CN117904327B - 特异性检测人源基因的生物标志物、引物对、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种特异性检测人源基因的生物标志物、引物对、试剂盒及其应用。通过本发明的引物对及试剂盒能够检测动物组织、血液等非人源样本中的人源基因，展现出卓越的特异性和灵敏度，为生物医学研究提供了新的有力工具。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，更具体地，本发明涉及特异性检测人源基因的生物标志物、引物对、试剂盒及其应用。
背景技术
细胞治疗是一种先进的医疗手段，通过利用或改造人体细胞来治疗疾病。它涉及从患者体内提取特定类型的细胞，在体外进行培养、扩增或基因编辑，然后重新植入患者体内，以修复受损组织、增强免疫功能或实现其他治疗效果。细胞治疗在多种疾病领域具有广阔应用前景，如癌症、神经性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病等，为一些传统治疗方法难以治愈的疾病提供了新的治疗途径。
细胞治疗尽管具有巨大的潜力和优势，但在实际应用中也面临着一系列的挑战。首先，细胞治疗的疗效和安全性需要得到充分的验证。尽管一些细胞治疗产品已经在某些疾病领域取得了显著的临床效果，但要想广泛应用，还需要经过更多严格的临床试验和长期观察，以确保其疗效和安全性。其次，细胞治疗的制备工艺和质量控制也是一大挑战。细胞治疗产品需要满足高标准的制备工艺和质量控制要求，以确保细胞的活性、纯度和稳定性。此外，细胞的来源、存储和运输等问题也需要得到妥善解决。
在药物开发过程中，动物实验是不可或缺的一部分。这是因为在进行人体试验之前，需要通过动物实验来评估药物的疗效和安全性。动物实验可以提供重要的数据，帮助研究人员了解药物在生物体内的吸收、分布、代谢和排泄情况，以及药物对机体的作用机制和可能产生的副作用。
在动物实验中，研究人员通常会选择与人类生理和疾病过程相似的动物模型来进行研究。这些动物模型可以是啮齿类动物（如小鼠、大鼠）、非啮齿类动物（如犬、猴）或其他动物。通过对这些动物进行实验，研究人员可以模拟人类疾病的发生和发展过程，评估药物对疾病的疗效和安全性。
细胞药物在生物体内的吸收、分布、代谢和排泄情况需要适当的方式来检测。qPCR是指在PCR反应中加入荧光基团，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量，该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。qPCR技术具有很高的灵敏度和特异性，可以准确地检测出样品中DNA或RNA的含量，因此qPCR技术广泛应用于生命科学领域，特别是在基因表达调控、疾病诊断、药物筛选和病原体定量测定等方面。
在细胞药物研发过程中，qPCR技术在动物试验中发挥着关键作用。qPCR技术可用于监测药物在动物体内的代谢和分布情况。研究人员可以通过检测药物相关基因的表达或药物代谢产物的含量，了解药物在动物体内的代谢途径和分布情况，为药物的优化和改进提供依据。
细胞药物研发过程中常用的模式动物如小鼠、大鼠、兔、犬、猴等，与人类基因组具有较高的相似性。例如小鼠和人类之间的基因组相似性非常高，小鼠的约99%的基因能在人类基因组中找到同源基因，而人类基因组的许多基因也能在小鼠基因组中找到对应序列。在基因组成方面，猴子与人的基因数量相近，大约在2万至2.5万之间，其中约95%至98%的基因组序列是相似的。这些相似的基因序列在许多方面都发挥着相同或相似的作用，包括构建身体、影响免疫系统、调节新陈代谢等。
目前主要依赖单个基因来检测人源性相关细胞的存在。然而，这些基因在常用的动物试验模式生物中往往存在相似或同源的序列，这增加了在动物试验中出现假阳性结果的风险，从而可能误导试验结论。因此，选择合适基因进行qPCR就显得十分关键。近年来，科研人员已经发现了一些人源特异性的基因，如FOXP2、TP53和TDRG1等，这些基因已被成功应用于检测人源性相关细胞的存在，为生物医学研究提供了新的工具和手段。尽管这些基因具有人特异性，但在常用的动物试验模式生物中往往存在相似或同源的基因。这种相似性可能导致试验结果出现假阳性，进而对试验结论的准确性产生不良影响。
发明内容
本发明为克服现有技术的不足，本发明人发现CHRFAM7A 是一种高度独特且进化特异性的人类基因，其复杂结构源于15号染色体在进化过程中的多次重排，包括复制、缺失和倒置等事件。这一基因位于15号染色体上，其5'端由3号染色体上的FAM7（ULK4）基因的4个外显子复制而来，而3'端则源自15号染色体上的CHRNA7基因的5-10外显子。这种由不同染色体来源拼接而成的结构使得CHRFAM7A在基因家族中独树一帜。CHRFAM7A基因能以正向或倒置的形式存在，进一步增加了其独特性。值得注意的是，在倒置的等位基因中，CHRNA7衍生序列的外显子6存在2bp的缺失，这引发了一个移码突变。这种突变与倒置之间的连锁不平衡关系，为本发明人提供了检测倒置等位基因的手段。
本发明人通过精心设计的分别针对FAM7（ULK4）基因外显子和CHRNA7基因外显子的引物，能够有效地避免同源基因的干扰，在检测非人源样本中的人源基因中展现出卓越的特异性和灵敏度。这一策略对于精准识别人源性相关细胞至关重要，成功弥补了现有技术在动物组织、血液等非人源样本中检测标志物特异性不足、灵敏度不够的缺陷，为生物医学研究提供了新的有力工具。
第一方面，本发明提供了一种特异性检测人源基因的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为CHRFAM7A基因。
另一方面，本发明提供了一种特异性检测所述生物标志物的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物和下游引物，其中所述上游引物如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供一种特异性检测所述生物标志物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括所述的引物对。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括PCR反应液、无核酸酶高纯水、人源性细胞不同比例标准品、含人源性基因的阳性对照品、不含人源性基因的阴性对照品以及质控品。
在一些实施方式中，所述PCR反应液为qPCR反应液。
在一些实施方式中，所述人源性细胞不同比例标准品包括猴、狗、兔、大鼠、小鼠中的一种或多种细胞。
本发明还提供了所述的引物对在制备特异性检测人源基因的试剂盒中的应用。
本发明还提供了所述的试剂盒在定量检测人源基因中的应用，其特征在于，检测人源基因的方法包括以下步骤：
1）从目标样本中提取总RNA，并将其反转录成样本模板DNA；
2）采用所述试剂盒中的试剂，以样本模板DNA为基础，进行qPCR检测；
3）结果判定：通过对比样本DNA检测得到的Ct值与已拟合的标准曲线，确定目标样本中人源细胞的含量。
在一些实施方式中，所述标准曲线中的横坐标（X）代表人源性标准品中人源性细胞量的对数，纵坐标（Y）则是代表相应的人源性标准品的Ct值；通过线性回归分析，得到R2值≥0.99的线性方程。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：
1.本发明首次揭示了CHRFAM7A基因作为人源基因检测标志物的创新应用，并利用设计的特异性引物，成功克隆了CHRFAM7A基因，展现了高度的准确性和可靠性；
2.通过本发明的引物对，能够在非人源样本中检测出低至十万分之一的人源细胞，凸显了本发明的高灵敏度；
3.在多种非人源细胞系（如恒河猴胚肾细胞、犬肾细胞等）中，本发明的引物对未克隆到对应的基因片段，进一步验证了其特异性；
4.DIR示踪技术揭示，UC-MSC在小鼠体内主要聚集于胸腔和腹腔，能够提供直观的分布信息；
5.通过qPCR检测，发现尾静脉注射UC-MSC后，在小鼠的肺部和肝脏中有显著的细胞聚集，并在其他组织中也有微弱的信号，证实了UC-MSC的体内分布和迁移情况。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为CHRFAM7A基因PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测结果。
图2为CHRFAM7A基因特异性扩增后所获得的标准曲线图。
图3为CHRFAM7A基因在不同细胞中的表达情况图。
图4为DIR示踪技术揭示结果。
图5为小鼠尾静脉注射UC-MSC，24h和72h后，各组织中CHRFAM7A基因表达情况图。
具体实施方式
本发明旨在提供一种特异性人源基因检测的引物对、试剂盒及其应用，以解决现有技术中存在的挑战。通过深入研究，本发明人发现人类特异性基因CHRFAM7A作为一个理想的标志物，可应用于临床前各种动物组织、血液以及其他非人源样本中的人源基因筛查。这一发现旨在弥补当前检测手段在特异性和灵敏度方面的不足，确保更准确、灵敏地识别人源基因。
为实现上述目标，本发明选定CHRFAM7A作为关键标志物。该基因是一种独特的人类限制性融合基因，由FAM7（ULK4）基因的4个外显子和CHRNA7基因的5-10外显子组合而成。
进一步，经过Genebank数据库的检索，确定了其核苷酸序列为NM_139320.2。基于这一序列设计了高灵敏度的特异性引物，相较于现有的人特异性基因检测方法，展现出更高的敏感性。具体的引物序列为：
上游引物(SEQ ID NO:1):5'-CCACATTCCACACTAACGTG-3';
下游引物(SEQ ID NO:2):5'-GCATCTGCAGATCCAAGGAC-3'。
为确保引物的有效性，对人UC-MSC进行了RNA提取，获取了高质量的总RNA，并反转录为cDNA模板。随后，利用特异性引物成功扩增出CHRFAM7A基因的核酸片段，并通过测序验证了其准确性。
利用小鼠成纤维细胞与人UC-MSC不同比例的混合样本，通过RNA提取获得总RNA，并反转录为cDNA模板。随后，运用qPCR技术，成功检测了CHRFAM7A基因的表达下限。
对人脐带间充质干细胞、恒河猴胚肾细胞、犬肾细胞、兔皮肤成纤维细胞、大鼠成纤维细胞和小鼠成纤维细胞进行了RNA提取，并反转录为cDNA模板。通过qPCR检测，验证了设计的引物在这些非人源样本中具有高特异性。
采用DIR示踪技术，直观展示了UC-MSC经尾静脉注射后在小鼠体内的分布情况。这一方法为本发明人提供了宏观上的观察手段，有助于深入了解UC-MSC在小鼠体内的迁移和分布情况。
通过qPCR技术，精细地检测了UC-MSC经尾静脉注射后在小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、血液和软骨等组织中的分布情况，为深入研究其生物学功能提供了微观层面的数据支持。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 引物合成及目的基因检测
1.在Genebank数据库中，检索到CHRFAM7A基因的核苷酸序列，编号为NM_139320.2。通过对这一序列进行详尽的比对分析，设计了分别来源于FAM7（ULK4）基因外显子和CHRNA7基因外显子的上下游引物。这些引物经过严格的序列筛选和验证，以确保其特异性和高效性。所设计的上游引物序列为：5'- CCACATTCCACACTAACGTG-3'(SEQ ID NO:1)，而下游引物序列为：5'- GCATCTGCAGATCCAAGGAC-3'(SEQ ID NO:2)。
2. RNA提取，采用RNA Easy Fast动物组织/细胞总 RNA提取试剂盒（DP451，天根生化科技有限公司），按照试剂盒提供的标准程序提取动物组织或细胞总 RNA。
3. 采用反转录试剂PrimeScript™ RT reagent Kit (Perfect Real Time)（RR037A，TaKaRa公司），按照试剂盒提供的标准程序将提取的总RNA进行反转录。
4. PCR扩增CHRFAM7A基因
PCR反应体系
PCR反应程序设定：首先设定PCR仪的顶盖温度为98℃，在循环开始前94℃条件下预变性5min。随后设定变性、退火、延伸三个反应，进行35次循环。变性在94℃条件下30s；退火温度由引物Tm值来确定，时间设置也是30s；延伸温度72℃，是ExTaq酶的最适温度，而延伸时间由目的片段长度来确定。循环结束后继续进行10 min的延伸时长。PCR程序结束后，直接进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，其中图1中M(Marker)为D2000；泳道1-5分别为CHRFAM7A基因对应引物在不同退火温度55℃、57℃、59℃、61℃、63℃条件下克隆得到的产物条带。
5. 测序检测，采用普通琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒(DP209，天根生化科技有限公司)，按照试剂盒提供的标准程序回收琼脂糖凝胶电泳的条带，将得到的DNA产物送生工生物进行测序检测。
实施例2 CHRFAM7A基因qPCR检测灵敏度测定
设计合成人CHRFAM7A基因特异性片段的引物如实施例1中所述。
以人脐带间充质干细胞(UC-MSC)与小鼠成纤维细胞混合得到的总RNA作为测试CHRFAM7A基因引物的灵敏度。总细胞量为106cells，其中分别含有10cells、100cells、1000cells、10000cells、100000cells、1000000cells的UC-MSC，剩余部分为非人源细胞为小鼠成纤维细胞。分别提取各组的总RNA，反转录得到各组别的模板，使用CHRFAM7A基因引物进行qPCR进行检测其特异性和灵敏度。结果如图2所示，其中Slope为标准曲线斜率；Y-Intercept为Y-截距；R Square为相关系数(R2)；Efficiency为扩增效率。图中横轴从左至右的七个点分别代表了七个不同浓度的标准样品。这些样品中的人源性细胞含量分别为每百万细胞中含有10cells、100 cells、1000 cells、10000 cells、100000 cells、1000000cells。作为对照的非人源细胞为小鼠成纤维细胞。每个样品都进行了三次重复实验以确保数据的可靠性。图中的标准曲线是以Ct值作为纵坐标（Y），以标准浓度样品浓度的对数值作为横坐标（X）进行拟合而成的，由图2结果可见，引物灵敏度非常强，可以成功检测得到十万分之一非人源样本中的人源细胞，从标准曲线可知，该引物的灵敏度还远高于此。
检测了每个标准浓度样品的Ct值，并以这些Ct值为纵坐标（Y），以标准细胞量的对数值为横坐标（X），绘制了标准曲线图，如图2所示。通过数据拟合，得到了标准曲线的回归方程以及相关系数，这些统计信息已详细列于下表中，以便参考和分析。这一标准曲线为本发明提供了CHRFAM7A基因在不同浓度下的扩增效果的定量描述，有助于更准确地评估该基因的表达水平和检测灵敏度。
实施例3 CHRFAM7A基因在不同动物细胞中特异性测定
分别取不同动物细胞，包括下列人脐带间充质干细胞、恒河猴胚肾细胞、犬肾细胞、兔皮肤成纤维细胞、大鼠成纤维细胞、小鼠成纤维细胞等细胞。分别提取各组的总RNA，反转录得到各组别的模板，使用CHRFAM7A基因引物进行qPCR进行检测其特异性，结果如图3所示，引物特异性非常强，除了人脐带间充质干细胞，别的非人源动物细胞中均未检测到CHRFAM7A基因。
实施例4 DIR活体成像示踪
细胞膜荧光探针DIR是一类亲脂性荧光染料，使用其与人脐带间充质干细胞进行孵育，可以使人脐带间充质干细胞带上荧光，将孵育好的人脐带间充质干细胞通过尾静脉注射进入小鼠体内，分别在24小时和72小时后进行观察，结果如图4所示，UC-MSC主要聚集在小鼠的胸腔和腹腔。
实施例5 CHRFAM7A基因检测尾静脉注射人脐带间充质干细胞的小鼠体内分布情况
将新鲜收获得到的人脐带间充质干细胞通过尾静脉注射进入小鼠体内，分别在24小时和72小时后，取心、肝、脾、肺、肾、脑、血液和软骨等组织，分别提取各组的总RNA，反转录得到各组别的模板，使用CHRFAM7A基因引物进行qPCR进行检测，结果如图5所示，人脐带间充质干细胞通过尾静脉注射进入小鼠体内后，24h后除脑部，别的检测的组织均有分布，主要再肝脏和肺部。72h后，各组织含量均明显下降，除脑部未检测到，肝脏和肺部表达量还较高，剩余组织中还有及其微量的分布。
综上，本发明为生物医学研究提供了新的有力工具，更有望在未来推动相关领域取得突破性的进展，为人类的健康与疾病研究带来新的希望和机遇。
虽然已经通过示例对本发明的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上示例仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围。本领域的技术人员还应理解，可以对实施例进行多种修改而不脱离本发明的范围和精神。本发明的范围由所附权利要求来限定。
Claims (9)
1.CHRFAM7A基因在特异性检测非人源样本中的人源细胞方面的应用，其特征在于，使用引物对检测CHRFAM7A基因，所述引物对包括上游引物和下游引物，其中所述上游引物如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示。
2.一种引物对，用于特异性检测非人源样本中的人源细胞，其特征在于，所述引物对包括上游引物和下游引物，其中所述上游引物如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示。
3.一种试剂盒，用于特异性检测非人源样本中的人源细胞，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求2所述的引物对。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应液、无核酸酶高纯水、人源性细胞不同比例标准品、含人源性基因的阳性对照品、不含人源性基因的阴性对照品以及质控品。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液为qPCR反应液。
6.如权利要求4-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述人源性细胞不同比例标准品包括猴、狗、兔、大鼠、小鼠中的一种或多种细胞。
7.权利要求2所述的引物对在制备特异性检测非人源样本中的人源细胞的试剂盒中的应用。
8.权利要求3-5任一项所述的试剂盒在定量检测非人源样本中的人源细胞中的应用，其特征在于，检测方法包括以下步骤：
1）从目标样本中提取总RNA，并将其反转录成样本模板DNA；
2）采用所述试剂盒中的试剂，以样本模板DNA为基础，进行qPCR检测；
3）结果判定：通过对比样本DNA检测得到的Ct值与已拟合的标准曲线，确定目标样本中人源细胞的含量。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述标准曲线中的横坐标代表人源性标准品中人源性细胞量的对数，纵坐标则是代表相应的人源性标准品的Ct值；通过线性回归分析，得到R2值≥0.99的线性方程。
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| Xitong Dang等.CHRFAM7A: a human-specific a7-nicotinic acetylcholine receptor gene shows differential responsiveness of human intestinal epithelial cells to LPS.The FASEB Journal.2015,第29卷第2292页摘要部分. * |
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