CN111471751B

CN111471751B - 一种可定量检测动物血液或组织中人源dna的方法

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Publication number: CN111471751B
Application number: CN202010509857.1A
Authority: CN
Inventors: 岑小波; 薛爱琴; 赖力
Original assignee: Chengdu Huaxi Haiqi Medical Technology Co ltd
Current assignee: Chengdu Huaxi Haiqi Medical Technology Co ltd
Priority date: 2020-06-05
Filing date: 2020-06-05
Publication date: 2024-02-02
Anticipated expiration: 2040-06-05
Also published as: CN111471751A

Abstract

本发明公开了一种可定量检测动物血液或组织中人源DNA的方法，属于核酸检测领域。本发明的方法包括如下步骤：(1)取动物的血液或组织，提取DNA；(2)以前述DNA为模板，使用序列如SEQ ID NO.1～2所述的引物进行染料法荧光定量PCR；(3)检测染料信号。本发明的方法具有极高的灵敏度，在人源DNA和干扰DNA的比值低至百万分之一级别时，仍能有效检测人源DNA，通过目标DNA含量可推知人源DNA的多少。

Description

一种可定量检测动物血液或组织中人源DNA的方法

技术领域

本发明属于核酸检测领域。

背景技术

近年来有大量临床研究结果显示，细胞治疗在癌症、关节炎、中枢神经系统病变等领域均显示了明显的疗效，基于免疫细胞、干细胞等的细胞药物已成为药物研发中最新的领域之一。目前，虽然细胞药物已经开始走向临床，但对细胞类药物进入体内之后的命运变化普遍缺乏认识。通过细胞药代动力学研究，有可能了解并准确描述细胞进入机体之后的命运变化，准确预测不同细胞药物的体内分布、代谢、排泄规律，据此改进细胞药物本身或其使用方法，提高细胞产品的临床疗效，降低风险，减少药物之间的相互作用。

对于临床前的检测，为了定量测定实验动物体内人源细胞的数量，首选的检测方式是实时荧光定量PCR(qPCR)。qPCR可以通过检测DNA含量，实现对血液、组织样品中的人源细胞的定量分析。理论上，可以使用任何人源性特异核酸序列作为生物标志物，用于检测人源性细胞在动物体内的分布和清除。但是，受DNA提取回收率、基质干扰、实验动物物种等因素的影响，导致采用qPCR技术对于人源DNA的定量分析受限，检测非人灵长类动物血液及组织样品中的人源DNA的定量分析更加困难，这是因为人类和非人灵长类动物在基因组序列相似度高达96％以上，在人源DNA含量很少的情况下，动物基因组DNA很容易对人源DNA的检测形成干扰，导致检测失败。

目前，还没有专门用于检测动物中人源DNA的现有技术。不过，存在与之类似的需面临高同源性序列干扰的DNA检测技术，比如ctDNA检测。ctDNA是游离于外周血循环系统的肿瘤来源的DNA，存在特定序列突变，但ctDNA量很少，在检测时容易被血液中大量未发生特定突变的DNA干扰。将qPCR技术应用于ctDNA的检测，目前能从野生型DNA中检测不低于0.05％(相当于万分之一级别)的突变DNA(CN 110373454 A)，检测能力仍然有限。

数字PCR可以通过高度分割检测样本的方式，产生成千上万的小样本，小样本中只要存在待检DNA，则其比例相对于原样本要高许多，进而可减少高同源性序列的干扰，可以用于定量检测动物血液/组织中人源DNA，但是，数字PCR设备、耗材昂贵，不适用于推广应用。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种高灵敏度的可检测动物血液及组织中人源DNA的实时荧光定量PCR检测方法和试剂盒。

本发明的技术方案如下：

一种检测动物血液或组织中人源DNA的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)取动物的血液或组织，提取DNA；

(2)以前述DNA为模板，使用序列如SEQ ID NO.1～2所述的引物进行荧光定量PCR；

(3)检测荧光信号。

如前述的方法，步骤(2)所述荧光定量PCR的退火温度为59℃～63.5℃。

如前述的方法，步骤(2)所述荧光定量PCR的循环数为35～40。

如前述的方法，它还包括对阳性样本的检测，所述阳性样本中，每μg DNA含有2.5pg人源DNA。

如前述的方法，步骤(2)所述荧光定量PCR为染料法荧光定量PCR，优选的，所述染料为SYBR Green染料。

如前述的方法，步骤(2)中，每20μL体积的PCR反应体系所使用的总模板量是200ng。

如前述的方法，所述动物是大鼠或食蟹猴。

一种人源DNA检测引物对，序列如SEQ ID NO.1～2所示。

一种检测动物血液及组织中人源DNA的实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒含有序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物对。

进一步的，试剂盒还包括人源DNA。

本发明的方法和试剂盒具有如下有益效果：

1)特异性强，对不含人源DNA的动物源DNA样本不会扩增；

2)重复性好，对浓度低至6.25×10^-5ng/μL的样本能稳定检出；

3)灵敏度高，其检测灵敏度为2.5pg/μg gDNA，相当于可以从百万份高度同源的DNA中检测出混入其中的2～3份人源DNA，灵敏度为百万分之一级别，远高于CN 110373454A的水平。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：对标准曲线样本(阳性样本)、LOD样本(阳性样本)、阴性质控样本(Neg)、无模板质控样本的扩增曲线。

图2：人源DNA的实时荧光定量PCR典型标准曲线。

图3：人源DNA的实时荧光定量PCR灵敏度试验(实验动物为食蟹猴)扩增曲线图。

图4：人源DNA的实时荧光定量PCR灵敏度试验(实验动物为大鼠)扩增曲线图。

具体实施方式

以下实施例或实验例中使用的人源细胞为人胎盘绒毛膜间充质干细胞，来源于云南舜喜再生医学工程有限公司，作为阴性质控样品和给药样品DNA制备的食蟹猴购买自北京中科灵瑞生物技术股份有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2018-0001，作为阴性质控样品和给药样品DNA制备的SD大鼠购买北京维通利华实验实验物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2016-0011。

SYBR Green Mix(2×)为宝生物工程(大连)有限公司产品。

核酸提取试剂为Roche产品。

RNase-free Water为宝生物工程(大连)有限公司产品。

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

DNA的提取

使用Roche MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit在MagNA Pure96全自动核酸纯化仪上提取人胎盘绒毛膜间充质干细胞及未给予人源细胞的实验动物全血及组织DNA样品。将提取的人胎盘绒毛膜间充质干细胞DNA作为标准品进行后续标准曲线样本的配制，将提取的未给予人源细胞的实验动物全血及组织DNA样本作为阴性样品(Neg)作为后续检测的阴性质控样本，无核酸酶水作为无模板对照(NTC)。

实施例1引物设计及合成

经过对所设计的大量引物进行筛选后，发现引物HMt-F、HMt-R在的特异性最强、扩增效率最高，其碱基序列如下所示。

HMt-F(SEQ ID NO.1)：5’-CCTAAAACCCGCCACATCTA-3’；

HMt-R(SEQ ID NO.2)：5’-AAGAGCGATGGTGAGAGCTAA-3’。

用HMt-F、HMt-R扩增序列(SEQ ID NO.3)如下：

CCTAAAACCCGCCACATCTAAAGAGCGATGGTGAGAGCTAA

CCTAAAACCCGCCACATCTAccatcaccctctacatcaccgccccgaccTTAGCTCTCACCATCGCTCTT

实施例2定量检测SD大鼠全血及组织中人源干细胞的实时荧光定量PCR检测方法

(1)核酸的提取

使用Roche MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit在MagNA Pure96全自动核酸纯化仪上分别对人胎盘绒毛膜间充质干细胞，给予人源细胞SD大鼠的全血、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、心脏，未给予人源细胞的SD大鼠的全血、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、心脏进行DNA提取。将提取的人胎盘绒毛膜间充质干细胞DNA作为标准品进行后续标准曲线样本的配制，将提取的给予人源细胞SD大鼠的全血、全血、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、心脏DNA作为待测样品，将提取的未给予人源细胞的SD大鼠全血及组织DNA样本作为阴性样品。

(2)标准曲线样本的配制

用标准品配制标准曲线样本，标准曲线样本包括1.25ng/μL,0.125ng/μL,0.0125ng/μL,0.00125ng/μL,0.000125ng/μL5个点。

(3)阴性质控样本的配制

将阴性样品用无核酸酶水稀释至25ng/μL作为阴性质控样品。

(4)给予人源细胞的待测样品的稀释

如有样本浓度超过25ng/μL，用无核酸酶水稀释至25ng/μL进行检测。

(5)PCR反应体系配制

注：模板分别为标准曲线DNA样本、待测稀释DNA样本、阴性质控样本(Neg)和纯水无模板阴性对照(NTC)，2个重复(LOD样本4个重复)，若液体挂壁，瞬时离心将液体离下。

(6)PCR扩增反应程序设置

1)95.0℃5分钟；

2)95.0℃15秒；

3)59.0℃15秒；

4)72.0℃30秒(此步骤结束后检测荧光)；

5)回到步骤2)，对步骤2)～4)进行34个循环；

6)溶解曲线65.0℃到95.0℃,升温速度为5秒0.5℃+荧光读取

(7)结果的判定与分析

从仪器上获得的扩增效率(E)在90％～105％之间，R²≥0.99，阴性质控样本和纯水无模板质控样本无扩增，说明该批次扩增合格能够对待测SD大鼠全血或组织样本中的人胎盘绒毛膜间充质干细胞进行定量分析。当E、R²和质控均符合要求时，若混合DNA样本的Cq值≤LOQ且获得的SD值≤0.5时所获得的浓度为人源细胞的DNA浓度，表示混合DNA样品中存在可以定量的人源DNA，浓度为人源细胞的DNA浓度，表示混合DNA样品中存在可以定量的人源DNA，对数据进行标准化：人源细胞的DNA浓度/模板DNA浓度*1000获得人源细胞DNA(单位为：ng)在1μg总gDNA中的含量；当混合DNA样本无Cq值且无扩增曲线的样品判为阴性，表示混合DNA样品中不存在人源DNA；当混合DNA样本测定的Cq值在LOQ和LOD的Cq值之间，说明混合DNA样品中存在人源细胞的DNA，但不可定量；若测定有Cq值但大于LOD的样品须调整稀释倍数重做，重做结果若Cq值≤LOD者为阳性扩增，否则为阴性。

实施例3定量检测食蟹猴全血及组织中人源干细胞的实时荧光定量PCR检测方法

(1)核酸的提取

使用Roche MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit在MagNA Pure96全自动核酸纯化仪上分别对人胎盘绒毛膜间充质干细胞，给予人源细胞食蟹猴的全血、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、心脏，未给予人源细胞的食蟹猴的全血、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、心脏进行DNA提取。将提取的人胎盘绒毛膜间充质干细胞DNA作为标准品进行后续标准曲线样本的配制，将提取的给予人源细胞食蟹猴的全血、全血、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、心脏DNA作为待测样品，将提取的未给予人源细胞的食蟹猴的全血及组织DNA样本作为阴性样品。

(2)标准曲线样本的配制

(3)阴性质控样本的配制

将阴性样品用无核酸酶水稀释至25ng/μL作为阴性质控样品。

(4)给予人源细胞的待测样品的稀释

(5)PCR反应体系配制

(6)PCR扩增反应程序设置

1)95.0℃5分钟；

2)95.0℃15秒；

3)59.0℃15秒；

4)72.0℃30秒(此步骤结束后检测荧光)；

5)回到步骤2)，对步骤2)～4)进行34个循环；

6)溶解曲线分析：65.0℃到95.0℃,升温速度为5秒0.5℃，并进行荧光读取。

(7)结果的判定与分析

从仪器上获得的扩增效率(E)在90％～105％之间，R²≥0.99，阴性质控样本和纯水无模板质控样本无扩增，说明该批次扩增合格能够对待测食蟹猴的全血或组织样本中的人胎盘绒毛膜间充质干细胞进行定量分析。当E、R²和质控均符合要求时，若混合DNA样本的Cq值≤LOQ且获得的SD值≤0.5时所获得的浓度为人源细胞的DNA浓度，表示混合DNA样品中存在可以定量的人源DNA，浓度为人源细胞的DNA浓度，表示混合DNA样品中存在可以定量的人源DNA，对数据进行标准化：人源细胞的DNA浓度/模板DNA浓度*1000获得人源细胞DNA(单位为：ng)在1μg总gDNA中的含量；当混合DNA样本无Cq值且无扩增曲线的样品判为阴性，表示混合DNA样品中不存在人源DNA；当混合DNA样本测定的Cq值在LOQ和LOD的Cq值之间，说明混合DNA样品中存在人源细胞的DNA，但不可定量；若测定有Cq值但大于LOD的样品须调整稀释倍数重做，重做结果若Cq值≤LOD者为阳性扩增，否则为阴性。

以下用实验例的形式对本发明的有益效果做进一步说明。

实验例1实时荧光定量PCR反应体系的建立与优化

(1)引物和探针浓度的优化

使实时荧光定量PCR反应体系的引物终浓度从0.1μmol/L至1μmol/L以0.1μmol/L递增，采用矩阵法进行对比试验，对比试验的其它条件完全一致。

实验结果显示，游引物浓度为10μM，引物用量为0.5μL时，可得到良好的扩增效果，且可以保证扩增的特异性。

(2)最佳退火温度和和循环数的确定

为了提高实时荧光定量PCR反应体系的灵敏度和特异性，分别设置退火温度为55.3℃、55.8℃、56.7℃、……65℃进行扩增，筛选合适的退火温度。

实验结果显示59℃～63.5℃作为退火温度较为合适，扩增循环数35～40个循环可保证扩增的灵敏度和特异性。

经优化确定定量检测实验动物血液及组织中人源DNA的实时荧光定量PCR检测方法最佳反应体系及反应参数，反应体系总体积20μL，各组分及浓度见下表。

实时荧光定量PCR反应条件：

1)95.0℃5分钟；

2)95.0℃15秒；

3)59.0℃15秒；

4)72.0℃30秒(此步骤结束后检测荧光)；

5)回到步骤2)，对步骤2)～4)进行34个循环；

实验例2基于标准品的重复性、特异性、定量限(LOQ)及检测限(LOD)实验

1.方法

(1)标准曲线样本和检测限样本的制备

用标准品配制标准曲线样本，标准曲线样本包括12.5ng/μL、1.25ng/μL、0.125ng/μL、0.0125ng/μL、0.00125 ng/μL、0.000125ng/μL6个浓度，其中将0.000125ng/μL作为定量限(LOQ)；再设定1/2LOQ，即6.25×10-⁵ng/μL作为检测限(LOD)样本。

(2)阴性质控样本的制备

将阴性样品用无核酸酶水稀释至25ng/μL作为阴性质控样品用于评价方法的特异性。

(3)扩增

对标准曲线样本(阳性样本)、LOD样本(阳性样本)、阴性质控样本(Neg)、无模板质控样本(NTC，以无核酸酶水代替DNA模板)进行了扩增，扩增体系同实施例2，LOD样本有4个重复，其余样本各有2个重复。

2.结果

人源DNA标准曲线的定量范围为：12.5～0.000125ng/μL，定量下限为：0.000125ng/μL。R²在0.997～1.000范围内，扩增效率在94.6％～99.1％；各样本浓度的RE％(相对误差百分率)在±30％以内，CV％(变异系数百分率)＜30％，LOD样本的4个重复均具有扩增，而阴性质控样本、无模板质控样本均无Cq值且无扩增曲线，扩增曲线图见图1，标准曲线如图2所示。

以上结果说明本发明方法和试剂盒的特异性强，重复性好，灵敏度高。

实验例3基于全血的灵敏度试验

用试验动物(食蟹猴、大鼠)的全血DNA阴性质控样本，加入实施例3的标准品，配制LOQ和LOD样本各6个重复，配制标准品浓度为1.25 ng/μL、0.125ng/μL、0.0125ng/μL、0.00125ng/μL的样本各2个重复。各DNA样本的DNA总浓度为25ng/μL,进行实时荧光定量PCR，方法同实施例2。

结果LOQ的SD≤0.5，LOD均有扩增(食蟹猴和大鼠全血DNA配制的样本的扩增曲线分别如图3和图4所示)，通过计算：LOQ的定量灵敏度＝(0.000125ng/μL)/(25ng/μL)*10⁶＝5pg/μg gDNA，检测灵敏度为2.5pg/μg gDNA。

以上结果说明，本发明的方法和试剂盒受高同源性DNA的干扰小，在目标DNA和干扰DNA的比值低至百万分之一级别时，仍能有效检测目标DNA。

综上，本发明的方法和试剂盒的特异性强，重复性好，灵敏度高，适用于动物血液及组织中人源DNA的检测。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都华西海圻医药科技有限公司

<120> 一种可定量检测动物血液或组织中人源DNA的方法

<130> GY159-2020P019899CC

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cctaaaaccc gccacatcta 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aagagcgatg gtgagagcta a 21

<210> 3

<211> 111

<212> DNA

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 3

cctaaaaccc gccacatcta aagagcgatg gtgagagcta acctaaaacc cgccacatct 60

accatcaccc tctacatcac cgccccgacc ttagctctca ccatcgctct t 111

Claims

1.一种检测动物血液或组织中人源DNA的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）取动物的血液或组织，提取DNA；所述动物是大鼠或食蟹猴；

（2）以前述DNA为模板，使用序列如SEQ ID NO.1~2所述的引物进行荧光定量PCR；所述荧光定量PCR为染料法荧光定量PCR，所述染料为SYBR Green染料；每20μL体积的PCR反应体系所使用的总模板量是200 ng；所述荧光定量PCR的循环数为35~40；所述荧光定量PCR的退火温度为59℃~63.5℃；

（3）检测荧光信号。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：它还包括对阳性样本的检测，所述阳性样本中，每μg DNA含有2.5pg人源DNA。