CN117089625A - 一种特异性人源细胞基因片段及检测其的引物、探针和应用 - Google Patents
一种特异性人源细胞基因片段及检测其的引物、探针和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种特异性人源细胞基因片段及检测其的引物、探针和应用，通过NCBI网站及其BLAST序列对比功能，得到notch2nlb基因上长度为277bp的一段人源特异性基因片段。并通过qPCR对临床前动物器官组织、血液样本以及其它非人源器官组织、血液样本中的人源基因进行定量检测。本发明采用的特异性基因片段及qPCR检测方法特异性高、灵敏度强、检测所需时间短且重复性好。为快速定量检测特异性人源基因提供有力的技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学分子检测技术领域，具体涉及一段特异性人源细胞基因片段及其引物探针以及应用。
背景技术
近年来，人源干细胞及免疫细胞越来越多应用于医学领域，由于其突出的生物学、医学作用，已成为21世纪生物医学领域的热点。人源干细胞治疗药物在治疗皮肤损伤、内脏损伤、脊髓损伤、急性移植物抗宿主病方面具有较好的临床疗效；人源免疫细胞治疗药物在抑制肿瘤、增强免疫力方面的效果也引起人们的高度重视。这些都表明人源细胞治疗药物在科研、临床领域具有巨大的研究和应用价值。目前在国内外已有多款人源细胞治疗药物进入临床试验阶段甚至批准上市。在细胞工程、基因工程、人工智能等技术迅猛发展的背景之下，人源细胞治疗药物必然在临床药物领域占有一席之地。但作为新兴的临床医学治疗手段，其药物代谢动力学方面的研究尚少。在科研及临床前领域常使用动物作为载体探索人源细胞在体内(外)的分布、代谢等。
解决检测科研、临床前实验动物组织、体液样本中微量的人源细胞的常用方案为实时荧光定量PCR法(RT-qPCR)。其原理是提取实验动物的器官组织、体液样本中的全基因组DNA，使用RT-qPCR检测全基因组DNA样本中人源特异性基因的含量，以达到和满足检测目的以及高特异性、高灵敏度的要求。
目前，尚无检测实验动物组织、体液中人源特异性基因的标准方案。常用的检测方案存在如下缺陷：1)人源特异性基因片段较少，无法满足其特异性的要求。人类基因组DNA序列与常用的实验动物(食蟹猴、比格犬、大小鼠、小型猪、猫、鸡、兔)相似性均在85％以上。2)人源基因组DNA中存在的内含子序列，介于外显子之间，其为大量重复无意义序列，致使大量基因组DNA无法作为检测的目的基因且设计引物探针难度极大。3)随着分子生物学的发展，先前作为人源细胞特异性基因在其它种类生物中也有所发现。其基因的人源特异性有待进一步商榷。
近几年，研究人员新发现了一个与大脑皮层神经元发生有关的人源特异性重复基因：notch2nlb基因(notch 2N-terminal like B，gene ID:100996763)，该基因位于人类1号染色体上，是一种在人类进化过程中新近分化出来的基因。该基因在人类整个大脑皮层发育期间高度稳定表达。notch2nlb基因可激活notch信号通路，促使神经元生长，促使大脑神经皮层面积扩大。美国科学家研究发现notch2nlb基因异常直接导致人类巨头症或小头症的出现。比利时科学家经过比对分析发现，notch2nlb基因仅在人类中表达。具有极强的特异性。现有技术中，尚未有将notch2nlb基因应用于人源细胞检测中的研究，因此亟需一种准确、快速、特异性强、便捷的RT-qPCR检测基因片段、引物探针以及方法来解决人源细胞在实验动物体内(外)分布、代谢等情况的难题。
发明内容
本发明的目的在于找到一种人源特异性基因片段，在此基础上设计出特异性的引物和探针以及用于特异性检测动物组织中人源细胞的方法。该方法灵敏度高、准确度好，且操作简便。可用于科研、临床前动物组织、体液样本中人源细胞基因的定量检测。
为了实现上述目的，本发明技术方案如下：一种特异性人源基因片段，所述的基因片段为SEQ ID NO.1所示的碱基序列。
所述人源细胞特异性片段位于notch2nlb基因。
一种特异性检测权利要求1所述的人源基因片段的引物、探针，所述的引物为SEQIDNO.2所示的Notch-F的碱基序列和SEQ ID NO.3所示的Notch-R的碱基序列，所述的探针为SEQ ID NO.4所示的Probe的碱基序列。
所述探针5’端标记有荧光报告基团，所述探针3’端标记有淬灭基团；所述荧光报告基团为FAM、TET、VIC、JOE和HEX中的至少一种，所述淬灭基团为荧光淬灭基团为TAMRA、DABCYL和BHQ中的至少一种。
所述荧光报告基团为FAM，所述淬灭基团为TAMRA。
一种上述的特异性检测人源基因片段的引物、探针在qPCR定量检测人源基因中的应用。
一种上述的特异性人源基因片段的载体。
一种定量检测人源细胞特异性基因片段的工具，包含上述的引物、探针，上述的人源细胞特异性基因片段，上述的人源细胞特异性基因片段的载体。
所述工具为独立试剂或试剂盒。
一种定量检测样品所含人源细胞特异性基因片段含量的方法，包括以下步骤：
(1)选择人源细胞特异性高的基因片段，并根据其设计引物、探针；
(2)获取包含步骤(1)所述的人源细胞特异性基因片段的质粒标准品；
(3)使用步骤(2)获得的质粒标准品建立标准曲线；
(4)使用步骤(2)获得的质粒标准品与步骤(1)获得的引物、探针检测待测样品中人源细胞特异性基因片段的含量。
与现用技术相比，本发明的优势在于：
(1)本发明所述人源细胞特异性基因片段具有较强的特异性，其在食蟹猴、比格犬、大小鼠、小型猪、猫、鸡、兔、鸟类等动物中均无非特异性扩增。
(2)本发明所述RT-qPCR定量检测人源细胞特异性基因的方法具有较高的灵敏度，其检测下限为1.23×101copies/μL。
(3)本发明所述RT-qPCR定量检测人源细胞特异性基因的方法具有较高的精密度，由标准质粒绘制的标准曲线稳定。
(4)本发明所述RT-qPCR定量检测人源细胞特异性基因的方法操作简便省时，RT-qPCR所需时间小于1小时。
附图说明
图1为实施例1notch2nlb引物探针qPCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图(M为Marker；MSC为人源脐带间充质干细胞基因组DNA使用notch2nlb引物探针qPCR扩增产物的电泳条带；N为无菌水空白对照)。
图2为实施例4标准曲线图。
图3为实施例4标准质粒qPCR扩增曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明，下述实施例不用于限制本发明，仅用于阐明本发明。以下实施例中所涉及的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获取。
本发明提供了一种定量检测人源细胞基因片段的引物、探针。
具体地，所述引物包含Notch-F和Notch-R，所述的Notch-F碱基序列如SEQ IDNO.2所示；所述的Notch-R碱基序列如SEQ ID NO.3所示；所述的Notch-P碱基序列如SEQIDNO.4所示。
进一步具体地，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团；经过筛选，所述荧光报告基团为FAM、TET、VIC、JOE和HEX中的至少一种，进一步优选为FAM，经过筛选，所述荧光淬灭基团为TAMRA、DABCYL和BHQ中的至少一种，进一步优选为TAMRA。
又一方面，本发明提供了上述引物探针组合在RT-qPCR定量检测人源细胞基因片段中的应用。
又一方面，本发明提供了一种人源细胞特异性基因片段在RT-qPCR定量检测人源细胞特异性基因中的应用。
具体地，所述的人源细胞特异性基因片段碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步具体地，所述人源细胞特异性基因片段位于notch 2N-terminal like B(notch2nlb，NCBI编号为Gene ID:100996763)基上，与食蟹猴、比格犬、大小鼠、小型猪、猫、鸡、兔等动物无相同序列，特异性高。
又一方面，本发明提供了一种包含上述人源细胞特异性基因片段的载体，所述载体包括但不限于质粒、病毒、噬菌体。优选地，所述载体为质粒，将所述的人源细胞特异性基因片段碱基序列如SEQ ID NO.1交由第三方公司重组在其质粒载体上，形成包含人源细胞特异性基因片段的标准质粒。
又一方面，本发明提供了上述包含人源细胞特异性基因片段的载体在RT-qPCR定量检测人源细胞特异性基因中的应用。
又一方面，本发明提供了上述引物探针组合、人源细胞特异性基因片段、包含人源细胞特异性基因片段的载体在制备RT-qPCR定量检测人源细胞特异性基因片段工具中的应用。
具体地，所述工具为独立试剂或试剂盒。
又一方面，本发明提供了一种RT-qPCR定量检测人源细胞特异性基因的工具，所述的工具包含引物探针组合、人源细胞特异性基因片段、包含人源细胞特异性基因片段的载体。
又一方面，本发明提供了一种RT-qPCR定量检测人源细胞特异性基因的方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)获得一段人源细胞特异性基因片段；
(2)设计步骤(1)中人源细胞特异性基因片段的引物、探针；
(3)获得包含步骤(1)中人源细胞特异性基因片段的标准质粒；
(4)根据步骤(3)获得的质粒，逐级稀释，绘制标准曲线；
(5)根据标准曲线定量检测待测样品中人源细胞特异性基因片段的含量。
具体地，步骤(1)中，所述的人源特异性高的基因片段可通过NCBI信息中心获取，并通过NCBI网站BLAST功能对该序列进行比对分析。
具体地，步骤(2)中所述的引物包含Notch-F和Notch-R。所述的Notch-F终浓度为：500nmol/L。所述的Notch-R终浓度为：500nmol/L。所述的Notch-P终浓度为：500nmol/L。进一步地，所述的5’端标记有荧光报告基团FAM，所述探针的3’端标记有淬灭基团TAMRA。
步骤(3)中，将所述的人源细胞特异性基因片段碱基序列如SEQ ID NO.1交由苏州金唯智生物科技有限公司重组在其质粒载体(pUC-GW-Amp)上，形成包含人源细胞特异性基因片段的标准质粒。
具体地，步骤(4)中标准质粒浓度范围为1.23×101-1.23×109copies/μL。所述的标准曲线可采用上述标准质粒浓度范围内所获得的不同浓度标准质粒通过qPCR方法获得。
进一步具体地，在步骤(4)中，所述的qPCR反应体系中，qPCR反应模板为标准质粒，其浓度范围为1.23×101-1.23×107copies/μL，所述的引物包含Notch-F和Notch-R。所述的Notch-F终浓度为：500nM。所述的Notch-R终浓度为：500nM。所述的Notch-P终浓度为：500nM。
具体地，步骤(5)中所述的定量检测人源细胞特异性基因的方法通过RT-qPCR检测得到。
进一步具体地，步骤(5)中所述的RT-qPCR定量检测人源细胞特异性基因的反应体系中，Notch-F终浓度为：500nM。所述的Notch-R终浓度为：500nM。所述的Notch-P终浓度为：500nM。待测样本终浓度为0-3μg/反应。
实施例1人源细胞特异性基因片段检测试剂盒
1.人源细胞特异性基因片段：通过NCBI网站确定notch2nlb基因特异性。通过BLAST序列比对功能获得人源细胞的特异性基因片段。
人源细胞的特异性基因片段序列(SEQ ID NO.1)：
5’-TATCGCTTATTACTGTCCTAAATTATTTTATTTATTAATTTTTTAGCCACCTTTCTCTTATAGAAATA AGGTTCCTGAGGACAGGGAGTTTATTCTGTATACTACGGTATCCCTGACATCAGGGCTTGTGCCTGCCGATAGTAG ATGCTTTCTAAATATGTTCTGAATATTAGATAGCTAGTTCCCAAATGCACTGCACTGAAAGTGTATGAAAATTGGA AATTGGCTTCTAGATTTTTGTATTATATTGCCAAATGATGGAGTGATGAGATTGAAA-3’
2.根据人源特异性基因片段序列设计特异性引物(Notch-F、Notch-R)及探针(Notch-P)，序列如下：
Notch-F(SEQ ID NO.2)：5’-TATCGCTTATTACTGTCCTA-3’
Notch-R(SEQ ID NO.3)：5’-TTTCAATCTCATCACTCCAT-3’
Notch-P(SEQ ID NO.4)：5’-FAM TGCCTGCCGATAGTAGATGCTTTC TAMRA-3’
该引物经NCBI网站的BLAST功能验证，仅能扩增人源特异性基因片段。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，发现扩增产物为目的基因(图1)。
琼脂糖凝胶电泳步骤如下：
①配制80ml 2.5％琼脂糖凝胶：称2g琼脂糖置于锥形瓶中，加入80ml 1×TBE缓冲液。加热至琼脂糖完全融化，摇匀。
②胶板制备：固定好制胶模与电泳梳，将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶溶液混匀倒入制胶膜中。室温静置直至凝胶完全凝固。垂直拔出电泳梳，从胶模中取出凝胶，放入电泳槽中。添加1×TBE缓冲液，淹没过凝胶。
③按照表1配制反应体系，室温避光反应8min。用20μL微量移液器在凝胶孔内加样品。
表1琼脂糖凝胶电泳待测样品反应体系
| 试剂名称 | 含量(μL) |
| 荧光染料 | 1 |
| Load buffer 6× | 3 |
| 扩增产物 | 5 |
| DNase free水 | 11 |
④加样后，连接电极，进行电泳。设置电压120V，样品由负极向正极方向移动。当指示条带移动到距离胶板下沿1cm左右时，停止电泳。
⑤电泳完毕后，取出凝胶。采用凝胶成像系统拍照保存。
实施例2qPCR反应体系的建立
qPCR反应体系中，采用控制变量法来研究Notch-F、Notch-R、Notch-P的最适反应体积。设置的体积梯度分别为：0.75、1、1.25、1.50μL，发现当Notch-F、Notch-R、Notch-P的体积均为1μL时，qPCR反应产生的Cq值最低，且Notch-F、Notch-R、Notch-P的浓度最低。
确定qPCR的最佳反应体系为：标准品1μL，Notch-F 1μL，Notch-R 1μL，Notch-P1μL，PerfectStart IIProbe qPCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司，货号：AQ711)10μL，DNase free水，至20μL。
反应条件：94℃预变性30s，1个循环；94℃变性5s，60℃复性/延伸30s，45个循环。
实施例3标准曲线的建立
标准质粒10倍系列稀释，获得7个标准样品，即标准曲线不同浓度点为1.23×101，1.23×102，1.23×103，1.23×104，1.23×105，1.23×106，1.23×107copies/μL。以标准品浓度的对数为X轴，以qPCR扩增的Cq值为Y轴，绘制标准曲线(图2)。
实施例4特异性检测
本实施例中使用实施例1的引物探针，实施例2的qPCR反应体系，实施例3的标准曲线分别检测人源细胞、食蟹猴、比格犬、大小鼠、小型猪、猫、鸡、兔的全基因组DNA，其检测结果为人源细胞DNA样本为阳性，其余非人源动物DNA样本均为阴性，无非特异性扩增。表明本发明中所述的人源细胞特异性基因组片段及其引物探针具有较强的特异性。
实施例5灵敏度的检测
本发明在重组质粒标准品浓度为1.23×100-1.23×107copies/μL范围内定量检测人源基因，发现标准品1.23×101-1.23×107copies/μL的浓度，重复的5个样本均有特异性扩增。标准品1.23×100copies/μL的浓度，重复的5个样本未全部扩增(表2)。本发明最低检测限为12.3copies/μL。本发明标准曲线的相关系数(R2)为0.99，标准差在0.10-0.20范围内，表明本发明特异性检测方法灵敏度良好。
表2灵敏度检测结果
注：“—”表示样本无扩增信号。
实施例6准确度的检测
将重组质粒标准品稀释至4个浓度，即1.23×107、1.23×105、1.23×103、1.23×101copies/μL，对4个浓度样本进行检测，每个浓度样本做5个平行，每个平行重复3次，取平均值作为实测值，计算其准确度(表3)。根据表3检测结果可知，4个浓度样本的准确度介于95-115％之间。表明本发明准确度良好。
表3准确度检测结果
实施例7精密度的检测
将重组质粒标准品稀释至4个浓度，分别检测4个浓度质粒样本1.23×107、1.23×105、1.23×103、1.23×101copies/μL的qPCR扩增结果，每个质粒样本重复5次，进行三次重复实验，计算其相对标准偏差(RSD)，由表4结果可见3批次的相对标准偏差RSD均小于0.2，表明本发明精密度良好。
表4精密度检测结果
实施例8人源脐带间充质干细胞治疗大鼠皮肤损伤体内组织分布
实验所用动物为大鼠，利用X射线照射构建大鼠皮肤损伤模型。造模后的小鼠随机分为2组，干细胞凝胶组与辅料对照组。干细胞凝胶组分为5个时间点，每个时间点6只。辅料对照组6只。
人脐带源间充质干细胞以2×104个/cm2皮肤给药大鼠，分别于用药后0.5h、12h、24h、48h和72h，处死大鼠，采集大鼠血液、皮肤(伤口)、肝、心、脾、肺、肾等组织。采用TakaRaMiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit试剂盒(takara，Cat：9765)按照使用说明书提取动物组织基因组DNA，作为待测样品。以人源间充质干细胞基因组DNA为阳性对照，无菌水为阴性对照。进行qPCR检测。将qPCR检测得到的数据代入标准曲线中，计算出待测样品中人源基因片段的含量。
发现大鼠全血DNA样品中未检测到notch2nlb基因表达。大鼠皮肤损伤组织DNA样品中治疗后0.5h均检测出notch2nlb基因表达，12h部分样品检测出notch2nlb表达，24h、48h、72h和涂抹辅料后0.5h均未检测出notch2nlb基因表达。
实施例9人源脐带间充质干细胞治疗大鼠脊髓损伤体内组织分布
模型构建方法参照药效学研究报告。该实验共计36只大鼠入组，分为3组，即：假手术组、鞘内注射组与静脉注射组。各组大鼠模型经治疗前于时间点(24h)取全血，采样数量为36只/时间点；各组大鼠模型经治疗后于时间点(3d、5d、7d)取全血，采样数量为36只/时间点；各组大鼠模型经治疗后于时间点(7d)取器官组织(心、肝、脾、肺、肾、脑、脊髓上段、脊髓中段、脊髓下段)，采样数量为36只/时间点，待测样品为提取各组大鼠全血和器官组织(心、肝、脾、肺、肾、脑、脊髓上段、脊髓中段、脊髓下段)的DNA，用TakaRa MiniBESTUniversal Genomic DNA Extraction Kit试剂盒(takara，Cat：9765)按照使用说明书提取动物组织基因组DNA，作为待测样品。以人源间充质干细胞基因组DNA为阳性对照，无菌水为阴性对照。进行qPCR检测。将qPCR检测得到的数据代入标准曲线中，计算出待测样品中人源基因片段的含量。
大鼠全血DNA样品中假手术组、鞘内注射组与静脉注射组于各时间点均未检测到notch2nlb基因表达。大鼠各器官组织DNA样品中假手术组未检测到notch2nlb基因表达；鞘内注射组个别动物器官组织DNA样品中检测出notch2nlb基因表达；静脉注射组个别动物脊髓上段、脊髓中段、脊髓下段DNA样品中检测出notch2nlb基因表达；其余动物各器官组织均未检测出notch2nlb基因表达。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此本发明的保护范围应以所附权利说明书要求为准。
Claims (10)
1.一种特异性人源基因片段，其特征在于，所述的基因片段为SEQ ID NO.1所示的碱基序列。
2.根据权利要求1所述特异性人源基因片段，其特征在于，所述人源细胞特异性片段位于notch2nlb基因。
3.一种特异性检测权利要求1所述的人源基因片段的引物、探针，其特征在于，所述的引物为SEQ ID NO.2所示的Notch-F的碱基序列和SEQ ID NO.3所示的Notch-R的碱基序列，所述的探针为SEQ ID NO.4所示的Probe的碱基序列。
4.根据权利要求3所述特异性检测人源基因片段的引物、探针，其特征在于，所述探针5’端标记有荧光报告基团，所述探针3’端标记有淬灭基团；所述荧光报告基团为FAM、TET、VIC、JOE和HEX中的至少一种，所述淬灭基团为荧光淬灭基团为TAMRA、DABCYL和BHQ中的至少一种。
5.根据权利要求4所述特异性检测人源基因片段的引物、探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM，所述淬灭基团为TAMRA。
6.一种权利要求3所述的特异性检测人源基因片段的引物、探针在qPCR定量检测人源基因中的应用。
7.一种包含权利要求1所述的特异性人源基因片段的载体。
8.一种定量检测人源细胞特异性基因片段的工具，其特征在于，包含权利要求3所述的引物、探针，权利要求1所述的人源细胞特异性基因片段，权利要求7所述的人源细胞特异性基因片段的载体。
9.根据权利要求8所述定量检测人源细胞特异性基因片段的工具，其特征在于，所述工具为独立试剂或试剂盒。
10.一种定量检测样品所含人源细胞特异性基因片段含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选择人源细胞特异性高的基因片段，并根据其设计引物、探针；
(2)获取包含步骤(1)所述的人源细胞特异性基因片段的质粒标准品；
(3)使用步骤(2)获得的质粒标准品建立标准曲线；
(4)使用步骤(2)获得的质粒标准品与步骤(1)获得的引物、探针检测待测样品中人源细胞特异性基因片段的含量。
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