CN117568494B - 一种淡水鱼中人兽共患吸虫囊蚴多重pcr检测引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种淡水鱼中人兽共患吸虫囊蚴多重PCR检测引物组、试剂盒及检测方法，引物组包括如下五对引物：华支睾吸虫检测引物；东方次睾吸虫检测引物；横川后殖吸虫检测引物；日本棘隙吸虫检测引物；圆圃棘口吸虫检测引物；多重PCR检测试剂盒包括应用于检测前述五对多重PCR检测引物组，以及超纯水（ddH2O）和2×Taq DNA聚合酶。本发明的有益效果是：本发明建立了一种能够同时检测淡水鱼中华支睾吸虫、东方次睾吸虫、横川后殖吸虫、日本棘隙吸虫和圆圃棘口吸虫五种人兽共患吸虫的多重PCR检测试剂盒及检测方法，具有经济快捷、高效、特异性强、重复性好的特点，可应用于快速检测淡水鱼中主要人兽共患吸虫囊蚴的感染情况。
Description
技术领域
本发明涉及微生物及微生物的测定技术领域，尤其涉及淡水鱼中人兽共患吸虫囊蚴多重PCR检测引物组及试剂盒及检测方法。
背景技术
鱼源性人兽共患吸虫（Fish-borne zoonotic trematodes, FZTs）是食源性寄生虫的一类，主要通过鱼类传播，人和动物通过食入生的或未熟的含有吸虫囊蚴的鱼而感染，可对人类和动物造成严重危害。现已被世界卫生组织（WHO）列入新发传染病名单。华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）、东方次睾吸虫（Metorchis orientalis）、横川后殖吸虫（Metagonimus yokogawai）、日本棘隙吸虫（Echinochasmus japonicus）和圆圃棘口吸虫（Echinostoma hortense）均属于鱼源性人兽共患吸虫，其第一中间宿主为淡水螺类，感染性囊蚴寄生在其第二中间宿主淡水鱼内，终末宿主可因食入含有感染性囊蚴的淡水鱼而感染。
华支睾吸虫是鱼源性吸虫的代表虫种，全球约有3 500万人感染华支睾吸虫病，主要分布于亚洲，是一种十分重要的人兽共患寄生虫。华支睾吸虫寄生于宿主的胆囊和肝胆管内，可引起宿主胆管炎、胆结石和肝硬化，还可诱发胆管上皮细胞癌，已被国际癌症研究机构分类为I类生物致癌物。东方次睾吸虫主要寄生于家禽和一些哺乳动物（包括人）的胆囊和胆管内，可引起与华支睾吸虫相似的临床症状。关于东方次睾吸虫病的报道较少，我国报道主要见于江苏省和福建省。由于其与华支睾吸虫的生活史和临床症状极其相似，临床上东方次睾吸虫病极易被误诊为华支睾吸虫病，因此，东方次睾吸虫是一种被忽视的人兽共患寄生虫。横川后殖吸虫属于异形吸虫，虫体通常很小，其主要寄生于禽类和哺乳动物的肠道。感染性囊蚴阶段寄生在淡水鱼的体表（鱼鳞）内，当宿主食入含有囊蚴的鱼鳞时便容易隐引发病原感染。由于横川后殖吸虫成虫较小，在肠管寄生时可钻入肠壁，因此虫体和虫卵有可能通过血液到达其它器官，以引起并发症的出现，威胁宿主生命健康。日本棘隙吸虫和圆圃棘口吸虫两者均隶属于棘口科吸虫，主要寄生于禽类和哺乳动物的肠道。在我国的贵州、广西和黑龙江地区均有过此病例的报道，且多为混合感染。由于两种病原不论是在囊蚴还是成虫阶段，形态均极其相似，临床鉴定难度较大。
除日本棘隙吸虫和圆圃棘口吸虫的成虫形态差异较小以外，其它三种吸虫的成虫形态差异虽较大，但寄生于淡水鱼体内的吸虫囊蚴形态却极其相似，需要具有丰富临床经验的科研人员才可以进行区分，但形态学鉴定多为人主观进行判断，容易造成误判。因此，仅仅依靠形态学完成对这些病原的鉴定受到了很大的局限性。
随着分子生物学技术的发展，PCR技术已广泛应用于病原的快速检测领域。与常规检测技术相比，此种方法不仅缩短了检测时间，而且节约了人力和物力，为病原的快速诊断提供了可靠的依据。核糖体18S rDNA和线粒体DNA被证明是良好的遗传标记基因。核糖体18S rDNA序列长短适中，其结构中既有保守区域又有变异区域，具备物种内具有保守性而物种间又存在特异性的优势，是较好的生物标志物。线粒体DNA独立于核基因组，且具有较高的突变率和母系遗传特征，因此适合作为寄生虫分子分类、物种鉴定和系统进化的分子标记。
多重PCR（multiplex PCR）技术在常规PCR技术的基础上，通过将多套引物混合一起，优化反应条件后，可实现一个反应同时检测多种人兽共患寄生虫的目的，极大的提高了检测效率，又保留了普通PCR敏感性高、特异性强的特点，适合现场及流行病学调查时大量样本的检测。目前国内外尚无有关利用多重PCR方法同时检测华支睾吸虫、东方次睾吸虫、横川后殖吸虫、日本棘隙吸虫和圆圃棘口吸虫囊蚴的报道。
发明内容
本发明的目的是针对背景技术中的问题，本发明提供淡水鱼中人兽共患吸虫囊蚴多重PCR检测引物组、试剂盒及检测方法，本申请基于核糖体18S rDNA序列及线粒体基因组设计特异性引物，用多重PCR方法检测这五种人兽共患囊蚴，消除了常规检测中误检、漏检和耗时等问题，可直观地从基因水平检测到五种吸虫囊蚴的存在，为预防鱼源性吸虫病提供科学的参考依据，具有显著的公共卫生安全意义。并利用该试剂盒进行五种人兽共患吸虫病原的检测，具备操作简单、节约成本和提高效率的特点。
本发明提供的技术方案是：一种淡水鱼中人兽共患吸虫囊蚴多重PCR检测引物组，引物组包括如下五对引物：
华支睾吸虫检测引物：
CSF：5’-CGGAGTATGCGGGCTTCTTT-3’(SEQ ID NO.1)；
CSR：5’-AAATACACACCCACCGCACT-3’ (SEQ ID NO.2)；
东方次睾吸虫检测引物：
MOF：5’-TGCTTTTGGTTACTAGGCTGACT-3’ (SEQ ID NO.3)；
MOR：5’-CCTCACCAACTCCCTCTCAG-3’ (SEQ ID NO.4)；
横川后殖吸虫检测引物：
MYF：5’-AGTGAACAGGGAAAAGCCCA-3’ (SEQ ID NO.5)；
MYR：5’-TTTCAAGACGGGTCAGGTGG-3’ (SEQ ID NO.6)；
日本棘隙吸虫检测引物：
EJF：5’-AGTAACGGCGAGTGAACAGG-3’ (SEQ ID NO.7)；
EJR：5’-AGTAACGGCGAGTGAACAGG-3’ (SEQ ID NO.8)；
圆圃棘口吸虫检测引物：
EHF：5’-CGGTCTTGTTCTTGCTATGTTGG-3’ (SEQ ID NO.9)；
EHR：5’-AAAACACCTTAATACCCGTAGGA-3’ (SEQ ID NO.10)。
一种淡水鱼中人兽共患吸虫囊蚴多重PCR检测试剂盒，所述的试剂盒包括淡水鱼中人兽共患吸虫囊蚴多重PCR检测引物组、以及超纯水（ddH2O）和2×Taq DNA聚合酶。
所述的淡水鱼中人兽共患吸虫囊蚴多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述人兽共患吸虫囊蚴包括华支睾吸虫、东方次睾吸虫、横川后殖吸虫、日本棘隙吸虫和圆圃棘口吸虫。
一种淡水鱼中人兽共患吸虫囊蚴多重PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、提取待检测样品的总DNA；
S2、采用多重PCR检测试剂盒中的五对引物，以所述五种人兽共患吸虫囊蚴的总DNA为模板，参照两个实施方案的反应体系和反应条件进行多重PCR反应，获得扩增后的产品；
S3、琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若扩增后的中含有560 bp的扩增产物，则样品中含有华支睾吸虫；若扩增后的物料中含有340 bp的扩增产物，则样品中含有东方次睾吸虫；若扩增后的物料中含有907 bp的扩增产物，则样品中含有横川后殖吸虫；若扩增后的物料中含有1510 bp的扩增产物，则样品中含有日本棘隙吸虫；若扩增后的物料中含有212 bp的扩增产物，则样品中含有圆圃棘口吸虫。
所述多重PCR反应体系为：25μL反应体系，其中引物各0.3 μL，DNA模板各1μL，2×Taq DNA聚合酶10.5μL，加ddH2O调整总体积至25 μL。所述多重PCR反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性50 s、59℃退火1min、68℃延伸1min30s扩增33个循环；72℃终延伸7 min。
本发明的有益效果为：本发明建立了一种能够同时检测淡水鱼中华支睾吸虫、东方次睾吸虫、横川后殖吸虫、日本棘隙吸虫和圆圃棘口吸虫五种人兽共患吸虫的多重PCR检测试剂盒及检测方法，具有经济快捷、高效、特异性强、重复性好的特点，可应用于快速检测淡水鱼中主要人兽共患寄生虫病。极大提高了分子检测的工作效率，该方法敏感性高、适合于医疗、养殖场及出入境检验检疫机构等使用。
附图说明
图1是本发明实施例中单重PCR扩增特异性验证的结果示意图；
图2是本发明实施例中多重PCR扩增退火温度优化的结果示意图；
图3是本发明实施例中多重PCR扩增引物浓度优化的结果示意图；
图4是本发明实施例中多重PCR扩增特异性验证的结果示意图；
图5是本发明实施例中PCR敏感性试验验证的结果示意图；
图6是分发明实例中临床样本检验中部分结果的结果示意图。
具体实施方式
下面将结合发明实施例及附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述：
1.设计引物：
根据GenBank登录的华支睾吸虫的NAD5基因序列（登录号：KC170240.1）；东方次睾吸虫的NAD1基因序列（登录号：KY232071.1）；横川后殖吸虫的COX1基因序列（登录号：NC023249.1）；日本棘隙吸虫的18S rDNA基因序列（登录号：LT904767.1）和圆圃棘口吸虫的COX1基因序列（登录号：AF025826.1）经比对分析后，运用DNAstar软件比对分析序列同源性，使用Primer 6.0软件选择保守区域设计各基因的特异性引物，筛选确定最终实验所用的引物，确保所设计引物能特异扩增出对应虫种的目标产物，并且在实施多重PCR过程中，多对引物之间没有干扰，即没有同源、互补，不形成发卡结构等。寄生虫的名称与各引物信息见表1。
表1 五种吸虫囊蚴特异性引物序列信息
Table 1 Information of specific primer sequences for the five speciesof trematode metacercariae
2.2.单一PCR扩增及特异性检验：
通过设计的特异性引物，分别对华支睾吸虫、东方次睾吸虫、横川后殖吸虫、日本棘隙吸虫和圆圃棘口吸虫进行单一PCR扩增，同时以肝片吸虫、土耳其斯坦裂体吸虫、扁弯口吸虫、胰阔盘吸虫、舟形嗜气管吸虫和卷棘口吸虫作为阳性对照，并设立阴性对照，以保证所设计引物的特异性。单一PCR扩增反应体系为25 μL：2×Taq DNA聚合酶10.5 μL，引物0.3 μL，DNA1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O加至25 μL。反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性50 s、59℃退火1 min、68℃延伸1 min 30 s、共33个循环；72℃终延伸7 min。电泳结果表面各引物特异性良好，扩增片段大小与预期相符，分别为1510 bp、907 bp、560 bp、340bp和212 bp，详见图1。图1中M：DL 2 000 Marker；1：华支睾吸虫；2：东方次睾吸虫；3：横川后殖吸虫；4：日本棘隙吸虫；5：圆圃棘口吸虫；6：肝片吸虫；7：土耳其斯坦裂体吸虫；8：扁弯口吸虫；9：胰阔盘吸虫；10：卷棘口吸虫；N：阴性对照。对所得产物测序结果BLAST比对分析，证实均为各自寄生虫扩增的特异性目的条带。
3.多重PCR扩增反应条件的优化：
对多重PCR反应条件进行优化，包括五对引物的浓度（500 nmol/L、400 nmol/L、300 nmol/L、200 nmol/L、100 nmol/L）及退火温度（56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃）进行优化。图2中M为DL 2000 Maker，1-6分别为56℃、57℃、58℃、59℃、60℃和61℃的退火温度；图3中M为DL 2000 Maker，1-5分别为500 nmol/L、400 nmol/L、300 nmol/L、200 nmol/L和100 nmol/L的引物浓度，详见图2和图3。最终确定最佳的多重PCR反应体系为：25 μL反应体系中，五种吸虫囊蚴的引物浓度为400 nmol/L，各0.3 μL，DNA 模板（20 ng/μL）各1 μL，2×Taq DNA聚合酶10.5 μL，加ddH2O调整总体积至25 μL。最佳PCR 反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性50 s、59℃退火1 min、68℃延伸1 min 30 s、共33个循环；72℃终延伸7min。对PCR产物进行1.5%核酸琼脂糖凝胶电泳，所得条带大小与预期相符。
4.多重PCR扩增及特异性检验：
同时利用本申请设计的五对引物（见表1），分别以华支睾吸虫、东方次睾吸虫、横川后殖吸虫、日本棘隙吸虫和圆圃棘口吸虫和五种模板的不同组合，以及肝片吸虫、土耳其斯坦裂体吸虫、扁弯口吸虫、胰阔盘吸虫、舟形嗜气管吸虫和卷棘口吸虫的基因组DNA为模板，按照上述PCR反应体系与条件进行扩增。结果显示：同时利用五对引物分别对华支睾吸虫、东方次睾吸虫、横川后殖吸虫、日本棘隙吸虫和圆圃棘口吸虫的混合模板进行PCR扩增，扩增出5条特异性的目的条带；同时利用五对引物分别对华支睾吸虫、东方次睾吸虫、横川后殖吸虫、日本棘隙吸虫与圆圃棘口吸虫；华支睾吸虫、东方次睾吸虫、横川后殖吸虫与圆圃棘口吸虫；横川后殖吸虫与日本棘隙吸虫；东方次睾吸虫、日本棘隙吸虫与圆圃棘口吸虫四种不同组合的模板进行PCR扩增，分别扩增出5条、4条、2条和3条相应特异性目的条带。因此，五种吸虫囊蚴多重PCR扩增特异性试验证实了这五对引物具有很强的特异性，可用于同时检测华支睾吸虫、东方次睾吸虫、横川后殖吸虫、日本棘隙吸虫和圆圃棘口吸虫。多重PCR扩增特异性验证的结果见图4，图4中M：DL 2 000 Marker；1：华支睾吸虫+东方次睾吸虫+横川后殖吸虫+日本棘隙吸虫+圆圃棘口吸虫混合模板；2：华支睾吸虫+东方次睾吸虫+横川后殖吸虫+圆圃棘口吸虫混合模板；3：横川后殖吸虫+日本棘隙吸虫混合模板；4：东方次睾吸虫+日本棘隙吸虫+圆圃棘口吸虫混合模板；5-9：肝片吸虫、土耳其斯坦裂体吸虫、扁弯口吸虫、胰阔盘吸虫和卷棘口吸虫DNA模板；10：阴性对照。
5.引物敏感性检验：
利用Nano-Drop 2000超微量分光光度计（赛默飞世尔科技公司）测定五种吸虫囊蚴DNA质量浓度，华支睾吸虫、东方次睾吸虫、横川后殖吸虫、日本棘隙吸虫和圆圃棘口吸虫DNA的质量浓度分别为：49.7 ng/μL，41.2 ng/μL，32.2 ng/μL，25.6 ng/μL，20.4 ng/μL和22.7 ng/μL。将其统一稀释为20 ng/μL。再将五种吸虫囊蚴模板进行倍比稀释，质量浓度分别稀释成原液的10-1~10-5倍，按上述条件进行多重PCR扩增，单一PCR对华支睾吸虫、东方次睾吸虫、横川后殖吸虫、日本棘隙吸虫和圆圃棘口吸虫的最小检出量分别为20 ng/μL×10-5、20 ng/μL×10-4、20 ng/μL×10-3、20 ng/μL×10-5和20 ng/μL×10-5（见图5）。因此，五种吸虫囊蚴多重PCR扩增敏感性试验证实了这五对引物对模板浓度的敏感性较高，可满足检测到淡水鱼中一个囊蚴的存在。详见图5，图5中M：DL 2000 Marker；1-5：10-1~10-5倍稀释的DNA模板。图5中第一部分是华支睾吸虫单一PCR敏感性试验的结果示意图；第二部分是东方次睾吸虫单一PCR敏感性试验的结果示意图；第三部分是横川后殖吸虫单一PCR敏感性试验的结果示意图；第四部分是日本棘隙吸虫单一PCR敏感性试验的结果示意图；第五部分是圆圃棘口吸虫单一PCR敏感性试验的结果示意图。
6.临床样本检测：
利用本发明建立的五种吸虫囊蚴多重PCR试剂盒对随机地点采集的50尾淡水鱼样品囊蚴感染情况进行检测，结果显示华支睾吸虫感染阳性27份，东方次睾吸虫感染阳性11份，横川后殖吸虫感染阳性6份，日本棘隙吸虫感染阳性9份，圆圃棘口吸虫感染阳性4份，多数样品呈混合感染，部分结果见图6。图6中M为DL 2000 Maker，1-21为部分淡水鱼人兽共患吸虫囊蚴阳性样品琼脂糖凝胶电泳结果示意图，N为阴性对照。上述检测的结果与利用形态学检测的结果一致。因此，应用多重PCR试剂盒对临床样品进行检测验证试验证实了该方法的可行性。
Claims (4)
1.一种淡水鱼中人兽共患吸虫囊蚴多重PCR检测引物组，引物组包括如下五对引物：
华支睾吸虫检测引物：
CSF：5’-CGGAGTATGCGGGCTTCTTT-3’；
CSR：5’-AAATACACACCCACCGCACT-3’；
东方次睾吸虫检测引物：
MOF：5’-TGCTTTTGGTTACTAGGCTGACT-3’；
MOR：5’-CCTCACCAACTCCCTCTCAG-3’；
横川后殖吸虫检测引物：
MYF：5’-AGTGAACAGGGAAAAGCCCA-3’；
MYR：5’-TTTCAAGACGGGTCAGGTGG-3’；
日本棘隙吸虫检测引物：
EJF：5’-AGTAACGGCGAGTGAACAGG-3’；
EJR：5’-AGTAACGGCGAGTGAACAGG-3’；
圆圃棘口吸虫检测引物：
EHF：5’-CGGTCTTGTTCTTGCTATGTTGG-3’；
EHR：5’-AAAACACCTTAATACCCGTAGGA-3’。
2.一种淡水鱼中人兽共患吸虫囊蚴多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括权利要求1所述的淡水鱼中人兽共患吸虫囊蚴多重PCR检测引物组、以及超纯水（ddH2O）和2×Taq DNA聚合酶。
3.如权利要求2所述的淡水鱼中人兽共患吸虫囊蚴多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述人兽共患吸虫囊蚴包括华支睾吸虫、东方次睾吸虫、横川后殖吸虫、日本棘隙吸虫和圆圃棘口吸虫。
4.一种非诊断目的的淡水鱼中人兽共患吸虫囊蚴多重PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、提取待检测样品的总DNA；
S2、采用如权利要求1所述的多重PCR检测引物组，以所述五种人兽共患吸虫囊蚴的总DNA为模板，进行多重PCR反应，获得扩增后的产品；所述多重PCR反应体系为：25μL反应体系，其中引物各0.3 μL，DNA模板各1μL，2×Taq DNA聚合酶10.5μL，加ddH2O调整总体积至25μL; 所述多重PCR反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性50 s、59℃退火1min、68℃延伸1min30s扩增33个循环；72℃终延伸7 min；
S3、琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若扩增后的物料中含有560 bp的扩增产物，则样品中含有华支睾吸虫；若扩增后的物料中含有340 bp的扩增产物，则样品中含有东方次睾吸虫；若扩增后的物料中含有907 bp的扩增产物，则样品中含有横川后殖吸虫；若扩增后的物料中含有1510 bp的扩增产物，则样品中含有日本棘隙吸虫；若扩增后的物料中含有212 bp的扩增产物，则样品中含有圆圃棘口吸虫。
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