 및 박테리아의 생존에 절대 필요하며 스트레스에 저항하는 단백질로서 세균의 진화를 잘 반영할 수 있는 샤페론(chaperone)인 GroEL 단백질을 코딩하는 groEL 유전자를 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균의 검출·진단·동정에 사용하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 검체 균주의 준비
본 실시예에서 사용한 Ehrichia chaffeensis Arkansas 균주는 Dr. William Nicholoson (Center of Disease Control and Prevention, National Center for Infectious Diseases, Atlanta, Geogia, U.S.A.)로부터 분양 받았다. Anaplasma phagocytophilum Webster 균주는 Dr. Stephane Dumler (Johns Hopkins Medical School, Maryland, U.S.A.)로부터 분양받아 사용하였다. 야생의 설치 동물은 1999년과 2000년도에 미국 및 한국 군대의 훈련장에서 Sherman trap을 이용하여 포획하였다. 포획한 설치동물에서 비장을 분리하여 각각의 비장의 일부를 멸균된 가위를 이용하여 균일하게 자르고, DNA를 추출 할 때까지 1.5㎕ eppendorf tube에 넣고 -70℃에서 보관하였다. 비장의 조직에서 QIAamp Tissue Kit (Qiagen, Avenue Stanford, Valencia, U.S.A.)를 이용하여 DNA를 추출하였다.
실시예 2: PCR을 위한 프라이머의 디자인
EF1 프라이머(서열번호 1)는 E. chaffeensis Arkansas의 groEL 유전자(GenBank Accession No. L10917)의 1109-1126영역을 포함하도록 디자인하였고, ER2 프라이머(서열번호 2)는 상기 groEL 유전자의1511-1495영역을 포함하도록 디자인하 였다. EF3 프라이머(서열번호 3)는 상기 groEL 유전자의 1114-1130영역을 포함하도록 디자인하였으며, ER4 프라이머(서열번호 4)는 상기 groEL 유전자의 1400-1384영역을 포함하도록 디자인 하였다. 상기 EF3 프라이머와 ER4 프라이머를 이용하여 2차 PCR을 수행하면 287bp의 groEL 유전자가 증폭되게 된다.
실시예 3. groEL 유전자 단편의 RFLP프로필
실시예 1에서 준비한 균주들에서 추출한 DNA를 주형으로 하고, EF1 프라이머 (서열번호 1)와 ER2 프라이머(서열번호 2)를 이용하여 1차 PCR을 하고, EF3 프라이머(서열번호 3)와 ER4 프라이머(서열번호 4)를 이용하여 2차 PCR을 수행하였다.
EF1 : 5'-CTGAYGGTATGCAGTTTG-3'(서열번호 1)
ER2 : 5'-AYRYYTTTAGCAGTACC-3'(서열번호 2)
EF3 : 5'-GGTATGCAGTTTGAYCG- 3'(서열번호 3)
ER4 : 5'-TCTTTTCTYCTRTCACC-3'(서열번호 4)
(Y는 C또는T, R은 A또는G이다.)
EF1및 ER2 프라이머 각각 20pmol과 증류수, 주형 DNA 50ng을 섞어 최종부피를 20㎕로 맞춘 후, PCR 프리믹스 튜브 (AccuPower PCR PreMix, Bioneer, Korea)에 섞어, 94℃에서 5분간 변성시킨 후, 94℃에서 30초간 변성, 50℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 45초간 신장의 사이클을 20회 수행한 후 최종적으로 72℃에서 5분 간 신장시켜 PCR을 수행하였다.
상기 PCR 산물 1㎕를 주형으로 하여 EF3 및 ER4 프라이머로 이차 PCR을 수행하였다. EF3과 ER4 프라이머 각각 20pmol과 증류수, 1차 PCR의 생산물(주형 DNA) 1㎕를 섞어 최종부피를 20㎕로 맞춘 뒤, PCR 프리믹스 튜브에 섞어, 94℃에서 5분간 변성시킨 후, 94℃에서 30초간 변성, 52℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 45초간 신장의 사이클을 25회 수행한 후 최종적으로 72℃에서 5분간 신장시켜 PCR을 수행하였다.
생산된 PCR 산물을 NIaⅢ 제한효소를 이용하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 절단하였다. 제한효소로 절단된 단편은 4% 엠플리사이즈 아가로스 젤 상에서 100V 25분 전기영동한 다음 확인하였다 (도 1).
PCR 산물을 NIaⅢ 제한효소로 절단 했을 때 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균을 2개의 패턴으로 분류·동정 할 수 있었다. Ehrlichia chaffeensis Arkansas는 43, 244bp의 절편을 나타냈으며 Anaplasma phagocytophilum Webster, MS173, MS186, MS295 및 MS297은 287bp의 절편을 나타내었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정 의된다고 할 것이다.
본 발명은 세균의 groEL 유전자를 NIaⅢ 제한효소로 처리하는 것을 특징으로 하는 PCR-RFLP법을 이용한 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균주의 동정·분류·검출 방법을 제공하는 효과가 있으며, 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균의 groEL 유전자를 NIaⅢ 제한효소로 처리하는 것을 특징으로 하는 PCR-RFLP법을 이용하여 인간을 제외한 동물에서 에를리히증(ehrlichiosis)을 진단하는 방법을 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 의하면, 배양이 까다로와 검출과 동정이 어려웠던 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균을 배양과정 없이 검출 및 동정할 수 있으며, 기존 groESL 유전자 비교 분석보다 빠르고 간편하게 동정, 검출, 분류 및 진단할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

  1. 하기의 단계를 포함하는 Ehrlichia chaffeensis 및 Anaplasma phagocytophilum의 검출방법:
    (a) 아나플라스마타케(Anaplasmataceae) 과에 속하는 균의 감염 의심 동물에서 추출된 임상 샘플의 DNA를 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 증폭하는 단계; 및
    (b) 상기 증폭된 산물을 NIaⅢ 제한효소로 처리하여 DNA 단편의 크기를 확인하고, 43bp 및 244bp의 단편이 존재하는 경우, Ehrlichia chaffeensis로 확인하고, 287bp의 단편이 존재하는 경우 Anaplasma phagocytophilum으로 확인하는 단계.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. Ehrlichia chaffeensis 및 Anaplasma phagocytophilum의 분류 및 동정방법에 있어서, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 증폭한 단편을 제한효소 NlaIII로 처리하여 DNA 단편의 크기를 확인하고, 43bp 및 244bp의 단편이 존재하는 경우, Ehrlichia chaffeensis로 동정하고, 287bp의 단편이 존재하는 경우 Anaplasma phagocytophilum으로 동정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 서열번호 3과 서열번호 4의 염기서열을 가지는 Ehrlichia chaffeensis 및 Anaplasma phagocytophilum의 검출·진단·동정용 프라이머 쌍.
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