JP4579577B2 - 情報処理装置および情報処理方法ならびに記憶媒体、プログラム - Google Patents
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Description
生物種の核酸配列の一部と相補的な核酸であるプローブを配置したDNAマイクロアレイを用いて、所定の検体をハイブリダイゼーション反応させた結果得られたDNAマイクロアレイ上の各プローブのシグナル強度に関する情報を処理する情報処理装置であって、
前記DNAマイクロアレイは、各生物種に特異的な複数種類のプローブがそれぞれ独立したスポットとして配置されており、
前記情報処理装置は、
既知の生物種が含まれる複数の検体をハイブリダイゼーション反応させた結果得られた、各検体ごとの、前記各プローブに対するシグナル強度を成分とするベクトルデータである第1の情報を保持する保持手段と、
前記所定の検体をハイブリダイゼーション反応させた結果得られた各プローブに対するシグナル強度を成分とするベクトルデータである第2の情報を取得する取得手段と、
前記保持手段に保持された前記第1の情報から、所定の生物種が含まれる検体をハイブリダイゼーション反応させた結果得られたベクトルデータ群と、該所定の生物種が含まれない検体をハイブリダイゼーション反応させた結果得られたベクトルデータ群とを選択し、該選択したベクトルデータ群の共分散行列を算出することにより生成されるベクトルフィルタであって、該所定の生物種が含まれているか否かを判定するのに寄与するプローブにおけるシグナル強度を抽出するためのベクトルフィルタと、
前記第1の情報のベクトルデータを前記ベクトルフィルタを用いてフィルタリングすることにより得られたベクトルデータと、前記第2の情報のベクトルデータを前記ベクトルフィルタを用いてフィルタリングすることにより得られたベクトルデータとを比較することにより、前記所定の検体に、前記所定の生物種が含まれているか否かを判定する判定手段とを備える。
[1−1.ハイブリダイゼーション反応実験の流れ]
はじめに図4を用いてDNAマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーション反応実験の実験手順全般について説明する。
次に、上述したハイブリダイゼーション反応(405)の概要について図3を用いて説明する。図3はDNAマイクロアレイ上でのハイブリダイゼーション反応の様子を示した図である。生体内ではほとんどの場合、DNAは2重らせん構造をしており、その2本鎖の間の結合は塩基間の水素結合で実現されている。一方、RNAは1本で存在する場合が多い。塩基の種類はDNAの場合はACGTの4種類、RNAの場合はACGUの4種類であり、それぞれ水素結合ができる塩基対はA−T(U)、G−Cのペアとなっている。
次に、図5により感染症の菌を特定するために用いられるDNAマイクロアレイの原理を説明する。図5で示したDNAマイクロアレイ(500−1、500−2)は、黄色ブドウ球菌を特定する目的で作られたDNAマイクロアレイの一例である。
次に、図6を用いて図5のハイブリ溶液に複数の種類の塩基配列が存在する理由を説明する。通常、自然界に存在する菌は、突然変異を頻繁に起こす。その結果、淘汰を経て生き残った主要な数種類の株が同時に存在することがある。例えば、院内感染などで問題を起こす菌株は、通常は薬剤耐性がないはずの菌が、突然変異を起こすことによって薬剤耐性を獲得することで出現する。薬剤耐性を獲得した結果、殺菌努力を行っている衛生的な環境でも旺盛な繁殖力を持つ菌が出現したりする。このように、自然界に存在する同一の菌の塩基配列は、数種類のバリエーションをもつものである。
次に、感染症の原因菌の特定を目的として実際に行ったハイブリダイゼーション反応実験の具体的な実施例について以下に詳説する。なお、本発明にかかる生物種類判定方法は、以下に述べる感染症の原因菌特定を目的としたものに限ったものではなく、MHCなどの人間の体質判定や、癌などの疾病に関わるDNA、RNAの解析などに用いてもよい。
エンテロバクタークロアカエ(Enterobacter cloacae)菌検出用プローブとして表1に示す核酸配列(I−n)(nは数字)を設計した。
黄色ブドウ球菌(A−n)、表皮ブドウ球菌(B−n)、大腸菌(C−n)、肺炎桿菌(D−n)、緑膿菌(E−n)、セラチア菌(F−n)、肺炎連鎖球菌(G−n)、インフルエンザ菌(H−n)、及びエンテロコッカス・フェカリス菌(J−n)(nは数字)についても同様な手法により以下に示すプローブセット(表2−1〜2−9)を設計した。
原因菌検出の為の16s rRNA核酸(標的核酸)増幅用PCR Primerとして表2に示す核酸配列を設計した。
[1-5-3.Enterobacter_cloacae Genome DNA(モデル検体)の抽出]
[1-5-3-1]微生物の培養 & Genome DNA抽出の前処理
まず、エンテロバクター クロアカエ(Enterobacter cloacae)標準株を、定法に従って培養した。この微生物培養液を1.5ml容量のマイクロチューブに1.0ml(OD600=0.7)採取し、遠心分離で菌体を回収した(8500rpm、5min、4℃)。
Lysozyme 50 μl (20 mg/ml in Enzyme Buffer)
N-Acetylmuramidase SG 50 μl (0.2 mg/ml in Enzyme Buffer)
次に、酵素溶液を加え再縣濁した菌液を、37℃のインキュベーター内で30分間静置し、細胞壁の溶解処理を行った。
以下に示す微生物のGenome DNA抽出は、核酸精製キット(MagExtractor -Genome-:TOYOBO社製)を用いて行った。
回収された微生物(Enterobacter cloacae株)のGenome DNAは、定法に従って、アガロース電気泳動と260/280nmの吸光度測定を行い、その品質(低分子核酸の混入量、分解の程度)と回収量を検定した。
[1-5-4-1]ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板(サイズ:25mmx75mmx1mm、飯山特殊ガラス社製)を耐熱、耐アルカリのラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中で浸した後、20分間超音波洗浄を行った。続いて基板を取り出し、軽く純水ですすいだ後、超純水中で20分超音波洗浄をおこなった。次に80℃に加熱した1N水酸化ナトリウム水溶液中に10分間基板を浸した。再び純水洗浄と超純水洗浄を行い、DNAチップ用の石英ガラス基板を用意した。
シランカップリング剤KBM−603(信越シリコーン社製)を、1%の濃度となるように純水中に溶解させ、2時間室温で攪拌した。続いて、先に洗浄したガラス基板をシランカップリング剤水溶液に浸し、20分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に乾燥した基板を120℃に加熱したオーブン中で1時間ベークし、カップリング剤処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。次いで同仁化学研究所社製のN−マレイミドカプロイロキシスクシイミド(N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido)(以下EMCSと略す)を、ジメチルスルホキシドとエタノールの1:1混合溶媒中に最終濃度が0.3mg/mlとなるように溶解したEMCS溶液を用意した。ベークの終了したガラス基板を放冷し、調製したEMCS溶液中に室温で2時間浸した。この処理により、シランカップリング剤によって表面に導入されたアミノ基とEMCSのスクシイミド基が反応し、ガラス基板表面にマレイミド基が導入された。EMCS溶液から引き上げたガラス基板を、先述のEMCSを溶解した混合溶媒を用いて洗浄し、さらにエタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
本実施例で作製した微生物検出用プローブを純水に溶解し、それぞれ、最終濃度(インク溶解時)10μMとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
グリセリン7.5wt%、チオジグリコール7.5wt%、尿素7.5wt%、アセチレノールEH(川研ファインケミカル社製)1.0wt%を含む水溶液を用意した。続いて、先に用意した7種類のプローブ(表1)を上記の混合溶媒に規定濃度なるように溶解した。得られたDNA溶液をバブルジェット(登録商標)プリンタ(商品名:BJF-850 キヤノン社製)用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
30分間の反応後、100mMのNaClを含む10mMのリン酸緩衝液(pH7.0)により表面に残ったDNA溶液を洗い流し、ガラス基板表面に一本鎖DNAが固定したDNAマイクロアレイを得た。
検体となる微生物DNAの増幅、および、標識化反応は以下に示すとおりである。
[1-5-6.ハイブリダイゼーション]
上記「1-5-4.DNAマイクロアレイの作製」で作製したDNAマイクロアレイと上記「1-5-5.検体の増幅と標識化(PCR増幅&蛍光標識の取り込み)」で作製した標識化検体を用いて検出反応を行った。
BSA(牛血清アルブミンFraction V:Sigma社製)を1wt%となるように100mM NaCl/10mM Phosphate Bufferに溶解し、この溶液に「1-5-4.DNAマイクロアレイの作製」で作製したDNAマイクロアレイを室温で2時間浸し、ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、0.1wt%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含む2xSSC溶液(NaCl 300mM、Sodium Citrate (trisodium citrate dihydrate, C6H5Na3・2H2O) 30mM、p.H. 7.0)で洗浄を行った後、純水でリンスしてからスピンドライ装置で水切りを行った。
水切りしたDNAマイクロアレイをハイブリダイゼーション装置(Genomic Solutions Inc. Hybridization Station)にセットし、以下([1-5-6-3]、[1-5-6-4])に示すハイブリダイゼーション溶液、条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
6 x SSPE / 10% Form amide / Target (2nd PCR Products 全量)
(6xSSPE: NaCl 900mM、NaH2PO4・H2O 60mM、EDTA 6mM、p.H. 7.4)
[1-5-6-4]ハイブリダイゼーション条件
65 ℃ 3min → 92℃ 2min → 45℃ 3hr → Wash 2xSSC / 0.1% SDS at 25℃ → Wash 2 x SSC at 20℃ → (Rinse with H2O : Manual) → Spin dry(65℃で3分、92度で2分、45℃で3時間ハイブリダイゼーション反応させた後、2xSSC / 0.1% SDS、25℃で洗浄、2xSSC、20℃で洗浄後、純水でリンスしスピンドライした。)
[1-5-7.微生物の検出(蛍光測定)]
ハイブリダイゼーション反応終了後のDNAマイクロアレイをDNAマイクロアレイ用蛍光検出装置(Axon社製、GenePix 4000B)を用いで蛍光測定を行った。
次に、上記ステップS101で得られたスキャン画像を用いて行われる生物種類判定処理(ステップS103)について以下に説明する。
図2は本発明の一実施形態にかかる情報処理方法(生物種類判定方法)を実現するための情報処理装置の構成を示すブロック図である。
次に、本発明の情報処理方法について詳説する前に本方法の特徴を明確にすべく、ハイブリダイゼーション反応実験により得られたスキャン画像についての従来の判定処理方法の具体例を示し、その問題点について検討する。
すでに、上記「従来技術」においても米国特許第6040138号明細書を挙げて述べたように、未知のサンプルの生物種を判定するために、相同性検索により、複数の原因菌の存在を判定する方法がある。
ハイブリダイゼーション反応の結果を用いて生物種を判定する方法は上記相同性検索のほかにも幾つか考えられる。例えば、あらかじめ既知の生物種からなる基準サンプルについてハイブリダイゼーション反応させた結果得られたスキャン画像を格納しておき、当該既知の生物種の基準サンプルによるスキャン画像に基づいてパターン認識させることで、未知のサンプルの生物種を判定する方法等が挙げられる。
上述のような背景のもと、本願に基づく生物種判定処理では、上記「2-2-1.相同性検索の場合」の問題点を解決すべくパターン認識による判定方法を採用しつつ、パターン認識を用いた場合の問題点に関する上記検討を考慮し、あらゆる原因菌の組み合わせを用意しておかなくても、類似する塩基配列について精度よく判定できるようにした。具体的には、基準サンプルと未知サンプルとのベクトル対比にあたり、ベクトルフィルタ処理を付加した点に特徴がある。以下に詳細を説明する。
図9は、本実施形態にかかる生物種類判定方法の処理を説明するための機能ブロック図である。901は“基準サンプルに対するスキャン画像”で、ターゲットとしている生物種由来の核酸断片を含む基準サンプルをハイブリダイゼーション反応させた結果得られたものである。通常この核酸断片には蛍光物質などの標識分子が付加されていて、DNAマイクロアレイとのハイブリダイゼーション反応の強度を簡単に測定できるようになっている。
以下に図9の各部の処理の詳細について説明する。
ベクトル正規化部904におけるベクトル正規化処理とは、各サンプルごとに得られた蛍光強度に基づいて導かれたベクトルを正規化する処理をいう。
次に本発明の特徴であるベクトルフィルタ部905におけるベクトルフィルタ処理について説明する。はじめに、ベクトルフィルタ処理の概念について説明する。上述のようにハイブリダイゼーション反応の結果得られた統合ベクトルは、プローブの数により決定される多次元空間において、各サンプルごとに決定される。このとき、検体にどのような原因菌が含まれているかによって、当該多次元空間における統合ベクトルが大きく異なってくる。
図10では、説明の便宜上、それぞれの生物種プローブに対応する測定値に1をかけて、それ以外のプローブに0をかける単純なフィルタの例を示したが、一般には、予め得られている知見に基づき、各プローブの測定値ごとに0から1の間の定数をかけることによって、フィルタを実現することができる。そこで、以下にフィルタの構成方法について説明する。
これが例えば80%以上の時点で、主成分分解(スペクトル分解)を打ち切り、それより小さい固有値に対応する成分を無視する。なお、上述の例で80%という数字はユーザが与える任意の比率に設定してよい。また、ユーザに個々の固有ベクトルを固有値と共に表示して見せて、無視する主成分分解成分をユーザに選択させてもよい。
一般に、ベクトル同士の比較、分類は“パターン認識”と呼ばれる技術で行う。その詳しい技術内容は例えば、IEEE Transaction on Pattern Analysis and Machine Learning, Vol. 22, No. 1, January 2000, pp.4-pp.37にある“Statistical Pattern Recognition: A Review”Anil K. Jain, Robert P.W. Duin, and Jianchan Mao. の論文にレビューされている。本発明の生物種類判定方法にはパターン認識の技術である、k-Nearest-Neighbor法、分類木、Support Vector Machine、ベイズ識別法、ブースティング法、ニューラルネットなどのいずれの方法についても適用できる。
次に分類木を用いたパターン認識について図13〜図15を用いて説明する。はじめに図13を用いて分類木を用いたパターン認識の概要について説明する。図13に示すように、分類木を用いたパターン認識では、まず、学習パターン1301から複数の分類木1303を作成する分類木作成処理を実行する(1302)。
以上の説明から明らかなように、本実施形態では、従来の培養法に替えて、DNAマイクロアレイによるハイブリダイゼーション反応を用いて判定を行うことにより、簡易かつ安価に、しかも短時間での生物種判定を実現した。
Claims (6)
- 生物種の核酸配列の一部と相補的な核酸であるプローブを配置したDNAマイクロアレイを用いて、所定の検体をハイブリダイゼーション反応させた結果得られたDNAマイクロアレイ上の各プローブのシグナル強度に関する情報を処理する情報処理装置であって、
前記DNAマイクロアレイは、各生物種に特異的な複数種類のプローブがそれぞれ独立したスポットとして配置されており、
前記情報処理装置は、
既知の生物種が含まれる複数の検体をハイブリダイゼーション反応させた結果得られた、各検体ごとの、前記各プローブに対するシグナル強度を成分とするベクトルデータである第1の情報を保持する保持手段と、
前記所定の検体をハイブリダイゼーション反応させた結果得られた各プローブに対するシグナル強度を成分とするベクトルデータである第2の情報を取得する取得手段と、
前記保持手段に保持された前記第1の情報から、所定の生物種が含まれる検体をハイブリダイゼーション反応させた結果得られたベクトルデータ群と、該所定の生物種が含まれない検体をハイブリダイゼーション反応させた結果得られたベクトルデータ群とを選択し、該選択したベクトルデータ群の共分散行列を算出することにより生成されるベクトルフィルタであって、該所定の生物種が含まれているか否かを判定するのに寄与するプローブにおけるシグナル強度を抽出するためのベクトルフィルタと、
前記第1の情報のベクトルデータを前記ベクトルフィルタを用いてフィルタリングすることにより得られたベクトルデータと、前記第2の情報のベクトルデータを前記ベクトルフィルタを用いてフィルタリングすることにより得られたベクトルデータとを比較することにより、前記所定の検体に、前記所定の生物種が含まれているか否かを判定する判定手段と
を備えることを特徴とする情報処理装置。 - 前記判定手段は分類木であり、該分類木は、2分岐分類木アンサンブルアルゴリズムを用いて作成されており、かつ、該分類木の各ノードにおける判定関数は、該各ノードに存在する学習データの中からランダムに選択されたカテゴリーの異なる2つの学習パターンのどちらに近いかを示す関数で定義されていることを特徴とする請求項1に記載の情報処理装置。
- 生物種の核酸配列の一部と相補的な核酸であるプローブを配置したDNAマイクロアレイを用いて、所定の検体をハイブリダイゼーション反応させた結果得られたDNAマイクロアレイ上の各プローブのシグナル強度に関する情報を処理する情報処理方法であって、
前記DNAマイクロアレイは、各生物種に特異的な複数種類のプローブがそれぞれ独立したスポットとして配置されており、
前記情報処理方法は、
既知の生物種が含まれる複数の検体をハイブリダイゼーション反応させた結果得られた、各検体ごとの、前記各プローブに対するシグナル強度を成分とするベクトルデータである第1の情報を保持手段に保持する保持工程と、
前記所定の検体をハイブリダイゼーション反応させた結果得られた各プローブに対するシグナル強度を成分とするベクトルデータである第2の情報を取得する取得工程と、
前記第1の情報のベクトルデータをベクトルフィルタを用いてフィルタリングすることにより得られたベクトルデータと、前記第2の情報のベクトルデータを前記ベクトルフィルタを用いてフィルタリングすることにより得られたベクトルデータとを比較することにより、前記所定の検体に、前記所定の生物種が含まれているか否かを判定する判定工程と、を備え、
前記ベクトルフィルタは、
前記保持手段に保持された前記第1の情報から、所定の生物種が含まれる検体をハイブリダイゼーション反応させた結果得られたベクトルデータ群と、該所定の生物種が含まれない検体をハイブリダイゼーション反応させた結果得られたベクトルデータ群とを選択し、該選択したベクトルデータ群の共分散行列を算出することにより生成され、該所定の生物種が含まれているか否かを判定するのに寄与するプローブにおけるシグナル強度を抽出するように構成されていることを特徴とする情報処理方法。 - 前記判定工程は分類木により処理され、該分類木は、2分岐分類木アンサンブルアルゴリズムを用いて作成されており、かつ、該分類木の各ノードにおける判定関数は、該各ノードに存在する学習データの中からランダムに選択されたカテゴリーの異なる2つの学習パターンのどちらに近いかを示す関数で定義されていることを特徴とする請求項3に記載の情報処理方法。
- 請求項3または4のいずれか1項に記載の情報処理方法をコンピュータに実行させるための制御プログラム。
- 請求項3または4のいずれか1項に記載の情報処理方法をコンピュータに実行させるための制御プログラムを格納した記録媒体。
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