KR101080381B1 - 녹용 및 순록의 뿔의 검출을 위한 다양한 ｐｃｒ 기법 - Google Patents

녹용 및 순록의 뿔의 검출을 위한 다양한 ｐｃｒ 기법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 녹용(Cervus Antlers) 및 순록의 뿔(Rangifer Antlers)의 검출을 위한 다양한 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 기법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 순록의 뿔 특이적인 증폭산물을 생성하는 프라이머와 순록의 뿔 특이적인 탐지하는 프로브를 이용한 PCR 기법을 통하여 녹용과 순록의 뿔을 구별할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 PCR을 이용한 순록의 뿔 구별방법은 녹용 중에 섞여있는 순록의 뿔을 구별해냄으로써 순록의 뿔이 녹용으로 둔갑하여 불법적으로 유통되는 것을 방지하는데 효과적으로 이용될 수 있다.
녹용, 순록의 뿔, 검출, 감별, PCR, 프라이머, 프로브.

Description

녹용 및 순록의 뿔의 검출을 위한 다양한 ＰＣＲ 기법{Multiple PCR―based assay for the detection of Cervus Antlers and Rangifer Antlers}
본 발명은 녹용과 순록의 뿔의 검출방법에 관한 것으로서, 구체적으로 순록의 뿔 특이적인 증폭산물을 생성하는 프라이머와 순록의 뿔 특이적인 탐지하는 프로브를 이용한 PCR 기법을 통하여 녹용과 순록의 뿔을 구별할 수 있는 방법에 관한 것이다.
녹용(Cervi Parvum Cornu, Antler)은 사슴과(Cervinae)에 속하는 어린 뿔을 건조한 것으로서, 한국을 비롯한 동북아 지역에서 널리 이용되어 왔다. 녹용은 한약으로 사용되는 동물성 생약으로 여러 가지 약리적 효과를 나타내는 것으로 보고되고 있는데 특히 항노화 활성, 남성화 효과(androgenic effect), 성선자극 효과(gonadotrophic effect), 프로스타글란딘-유사 활성(prostaglandin-like activity), 조혈 효과(hematopoietic effect), 면역기능이 있는 것으로 보고되어 있다(Kim et al., 2004; Suh JS et al., 1999). 그러나 순록의 뿔에 대해서는 약리적 효과에 대해 보고된 바가 거의 없다. 또한, 녹용으로 사용되는 사슴은 수컷에서만 뿔이 나지만 순록은 수컷과 암컷 모두에서 뿔이난다. 그리고 녹용으로 사용되는 뿔은 사슴과(Cervidae)의 사슴아과(Cervinae)에 속하며, 순록은 흰꼬리 사슴아과(Odocoilinae)에 속하므로 분류학적으로 다른 부계열(subfamily)에 속해 있다. 그러나 식품 또는 한약으로 사용할 경우, 뿔을 절단하면 육안으로 구분이 쉽지 않으므로 정확한 구분이 필요하다.
사슴과는 4아과 16속 36종 189아종으로 분류하고 있으며, 크게 사슴아과(Cervinae)에 속하는 매화록(Cervus nippon Temminck, Japanese deer), 마록(Cervus elaphus, Red deer), 대록(Cervus canadensis) 등이 있다(Hong 등, 1991). 그러나 흰꼬리 사슴아과(Odocoilinae)에 속하는 순록(Rangifer tarandus, Reindeer)은 녹용과 구분이 어려워 녹용과 혼용되어 사용되거나 잘못 유통되고 있다. 이러한 이유로, 동물조직의 종 구별을 위해 PCR-분석과 같은 분석방법을 통해 검출방법에 많이 사용되고 있다(Kesmen Z et al., Meat science 82, 444-449, 2009).
모세관 전기영동(Capillary electrophoresis, CE)는 겔(gel)을 사용하여 PCR 증폭산물을 확인하는 기존의 시스템과 비교하여 더 빠른 분석 속도, 낮은 시료와 시약(reagents) 사용량, 최적의 온도 조절, 높은 문제 해결 능력, 재현성이 좋다. 또한, 겔 전기영동(gel electrophoresis)에 비하여 인산화된 가닥(phosphorylated strands)과 잉여된 프라이머(primers)의 제거 등과 같은 더 높은 수준에서의 증폭산물의 정제나 염기서열의 GC 농도(content)의 비율에 따른 다른 분석 조건이 필요 하지 않다. 특히, 모세관 전기영동 시스템에 레이저 유도 형광 검출(laser-induced fluorescence detection)을 같이 사용할 경우에는 전통적인 전기영동 분리(electrophoretic separation) 보다 상당히 높은 수준의 민감도를 가지게 된다. 이러한 장점으로 인하여 CE는 토양 내 박테리아의 종 분석(King et al, 2005)같은 생물체 종의 분석, GMO 식품의 검출(Kim et al, 2005)과 같이 의학, 법의학, 약학, 식품 분석 등 여러 분야에서 매우 유용하게 쓰이고 있는 분석 방법이다.
실시간(Realtime)-PCR 분석은 겔을 이용한 PCR 분석(gel-based PCR assay)과는 다르게 정량과 정성분석이 둘 다 가능하여 최근 GMO 분석(Marta et al., 2003)이나 C형 간염 바이러스의 유전자형(genotyping)(Magnus and Charles, 2005), 세균 감지 및 종구별 연구(Alessandra and Lorenzo, 2004), 물에서의 장내바이러스 감염균의 정량 검출방법(Donaldson et al., 2002) 등 간단하고, 빠르게 분석할 수 있는 장점이 있어 널리 쓰이고 있는 분석 방법이다. 또한, 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)을 이용하여 성구별을 위한 SNP 멀티플렉스(multiplex) 분석(Dixon et al., 2005), 설사를 일으키는 대장균의 동정을 위해 옥타플렉스(octaplex) PCR의 검출기법(Brandal et al., 2007), 세균감염의 동정을 위한 멀티플렉스(multiplex) PCR(Dean et al., 2005) 등, 한 번의 분석으로 정확하고, 간단하며 빠르게 분석할 수 있는 PCR 기법들이 보고되고 있다.
미토콘드리아 사이토크롬 비 유전자(mitochondrial cytochrome b gene)의 특이 염기서열로 CITES 품목인 호랑이 종(tiger species)의 유전자감식(Wan and Fang, 2003), 중국 사슴의 분류, 생태, 진화를 알아보기 위해 순록(reindeer)을 포함한 21개의 서로 다른 사슴종의 분포를 확인하고, 중국에 분포하고 있는 순록의 아종은 R. t. fennicus(Rangifer tarandus fennicus)라고 하였다(Ohtaishi and Gao., 1990). 또한, 미토콘드리아 DNA로 부터 큰사슴(wapiti), 붉은사슴(red deer), 일본사슴(sika deer), 유라시아 순록(caribou)의 염기서열비교(Polziehn and Strobeck, 1998), 알라스카의 순록(reindeer)과 유라시아 순록(caribou)의 유전적인 변이(Cronin, et al., 1995), 및 노르웨이의 반가축의 순록(semi-domestic reindeer)과 야생형 순록(wild reindeer)의 유전적인 변이를 살펴보았을 때 99% 이내의 다형성을 지닌 5개 군집의 순록의 유전적인 변이를 확인하였다(Roed, 1986).
녹용과 순록의 뿔은 녹용의 종류인 C. e. sibericus(AF058371)와 C. e. bactrianus(AF296822)와 비교했을때 순록의 뿔인 R. tarandus(AF096449)와 염기서열 비교에서 약 88 ~ 90%의 상동성이 있으며 유전적으로는 많은 차이가 있다. 그러나 절단된 상태의 형태적으로는 매우 유사하여 구별하기 어려우므로 주로 DNA 분석을 이용하고 있다(Poetsch et al., 2001, Jones et al., 2000).
이에, 본 발명자들은 육안으로 구별이 어려운 녹용과 순록의 뿔을 구분하기 위한 방법을 연구하던 중, 다중 PCR 기반 분석법(PCR-based assay)을 적용하여 유전자형(genotyping)으로 이들을 구별할 수 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 순록의 뿔 특이적인 증폭산물을 생성하는 프라이머와 순록의 뿔 특이적인 탐지하는 프로브를 이용한 PCR 분석을 통해 녹용과 순록의 뿔을 감별할 수 있는 방법, 및 상기 프라이머와 프로브를 포함하는 순록의 뿔 감별용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 피검체에서 DNA를 추출하는 단계; 2) 추출한 DNA를 주형으로 하고 서열번호 7과 8로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프라이머쌍, 및 서열번호 9로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프로브를 사용하여 PCR로 증폭시키는 단계; 및, 3) PCR 증폭 산물을 정량분석하여 증폭되는 피검체를 순록의 뿔으로 판단하는 단계를 포함하는 순록의 뿔의 감별 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 피검체에서 DNA를 추출하는 단계; 2) 추출한 DNA를 주형으로 하고 서열번호 10과 11로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프라이머쌍, 및 서열번호 12와 13으로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프로브쌍을 사용하여 PCR로 증폭시키는 단계; 및, 3) PCR 증폭 산물을 대립유전자(allele) 분석하여 서열번호 12로 기재되는 프로브에 의해 탐색되는 피검체를 순록의 뿔로 판단하는 단계를 포함하는 순록의 뿔의 감별 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 7과 8로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프라이머쌍, 및 서열번호 9로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프로브를 포함하는 순록의 뿔 감별용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 서열번호 10과 11로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프라이머쌍, 및 서열번호 12와 13으로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프로브쌍을 포함하는 순록의 뿔 감별용 키트를 제공한다.
본 발명의 감별방법은 다중 PCR 기반 분석법(PCR-based assay)을 이용하여 유전자형(genotyping)으로 녹용과 순록의 뿔을 간단하고 신속하게 감별할 수 있으므로, 종종 녹용과 함께 위화물로 혼합되어 유통되는 순록의 뿔을 감지함으로써 불법적인 녹용 판매를 방지하는데 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 순록의 뿔 특이적인 증폭산물을 생성하는 프라이머와 순록의 뿔 특이적인 탐지하는 프로브를 이용한 PCR 분석을 통해 녹용과 순록의 뿔을 감별할 수 있는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 한가지 양태로는
1) 피검체에서 DNA를 추출하는 단계;
2) 추출한 DNA를 주형으로 하고 서열번호 7과 8로 기재되는 핵산 서열을 갖 는 프라이머쌍, 및 서열번호 9로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프로브를 사용하여 PCR로 증폭시키는 단계; 및,
3) PCR 증폭 산물을 정량분석하여 증폭되는 피검체를 순록의 뿔로 판단하는 단계를 포함하는 순록의 뿔의 감별 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 피검체는 단일 녹용 품종 시료, 녹용 품종 혼합 시료 또는 녹용과 비녹용 혼합 시료인 것이 바람직하고, 녹용 및 비녹용의 혼합 시료인 것이 더욱 바람직하며, 사슴과 순록의 뿔(antler)인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 DNA는 게놈 DNA(Genomic DNA)인 것이 바람직하고, 상기 게놈 DNA의 추출은 DNA plant kit를 이용하여 제조사의 지시대로 추출하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 일반적으로 사용되는 게놈 DNA의 추출방법은 모두 사용가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 PCR은 정량적 실시간(Real-time) PCR을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 PCR 증폭은 ABI 7500 실시간 PCR 시스템을 이용하여 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 일반적으로 사용되는 PCR 증폭방법은 모두 사용가능하다.
상기 PCR은 50℃ 2분, 95℃ 10분간 활성화(activation)시키고, 95℃에서 15초간 변성(denaturation)시킨 다음, 60℃에서 1분간 40회 반복하는 조건으로 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 DNA 분석을 통한 녹용 및 순록의 뿔을 구별하기 위해, 사슴과 순록의 뿔로부터 게놈 DNA를 추출한 후, 게놈 DNA로부터 미토콘드리아 DNA 부분의 D-loop 영역을 선택적으로 증폭시키기 위해 Polziehn 등(1998)의 CST2 프라이머과 CST39 프라이머를 사용하여 미토콘드리아 D-loop 부분을 PCR 증폭시켰다. 그런 다음, 증폭된 산물은 아가로즈 젤(agarose gel)에서 전기 영동하여 바이오이미징 시스템(Bioimaging system)으로 분석하였다. 증폭 산물을 정제한 후, pGEM T-easy 벡터 시스템을 이용하여 HITTM-DH5a 컴프턴트 세포에 형질전환(transformation)한 다음, 배양하여 나타난 흰색 콜로니(white colony)만을 다시 배양한 후, 그 배양액으로부터 플라스미드만을 추출하여 염기서열을 분석하였다.
또한, 본 발명자들은 모세관 전기영동를 이용하여 녹용과 순록의 뿔 시료의 유전자형을 구별하기 위해, 녹용과 순록의 뿔 시료를 사용하여 제작한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 순록의 뿔의 특이적인 부위만을 검출하기 위해, D-loop 부위 증폭에 사용된 CST2 프라이머, 및 등록특허 제 10-0768829호의 순록의 뿔 구별 프라이머인 JER1 프라이머의 5' 부위에 JOE를 표지하여 270 bp에서 형광물질을 나타내도록 하였다. 녹용과 순록의 뿔에서 Masuda et al.(1996)의 포유동물 사이토크롬 비(cytochrome b) 부위의 공통 프라이머인 L14724 및 H15149 프라이머를 변형하여 L14724-tm58과 H15149-tm58 프라이머를 제작하였으며 H15149-tm58 프라이머의 5' 부위에 FAM을 표지하여 466 bp에서 형광물질을 나타내도록 PCR을 증폭하였다. 그 결과, 녹용과 순록의 뿔의 동시구별 피크(peak)인 파란색 형광을 띄는 466 bp 단편(fragment)을 확인하였고, 순록의 뿔에서만 특이적으로 증폭되는 피크인 녹색 형광을 띄는 270 bp 단편을 확인하였다(도 1 참조).
또한, 본 발명자들은 녹용과 순록의 뿔을 실시간 PCR을 이용한 후 정량분석함으로써 이들을 구별하기 위해, 녹용과 순록의 뿔에서 공통적으로 증폭되도록 정방향 프라이머(forward primer)와 역방향 프라이머(reverse primer), 및 순록의 뿔의 742번째 티민(thymine)이 결손된 대립유전자(allele)를 인식하는 FAM-표지된 리포터 Taqman　 MGB 프로브인 프로브 1(probe 1)을 이용하여 이용하여 프라이머/프로브 믹스(primer/probe mix)로 준비하여 실시간 PCR 증폭을 수행한 후, SDS 소프트웨어를 이용하여 정량하였다. 그 결과, 순록의 뿔에만 특이적으로 반응하는 프라이머와 프로브를 이용하여 증폭한 결과, 녹용 시료(B)에서는 전혀 증폭되지 않았으며, 순록의 뿔 시료(A)에서만 약 2.6 X 109과 8.1 X 108의 복제수를 보였으며, CT 값은 16.4261과 18.3038에 해당되었다(도 2 참조).
따라서, 본 발명의 순록의 뿔 특이적인 증폭산물을 생성하는 프라이머와 순록의 뿔 특이적인 탐지하는 프로브를 이용하여 PCR 증폭한 후, 정량 분석을 통해 녹용과 순록의 뿔을 감별할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 또다른 양태로는
1) 피검체에서 DNA를 추출하는 단계;
2) 추출한 DNA를 주형으로 하고 서열번호 10과 11로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프라이머쌍, 및 서열번호 12와 13으로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프로브쌍을 사용하여 PCR로 증폭시키는 단계; 및
3) PCR 증폭 산물을 대립유전자(allele) 분석하여 서열번호 12로 기재되는 프로브에 의해 탐색되는 피검체를 순록의 뿔로 판단하는 단계를 포함하는 순록의 뿔의 감별 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 피검체는 단일 녹용 품종 시료, 녹용 품종 혼합 시료 또는 녹용과 비녹용 혼합 시료인 것이 바람직하고, 녹용 및 비녹용의 혼합 시료인 것이 더욱 바람직하며, 사슴과 순록의 뿔(antler)인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 DNA는 게놈 DNA(Genomic DNA)인 것이 바람직하고, 상기 게놈 DNA의 추출은 DNA plant kit를 이용하여 제조사의 지시대로 추출하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 일반적으로 사용되는 게놈 DNA의 추출방법은 모두 사용가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 PCR은 정량적 실시간(Real-time) PCR을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
실시간 PCR 증폭은 Applied Biosystems(USA)사의 ABI 7500 실시간 PCR 시스템을 이용하여 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 일반적으로 사용되는 PCR 증폭방법은 모두 사용가능하다.
상기 PCR 조건은 60℃에서 30초간 pre-PCR read한 후, 95℃ 10분간 반응하고, 92℃에서 15초간 변성한 다음, 60℃에서 1분 30초간 40회 반복하여 어닐링을 수행하고 다시 60℃에서 30초간 post-PCR read를 실시하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 녹용과 순록의 뿔을 실시간 PCR을 이용한 후 대립유전자를 분석함으로써 이들을 구별하기 위해, 녹용과 순록의 뿔에서 공통적으로 증폭되도록 정방향 프라이머(forward primer)와 역방향 프라이머(reverse primer), 및 순록의 뿔(AY970666)의 742번째 티민(thymine)이 결손된 대립유전자(allele)를 인식하는 FAM-표지된 리포터 Taqman® MGB 프로브인 프로브 1(probe 1)과 티민(thymine)이 존재하는 대립유전자(allele)를 인식하는 VIC-표지된 리포터 Taqman® MGB 프로브인 프로브인 프로브 2(probe 2)를 이용하여 프라이머/프로브 믹스(primer/probe mix)로 준비하여 PCR 증폭시킨 다음, 서열 검출 소프트웨어(Sequence Detection Software)를 사용하여 분석하였다. 그 결과, 순록의 뿔 시료는 FAM 염료(dye)에서만 반응을 보였고, 녹용 시료들은 VIC 염료에서만 반응을 보였다(도 3 참조).
따라서, 본 발명의 순록의 뿔 특이적인 증폭산물을 생성하는 프라이머와 순록의 뿔 특이적인 탐지하는 프로브를 이용하여 PCR 증폭한 후, 대립유전자 분석을 통해 녹용과 순록의 뿔을 감별할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 대립유전자 분석을 통한 감별방법은 상기 정량분석과 함께 병행함으로써 효율적으로 녹용과 순록의 뿔을 구별할 수 있다.
본 발명의 감별방법은 다중 PCR 기반 분석법(PCR-based assay)을 이용하여 유전자형(genotyping)으로 녹용과 순록의 뿔을 간단하고 신속하게 감별할 수 있으므로, 녹용과 함께 혼합되어 유통되는 순록의 뿔을 감별함으로써 불법적인 녹용 판매를 방지하는데 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 7로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프라이머 또는 서열번호 8로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프라이머를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 10으로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프라이머 또는 서열번호 11로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프라이머를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 7과 8로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프라이머쌍, 및 서열번호 9로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프로브를 포함하는 순록의 뿔 감별용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 서열번호 10과 11로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프라이머쌍, 및 서열번호 12와 13으로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프로브쌍을 포함하는 순록의 뿔 감별용 키트를 제공한다.
상기 프라이머 및 프로브는 순록의 뿔 특이적인 증폭산물을 생성하는 프라이머 및 순록의 뿔을 특이적으로 탐지하는 프로브로서 이를 이용한 PCR 기법을 통하여 녹용과 순록의 뿔을 구별할 수 있다. 따라서 PCR을 이용하여 유전자형(genotyping)으로 녹용과 순록의 뿔을 간단하고 신속하게 감별하는데 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 시료 및 DNA의 준비
본 발명자들은 러시아, 캐나다, 중국, 뉴질랜드, 알래스카에서 한국으로 수입된 사슴과 순록의 뿔(antler)을 사용하였다(표 1). 구체적으로 사용한 녹용 시료는 NCBI genbank의 큰사슴 종인 C. e. sibericus(AF058371), C. e. manitobensis(AF016958), C. e. canadensis(AY970666) 및 C. e. nelsoni(AF016962, AF016965); 붉은사슴 종인 C. elaphus(AF016973) 및 C. e. bactrianus(AF296822); 일본사슴 종인 C. nippon(AB012371)의 염기서열과 비교하면서 사용하였다. 순록의 뿔의 D-loop 부위 염기서열은 AF096449가 등록되어 있으며, 사용한 순록의 뿔 시료는 AF096449와 유사도를 확인하여 사용하였다.
게놈 DNA(Genomic DNA)의 추출은 약 100 mg의 시료를 QIAamp DNA plant kit(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 이용하여 제조사의 사용방법에 의해 추출하고, ND-1000 분광광도계(spectrophotometer)(NanoDrop Tech. USA)를 이용하여 DNA 순도검정 및 정량을 수행하였다.
사용된 사슴 종과 순록
번호 시료 종 일반 명칭 원산지
1 NY-1 C. e. sibericus 큰사슴 1 러시아
2 NY-2 C. e. sibericus 큰사슴 2 러시아
3 NY-3 C. e. nelsoni 큰사슴 3 캐나다
4 NY-4 C. e. nelsoni 큰사슴 4 한국
5 NY-5 C. e. canadensis 큰사슴 5 캐나다
6 NY-6 C. e. manitobensis 큰사슴 6 캐나다
7 NY-7 C. elaphus 붉은사슴 1 뉴질랜드
8 NY-8 C. elaphus 붉은사슴 2 한국
9 NY-9 C. e. bactrianus 붉은사슴 3 중국
10 NY-10 C. e. bactrianus 붉은사슴 4 중국
11 NY-11 C. nippon 일본사슴 1 중국
12 NY-12 C. nippon 일본사슴 2 중국
13 REIN-1 R. tarandus 순록 1 알래스카
14 REIN-2 R. tarandus 순록 2 알래스카
15 REIN-3 R. tarandus 순록 3 알래스카
<실시예 2> PCR 증폭 및 DNA 서열화(sequencing)
본 발명자들은 상기 <실시예 1>에서 추출한 총 게놈 DNA(total genomic DNA)로부터 녹용과 순록의 뿔의 미토콘드리아 DNA부분의 D-loop 영역을 선택적으로 증폭시키기 위해 Polziehn 등(1998)의 CST2 프라이머[5'-taa tat act ggt ctt gta aac c-3'(서열번호 1)]과 CST39 프라이머[5'-ggg tcg gaa ggc tgg gac caa acc-3'(서열번호 2)]를 사용하여 미토콘드리아 D-loop 부분을 증폭시켰다.
PCR 반응액은 2X PCR Pre-Mix(Solgent, Korea)에 20 ng의 주형(template) DNA 1 ㎕와 10 pmole의 CST2, CST39 프라이머를 각각 1 ㎕ 혼합하여 총 30 ㎕로 조성하였다. PCR은 DNA Engine®(BIORAD, USA)을 이용하여 95℃에서 12분간 전변성(predenaturation)한 후 95℃에서 30초 변성(denaturation), 55℃에서 30초간 어닐링(annealing), 72℃에서 30초간 연장(extension)을 35회 수행하고 마지막으로 72℃에서 7분간 반응시켰다.
증폭된 산물은 LoadingSTAR(Dynebio, Korea)를 1 ㎕을 넣어 혼합한 후, 1.5% 아가로즈 젤(agarose gel)에서 전기 영동하여 바이오이미징 시스템(Bioimaging system)(Syngene, England)으로 관찰하였다. CST2와 CST39 프라이머를 이용하여 증폭된 밴드만을 잘라내어 NucleoSpin Extract II Kit(Macherey-Nagel, Germany)를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 pGEM T-easy 벡터 시스템(Promega, USA)을 이용하여 16℃에서 밤새 리게이션(ligation)한 후, HITTM-DH5a 컴프턴트 세포(competent cell)(RBC, Taiwan)에 형질전환(transformation)한 다음, 앰피실린(ampicillin)(Duchefa, Netherland)과 X-gal (Promega, USA)을 첨가한 LB 아가 플레이트(agar plate)에 도말하여 인큐베이션(incubation)하였다. 이때, 나타난 흰색 콜로니(white colony)만을 다시 LB 액체배지에 계대 배양한 후, 그 배양액을 플라스미드 미니-프렙 키트(Plasmid Mini-prep Kit)(Solgent, Korea)로 플라스미드만을 추출하여 ABI 3730(Applied Biosystems, USA)으로 염기서열을 결정한 후 DNASIS MAX-Ver. 2.05(MiraiBio, USA)로 분석하였다.
<실시예 3> 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)을 이용한 녹용 및 순록의 뿔 유전자형의 구별
본 발명자들은 모세관 전기영동를 이용하여 녹용과 순록의 뿔의 유전자형을 구별하기 위해, 녹용과 순록의 뿔의 시료를 사용하여 제작한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다.
구체적으로, 순록의 뿔의 특이적인 부위만을 검출하기 위해, D-loop 부위 증폭에 사용된 CST2 프라이머, 및 등록특허 제 10-0768829호의 순록의 뿔 구별 프라이머인 JER1 프라이머의 5' 부위에 JOE를 표지하여 270 bp에서 형광물질을 나타내도록 하였다. 녹용과 순록의 뿔에서 Masuda et al.(1996)의 포유동물 사이토크롬 비(cytochrome b) 부위의 공통 프라이머인 L14724 및 H15149 프라이머를 변형하여 L14724-tm58과 H15149-tm58 프라이머를 제작하였으며 H15149-tm58 프라이머의 5' 부위에 FAM을 표지하여 466 bp에서 형광물질을 나타내도록 PCR을 증폭하였다(표 2).
상기 PCR 증폭은 2X PCR premix (Solgent, Korea)에 10 pmole 프라이머(CST2, C-JER1, L14724-tm58, C-H15149-tm58)와 1 ng ~ 10 ng 주형 DNA를 혼합하여 총 30 ㎕로 조성하여 PCR을 수행하였다. PCR은 PTC-200(MJ Reserch, USA)을 이용하여 95℃에서 15분간 전병성(predenaturation)한 후, 95℃에서 20초간 변성(denaturation), 50℃에서 30초간 어닐링(annealing), 72℃에서 40초간 연장(extension)을 35회 수행하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시킨 후, Genetic Analyser 310(Applied biosystems, USA)으로 분석하였다. PCR 산물에 14.7 Hi-Di 포름아마이드(Formamide)(Applied Biosystems, USA)와 0.3 GeneScan-500ROX(Applied Biosystems, USA)를 넣고 전기영동(electrophoresis)하였으며, 사용한 기질(matrix)은 POP-4이며, Filterset F를 사용하여 15 kV로 24분간 전기영동하였다.
모세관 전기영동을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 형광 태그
프라이머 명칭 올리고뉴클레오티드 서열(5'→3')
CST2 TAA TAT ACT GGT CTT GTA AAC C (서열번호 3)
C-JER1 JOE-CAT ATA TGT ACG TTT ATA AAA TAT (서열번호 4)
L14724-tm58 TTG ATA TGA AAA ACC ATC GTT G (서열번호 5)
C-H15149-tm58 FAM-TCA GAA ATG ATA TTT GTC CTC A (서열번호 6)
상기 PCR 증폭 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 사용된 시료 모두에서 녹용과 순록의 뿔의 동시구별 피크(peak)인 파란색 형광을 띄는 466 bp 단편(fragment)을 확인하였고, 순록의 뿔에서만 특이적으로 증폭되는 피크인 녹색 형광을 띄는 270 bp 단편을 확인하였다. 녹용과 순록의 뿔의 동시구별 피크인 466 bp 단편은 순록의 뿔의 특이적인 프라이머와 함께 증폭할 경우 32%의 빈도(frequency)를 나타냈다(도 1).
<실시예 4> 실시간(Real-time) PCR을 이용한 정량 분석 및 대립유전자 구별을 이용한 녹용 및 순록의 뿔 유전자형의 구별
<4-1> 정량적 실시간 PCR
본 발명자들은 실시간 PCR을 이용하여 녹용 시료와 순록의 뿔 시료를 정량하였다.
구체적으로, 실시간 PCR 증폭은 Applied Biosystems(USA)사의 ABI 7500 실시간 PCR 시스템과 서열 검출 소프트웨어(Sequence Detection Software)(Version 1.2)를 사용하였다. PCR 반응물 조성은, 96-웰 광학 반응 플레이트(well optical reaction plate)에 2X Taqman® universal PCR master mix 12.5 ㎕, 20X Taqman® 프라이머/프로브 시약(primer/probe reagent) 1.25 ㎕와 멸균된 증류수 8.25 ㎕, 40 ng DNA 3 ㎕을 넣어 반응시켰다. PCR 조건은 50℃ 2분, 95℃ 10분간 활성화(activation)시키고, 95℃에서 15초간 변성(denaturation)시킨 다음, 60℃에서 1분간 40회 반복하였다.
SDS 소프트웨어에서 정량 방법은 Absolute Quantification 방법을 선택하였고, 정량의 기준이 되는 표준(standard)은 순록의 뿔의 D-loop 부위인 1,142 bp를 pGEM-T Easy Vector(Promega, USA)를 사용하여 클로닝한 후, 플라스미드(plasmid) 원액의 21.2 ng/㎕을 1/5씩 희석(dilution)시켜, STD 1, 2, 3, 4의 희석 인자(dilution factors)로 측정하였다(표 2). 복제수(Copy number)는 Tobe and Linacre(2008)에 이용된 수식을 이용하고, 염기쌍(base pair)의 평균 중량(average weight)을 650 달톤(Daltons)으로 하여 하기 [수학식 1]과 같이 계산하였다.
Figure 112009040210336-pat00001
<4-2> 대립유전자 구별(Allele Discrimination)
녹용과 순록의 뿔에서 공통적으로 증폭되도록 정방향 프라이머(forward primer)와 역방향 프라이머(reverse primer)를 제작하였으며, 프로브(probe)는 NCBI Genbank의 순록의 뿔(AY970667)의 742번째 티민(thymine)이 결손된 대립유전자(allele)를 인식하는 FAM-표지된 리포터 Taqman® MGB 프로브인 프로브 1(probe 1)과 티민(thymine)이 존재하는 대립유전자(allele)를 인식하는 VIC-표지된 리포터 Taqman® MGB 프로브인 프로브인 프로브 2(probe 2)를 Assays-by-Design serviceSM(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 40X 프라이머/프로브 믹스(primer/probe mix)로 준비하였으며, 이에 대한 프라이머와 프로브의 염기서열은 하기 표 3에 표기하였다.
PCR 반응물 조성은 Taqman® Genotyping Master mix(Applied Biosystems, USA) 5 ㎕, 40X primer/probe mix(Applied Biosystems, USA) 0.25 ㎕와 멸균된 증류수 3.75 ㎕를 넣고, 5 ng DNA 1 ㎕을 넣어 반응하였다. 실시간 PCR 증폭은 Applied Biosystems(USA)사의 ABI 7500 실시간 PCR 시스템을 이용하였고, 서열 검출 소프트웨어(Sequence Detection Software) 7500(Ver. 2.0)를 사용하였다. PCR 조건은 60℃에서 30초간 pre-PCR read한 후, 95℃ 10분간 반응하고, 92℃에서 15초간 변성한 다음, 60℃에서 1분 30초간 40회 반복하여 어닐링을 수행하고 다시 60℃에서 30초간 post-PCR read를 실시하였다.
실시간 PCR 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브
프라이머 / 프로브 올리고뉴클레오티드 서열
정량 분석 정방향 프라이머 5'-ATATTATGTATAATAGTACATTAAATTATATGCCCCATGCTT (서열번호 7)
역방향 프라이머 3'-CGCATGTTGACAAGAAAGGATTTGA (서열번호 8)
프로브 1 FAM-CCATGTACGATCAATAATATT-NFQ (서열번호 9)
대립유전자 구별 정방향 프라이머 5'-ACA TAA CTG TGG TGT CAT ACA TTT GGT (서열번호 10)
역방향 프라이머 3'-AAG ATG CAG TTA AGT CCA GCT ACA A (서열번호 11)
프로브 1 6FAM-ACG GCC ATA GCT GAG-MGBNFQ (서열번호 12)
프로브 2 VIC-ACG GYC ATT GCT GAG-MGBNFQ (서열번호 13)
상기 정량 결과, 복제수(copy number)와 분석 완료된 주기 역가(cycle threshold(CT)) 값은 하기 표 4와 같았다.
실시간 PCR의 정량분석을 위한 표준곡선값
번호 DNA 농도 (ng/㎕) 복제수 CT 값
STD-1 21.2 1.4 X 1010 13.7814
STD-2 4.25 2.8 X 109 16.3204
STD-3 0.85 5.6 X 108 18.9309
STD-4 0.17 1.12 X 108 21.4406
순록의 뿔에만 특이적으로 반응하는 프라이머와 프로브를 이용하여 증폭한 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 녹용 시료(B)에서는 전혀 증폭되지 않았으며, 순록의 뿔 시료(A)에서만 약 2.6 X 109과 8.1 X 108의 복제수를 보였으며, CT 값은 16.4261과 18.3038에 해당되었다(도 2).
상기 표 3에 제시된 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 2가지의 Taqman MGB 프로브를 이용하여 녹용과 순록의 뿔을 구별한 결과, 3개의 순록의 뿔 시료들은 FAM 염료(dye)에서만 반응을 보였고, 12개의 녹용 시료들은 VIC 염료에서만 반응을 보였다(도 3).
상기와 같이, 본 발명은 형태적으로 구분이 어려운 녹용과 순록의 뿔의 검출을 위해 다양한 PCR 기반 분석법(PCR-based assay)을 통해 신속하고, 정확한 분석방법을 개발하였으며, 이에 대한 정량분석과 함께 병행함으로써 효율적으로 녹용과 순록의 뿔을 구별하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 순록의 뿔(A) 및 녹용(B)에 대한 모세관 전기영동에 대한 결과를 나타내는 그림이다(여기서, X축은 염기쌍의 크기를 나타내고, Y축은 상대적인 형광 강도를 나타낸다; 및 A)는 JOE 형광 태그(fluorescent tag)를 포함하고, B)는 FAM 형광 태그를 포함한다).
도 2는 표적 종에 대한 실시간 PCR 증폭 곡선 및 표준 곡선을 나타내는 그림으로서, 증폭 곡선은 녹용을 제외한 순록의 뿔에 대한 양성 반응을 나타냄을 보여주는 그림이고(여기서, Y축은 절대적인 방출 강도이고, X축은 PCR 주기의 수를 나타낸다), 표준 곡선은 각 실험에 대한 Ct 값을 나타낸다.
도 3은 특이적인 녹용 및 순록의 뿔에 의한 대립 유전자형이 구별되는 것을 보여주는 대립유전자 구별 플랏(Allelic discrimination plot)을 나타내는 그림이다(A는 순록의 뿔; B는 녹용; 및 C는 DNA 주형이 없는 것임).
<110> Korea Institute of Oriental Medicine <120> Multiple PCR-based assay for the detection of Cervus Antlers and Rangifer Antlers <130> 9p-06-45 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CST2 primer <400> 1 taatatactg gtcttgtaaa cc 22 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CST39 primer <400> 2 gggtcggaag gctgggacca aacc 24 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CST2 primer <400> 3 taatatactg gtcttgtaaa cc 22 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-JER1 primer <400> 4 catatatgta cgtttataaa atat 24 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L14724-tm58 primer <400> 5 ttgatatgaa aaaccatcgt tg 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-H15149-tm58 primer <400> 6 tcagaaatga tatttgtcct ca 22 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for quantitative analysis <400> 7 atattatgta taatagtaca ttaaattata tgccccatgc tt 42 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for quantitative analysis <400> 8 cgcatgttga caagaaagga tttga 25 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 1 for quantitative analysis <400> 9 ccatgtacga tcaataatat t 21 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Allele Discrimination <400> 10 acataactgt ggtgtcatac atttggt 27 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Allele Discrimination <400> 11 aagatgcagt taagtccagc tacaa 25 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 1 for Allele Discrimination <400> 12 acggccatag ctgag 15 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 2 for Allele Discrimination <400> 13 acggycattg ctgag 15

Claims (12)

1) 피검체로서 녹용 및 순록의 뿔의 혼합 시료에서 DNA를 추출하는 단계;
2) 추출한 DNA를 주형으로 하고 서열번호 7과 8로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프라이머쌍, 및 서열번호 9로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프로브를 사용하여 PCR로 증폭시키는 단계; 및
3) PCR 증폭 산물을 정량분석하여, 증폭되는 피검체를 순록의 뿔로 판단하고, 증폭되지 않는 피검체를 녹용으로 판단하는 단계를 포함하는, 순록의 뿔 감별 방법.
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 단계 2)의 PCR은 정량적 실시간(Real-time) PCR인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
1) 피검체로서 녹용 및 순록의 뿔의 혼합 시료에서 DNA를 추출하는 단계;
2) 추출한 DNA를 주형으로 하고 서열번호 10과 11로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프라이머쌍, 및 서열번호 12와 13으로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프로브쌍을 사용하여 PCR로 증폭시키는 단계; 및
3) PCR 증폭 산물을 대립유전자(allele) 분석하여 서열번호 12로 기재되는 프로브에 의해 탐색되는 피검체를 순록의 뿔로 판단하고, 서열번호 13으로 기재되는 프로브에 의해 탐색되는 피검체를 녹용으로 판단하는 단계를 포함하는, 순록의 뿔 감별 방법.
삭제
삭제
제 6항에 있어서, 단계 2)의 PCR은 정량적 실시간(Real-time) PCR인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
서열번호 7과 8로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프라이머쌍, 및 서열번호 9로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프로브를 포함하는 순록의 뿔 감별용 키트.
서열번호 10과 11로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프라이머쌍, 및 서열번호 12와 13으로 기재되는 핵산 서열을 갖는 프로브쌍을 포함하는 순록의 뿔 감별용 키트.
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Title
‘녹용 중 순록검출 kit 개발’, 식품의약품안전청 용역연구개발과제 최종보고서, 과제번호 08112생약한236(2009.04.)

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