CN110628919B - 检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法，属于基因工程以及遗传育种技术领域。与传统的基于4P‑ARMS‑PCR、PCR‑RFLP、PCR‑SSCP以及Sanger测序检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法相比，本发明的方法基于特异性引物对以及高分辨率熔解曲线分析，这使得本发明的方法仅需通过一次PCR，无需酶切或者测序等手段，即可将绵羊MSTN基因g.+6723位点的三种基因型AA、AG和GG进行分型，检测效率极高且操作简便。

Description

检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法
技术领域
本发明涉及检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法，属于基因工程以及遗传育种技术领域。
背景技术
绵羊肌肉的产量和质量决定了绵羊品种的肉用性能。肉用绵羊产肉性能的好坏，除与营养和饲养管理等因素有关外，还与遗传因素密切相关，即受绵羊体内与肌肉生长发育相关的基因的调控。
肌肉生长抑制素基因（Myostatin，MSTN），也称生长分化因子8（differentiationfactor 8，GDF8），属于转化生长因子超家族成员，是肌肉生长的负调控因子（具体可见参考文献：McPherron, A.C. and S. Lee, Double Muscling in Cattle Due to Mutationsin the Myostatin Gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America, 1997. 94(23): p. 12457-12461.）。该基因的突变失活，能阻断MSTN对肌细胞增殖生长的抑制作用，引起广泛的肌肉增殖并显著降低脂肪的沉积（具体可见参考文献：Grobet, L., et al., Molecular definition of an allelic seriesof mutations disrupting the myostatin function and causing double-muscling incattle. Mammalian Genome, 1998. 9(3): p. 210-213.）。
2006年，Clop等报道了在德克赛尔羊MSTN基因3’UTR区的g.+6723G > A突变，该突变的出现使得该处的寡核苷酸序列成为肌肉细胞中高表达的两个microRNA，即mir1和mir206的结合位点，从而影响了MSTN基因mRNA的翻译，出现类似“双肌”的表型（具体可见参考文献：Clop, A., et al., A mutation creating a potential illegitimatemicroRNA target site in the myostatin gene affects muscularity in sheep.Nature Genetics, 2006. 38(7): p. 813-818.）。有研究表明，MSTN基因g.+6723位点G >A纯合突变的绵羊（AA）与野生型（GG）相比，胴体重和肌肉重均显著增加，且脂肪沉积减少（具体可见参考文献：Haynes, F.E.M., et al., Lack of association between allelicstatus and myostatin content in lambs with the myostatin g+6723G > A allele1.Journal of Animal Science, 2013. 91(1): p. 78-89.）。另有研究表明，携带该突变的杂交绵羊（AG）比不携带该突变的绵羊（GG）具有更高的屠宰率和肌肉质量（具体可见参考文献：Hope, M., et al., The effects of the myostatin g+6723G>A mutation oncarcass and meat quality of lamb. Meat Science, 2013. 95(1): p. 118-122.）。因此，筛选携带MSTN基因g.+6723位点G > A突变的绵羊对培育高产肉用绵羊新品系（种）十分重要。
目前，针对某一特定SNP位点的检测方法主要包括基于PCR的四引物扩增受阻突变系统聚合酶链式反应（4P-ARMS-PCR）（具体可见参考文献：Polley, S., et al.,Polymorphism of BMPR1B, BMP15 and GDF9 fecundity genes in prolific Garolesheep. Tropical Animal Health and Production, 2010. 42(5): p. 985-993.）、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（PCR-RFLP）（具体可见参考文献：Hanrahan, J.P., etal., Mutations in the Genes for Oocyte-Derived Growth Factors GDF9 and BMP15Are Associated with Both Increased Ovulation Rate and Sterility in Cambridgeand Belclare Sheep (Ovis aries)1. Biology of Reproduction, 2004. 70(4): p.900-909.）、单链构象多态性聚合酶链式反应（PCR-SSCP）以及直接测序等（具体可见参考文献：Dehnavi, E., et al., Polymorphism of Myostatin Gene in Intron 1 and 2 andExon 3, and Their Associations with Yearling Weight, UsingPCR-RFLP andPCR-SSCP Techniques in Zel Sheep. Biotechnology Research International, 2012.2012: p. 1-5.）。然而，这些方法或步骤繁琐、难度大，或成本高、周期长，或通量低、检测效率低（具体可见参考文献：Escobar-Chaparro, R.A., et al., qPCR and HRM-baseddiagnosis of SNPs on growth differentiation factor 9 (GDF9), a geneassociated with sheep (Ovis aries) prolificacy. 3 Biotech, 2017. 7(3).），不利于在育种实践中的大规模应用和推广。因此，急需建立一种针对MSTN基因g.+6723位点的效率高、成本低且操作简便的满足育种实践需求的基因型检测方法。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种效率高、成本低且操作简便的检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法。
[技术方案]
为解决上述技术问题，本发明提供了一组可用于检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的引物对，所述引物对中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
在本发明的一种实施方式中，所述绵羊为戴瑞羊、东弗里生羊、德克赛尔羊、萨福克羊、杜泊羊、多赛特羊、蒙古羊、小尾寒羊、滩羊或湖羊。
本发明还提供了一种检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法，所述方法为以已知MSTN基因g.+6723位点基因型的绵羊的基因组DNA作为内标，先使用上述引物对对MSTN基因g.+6723位点的基因型为AA的绵羊的基因组DNA、MSTN基因g.+6723位点的基因型为AG的绵羊的基因组DNA、MSTN基因g.+6723位点的基因型为GG的绵羊的基因组DNA以及待测绵羊的基因组DNA进行扩增，然后对扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，最后根据待测绵羊的基因组DNA扩增获得的高分辨率熔解曲线与MSTN基因g.+6723位点的基因型为AA的绵羊的基因组DNA、MSTN基因g.+6723位点的基因型为AG的绵羊的基因组DNA以及MSTN基因g.+6723位点的基因型为GG的绵羊的基因组DNA扩增获得的高分辨率熔解曲线判断待测绵羊MSTN基因g.+6723位点的基因型。
在本发明的一种实施方式中，所述扩增以及高分辨率熔解曲线分析均在实时荧光定量PCR仪上进行。
在本发明的一种实施方式中，所述高分辨率熔解曲线由实时荧光定量PCR仪配套软件的Gene Scanning模块自动生成；所述判断的程序为：先在实时荧光定量PCR仪配套软件的gene scanning模块中将MSTN基因g.+6723位点的基因型为AA的绵羊的基因组DNA、MSTN基因g.+6723位点的基因型为AG的绵羊的基因组DNA以及MSTN基因g.+6723位点的基因型为GG的绵羊的基因组DNA设为stand样，并且，标注基因型，然后对扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，最后gene scanning模块会自动以stand样为判断基准，根据位移曲线判断待测绵羊的基因型。
在本发明的一种实施方式中，所述扩增的反应体系为20 μL，含有5 ng待测绵羊的基因组DNA、10μL 2´Master Mix、4.0 mmol/L MgCl2以及0.1 μM所述用于检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的的引物对。
在本发明的一种实施方式中，所述扩增的程序为：先95℃预变性10 min，然后95℃变性15 s、57℃退火20 s、72℃延伸20 s的过程进行45个循环。
在本发明的一种实施方式中，所述高分辨率熔解曲线分析的程序为：扩增的程序结束成后，先95℃变性1 min，然后40℃退火1 min，再从65℃连续升温至95℃，最后降温至40℃；连续升温的速率为1℃/s；连续升温期间，每秒采集荧光信号25次。
在本发明的一种实施方式中，所述绵羊为戴瑞羊、东弗里生羊、德克赛尔羊、萨福克羊、杜泊羊、多赛特羊、蒙古羊、小尾寒羊、滩羊或湖羊。
本发明还提供了一种可用于检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的产品，所述产品含有上述引物对。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为检测试剂或检测试剂盒。
在本发明的一种实施方式中，所述绵羊为戴瑞羊、东弗里生羊、德克赛尔羊、萨福克羊、杜泊羊、多赛特羊、蒙古羊、小尾寒羊、滩羊或湖羊。
本发明还提供了上述引物对或上述方法或上述产品在检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述绵羊为戴瑞羊、东弗里生羊、德克赛尔羊、萨福克羊、杜泊羊、多赛特羊、蒙古羊、小尾寒羊、滩羊或湖羊。
[有益效果]
（1）与传统的基于4P-ARMS-PCR、PCR-RFLP、PCR-SSCP以及Sanger测序检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法相比，本发明的方法基于特异性引物对以及高分辨率熔解曲线分析，这使得本发明的方法仅需通过一次PCR，无需酶切或者测序等手段，即可将绵羊MSTN基因g.+6723位点的三种基因型AA、AG和GG进行分型，检测效率极高且操作简便。
（2）利用本发明的方法检测绵羊MSTN基因g.+6723位点的基因型准确性较高，在发明涉及的戴瑞羊样本内，准确率为100%。
（3）利用本发明的方法检测绵羊MSTN基因g.+6723位点的基因型时只需使用实时荧光定量PCR仪以及PCR过程所需的一些试剂，成本较低。
附图说明
图1：MSTN基因g.+6723位点经引物对A扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图2：MSTN基因g.+6723位点经引物对A扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图3：MSTN基因g.+6723位点经引物对B扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图4：MSTN基因g.+6723位点经引物对B扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图5：MSTN基因g.+6723位点经引物对C扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图6：MSTN基因g.+6723位点经引物对C扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图7：MSTN基因g.+6723位点经引物对D扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图8：MSTN基因g.+6723位点经引物对D扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图9：MSTN基因g.+6723位点经引物对E扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图10：MSTN基因g.+6723位点经引物对E扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图11：MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图12：MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图13：MSTN基因g.+6723位点经引物对G扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图14：MSTN基因g.+6723位点经引物对G扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图15：MSTN基因g.+6723位点的PCR-RFLP验证结果；其中，1~5为AA基因型，6~10为AG基因型，11~15为GG基因型。
图16：MSTN基因g.+6723位点PCR扩增产物的Sanger测序验证碱基序列峰图。
图17：引物对的浓度为0.2 μM时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图18：引物对的浓度为0.2 μM时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图19：引物对的浓度为0.3 μM时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图20：引物对的浓度为0.3 μM时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图21：引物对的浓度为0.4 μM时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图22：引物对的浓度为0.4 μM时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图23：引物对的浓度为0.5 μM时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图24：引物对的浓度为0.5 μM时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图25：引物对的浓度为0.6 μM时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图26：引物对的浓度为0.6 μM时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图27：基因组DNA的添加量为10ng时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图28：基因组DNA的添加量为10ng时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图29：基因组DNA的添加量为20ng时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图30：基因组DNA的添加量为20ng时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图31：基因组DNA的添加量为30ng时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图32：基因组DNA的添加量为30ng时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图33：扩增程序的退火温度为56℃时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图34：扩增程序的退火温度为56℃时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图35：扩增程序的退火温度为57℃时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图36：扩增程序的退火温度为57℃时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图37：扩增程序的退火温度为58℃时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图38：扩增程序的退火温度为58℃时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图39：扩增程序的退火温度为59℃时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图40：扩增程序的退火温度为59℃时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图41：扩增程序的退火温度为60℃时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图42：扩增程序的退火温度为60℃时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图43：MgCl2的浓度为1.5 mmol/L时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图44：MgCl2的浓度为1.5 mmol/L时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图45：MgCl2的浓度为2.0 mmol/L时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图46：MgCl2的浓度为2.0 mmol/L时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图47：MgCl2的浓度为2.5 mmol/L时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图48：MgCl2的浓度为2.5 mmol/L时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图49：MgCl2的浓度为3.0 mmol/L时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图50：MgCl2的浓度为3.0 mmol/L时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图51：MgCl2的浓度为3.5 mmol/L时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图52：MgCl2的浓度为3.5 mmol/L时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图53：MgCl2的浓度为4.5 mmol/L时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的高分辨率熔解曲线图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
图54：MgCl2的浓度为4.5 mmol/L时，MSTN基因g.+6723位点经引物对F扩增所得扩增产物经归一化后的温度位移差异图；其中，横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的戴瑞羊和购自小尾寒羊均购自蒙天然牧业科技发展有限公司；下述实施例中涉及的血液DNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；下述实施例中涉及的LightCycler 480II实时荧光定量PCR仪购自罗氏（Roche）公司，其配套软件为LightCycler 480 Software ver.1.5.1，具备Gene Scanning模块。
实施例1：可用于检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的引物对的构建
具体步骤如下：
从NCBI（National Center for Biotechnology Information）的绵羊全基因组数据库中获取MSTN基因的核苷酸序列（NCBI编号为NC_040253.1）；选取核苷酸序列中位于g.+6723位点前后300 bp的序列，根据选取的序列设计可用于检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的特异性引物对；
其中，引物对A的序列如下：
上游引物（F）：5’-AATGGTTTACTGTCATTGTATTC -3’（SEQ ID NO:1）；
下游引物（F）：5’-GAGTTAAATCATTTTGGTTTGCT -3’（SEQ ID NO:2）；
引物对B的序列如下：
上游引物（F）：5’- TCAATGGTTTACTGTCATTGTAT -3’（SEQ ID NO:3）；
下游引物（F）：5’- GAGTTAAATCATTTTGGTTTGCT -3’（SEQ ID NO:4）；
引物对C的序列如下：
上游引物（F）：5’- ATGGTTTACTGTCATTGTATTCA -3’（SEQ ID NO:5）；
下游引物（F）：5’-GAGTTAAATCATTTTGGTTTGCT -3’（SEQ ID NO:6）；
引物对D的序列如下：
上游引物（F）：5’- AATAGTGGTCTTAAAACTCCATA -3’（SEQ ID NO:7）；
下游引物（F）：5’- GATACCATCAGTTTATTATTCTG -3’（SEQ ID NO:8）；
引物对E的序列如下：
上游引物（F）：5’-TGTTAGCATTCACTTATGGGTTC -3’（SEQ ID NO:9）；
下游引物（F）：5’-CAATTTGTAAGATACCATCAGTTTA -3’（SEQ ID NO:10）；
引物对F的序列如下：
上游引物（F）：5’-CTTATGGGTTCGTGATGGCTGTA -3’（SEQ ID NO:11）；
下游引物（F）：5’-CAATTTGTAAGATACCATCAGTTTA -3’（SEQ ID NO:12）；
引物对G的序列如下：
上游引物（F）：5’-AACTCCATATGCAAATGGTTAGA -3’（SEQ ID NO:13）；
下游引物（F）：5’-AACAATTTGTAAGATACCATCAG -3’（SEQ ID NO:14）。
使用实施例1获得的引物对A-G分别对含g.+6723位点的MSTN基因（NCBI编号为NC_040253.1）片段进行PCR扩增，扩增产物的大小分别为扩增产物的大小分别为86 bp、88 bp、85 bp、249 bp、187 bp、175 bp、247 bp，符合预测大小。
实施例2：一种检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法的构建
具体步骤如下：
所述方法为以已知MSTN基因g.+6723位点基因型的绵羊的基因组DNA作为内标，先使用引物对对MSTN基因g.+6723位点的基因型为AA的绵羊的基因组DNA、MSTN基因g.+6723位点的基因型为AG的绵羊的基因组DNA、MSTN基因g.+6723位点的基因型为GG的绵羊的基因组DNA以及待测绵羊的基因组DNA进行扩增，然后对扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，最后根据待测绵羊的基因组DNA扩增获得的高分辨率熔解曲线与MSTN基因g.+6723位点的基因型为AA的绵羊的基因组DNA、MSTN基因g.+6723位点的基因型为AG的绵羊的基因组DNA以及MSTN基因g.+6723位点的基因型为GG的绵羊的基因组DNA扩增获得的高分辨率熔解曲线的重合度判断待测绵羊MSTN基因g.+6723位点的基因型；
所述扩增以及高分辨率熔解曲线分析均在实时荧光定量PCR仪上进行；所述高分辨率熔解曲线由实时荧光定量PCR仪配套软件的Gene Scanning模块中自动生成；所述判断的程序为：先在实时荧光定量PCR仪配套软件的gene scanning模块中将MSTN基因g.+6723位点的基因型为AA的绵羊的基因组DNA、MSTN基因g.+6723位点的基因型为AG的绵羊的基因组DNA以及MSTN基因g.+6723位点的基因型为GG的绵羊的基因组DNA设为stand样，并且，标注基因型，然后对扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，最后gene scanning模块会自动以stand样为判断基准，根据位移曲线判断待测绵羊的基因型；所述扩增的反应体系为20 μL，含有5 ng待测绵羊的基因组DNA、10μL 2´Master Mix、4.0 mmol/L MgCl2以及0.1 μM引物对；所述扩增的程序为：先95℃预变性10 min，然后95℃变性15 s、55℃退火20 s、72℃延伸20 s的过程进行45个循环；所述高分辨率熔解曲线分析的程序为：扩增的程序结束后，先95℃变性1 min，然后40℃退火1 min，再从65℃连续升温至95℃，最后降温至40℃；连续升温的速率为1℃/s；连续升温期间，每秒采集荧光信号25次；其中，引物对分别为实施例1获得的引物对A-G。
实施例3：一种检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法的验证
具体步骤如下：
随机选取56只戴瑞羊和18只小尾寒羊，分别采集56只戴瑞羊和18只小尾寒羊的颈静脉血，并且，利用血液DNA提取试剂盒进行56只戴瑞羊和18只小尾寒羊的基因组DNA；通过56只戴瑞羊和18只小尾寒羊的基因组DNA，分别采用实施例2的方法、PCR-RFLP法（具体可见参考文献：Johnson, P.L., et al., Investigations into the GDF8 g+6723G-Apolymorphism in New Zealand Texel sheep. Journal of Animal Science, 2009. 87(6): p. 1856-1864.）以及PCR产物Sanger测序法（具体可见参考文献：Zhou, H., et al.,Variation in the coding region of the myostatin (GDF8) gene in sheep.Molecular and Cellular Probes, 2008. 22(1): p. 67-68.）检测56只戴瑞羊和18只小尾寒羊的MSTN基因g.+6723位点基因型。
使用实施例2的方法得到的检测结果如图1-14所示，其中，仅有使用引物对F得到的检测结果与使用PCR-RFLP法（检测结果见图15）和PCR产物Sanger测序法得到的检测结果（检测结果见图16）一致，其余引物对均不能很好的检测绵羊MSTN基因g.+6723位点的基因型。
实施例4：引物浓度对检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的结果的影响
具体步骤如下：
在实施例2的方法的基础上，选用引物对F，并将引物对的浓度分别替换为0.2 μM、0.3 μM、0.4 μM、0.5 μM或0.6 μM，并采用替换后的方法检测实施例3中同样的56只戴瑞羊和18只小尾寒羊的MSTN基因g.+6723位点基因型。
检测结果见图17-26，由检测结果可知，将引物对的浓度分别替换为0.2 μM、0.3 μM、0.4 μM、0.5 μM或0.6 μM时，引物对F对绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的分辨能力较实施例3下降。可见，引物对的浓度对使用实施例2的方法检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的结果影响巨大，将引物对的浓度替换为0.2 μM、0.3 μM、0.4 μM、0.5 μM或0.6 μM后的效果远差于替换前。
实施例5：模板浓度对检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的结果的影响
具体步骤如下：
在实施例2的方法的基础上，选用引物对F，并将待测绵羊的基因组DNA的添加量分别替换为10ng、20ng或30ng，并采用替换后的方法检测实施例3中同样的56只戴瑞羊和18只小尾寒羊的MSTN基因g.+6723位点基因型。
检测结果见图27-32，由检测结果可知，将待测绵羊的基因组DNA的添加量分别替换为10ng、20ng或30ng时，引物对F对绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的分辨能力较实施例3下降。可见，待测绵羊的基因组DNA的浓度对使用实施例2的方法检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的结果影响巨大，将待测绵羊的基因组DNA的添加量替换为10ng、20ng或30ng后的效果远差于替换前。
实施例6：退火温度对检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的结果的影响
具体步骤如下：
在实施例2的方法的基础上，选用引物对F，并将扩增程序的退火温度分别替换为56℃、57℃、58℃、59℃或60℃，并采用替换后的方法检测实施例3中同样的56只戴瑞羊和18只小尾寒羊的MSTN基因g.+6723位点基因型。
检测结果见图33-42，由检测结果可知，将扩增程序的退火温度分别替换为56℃、57℃、58℃、59℃或60℃时，引物对F对绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的分辨能力较实施例3下降。可见，扩增程序的退火温度对使用实施例2的方法检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的结果影响巨大，将扩增程序的退火温度分别替换为56℃、57℃、58℃、59℃或60℃时后的效果远差于替换前。
实施例7：MgCl2对检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的结果的影响
具体步骤如下：
在实施例2的方法的基础上，将MgCl2的浓度分别替换为1.5 mmol/L、2.0 mmol/L、2.5 mmol/L、3.0 mmol/L、3.5 mmol/L或4.5 mmol/L，并采用替换后的方法检测实施例3中同样的56只戴瑞羊和18只小尾寒羊的MSTN基因g.+6723位点基因型。
检测结果见图43-54，由检测结果可知，将MgCl2的浓度分别替换为1.5 mmol/L、2.0 mmol/L、2.5 mmol/L、3.0 mmol/L、3.5 mmol/L或4.5 mmol/L时，引物对F对绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的分辨能力较实施例3下降。可见，MgCl2的浓度对使用实施例2的方法检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的结果影响巨大，将MgCl2的浓度分别替换为1.5mmol/L、2.0 mmol/L、2.5 mmol/L、3.0 mmol/L、3.5 mmol/L或4.5 mmol/L后的效果远差于替换前。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 内蒙古大学
<120> 检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aatggtttac tgtcattgta ttc 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gagttaaatc attttggttt gct 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcaatggttt actgtcattg tat 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gagttaaatc attttggttt gct 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atggtttact gtcattgtat tca 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gagttaaatc attttggttt gct 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aatagtggtc ttaaaactcc ata 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gataccatca gtttattatt ctg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgttagcatt cacttatggg ttc 23
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
caatttgtaa gataccatca gttta 25
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cttatgggtt cgtgatggct gta 23
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
caatttgtaa gataccatca gttta 25
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
aactccatat gcaaatggtt aga 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aacaatttgt aagataccat cag 23

Claims (10)

1.一组可用于检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的引物对，其特征在于，所述引物对中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
2.一种检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法，其特征在于，所述方法为以已知MSTN基因g.+6723位点基因型的绵羊的基因组DNA作为内标，先使用权利要求1所述的引物对对MSTN基因g.+6723位点的基因型为AA的绵羊的基因组DNA、MSTN基因g.+6723位点的基因型为AG的绵羊的基因组DNA、MSTN基因g.+6723位点的基因型为GG的绵羊的基因组DNA以及待测绵羊的基因组DNA进行扩增，然后对扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，最后根据待测绵羊的基因组DNA扩增获得的高分辨率熔解曲线与MSTN基因g.+6723位点的基因型为AA的绵羊的基因组DNA、MSTN基因g.+6723位点的基因型为AG的绵羊的基因组DNA以及MSTN基因g.+6723位点的基因型为GG的绵羊的基因组DNA扩增获得的高分辨率熔解曲线判断待测绵羊MSTN基因g.+6723位点的基因型。
3.如权利要求2所述的一种检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法，其特征在于，所述扩增以及高分辨率熔解曲线分析均在实时荧光定量PCR仪上进行。
4.如权利要求3所述的一种检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法，其特征在于，所述高分辨率熔解曲线由实时荧光定量PCR仪配套软件的Gene Scanning模块自动生成；所述判断的程序为：先在实时荧光定量PCR仪配套软件的gene scanning模块中将MSTN基因g.+6723位点的基因型为AA的绵羊的基因组DNA、MSTN基因g.+6723位点的基因型为AG的绵羊的基因组DNA以及MSTN基因g.+6723位点的基因型为GG的绵羊的基因组DNA设为stand样，并且，标注基因型，然后对扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，最后genescanning模块会自动以stand样为判断基准，根据位移曲线判断待测绵羊的基因型。
5.如权利要求2-4任一所述的一种检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法，其特征在于，所述扩增的反应体系为20 μL，含有5 ng待测绵羊的基因组DNA、10μL 2× MasterMix、4.0 mmol/L MgCl2以及0.1 μM权利要求1所述的引物对。
6.如权利要求2所述的一种检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法，其特征在于，所述扩增的程序为：先95℃预变性10 min，然后95℃变性15 s、57℃退火20 s、72℃延伸20 s的过程进行45个循环。
7.如权利要求2所述的一种检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法，其特征在于，所述高分辨率熔解曲线分析的程序为：扩增的程序结束后，先95℃变性1 min，然后40℃退火1 min，再从65℃连续升温至95℃，最后降温至40℃；连续升温的速率为1℃/s；连续升温期间，每秒采集荧光信号25次。
8.一种可用于检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的产品，其特征在于，所述产品含有权利要求1所述的引物对。
9.如权利要求8所述的一种可用于检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的产品，其特征在于，所述产品为检测试剂或检测试剂盒。
10.权利要求1所述的引物对或权利要求2-7所述的方法或权利要求8或9所述的产品在检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型中的应用。
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