CN103320511A

CN103320511A - 一种法医学上物种鉴定方法

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Publication number: CN103320511A
Application number: CN2013102114727A
Authority: CN
Inventors: 张更谦
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-05-31
Filing date: 2013-05-31
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2033-05-31
Also published as: CN103320511B

Abstract

本发明一种法医学上物种鉴定方法，属于法医鉴定学技术领域。该方法包括以生物检材的mtDNA为模板，以12SF1/12SR、12SF2/12SR、COX1F/COX1R和16SF/16SR引物对混合物为引物进行PCR扩增，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，当电泳条带为三条时，待检生物检材为人体组织，当电泳条带为两条时，待检生物检材为动物组织。本发明具有以下优点：同时使用12SrRNA、16SrRNA、COX1三种基因共7条引物进行复合扩增，引物通过了特异性验证，可以区分人与其他包括恒河猴在内的常见动物；三个引物复合扩增，有两个内参照，结果更确信；本发明方法的灵敏度达到pg级。

Description

一种法医学上物种鉴定方法

技术领域

本发明属于法医鉴定学技术领域，具体涉及一种法医学上物种鉴定方法。

背景技术

种属鉴定是法医物证检验的一个重要步骤，对现场提取的各种生物检材进行种属鉴定是进行其他鉴定的首要及关键环节。其主要任务是鉴定法科学生物检材的种属来源，确定检材是否来自人体。我们采用PCR复合扩增-琼脂糖电泳检测的方法，进行种属鉴定。

传统的种属检验方法包括，核DNA序列的特异性检验(PCR-RFLP)，mtDNA的测序分析，和免疫学的检验方法等等。目前法医检验广泛采用的是免疫试纸条分析，其原理是免疫扩散实验，即用血痕或精斑的浸出液与预加在试纸条上的抗体反应。

目前的种属检验方法有一下缺陷：

1、Alu序列种属鉴定法：Alu序列为人和灵长类所特有，区分不开人与猴；Alu序列是核基因组DNA，需要得到核基因组模板才能进行有效地鉴定，这样需要更多的DNA，故降低了其灵敏度；而mtDNA在动物细胞中含量要比细胞核DNA多出成千上万的拷贝，如果有合适的方法，必将使得检测灵敏度大大提高。

2、mtDNA进行种属检验经常采用测序的办法费用昂贵，该方法是将某些mtDNA的编码基因扩增测序，将其序列在基因库中进行同源性比对后才能做出种属的判断。虽然该方法可能鉴别出检材究竟来自何种动物，然而检测过程烦琐，测序费用昂贵；并且法医学实践中较为常见的只需判别该生物性检材是否来自人类。

3、公安常用的种属检验试纸条：首先、目前公安检验中的种属试纸条为针对血痕和精斑的试纸条，只能检测血或者精斑的种属特异性，对于其他组织如骨、毛发唾液则无能为力；其次、试纸条检验的特异性不高，猴的会误测为人的；最后、非常重要的是，在刑事案件现场的生物检材会受到诸多因素，如雨淋、酶解、污染等的影响，而蛋白质分子容易变性降解和受环境的影响，免疫试纸条容易得到假阴性结果。

4、现在公安上采用DNA STR位点进行荧光STR复合扩增用于个体识别和亲权鉴定。其技术发展之速度远快于种属检验技术的发展，以至于现在做个体识别所需的检材量(荧光复合扩增自动分型技术)少于种属实验所需的检材量(公安常用的试纸条)。这样，如果检材按照常规方法先进行种属检验，则剩余的检材不足以进行STR分型，甚至检材根本不足以进行种属检验，造成检材和证据的浪费。而直接进行STR分型有可能造成假排除，原因在于：当遇到法医痕量检材(pg级别的检材，如小于大米粒大小的血痕检材等)，由于检材量太低，为了得到STR分型，可能会放弃种属检验(种属检验所需检材量远大于DNA-STR分型所需量)而直接进行DNA-STR分型检验，如果得到完整的分型结果即可确定或排除嫌疑人，但是当只是得到部分的STR分型结果时(由于检材降解、痕量或污染、扩增体系等原因造成)，由于并非全部STR位点都具有种属特异性，这样得到的部分STR分型有可能是动物组织造成的，也可能是人的组织但是没有得到STR全部分型，如果据此来认定或排除嫌疑人，往往会得出错误结论，尤其容易造成假阴性(假排除)。

发明内容

为了解决目前法医学上进行物种鉴定存在的上述问题，本发明的目的在于公开了一种法医学上物种鉴定方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种法医学上物种鉴定方法，包括下述步骤：

(1)、以生物检材的mtDNA为模板，以12SF1/12SR、12SF2/12SR、COX1F/COX1R和16SF/16SR引物对混合物为引物进行PCR扩增，其中12SF1的序列如SEQ ID No.1所示，12SR的序列如SEQ ID No.2所示，12SF2的序列如SEQ ID No.3所示，COX1F的序列如SEQ ID No.4所示，COX1R的序列如SEQ ID No.5所示，16SF的序列如SEQ ID No.6所示，16SR的序列如SEQ ID No.7所示；

(2)、对步骤(1)的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，当电泳条带为三条时，待检生物检材为人体组织；当电泳条带为两条时，待检生物检材为动物组织。

上述技术方案所述的一种法医学上物种鉴定方法，其中，所述PCR扩增的扩增体系为：模板1μl、引物3.2μl、10×缓冲液2.5μl、2.5mMdNTP2μl、Taq酶0.25μl和去离子水16.05μl，整个扩增体系为25μl；所述3.2μl引物中含有7条引物，引物浓度均为10μM，其中12SF1为0.3μl，12SF2为0.3μl，12SR为0.6μl，16SF为0.5μl，16SR为0.5μl，COX1F为0.5μl，COX1R为0.5ul；其中Taq酶为Transgen公司的EasyTaq DNA polymerase，0.25μl或1.5U。

上述技术方案所述的一种法医学上物种鉴定方法，其中，所述PCR扩增的扩增条件为94℃30sec、63℃30sec、72℃30sec、32循环；72℃后延伸3min。

上述技术方案所述的一种法医学上物种鉴定方法，其中，所述凝胶电泳的条件为3％的琼脂糖凝胶、6×上样缓冲液5μl、PCR扩增产物全部上样在80v电压下恒压电泳60分钟。

上述技术方案所述的一种法医学上物种鉴定方法，其中，所述鉴定方法还包括对生物检材进行mtDNA提取步骤：

(i)、在离心管中加入1ml去离子水，去5-20μl全血，高速震荡5-10秒；

(ii)、室温放置10分钟，每1-2分钟振荡一次；

(iii)、13000转每分的转速离心两分钟，弃上清，重复以上步骤直至上清基本无色；

(iv)、加入100μl悬浮好的5％chelex100溶液，56℃水浴30分钟，振荡5-10秒；

(v)、100℃煮沸8分钟，13000转离心3分钟，4℃保存备用。

上述技术方案所述的一种法医学上物种鉴定方法，其中，所述鉴定方法还包括对生物检材进行mtDNA提取步骤：100μl5％Chelex100液体中，直接加入0.1-1g动物组织，加入蛋白酶K至50μg/ml，56℃水浴3小时，振荡5-10秒；100℃煮沸8分钟，13000转离心3分钟，4℃保存备用。

本发明中的mtDNA的提取可以采用常规Chelex100提取或有机溶剂提取DNA法均可。

本发明的鉴定原理为：

实验设计上，本发明选择位于线粒体DNA上的12SrRNA，16SrRNA，和COX1基因，其中12SRNA和16SRNA引物设计在物种间的保守区，中间的差别碱基设计在引物的5’端，COX1基因在种属间差别较大，我们也选在种属间的变化较大的区域；设计时充分考虑了人和动物的DNA多态性因素。进行复合扩增时，由于引物的相互作用保证了最大的特异性，并且，由于这三个基因的产物大小不同，可以通过常规的琼脂糖电泳得以区分。

12SrRNA引物分别对应人类线粒体DNA(genbank：Sequence ID：gb|KC533522.1)的871-1082bp；也对应于动物的相应序列，由于动物的序列在引物区域有些差异，为了保证扩增，本发明设计了两条12SrRNA的上游引物，以保证所有动物都能扩增，在5’端的差异碱基不影响扩增过程。

16SrRNA引物分别对应人类线粒体DNA(genbank：Sequence ID：gb|JQ245805.1)的2713-3107bp，也对应于动物的相应序列稍有差异且位于5’端，不影响以后复合扩增。

COX1引物分别对应人类线粒体DNA(genbank：Sequence ID：gb|KC533522.1)的7129-7335bp，也对应于动物的相应序列。

引物设计时候，除了考虑特异性外，也充分考虑了他们之间的相互作用和复合扩增条件，并在实验中证明了三个基因的7条引物以本发明的比例配合时候有最高的人类特异性，远远高于12SrRNA和COX1两个基因四条引物的特异性，达到应用水平。

本发明中12SF1/12SR为一对引物，12SF2/12SR为一对引物，这两对扩增产物片段大小相同，16F/16R为一对引物，COX1F/COX1R为一对引物。12SF1与12SR及12SF2与12SR扩增的是12SrRNA基因上的一段；16F与16R扩增的是16SrRNA基因上的一段；COX1F与COX1R扩增的是COX1基因上的一段；其中12SrRNA、16SrRNA、COX1是mtDNA上面的基因；

其中COX1引物(COX1F/COX1R)是对人特异的，只有人能扩增出来，如果扩出来COX1片段该片段即为人的条带(即琼脂糖凝胶电泳出现三条带)，我们便可确定该检测样品为是人体组织；为了防止假阴性，在鉴定时需要内对照，即12SrRNA(由12SF1/12SR和12SF2/12SR扩增得到)与16SrRNA(由16F/16R扩增得到)，进行复合扩增，更重要的是这7条引物在一起进行复合扩增时，由于扩增条件的限制，使得特异性达到最高。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明以12SF1/12SR、12SF2/12SR、COX1F2/COX1R和16SF/16SR共7条引物混合物以合适的浓度比例进行PCR复合扩增，由于cox1引物(COX1F2/COX1R)只对人特异，所有其它动物均扩不出来，包括多种猴和猩猩在内；而12SrRNA引物与16SrRNA引物作为内对照，能够保证鉴定结果的准确性。

2、本发明与传统的Alu序列种属鉴定法比较：本发明是以mtDNA(线粒体DNA)为底物进行扩增，相对丰富的线粒体DNA使得那些核DNA已经降解的样品中有比较大的可能性提到线粒体DNA；还有，由于mtDNA的高copy数，扩增的灵敏度很高，试验中发现10pg的DNA即可得到明确的结果，当提取的mtDNA量保持在20pg以上，结果最为清晰。

3、本发明与mtDNA测序分析比较：本发明采用PCR不需要其它仪器设备，灵敏度高，操作简单，不需测序，只需琼脂糖凝胶电泳，鉴定过程简单时间短只需一个小时。

4、本发明与公安上常用的种属检验试纸条相比：本发明是以mtDNA(线粒体DNA)为底物进行扩增，它的高copy数决定了的方法检测时限比传统的核DNA长很多，可用于几年甚至更长时间的检材；并且本发明的方法可用于多种检材，血痕、精斑、唾液斑、皮肤及组织毛发骨头，因为只要是动物细胞都会含有远高于细胞核DNA含量的mtDNA。

5、本发明可与目前主流DNA STR位点进行荧光STR复合扩增进行DNA分型等方法合并应用。由于本发明的方法采用的常规的DNA提取方法，只需把STR检验的DNA模板(不需要再处理DNA模版)扩增即可分辨出是否为人的检材：这样就补充了单纯STR分型的不足之处，也不需要再单独进行测序等反应，对于解释微量或污染检材出现的不完成STR图谱非常有意义，也大大提高了检材的利用效率。

6、本发明采用12SrRNA、16SrRNA、COX1三种引物进行扩增，使得本发明的引物通过了特异性验证，可以区分人与猴；其次，三个引物复合扩增，有两个内参照，结果更确信；最后，本发明方法的灵敏度达到pg级。

7、法医检验中最常见和难以分别的是动物组织人组织，如相似的肌肉组织，血液等等；本发明利用mDNA的高拷贝和其部分基因的特异性等特点，来区分人体组织和常见动物组织。

附图说明：

1、图1为人和恒河猴猴、黑猩猩、猕猴、羊、猪、牛以及兔等7种动物琼脂糖凝胶电泳图；

2、图2为鲈鱼、鲍鱼、鸭、鸡、狗和鼠6种动物琼脂糖凝胶电泳图；

3、图3为灵敏度实验琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明的物种鉴定方法在法医鉴定中的应用作进一步的说明。

实施例1：人与动物检材的鉴定：

从人和恒河猴猴、黑猩猩、猕猴、羊、猪、牛以及兔等7种动物组织或血液中提取mtDNA(线粒体DNA)，依次分成1-8共8个实验组，每个实验组中PCR扩增的扩增体系为模板量1μl、引物3.2μl、10×缓冲液2.5μl、dNTP2μl、Taq酶0.25μl和去离子水16.05μl，整个扩增体系为25μl；每个扩增体系的引物均为12SF1/12SR、12SF2/12SR、COX1F/C0X1R和16SF/16SR混合物，所述3.2μl引物中含有7条引物，引物浓度均为10μM，其中12SF1为0.3μl，12SF2为0.3μl，12SR为0.6μl，16SF为0.5μl，16SR为0.5μl，COX1F为0.5μl，COX1R为0.5ul；引物序列由宝生物工程(大连)有限公司合成，OPC纯度；Taq酶为Transgen公司的EasyTaq DNA polymerase。

每个实验组的PCR扩增条件为PCR扩增的扩增条件为94℃30sec、63℃30sec、72℃30sec、32循环；72℃后延伸3min。

将PCR扩增产物全部进行琼脂糖凝胶电泳，在3％的琼脂糖凝胶、6×上样缓冲液5μl、PCR扩增产物全部上样在80v电压下恒压电泳60分钟，结果如图1所示，其中1是人、2是恒河猴、3是黑猩猩、4是猕猴、5是羊、6是猪、7是牛、8是兔，由图1可知只有人的mtDNA经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳后会有3条带，由上到下分别为16SrRNA、12SrRNA和COX1的扩增产物，大小分别为439bp、243bp和207bp。各种动物只有两条扩增条带，即16SrRNA和12SrRNA条带，大小与人稍微差别。

本发明在鲈鱼、鲍鱼、鸭、鸡、狗和鼠6种动物体上按照上述鉴定方法进行了相同的实验，结果如图2所示，其中1是鲈鱼、2是鲍鱼、3是鸭、4是Marker、5是鸡、6是狗、7是鼠，均只有2条条带，从上到下为16SrRNA和12SrRNA。

本实施例中的mtDNA是通过下述两种方法提取的：

一、动物血液中提取：

(i)、在离心管中加入1ml去离子水，加5-20μl全血，高速震荡5-10秒；

(ii)、室温放置10分钟，每1-2分钟振荡一次；

(v)、100℃煮沸8分钟，13000转离心3分钟，4℃保存备用。

二、动物组织中提取：

100μl5％Chelex100液体中，直接加入0.1-1g动物组织，加入蛋白酶K至50μg/ml，56℃水浴3小时，振荡5-10秒；100℃煮沸8分钟，13000转离心3分钟，4℃保存备用。

实施例2：本发明鉴定方法的灵敏度实验：

1、DNA用量的确定：按照实施例1中的提取mtDNA的方法提取mtDNA后，用分光光度法定量，测定OD₂₆₀，按照双链DNA1OD对应50ug/ml的计算方法，进行定量，分别用水稀释mtDNA至2.5pg，5pg，10pg，20pg，50pg，100pg，lng，

2、按照实施例1中的方法，对步骤(1)中7种浓度的mtDNA进行PCR扩增；

3、按照按照实施例1中的方法进行琼脂糖凝胶电泳。

结果如图3所示，其中从左到右1、2、3、4、5、6、7加样孔的DNA模板量依次为2.5pg，5pg，10pg，20pg，50pg，100pg和1ng。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.一种法医学上物种鉴定方法，包括下述步骤：

2.根据权利要求1所述的一种法医学上物种鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增的扩增体系为：模板1μl、引物3.2μl、10×缓冲液2.5μl、2.5mMdNTP2μl、Taq酶0.25μl和去离子水16.05μl，整个扩增体系为25μl；所述3.2μl引物中含有7条引物，引物浓度均为10μM，其中12SF1为0.3μl，12SF2为0.3μl，12SR为0.6μl，16SF为0.5μl，16SR为0.5μl，COX1F为0.5μl，COX1R为0.5ul。

3.根据权利要求1所述的一种法医学上物种鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增的扩增条件为94℃30sec、63℃30sec、72℃30sec、32循环；72℃后延伸3min。

4.根据权利要求1所述的一种法医学上物种鉴定的方法，其特征在于：所述凝胶电泳的条件为3％的琼脂糖凝胶、6×上样缓冲液5μl、PCR扩增产物全部上样在80v电压下恒压电泳60分钟。

5.根据权利要求1-4任一权利要求所述的一种法医学上物种鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法还包括对生物检材进行mtDNA提取步骤：

(ii)、室温放置10分钟，每1-2分钟振荡一次；

(v)、100℃煮沸8分钟，13000转离心3分钟，4℃保存备用。

6.根据权利要求1-4任一权利要求所述的一种法医学上物种鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法还包括对生物检材进行mtDNA提取步骤：100μl5％Chelex100液体中，直接加入0.1-1g动物组织，加入蛋白酶K至50μg/ml，56℃水浴3小时，振荡5-10秒；100℃煮沸8分钟，13000转离心3分钟，4℃保存备用。