CN108504731A - 诊断脂质代谢相关疾病或阿尔茨海默病标志物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及诊断脂质代谢相关疾病或阿尔茨海默病标志物载脂蛋白E的方法。本发明提供了检测APOE基因多态性的检测试剂和检测方法，解决了现有技术的测序结果中存在较高比例的等位基因非特异性交叉扩增的技术问题。

Description

诊断脂质代谢相关疾病或阿尔茨海默病标志物的方法

技术领域

本发明属于诊断领域，更具体地，本发明涉及诊断冠心病或心肌梗塞相关标志物的方法；尤其涉及一种载脂蛋白E(APOE)基因两个SNP位点rs429358和rs7412的多态性检测试剂盒。

背景技术

载脂蛋白E基因编码载脂蛋白E前体(Apolipoprotein E，ApoE)，含有317个氨基酸残基，经过加工后的载脂蛋白E包含299个氨基酸残基，分子量为34.2KD，是一种具有脂蛋白转运、代谢、修复细胞膜、神经发育、修复损伤等多种功能的脂质转运蛋白。ApoE与多种心脑血管疾病密切相关，参与高血脂症、动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病的整个发生发展过程，ApoE基因多态性是这些疾病早期及发展过程中个体差异的主要原因。其遗传多态性主要受控于两个SNP位点rs429358和rs7412，这两个SNP位点通过不同的核酸组合决定了ApoE的三种等位基因型：ε2(rs429358为T，rs7412为T)、ε3(rs429358为T，rs7412为C)、ε4(rs429358为C，rs7412为C)，这三种类型等位基因分别编码三种ApoE蛋白亚型，即ApoE2(其蛋白序列的112位和158位均为半胱氨酸)、ApoE3(其蛋白序列的112位为半胱氨酸，158位为精氨酸)、ApoE4(其蛋白序列的112位和158位均为精氨酸)。因此，ApoE基因有ε2/ε2、ε3/ε3、和ε4/ε4三种纯合子型与ε2/ε3、ε2/ε4和ε3/ε4三种杂合子型。自然人群中，基因频率ε3分布最高，ApoE3/3(即ε3/ε3)表型分布约70％。ApoE基因具有异构体特异性，即不同基因编码的蛋白质功能具有差异性，从而导致不同蛋白质对脂质的代谢能力不同、抗氧化及抗炎症能力不同。

ApoE基因多态性是冠心病(CHD)早期及发展过程中个体差异的主要原因，通过ApoE基因多态性的检测可以了解个体CHD及心肌梗塞(MI)的易感性。ApoE2的作用是降低胆固醇浓度，对冠状动脉硬化的发展有一定的防护作用，而ApoE 4则会使血浆LDL-C、TC浓度升高，易诱发CHD及MI。

ApoE基因是目前已知的阿尔茨海默病最密切的遗传标志物，ApoE4携带者阿尔茨海默病的易感性增加。ApoE突变后，其与LDL-R的亲和力发生改变。携带一个E4等位基因的个体其发展为AD的可能性高于无E4等位基因的个体约3-4倍。E4等位基因在普通人群中比例大约为15％，而在AD患者中的比例可达40％。ApoE4是AD的重要危险因素。通过检测ApoE的基因型，可了解是否为AD易感人群，继而从病因学延缓AD的发生、发展；并定期检查，以便早诊断、早治疗、最大程度的降低疾病造成的损害。

目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法、基因芯片杂交法、PCRRFLP方法、PCR扩增产物毛细管电泳分析法、PCR-SSCP、PCR高分辨熔解曲线分析技术、PCRTaqman MGB(Minor Groove Binder)探针法、AS-PCR法、Cast-PCR法等。这些方法或多或少存在着仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等缺点，需要加以改进和优化。

本领域中，多数的遗传标记物以检测组织样本或血液样本为主，较少地采用口腔上皮细胞样本。获取口腔上皮细胞作为样本来进行检查，虽然取样简单、对患者无痛苦，但是相比于血清检测，其一次取样获得的DNA样本量少、样本背景复杂，对于检测的精密度，检测试剂的敏感性的要求显著更高，因此本领域中对于疾病检测以获取口腔上皮细胞(例如以唾液拭子来获取)作为检测样本的情形少之又少，成功开发出成熟的诊断试剂的也很少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种载脂蛋白E(APOE)基因的多态性检测试剂盒。

在本发明的第一方面，提供检测载脂蛋白E基因多态性的试剂，所述的试剂包括：

(a)前引物，其包括分别具有SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的6条引物；

(b)后引物，其包括分别具有SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列的6条引物；和

(c)针对(a)和(b)引物的扩增产物的1条探针，所述的探针具有SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列。

在一个优选例中，所述的试剂还包括提高检测特异性的序列片段，其是具有SEQID NO:13～SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列的4条序列片段。

在另一优选例中，所述的探针为Taqman探针。

在另一优选例中，所述试剂还包括：DNA扩增试剂，PCR扩增缓冲液，TaqMan MasterMix(含内参ROX染料)混合液，和/或空白对照。

在另一优选例中，所述试剂置于试剂盒中，且该试剂盒中还包括唾液拭子和/或阐明操作方法的使用说明书。

在另一优选例中，所述的基因多态性是载脂蛋白E基因SNP位点rs429358和rs7412的多态性。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的试剂的用途，用于制备检测检测载脂蛋白E基因多态性的试剂盒。

在本发明的另一方面，提供一种检测载脂蛋白E基因SNP位点rs429358和rs7412的多态性的方法，所述方法包括：(i)以待测样品为模板，以前面任一所述的试剂进行PCR扩增；(ii)分析PCR扩增产物，确定待测样品中载脂蛋白E基因SNP位点rs429358和rs7412的多态性。

在一个优选例中，所述的待测样品为取自于口腔的体液样品；较佳地，其为含有口腔上皮细胞的样品。

在本发明的另一方面，提供如下判别多态性：rs429358为T，rs7412为T，载脂蛋白E基因型为ε2型；rs429358为T，rs7412为C，载脂蛋白E基因型为ε3型；rs429358为C，rs7412为C，载脂蛋白E基因型为ε4型。

在本发明的另一方面，提供所述的检测载脂蛋白E基因SNP位点rs429358和rs7412的多态性的方法不是以获得疾病诊断结果为直接目的的方法；较佳地，其不是诊断方法。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1为E2/E2型ApoE基因的扩增曲线图；

图2为E2/E3型ApoE基因的扩增曲线图；

图3为E2/E4型ApoE基因的扩增曲线图；

图4为E3/E3型ApoE基因的扩增曲线图；

图5为E3/E4型ApoE基因的扩增曲线图；

图6为E4/E4型ApoE基因的扩增曲线图；

图7为阴性对照的PCR扩增曲线图；

图8为E2/E2型ApoE基因的扩增曲线图(不加所述提高检测特异性的序列片段)；

图9为E2/E3型ApoE基因的扩增曲线图(不加所述提高检测特异性的序列片段)；

图10为E2/E4型ApoE基因的扩增曲线图(不加所述提高检测特异性的序列片段)；

图11为E3/E3型ApoE基因的扩增曲线图(不加所述提高检测特异性的序列片段)；

图12为E3/E4型ApoE基因的扩增曲线图(不加所述提高检测特异性的序列片段)；

图13为E4/E4型ApoE基因的扩增曲线图(不加所述提高检测特异性的序列片段)；

图14为阴性对照的PCR扩增曲线图(不加所述提高检测特异性的序列片段)；

图15为本发明的检测试剂的工作示意图。

具体实施方式

本发明人致力于提高载脂蛋白E(APOE)基因多态性检测的检测效率，特别是针对口腔样本的检测效率。在经过大样本量的反复研究后优化了检测APOE基因多态性的检测试剂，可以快速、精准地获得APOE基因多态性检测结果。

在前期研究中，本发明人探讨载脂蛋白E基因SNP位点rs429358和rs7412分别设计扩增可行性。由于该两个位点的位置特殊，选择引物探针比较困难，根据常规的SNP测定方法，难以获得4条特异性非常高的探针来匹配2个SNP位点，实验过程也存在单个SNP位点特异性交叉的问题。经过反复分析，本发明人克服了前述问题，实现了针对两个SNP位点，仅用一套引物、探针即可达到准确检测的目的，还可以很好地避免等位基因的非特异性交叉扩增问题。

如本发明所用，“等位基因”一般是指DNA区段，同源染色体上的相同物理位置上，控制相对性状的一对基因。在一些情况下，等位基因可以对应于特定物理基因座上的单核苷酸的替换。在其它情况中，等位基因可以对应于核苷酸(单个或多个)插入或缺失。

如本发明所用，“等位基因特异性引物”是指与目标等位基因的序列互补，在PCR时能够延伸完成特异的PCR反应。等位基因特异性引物可以设计成能检测出靶序列中少至1个核苷酸差异特异的引物，该引物可以包含等位基因特异性核苷酸部分、3’端靶标特异性部分和尾巴。

本发明开发了Past-PCR(Perfect allele-specific Taqman PCR)方法，成功地进行了ApoE基因rs429358位点和rs7412位点的同时检测。本发明的Past-PCR是由检测基因SNP或突变的高特异性ASPCR方法和Taqman探针的荧光PCR技术结合而成，其每个位点仅用一条Taqman探针。本发明人经过反复比较和验证，确定了所述探针的理想位置。TaqMan探针法的核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号，由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。本发明中的Past-PCR方法，将AS-PCR和Taqman荧光PCR两种方法完美结合，并使两者的优点得到了极度的发挥，在AS-PCR方法中，靠引物设计和加入特异的“提高检测特异性的序列片段”成功消除了非特异性扩增，使得结果判断呈现出“有或无”方式，即有就有，没有就没有，使得结果的判断简单而准确，这是对过去的AS-PCR方法最大的改进，也是对AS-PCR方法为人所诟病的有效弥补，从而将AS-PCR方法的优点发挥到了极致，是该方法所能达到的最高境界。众所周知，Taqman荧光PCR具有密闭性检测的特点，无需反应完结后的处理，不仅节省了时间，而且减少了PCR产物污染的风险，所述提高检测特异性的序列片段的特异性阻断和探针的第二次识别靶序列保障了检测的特异性和可靠性，还可用于对基因的定量检测，达到了临床使用标准等优点。

本发明的Past-PCR方法的示意图如图15所示，上游引物组Forward，下游引物组Rerverse。对应于突变位点，还在上游和下游分别设计提高检测特异性的序列片段。并且，Taqman荧光探针位于上游引物组附近，位于位置的探针是理想的，仅利用该一条探针即可同时兼顾到rs429358位点和rs7412位点的检测。

基于本发明开发和优化的Past-PCR方法，本发明提供了用于检测ApoE基因多态性的试剂盒，其主要包括：(a)高度特异的等位基因特异性引物；(b)携带可检测标记的检测探针；(c)与等位基因特异性引物配对的另一条特异性引物。(d)具有阻断非特异性扩增功能的所述提高检测特异性的序列片段。为了避免检测时的非特异性干扰，所述试剂盒中还提供了一系列“提高检测特异性的序列片段”，优选地，其是具有SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列的4条序列片段。该4条序列片段，分别对应rs429358SNP位点和rs7412SNP位点，在反应过程中可特异地与其对应的序列结合，阻断扩增，防止了因引物非特异性结合导致的非特异性扩增荧光曲线。

在本发明的优选方式中，所述试剂盒中还包括(但不限于)：DNA扩增试剂，PCR扩增缓冲液，TaqMan Master Mix(含内参ROX染料)混合液，空白对照，唾液拭子，PCR反应管等；以及还可包括说明操作方法的使用说明书，从而有利于本领域技术人员方便地实施检测。

本发明还提供了一种检测APOE基因SNP位点rs429358和rs7412的多态性的方法，所述方法包括：(i)以待测样品为模板，以前面所述的试剂盒中的试剂(引物、探针及所述提高检测特异性的序列片段)进行PCR扩增；(ii)分析PCR扩增产物，确定待测样品中APOE基因SNP位点rs429358和rs7412的多态性。

本发明所述的方法，可以是临床诊断方法，也可以是非诊断性的方法。例如，仅在实验室中应用该方法分析APOE的变异情况，进行研究分析，这种实施方式不面对患者，不给出诊断结果，属于非诊断性的方法。

本发明优化的检测方法和检测试剂，准确度、灵敏度、稳定性均非常理想，对于口腔取样样品这类难检样品也能够获得准确的结果。应理解，本发明的试剂盒，还可以适用于多种口腔取样样本以外的其它来源的样本，例如血液样本、组织样本等。

本发明提供的APOE检测引物、检测试剂盒和检测方法，解决了现有技术的测序结果中存在较高比例的等位基因非特异性交叉扩增的技术问题，大大增加了APOE等位基因特异性引物PCR区分不同等位基因位点的能力，使不同位点间的非特异性交叉扩增的可能性降到最低，能够做到真正“有或无”式的扩增，不仅有很好的特异性，也具有非常好的灵敏度。本发明的方法和试剂还具有检测速度快的特点，整个过程能在1小时20分钟内完成。

本发明提供的APOE检测引物、检测试剂盒和检测方法，仅使用一条Taqman探针，别无其他诸如封闭探针等，可有效地控制试剂盒的成本。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、引物设计

设计检测ApoE基因多态性的引物，包括检测rs429358位点和rs7412位点的两组引物。

上游引物包括：

5’-CGCACATGCAGGACGTGT-3’(SEQ ID NO:1)

5’-GCGCACATGCAGGACGAGT-3’(SEQ ID NO:2)

5’-CGCGCACATGCAGGACGTTT-3’(SEQ ID NO:3)

5’-CGCACATGCAGGACGAGC-3’(SEQ ID NO:4)

5’-GCGCACATGCAGGACGTGC-3’(SEQ ID NO:5)

5’-CGCGCACATGCAGGACGTTC-3’(SEQ ID NO:6)

下游引物序列为：

5’-TGCTAGACTGCGAGGTA-3’(SEQ ID NO:7)

5’-CTGCTAGACTGCGAGTCA-3’(SEQ ID NO:8)

5’-CCTGCTAGACTGCGAGGCA-3’(SEQ ID NO:9)

5’-TGCTAGACTGCGAGGCG-3’(SEQ ID NO:10)

5’-CTGCTAGACTGCGAGGTG-3’(SEQ ID NO:11)

5’-CCTGCTAGACTGCGAGTCG-3’(SEQ ID NO:12)

设计阻断非特异性扩增的四个序列片段(b1～b4)：

b1：5’-GGCTCGGCGCGCACATGCAGGACGTGC(SEQ ID NO:13)-ddC-3’

b2：5’-GGCCGCGGCCTGCTAGACTGCGAGGCG(SEQ ID NO:14)-ddC-3’

b3：5’-GGCTCGGCGCGCACATGCAGGACGTGT(SEQ ID NO:15)-ddC-3’

b4：5’-GGCCGCGGCCTGCTAGACTGCGAGGCA(SEQ ID NO:16)-ddC-3’

设计Taqman探针，核酸探针的序列为：

5’FAM-CGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGA(SEQ ID NO:17)-BHQ1 3’。

具体的检测过程为：

1.基因组DNA提取：

a、利用拭子采样，把已采样拭子转移至含有300μl保护液的2ml离心管中，盖上管盖标记样品名称。

b、加入300μl Buffer ATL和20μl Proteinase K，涡旋混匀。56℃振荡温育1小时。

c、短暂离心去除管盖上液体。加入600μl Buffer AL，涡旋15秒混匀。70℃温浴10分钟。此时可将Buffer AE分装至1.5ml离心管置70℃温浴着备用。

d、短暂离心去除管盖上液体。加入600μl无水乙醇，涡旋15秒混匀。

e、短暂离心去除管盖上液体。把HiPure DNA Mini Column I吸附柱装在2ml收集管中，吸附柱管盖标记样品名称，移液枪调至750μl将混合液(包括沉淀)转移至柱子中。10,000x g离心1分钟。

f、倒弃滤液，收集管口在干净纸巾上按压去除残留液滴，把柱子重新装回收集管中。转移剩余的混合液(包括沉淀)至柱子中。10,000x g离心1分钟。

g、弃去废液和收集管。把柱子装在新的收集管中。加入500μl Buffer GW1(已用乙醇稀释，用前摇匀)至柱子上。10,000x g离心1分钟。

h、倒弃滤液，收集管口在干净纸巾上按压去除残留液滴，把柱子重新装回收集管中。加入650μl Buffer GW2(已用乙醇稀释，用前摇匀)至柱子中。10,000x g离心1分钟。

i、倒弃滤液，收集管口在干净纸巾上按压去除残留液滴，把柱子重新装回收集管中。10,000×g离心2分钟。

j、弃去废液和收集管。将柱子装在新的1.5ml离心管中，开盖晾干3分钟。

k、加入50μl已预热至70℃ Buffer AE至柱子的膜中央。静置3分钟，10,000×g离心1分钟。

l、丢弃DNA结合柱，利用全波长扫描式多功能读数仪中的DNA浓度测量程序测量所提DNA的浓度，取一部分DNA溶液用无菌去离子水稀释至2ng/ml，作为后续PCR检测模板，剩余DNA溶液存放于2～8℃或-20℃。

2、PCR反应体系配制

根据ApoE基因的多态性，与三种检测试剂(ε2试剂、ε3试剂和ε4试剂)，分别用于人群中存在6种不同ApoE基因型ε2/ε2，ε3/ε3，ε4/ε4，ε2/ε3，ε2/ε4和ε3/ε4的检测。6种已知ApoE基因型DNA已知样本(ε2/ε2DNA已知样本、ε3/ε3DNA已知样本、ε4/ε4DNA已知样本、ε2/ε3DNA已知样本、ε2/ε4DNA已知样本和ε3/ε4DNA已知样本)作为对照。

其中ε2试剂包括：

a、对应ApoEε2等位基因型SNP位点rs429358SNP核酸形式的正向引物p112T-2(5’-CGCACATGCAGGACGTGT-3’(SEQ ID NO:1))。

b、对应ApoEε2等位基因型SNP位点rs7412反向引物核酸形式的反向引物p158T-2(5’-CCTGCTAGACTGCGAGGCA-3’(SEQ ID NO:9))。

c、荧光探针(5’FAM-CGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGA(SEQ ID NO:17)-BHQ1 3’)。

d、对应ApoEε4等位基因型SNP位点rs429358SNP核酸形式的b1和对应ApoEε3ε4等位基因型SNP位点rs7412核酸形式的b2(b1核酸序列为5’-GGCTCGGCGCGCACATGCAGGACGTGC(SEQ ID NO:13)-ddC3’；b2核酸序列为5’-GGCCGCGGCCTGCTAGACTGCGAGGCG(SEQ ID NO:14)-ddC3’)。能够排除掉ε3、ε4相关的非特异性影响。

e、PCR预混液TaqMan Genotyping Master Mix。

其各成分具体剂量为：

其中ε3试剂包括：

a、对应ApoEε3等位基因型SNP位点rs429358SNP核酸形式的正向引物p112T-3(5’-CGCACATGCAGGACGTGT-3’(SEQ ID NO:1))。

b、对应ApoEε3等位基因型SNP位点rs7412反向引物核酸形式的反向引物p158C-3(5’-TGCTAGACTGCGAGGCG-3’(SEQ ID NO:10))。

c、荧光探针(5’FAM-CGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGA(SEQ ID NO:17)-BHQ13’)。

d、对应ApoEε4等位基因型SNP位点rs429358SNP核酸形式的b1和对应ApoEε2等位基因型SNP位点rs7412核酸形式的b4(b1核酸序列为5’-GGCTCGGCGCGCACATGCAGGACGTGC(SEQ ID NO:13)-ddC3’；b4核酸序列为5’-GGCCGCGGCCTGCTAGACTGCGAGGCA(SEQ ID NO:16)-ddC3’)；能够排除掉ε2、ε4相关的非特异性影响。

e、PCR预混液TaqMan Genotyping Master Mix。

其各成分具体剂量为：

其中ε4试剂包括：

a、对应ApoEε4等位基因型SNP位点rs429358SNP核酸形式的正向引物p112C-4(5’-GCGCACATGCAGGACGTGC-3’(SEQ ID NO:5))。

b、对应ApoEε4等位基因型SNP位点rs7412反向引物核酸形式的反向引物p158C-4(5’-TGCTAGACTGCGAGGCG-3’(SEQ ID NO:10))。

c、荧光探针(5’FAM-CGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGA(SEQ ID NO:17)-BHQ1 3’)。

d、对应ApoEε2ε3等位基因型SNP位点rs429358SNP核酸形式的b3和对应ApoEε2等位基因型SNP位点rs7412核酸形式的b4(b3核酸序列为5’-GGCTCGGCGCGCACATGCAGGACGTGT(SEQ ID NO:15)-ddC3’；b4核酸序列为5’-GGCCGCGGCCTGCTAGACTGCGAGGCA(SEQ ID NO:16)-ddC3’)；能够排除ε2、ε3相关的非特异性影响。

e、PCR预混液TaqMan Genotyping Master Mix。

其各成分具体剂量为：

使用ApoE基因分型检测试剂需要20μl反应体系就可以充分检测到信号。

ε2基因检测的PCR反应体系为：

ε2阳性对照检测体系1：

ε2试剂： 19μl

ε2/ε2DNA已知样本： 1μl

ε2阳性对照检测体系2：

ε2试剂： 19μl

ε2/ε3DNA已知样本： 1μl

ε2阳性对照检测体系3：

ε2试剂： 19μl

ε2/ε4DNA已知样本： 1μl

ε2阴性对照检测体系1：

ε2试剂： 19μl

ε3/ε3DNA已知样本： 1μl

ε2阴性对照检测体系2：

ε2试剂： 19μl

ε4/ε4DNA已知样本： 1μl

ε2阴性对照检测体系3：

ε2试剂： 19μl

ε3/ε4DNA已知样本： 1μl

ε3基因检测的PCR反应体系为：

ε3阳性对照检测体系1：

ε3试剂： 19μl

ε3/ε3DNA已知样本： 1μl

ε3阳性对照检测体系2：

ε3试剂： 19μl

ε2/ε3DNA已知样本： 1μl

ε3阳性对照检测体系3：

ε3试剂： 19μl

ε3/ε4DNA已知样本： 1μl

ε3阴性对照检测体系1：

ε3试剂： 19μl

ε2/ε2DNA已知样本： 1μl

ε3阴性对照检测体系2：

ε3试剂： 19μl

ε4/ε4DNA已知样本： 1μl

ε3阴性对照检测体系3：

ε3试剂： 19μl

ε2/ε4DNA已知样本： 1μl

ε4基因检测的PCR反应体系为：

ε4阳性对照检测体系1：

ε4试剂： 19μl

ε4/ε4DNA已知样本： 1μl

ε4阳性对照检测体系2：

ε4试剂： 19μl

ε2/ε4DNA已知样本： 1μl

ε4阳性对照检测体系3：

ε4试剂： 19μl

ε3/ε4DNA已知样本： 1μl

ε4阴性对照检测体系1：

ε4试剂： 19μl

ε2/ε2DNA已知样本： 1μl

ε4阴性对照检测体系2：

ε4试剂： 19μl

ε3/ε3DNA已知样本： 1μl

ε4阴性对照检测体系3：

ε4试剂： 19μl

ε2/ε3DNA已知样本： 1μl

3、PCR扩增反应

将待测样品即人口腔上皮细胞提取的基因组DNA与已知ApoE基因型的DNA已知样品分别加入ε2，ε3或ε4基因检测的20μl PCR反应体系中。用灭菌的去离子水作为整个PCR体系的阴性对照。在PCR八连管中配制好所有PCR反应体系后，用PCR封口板封闭好PCR板，残留在PCR板孔壁上液体用高速离心机离心到管底并排除气泡。然后，将该PCR八连管放入7500Real-Time PCR system仪器中，打开7500software V2.0.6软件，选择软件中的Genotyping模块，在Plate setup中设置对应放入PCR板上每孔的检测内容。然后在Runmethod中设置PCR反应程序及反应体系，这些项目设置完毕后，便可运行程序。该程序默认PCR反应之前先在60℃条件下预读取本底荧光强度值再进行PCR扩增以消除背景荧光值。待PCR反应完成之后，仪器可自动在60℃条件下收集荧光数据。反应程序如下：

八连管加样顺序如下表：

ε2试剂	ε3试剂	ε4试剂
			ε2/ε2	ε2/ε2	ε2/ε2
ε2/ε3	ε2/ε3	ε2/ε3
			ε2/ε4	ε2/ε4	ε2/ε4
ε3/ε3	ε3/ε3	ε3/ε3
			ε3/ε4	ε3/ε4	ε3/ε4
ε4/ε4	ε4/ε4	ε4/ε4
			NTC	NTC	NTC

4、结果判读

根据荧光曲线可以准确地判读出所选样品的基因型，只在一种试剂体系中出现荧光扩增曲线则样本基因型为相应体系对应基因型的纯合个体，在两个不同实际体系中均有扩增的则为相应体系对应的两个基因型的杂合个体。

ε2/ε2型Apoε基因的扩增曲线图如图1；ε2/ε3型Apoε基因的扩增曲线图如图2；ε2/ε4型Apoε基因的扩增曲线图如图3；ε3/ε3型Apoε基因的扩增曲线图如图4；ε3/ε4型Apoε基因的扩增曲线图如图5；ε4/ε4型Apoε基因的扩增曲线图如图6；阴性对照的PCR扩增曲线图如图7。

不加所述提高检测特异性的序列片段的情况下，ε2/ε2型Apoε基因的扩增曲线图如图8；ε2/ε3型Apoε基因的扩增曲线图如图9；ε2/ε4型Apoε基因的扩增曲线图如图10；ε3/ε3型Apoε基因的扩增曲线图如图11；ε3/ε4型Apoε基因的扩增曲线图如图12；ε4/ε4型Apoε基因的扩增曲线图如图13；阴性对照的PCR扩增曲线图如图14。

由上述结果可见，因加入了所述提高检测特异性的序列片段，可以分别与ε2试剂体系，ε3试剂体系，ε4试剂体系中不相对应的样本基因序列特异性结合，阻断其扩增。在不同体系中杜绝了因引物3’非特异性结合所造成的非特异性扩增。大大提高了精确度，消除了假阳性的出现。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海惠皓医疗科技有限公司

<120> 诊断脂质代谢相关疾病或阿尔茨海默病标志物的方法

<130> 183569

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 1

cgcacatgca ggacgtgt 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 2

gcgcacatgc aggacgagt 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 3

cgcgcacatg caggacgttt 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 4

cgcacatgca ggacgagc 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

gcgcacatgc aggacgtgc 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

cgcgcacatg caggacgttc 20

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

tgctagactg cgaggta 17

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

ctgctagact gcgagtca 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

cctgctagac tgcgaggca 19

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

tgctagactg cgaggcg 17

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

ctgctagact gcgaggtg 18

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

cctgctagac tgcgagtcg 19

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 13

ggctcggcgc gcacatgcag gacgtgc 27

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 14

ggccgcggcc tgctagactg cgaggcg 27

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

ggctcggcgc gcacatgcag gacgtgt 27

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 16

ggccgcggcc tgctagactg cgaggca 27

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 探针(Probe)

<400> 17

cgcctggtgc agtaccgcgg cga 23

Claims (10)

1.检测载脂蛋白E基因多态性的试剂，其特征在于，所述的试剂包括：

(a)前引物，其包括分别具有SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的6条引物；

(b)后引物，其包括分别具有SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列的6条引物；和

(c)针对(a)和(b)引物的扩增产物的1条探针，所述的探针具有SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述的试剂还包括提高检测特异性的序列片段，其是具有SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列的4条序列片段。

3.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述的探针为Taqman探针。

4.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括：

DNA扩增试剂，

PCR扩增缓冲液，

TaqMan Master Mix混合液，和/或

空白对照。

5.如权利要求1～4任一所述的试剂，其特征在于，所述试剂置于试剂盒中，且该试剂盒中还包括唾液拭子和/或阐明操作方法的使用说明书。

6.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述的基因多态性是载脂蛋白E基因SNP位点rs429358和rs7412的多态性。

7.权利要求1～4任一所述的试剂的用途，用于制备检测检测载脂蛋白E基因多态性的试剂盒。

8.一种检测载脂蛋白E基因SNP位点rs429358和rs7412的多态性的方法，其特征在于，所述方法包括：

(i)以待测样品为模板，以权利要求1～3任一所述的试剂进行PCR扩增；

(ii)分析PCR扩增产物，确定待测样品中载脂蛋白E基因SNP位点rs429358和rs7412的多态性。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的待测样品为取自于口腔的体液样品；较佳地，其为含有口腔上皮细胞的样品。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，如下判别多态性：

rs429358为T，rs7412为T，载脂蛋白E基因型为ε2型；

rs429358为T，rs7412为C，载脂蛋白E基因型为ε3型；

rs429358为C，rs7412为C，载脂蛋白E基因型为ε4型。