JP2008175769A - 生物種判定用の辞書作成方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明は、上記課題を鑑みてなされたものであり、
辞書を作成する際に、生物種の変異速度を考慮した最適な個数での辞書サンプルの収集が実現でき、そのことによって生物種の判定精度を向上させることを目的とする。
【解決手段】 本発明による生物種判定用の辞書作成方法は、従来のように一律に辞書サンプル数を固定するのではなく、生物種の核酸配列の変異速度に応じて適切な辞書サンプル数を決定した上で辞書を作成することを特徴とする。
【選択図】 図１

Description

本発明はハイブリダイゼーション反応を用いて生物種を判定する方法に関するものであり、特にＤＮＡマイクロアレイを用いた、核酸の塩基配列の解析システムに適用し、細菌などの微生物の種類を判定する用途に用いるとその効果を発揮する。

従来、特開２００５−３６７６にあるように、生物の種類を判定するＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸の塩基配列の解析システムが存在した。上記文献によると、まず検査対象となる検体からＤＮＡを抽出し、適切な溶媒に溶解した溶液サンプルを作成する。この溶液サンプル中に含まれるＤＮＡの塩基配列を解析することで、検体中に特定の生物種が存在するか否かを判定するのである。

上記文献による解析システムは、溶液サンプル中に存在する核酸の断片を、ＰＣＲ法などに代表される増幅方法を用いて増幅したうえでＤＮＡマイクロアレイ上に展開し、ハイブリダイゼーション反応を実行したのちに、生物種を解析するものである。ハイブリダイゼーション反応とは、１本鎖状態の２つの核酸分子同士が適切な条件下で反応して、核酸中にある塩基配列を介して１つに結合するこという。

通常、このような解析システムを用いてサンプル中に存在する核酸を解析する場合、予め生物種が判明している生物から抽出された核酸を含むサンプルを用意する。

上記文献による生物種を判定する解析システムの場合、既知の生物種から抽出された核酸を含んだサンプル（既知サンプルと称す）を用いてハイブリダイゼーション反応を実行し、解析システムを用いて解析する。その後、解析データを適切な情報処理装置に記憶し、データベースとして蓄積する。

データベースを構築した後に、未知の生物種から抽出された核酸を含むサンプル（未知サンプルと称す）を、同じ解析システムを用いて解析し、解析データをデータベース上に蓄積してある既知サンプルに関する解析データと照合し、どの生物種である可能性が高いか判断する。

まとめると、生物種の判定には、まず既知サンプルを用いて、解析システムによって解析した解析データを生物種ごとに数データずつ収集したものの総体を、「辞書」として情報処理装置に記憶する。そして、未知サンプルを解析した結果得られたデータと記憶された「辞書」とを照合することによって、未知のサンプルの生物種を解析システムは出力するのである。
特開２００５−３６７６

従来の方法では、「辞書」として収集するサンプルは、生物種を判定する解析システムの場合、生物種毎にｎ種類という風に、生物種毎に同じ数だけ集めていた。ところが、核酸（特にＤＮＡ）を用いて細菌（バクテリア）を判定する場合は、この方法では不都合が生じてしまう。

細菌は核酸変異が速い上に、細菌の種類によって変異する速度が異なる。また、１種の生物につき、あまりに多くの既知サンプルからなる辞書を用いて生物種の判定を行うと判定結果が未知サンプルごとに過敏になりすぎ、類似した生物種同士の境界での生物種の判定結果が、サンプルごとに異なるなどのように不安定になる。従って、生物種ごとに適切な数の既知サンプルを用いて辞書を作成することが望ましい。

上記の理由によって、核酸を用いて細菌の種類を判定する場合、細菌によって核酸の変異速度が異なることは、「辞書」を作成する上での障害となる。

例えば、細菌Ａより細菌Ｂの方が、種として本質的に変異速度が大きい場合を考える。この時、細菌Ａの辞書を、細菌Ｂの辞書の数と同じ既知サンプル数にすると、細菌Ａの判定結果が不安定になる危険性がある。また、辞書を作成するためのサンプルを集めること自体が容易ではなく、ある細菌の変異速度が大きいからといって、１００データ／１細菌のように、むやみやたらにサンプル数を増やすことは現実的ではない。

本発明は、上記課題を鑑みてなされたものであり、辞書を作成する際に、生物種の変異速度を考慮した最適な個数での辞書サンプルの収集が実現でき、そのことによって生物種の判定精度を向上させることを目的とする。

上記の問題点を解決するために本発明による生物種判定用の辞書作成方法は、ターゲットとする全ての生物種の既知サンプルを収集する予備サンプル収集ステップと、前記予備サンプル収集ステップを用いて生物種の核酸配列の変異を評価する生物種変異評価ステップと、前記生物種変異評価ステップの結果得られた生物種ごとの変異情報に基づいたサンプル数でサンプルを収集する辞書サンプル収集ステップと、前記辞書サンプル収集ステップで集めたサンプルを元に生物種判定用の辞書を作成する辞書作成ステップを有することを特徴とする。

以上説明したように、本発明によれば、生物種の変異程度を考慮した最適な辞書サンプルの収集が実現でき、そのことによって生物種の判定確率が高くなるという効果がある。

以下、図面に基づいて本発明の好適な実施例を説明する。

＜実施例１＞
図１は、第１の実施形態による生物種判定用の辞書作成方法の処理手順を説明するフローチャートである。

まず、「予備サンプル収集ステップ」（１０１）において生物種毎の変異の具合を評価するためのサンプルを収集する。次に「生物種変異評価ステップ」（１０２）で、前記「予備サンプル収集ステップ」で収集されたサンプルを用いて生物種ごとの変異の具合を評価する。

そして前記「生物種変異評価ステップ」の結果得られた好適なサンプル数のサンプルを集める「辞書サンプル収集ステップ」（１０３）で判定用の辞書となるサンプルを収集する。

そして最後に「辞書サンプル収集ステップ」で収集されたサンプルを元に生物種を判定する辞書を作成する。

図１を詳しく説明する前に、本発明の具体的な実施形態、及び、前提となる基本知識、実験手順を説明する。

図２は本発明の以下の実施例すべてに係わる生物種判定用の辞書作成方法が適用される情報処理装置の構成の一例を示すブロック図である。

本発明にかかる生物種判定用の辞書作成方法は、外部記憶装置２０１、中央処理装置（ＣＰＵ）２０２、メモリ２０３、入出力装置２０４から構成される装置に実装される。外部記憶装置２０１は、本発明の実施例を実現するプログラムや、ハイブリダイゼーション反応の結果を保持する。また、本発明によって作成された生物種判定用の辞書を保持する機能を持つ。中央処理装置（ＣＰＵ）２０２は生物種判定用のためのプログラムを実行したり、すべての装置の制御を行なったりする。メモリ２０３は中央処理装置（ＣＰＵ）２０２が使用するプログラム、及びサブルーチンやデータを一時的に記録する。入出力装置２０４は、ユーザーとのインタラクションを行う。多くの場合、本発明の生物種判定用の辞書作成方法を実現するプログラム実行のトリガーはこの入出力装置を介してユーザーが出す。また、ユーザーが結果を見たり、プログラムのパラメータ制御をこの入出力装置を介して行う。

図３はＤＮＡマイクロアレイ上のハイブリダイゼーションの様子を示した図である。生体内でほとんどの場合、ＤＮＡは２重らせん構造をしていて、その２本鎖の間の結合は塩基間の水素結合で実現されている。一方、ＲＮＡは１本で存在する場合が多い。塩基の種類はＤＮＡの場合はＡＴＧＣの４種類、ＲＮＡの場合はＡＵＧＣの４種類であり、それぞれ水素結合ができる塩基対はＡ−Ｔ（Ｕ）、Ｇ−Ｃのペアとなっている。一般にハイブリダイゼーション反応とは、１本鎖状態の核酸分子同士がその中にある部分塩基配列を介して部分的に結合する状態をいう。

本発明で想定しているハイブリダイゼーション反応は図３に示した。図３の上側の基板にくっついた核酸分子（プローブ）の方が下側のサンプル中にある核酸分子より短い。サンプル中に存在する核酸分子がプローブの塩基配列を含む場合は、このハイブリダイゼーション反応が進行し、サンプル中のターゲット核酸分子はＤＮＡマイクロアレイにトラップされることとなる。

次に図４を用いてＤＮＡマイクロアレイを用いる実験手順全般について説明する。番号４０１の“サンプル”とは対象としている核酸が含まれていることが想定される液体や個体などの検体から抽出された核酸を含む溶液である。感染症の原因菌の特定をするために本発明を適用した場合、検体の例としては、ヒト、家畜等の動物由来の血液、喀痰、胃液、膣分泌物、口腔内粘液等の体液、尿及び糞便のような排出物等細菌が存在すると思われるあらゆる物が検体となる。また、食中毒、汚染の対象となる食品、飲料水及び温泉水のような環境中の水等、細菌による汚染が引き起こされる可能性のある媒体を検体としてサンプルが作成されることもある。さらに、輸出入時における検疫等の動植物も検体としてその対象となる。

次に、４０２の“生化学的増幅”方法を用いて４０１のサンプル増幅する。例えば感染症の原因菌の特定をするために本発明を適用した場合、１６ｓ ｒＲＮＡ検出用に設計されたＰＣＲ反応用プライマーを用いてＰＣＲ法によって対象核酸を増幅したり、或いはＰＣＲ増幅物を元にさらにＰＣＲ反応等を行なって調整したりする。また、ＰＣＲ以外のＬＡＭＰ法などの増幅方法により調整してもよい。

その後で、増幅されたサンプル、または４０１のサンプルそのものに、可視化のために各種標識法により標識する。この標識物質としては、通常Ｃｙ３，Ｃｙ５，Ｒｏｄａｍｉｎなどの蛍光物質が用いられる。また、４０２の生化学的増幅の実験手順の中で、標識分子を混入することもある。

そして、標識分子が付加された核酸は、４０４のＤＮＡマイクロアレイとハイブリダイゼーション反応（４０５）を行う。この様子は、図３に示した通りである。例えば感染症の原因菌の特定をするために本発明を適用したと場合、４０４のＤＮＡマイクロアレイは、細菌に特異的なプローブを基板に固定したものとなる。各細菌のプローブの設計は、例えば１６ｓ ｒＲＮＡをコーディングしているゲノム部分より、当該細菌に対し非常に特異性が高く、十分かつそれぞれのプローブ塩基配列で“出来るだけ”ばらつきのないハイブリダイゼーション感度が期待できるように行う。

４０４のＤＮＡマイクロアレイのプローブを固定する担体（基板）は、ガラス基板、プラスチック基板、シリコンウェハー等の平面基板が考えられる。また、凹凸のある三次元構造体、ビーズのような球状のもの、棒状、紐状、糸状のもの等を用いても、本発明の実施形態、効果には影響ない。

通常、前記基板の表面はプローブＤＮＡの固定化が可能なように処理したものが使用される。特に、表面に化学反応が可能となるように官能基を導入した物は、ハイブリダイゼーション反応の過程でプローブが安定に結合している為に、再現性の点で好ましい形態である。

本発明に用いられる固定化方法は、例えば、マレイミド基とチオール（−ＳＨ）基との組合わせを用いる例が挙げられる。即ち核酸プローブの末端にチオール（−ＳＨ）基を結合させておき、固相表面がマレイミド基を有するように処理しておくことで、固相表面に供給された核酸プローブのチオール基と固相表面のマレイミド基とが反応して核酸プローブを固定化する。マレイミド基の導入方法としては、まず、ガラス基板にアミノシランカップリング剤を反応させ、次にそのアミノ基とＥＭＣＳ試薬（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：Ｄｏｊｉｎ社製）との反応によりマレイミド基を導入する。

ＤＮＡへのＳＨ基の導入は、ＤＮＡ自動合成機上５’−Ｔｈｉｏｌ−ＭｏｄｉｆｉｅｒＣ６（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いる事により行なうことができる。固定化に利用する官能基の組合わせとしては、上記したチオール基とマレイミド基の組合わせ以外にも、例えばエポキシ基（固相上）とアミノ基（核酸プローブ末端）の組合わせ等が挙げられる。また、各種シランカップリング剤による表面処理も有効であり、該シランカップリング剤により導入された官能基と反応可能な官能基を導入したオリゴヌクレオチドが用いられる。さらに、官能基を有する樹脂をコーティングする方法も利用可能である。

ハイブリダイゼーション反応を行った後、４０４のＤＮＡマイクロアレイの表面を洗浄し、プローブと結合していない核酸を剥がした後で、通常は乾燥し、４０５の蛍光量を測定する。そして、ＤＮＡマイクロアレイの基板に励起光を照射し、蛍光強度を測定した画像（４０６）が得られる。

次に、図５を用いて感染症の細菌を特定するＤＮＡマイクロアレイの原理を示す。図５で示したＤＮＡマイクロアレイは、黄色ブドウ球菌を特定する目的で作られているとする。

左の列は、黄色ブドウ球菌野生株由来の処理系列であり、右の列は大腸菌野生株由来の処理系列である。例えば、左は黄色ブドウ球菌に感染した患者の血液を処理する流れで、右は大腸菌に感染した患者の血液を処理する流れだと考えてよい。

どちらも基本的には同じ処理を行う。つまり、まず初めに例えば菌感染患者の血液や、痰などからＤＮＡを抽出する。この際に、一般的には、患者の体細胞由来の人間のＤＮＡも含まれる可能性がある。

抽出されたＤＮＡが少ない場合、ＰＣＲ法などの方法で増幅を行う。この際に蛍光物質もしくは蛍光物質を結合させることができる物質を標識として混入させるのが一般的である。

増幅をしない場合は、抽出されたＤＮＡを用いて、相補鎖を作りながら蛍光物質もしくは蛍光物質を結合させることができる物質を標識として混入させる。または、そのまま直接抽出されたＤＮＡに蛍光物質もしくは蛍光物質を結合させることができる物質を標識として付加させる。

通常、ＰＣＲ増幅を行う場合、感染症の細菌特定目的であれば、いわゆる１６ｓ ｒＲＮＡといわれるリボゾームＲＮＡを構成する塩基配列の部分を増幅するのが一般的である。この場合、左の黄色ブドウ球菌のＰＣＲプライマーと右の大腸菌のＰＣＲプライマーはほとんど同じものを使うこととなる。より具体的には、どんな細菌の１６ｓ ｒＲＮＡをコーディングしている部分でも増幅させることができるプライマーセットを用いて、マルチプレックスＰＣＲを行う。

黄色ブドウ球菌を判定する目的のために設計されたＤＮＡマイクロアレイが正しく動作するならば、左のハイブリ溶液では、スポットがポジティブに反応し、右のハイブリ溶液では、スポットがネガティブに反応する。

これと全く同じように、大腸菌の存在を判定する目的のために設計されたＤＮＡマイクロアレイが正しく動作するならば、左のハイブリ溶液では、スポットがネガティブに反応し、右のハイブリ溶液では、スポットがポジティブに反応する。もちろん、いろんな細菌に対してそれぞれ特異的に反応する数種類のスポットを同時に並べたＤＮＡマイクロアレイを用いて、感染菌の判定を行ってもかわまない。

以下、図４を用いて説明した実験の流れを、感染症の原因菌特定の目的を想定した具体的実験操作に即して説明する。なお、本発明にかかる生物種類判定方法は、以下に述べる感染症の原因菌特定に限ったものではなく、ＭＨＣなどの人間の体質判定や、癌などの疾病に関わるＤＮＡ、ＲＮＡの解析に用いてもよい。

＜プローブＤＮＡの準備＞
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ菌検出用Ｐｒｏｂｅとして表１に示す核酸配列（Ｉ−ｎ）（ｎは数字）を設計した。

具体的には、１６ｓ ｒＲＮＡをコーディングしているゲノム部分より、以下に示したプローブ塩基配列を選んだ。これらのプローブ塩基配列群は、当該細菌に対し非常に特異性が高く、十分かつそれぞれのプローブ塩基配列で“出来るだけ”ばらつきのないハイブリダイゼーション感度が期待できるように設計されている。

表中に示したプローブは、ＤＮＡマイクロアレイに固定するための官能基として、合成後、定法に従って核酸の５’末端にチオール基を導入した。官能基の導入後、精製し、凍結乾燥した。凍結乾燥した内部標準用プローブは、−３０℃の冷凍庫に保存した。

黄色ブドウ球菌（Ａ−ｎ）、表皮ブドウ球菌（Ｂ−ｎ）、大腸菌（Ｃ−ｎ）、肺炎桿菌（Ｄ−ｎ）、緑膿菌（Ｅ−ｎ）、セラチア菌（Ｆ−ｎ）、肺炎連鎖球菌（Ｇ−ｎ）、インフルエンザ菌（Ｈ−ｎ）、及びエンテロコッカス・フェカリス菌（Ｊ−ｎ）（ｎは数字）についても同様な手法により以下に示すプローブセットを設計した。

＜検体増幅用ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒの準備＞
起炎菌検出用の為の１６ｓ ｒＲＮＡ核酸（標的核酸）増幅用ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒとして表２に示す核酸配列を設計した。

具体的には、１６ｓ ｒＲＮＡをコーディングしているゲノム部分を特異的に増幅するプローブセット、つまり約１５００塩基長の１６ｓ ｒＲＮＡコーディング領域の両端部分で、特異的な融解温度をできるだけ揃えたプライマーを設計した。なお、変異株や、ゲノム上に複数存在する１６ｓ ｒＲＮＡコーディング領域も同時に増幅できるように複数種類のプライマーを設計した。

表中に示したＰｒｉｍｅｒは、合成後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ３種、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ３種を混合し、それぞれのＰｒｉｍｅｒ濃度が、最終濃度１０ ｐｍｏｌ／μｌとなるようにＴＥ緩衝液に溶解した。

＜Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ＿ｃｌｏａｃａｅ Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ（モデル検体）の抽出＞
（微生物の培養＆Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ抽出の前処理）
まず、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ標準株を、定法に従って培養した。

この微生物培養液を１．５ｍｌ容量のマイクロチューブに１．０ｍｌ（ＯＤ６００＝０．７）採取し、遠心分離で菌体を回収した。（８５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）上精を捨てた後、Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐ．Ｈ．８．０、２５ｍＭ ＥＤＴＡ）３００μｌを加え、ミキサーを用いて再縣濁した。再縣濁した菌液は、再度、遠心分離で菌体を回収した。（８５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）上精を捨てた後、回収された菌体に、以下の酵素溶液を加え、ミキサーを用いて再縣濁した。

Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ５０μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｕｆｆｅｒ）
Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅ ＳＧ ５０μｌ（０．２ｍｇ／ｍｌ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｕｆｆｅｒ）
次に、酵素溶液を加え再縣濁した菌液を、３７℃のインキュベーター内で３０分間静置し、細胞壁の溶解処理を行った。

（Ｇｅｎｏｍｅ抽出）
以下に示す微生物のＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡ抽出は、核酸精製キット（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ−：ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて行った。

具体的には、まず、前処理した微生物縣濁液に溶解・吸着液７５０μｌと磁性ビーズ４０μｌを加え、チューブミキサーを用いて、１０分間激しく攪拌した（ステップ１）。

次に、分離用スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ Ｔｒａｐｐｅｒ）にマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた（ステップ２）。

次に、洗浄液９００μｌを加え、ミキサーで５ｓｅｃ程度攪拌して再縣濁を行った（ステップ３）。

次に、分離用スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ Ｔｒａｐｐｅｒ）にマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた（ステップ４）。

ステップ３、４を繰り返して２度目の洗浄（ステップ５）を行った後、７０％エタノール９００μｌを加え、ミキサーで５ｓｅｃ程度攪拌して再縣濁した（ステップ６）。

次に、分離用スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ Ｔｒａｐｐｅｒ）にマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた（ステップ７）。

ステップ６、７を繰り返して７０％エタノールによる２度目の洗浄（ステップ８）を行った後、回収された磁性粒子に純水１００μｌを加え、チューブミキサーで１０分間攪拌を行った。

次に分離用スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ Ｔｒａｐｐｅｒ）にマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブ壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を新しいチューブに回収した。

（回収したＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡの検査）
回収された微生物（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ 株）のＧｅｎｏｍｅＤＮＡは、定法に従って、アガロース電気泳動と２６０／２８０ｎｍの吸光度測定を行い、その品質（低分子核酸の混入量、分解の程度）と回収量を検定した。

本実施例では、約１０μｇのＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡが回収され、Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡのデグラデーションやｒＲＮＡの混入は認められなかった。

回収したＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡは、最終濃度５０ｎｇ／μｌとなるようにＴＥ緩衝液に溶解し、サンプルとして、以下の実施例に使用した。

＜ＤＮＡマイクロアレイの作製＞
［１］ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板（サイズ：２５ｍｍｘ７５ｍｍｘ１ｍｍ、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリのラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中で浸した後、２０分間超音波洗浄を行った。続いて基板を取り出し、軽く純水ですすいだ後、超純水中で２０分超音波洗浄をおこなった。次に８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間基板を浸した。再び純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡチップ用の石英ガラス基板を用意した。

［２］表面処理
シランカップリング剤ＫＢＭ−６０３（信越シリコーン社製）を、１％の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、先に洗浄したガラス基板をシランカップリング剤水溶液に浸し、２０分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に乾燥した基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。次いで同仁化学研究所社製のＮ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ）（以下ＥＭＣＳと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒中に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。ベークの終了したガラス基板を放冷し、調製したＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。

この処理により、シランカップリング剤によって表面に導入されたアミノ基とＥＭＣＳのスクシイミド基が反応し、ガラス基板表面にマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、先述のＭＣＳを溶解した混合溶媒を用いて洗浄し、さらにエタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。

［３］プローブＤＮＡ
実施例１で作製した微生物検出用プローブを純水に溶解し、それぞれ、最終濃度（インク溶解時）１０μＭとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。

［４］ＢＪプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板への結合
グリセリン７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、アセチレノールＥＨ（川研ファインケミカル社製）１．０ｗｔ％を含む水溶液を用意した。続いて、先に用意した７種類のプローブ（表１）を上記の混合溶媒に規定濃度なるように溶解した。得られたＤＮＡ溶液をバブルジェット（登録商標）プリンター（商品名：ＢＪＦ−８５０ キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。

なおここで用いたバブルジェット（登録商標）プリンターは平板への印刷が可能なように改造を施したものである。またこのバブルジェット（登録商標）プリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約５ピコリットルのＤＮＡ溶液を約１２０マイクロメートルピッチでスポッティングすることが可能となっている。

続いて、この改造バブルジェット（登録商標）プリンターを用いて、１枚のガラス基板に対して、印字操作を行い、アレイを作製した。印字が確実に行われていることを確認した後、３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。

［５］洗浄
３０分間の反応後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により表面に残ったＤＮＡ溶液を洗い流し、ガラス基板表面に一本鎖ＤＮＡが固定したＤＮＡマイクロアレイを得た。

＜検体の増幅と標識化（ＰＣＲ増幅＆蛍光標識の取り込み）＞
検体となる微生物ＤＮＡの増幅、および、標識化反応を以下に示す。
Ｐｒｅｍｉｘ ＰＣＲ試薬（ＴＡＫＡＲＡ ＥｘＴａｑ） ２５μｌ
Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ２μｌ（１００ｎｇ）
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘ ２μｌ（２０ｐｍｏｌ／ｔｕｂｅ ｅａｃｈ）
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘ ２μｌ（２０ｐｍｏｌ／ｔｕｂｅ ｅａｃｈ）
Ｃｙ−３ ｄＵＴＰ （１ｍＭ） ２μｌ（２ｎｍｏｌ／ｔｕｂｅ）
Ｈ２０ １７μｌ
Ｔｏｔａｌ ５０μｌ
上記組成の反応液を以下のプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行った。

反応終了後、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いてＰｒｉｍｅｒを除去した後、増幅産物の定量を行い、標識化検体とした。

＜ハイブリダイゼーション＞
＜ＤＮＡマイクロアレイの作製＞で作製したＤＮＡマイクロアレイと＜検体の増幅と標識化（ＰＣＲ増幅＆蛍光標識の取り込み）＞で作製した標識化検体を用いて検出反応を行った。

（ＤＮＡマイクロアレイのブロッキング）
ＢＳＡ（牛血清アルブミンＦｒａｃｔｉｏｎ Ｖ：Ｓｉｇｍａ社製）を１ｗｔ％となるように１００ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒに溶解する。この溶液に＜ＤＮＡマイクロアレイの作製＞で作製したＤＮＡマイクロアレイを室温で２時間浸し、ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、０．１ｗｔ％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２ｘＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ ３００ｍＭ、Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｄｉｈｙｄｒａｔｅ，Ｃ６Ｈ５Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ）３０ｍＭ、ｐ．Ｈ．７．０）で洗浄を行った後、純水でリンスしてからスピンドライ装置で水切りを行った。

（ハイブリダイゼーション）
水切りしたＤＮＡマイクロアレイをハイブリダイゼーション装置（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎ）にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション溶液、条件でハイブリダイゼーション反応を行った。

＜ハイブリダイゼーション溶液＞
６ ｘ ＳＳＰＥ／１０％Ｆｏｒｍ ａｍｉｄｅ／Ｔａｒｇｅｔ （２ｎｄ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ 全量）
（６ｘＳＳＰＥ：ＮａＣｌ ９００ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ ６０ｍＭ、ＥＤＴＡ ６ｍＭ、ｐ．Ｈ．７．４）
＜ハイブリダイゼーション条件＞
６５℃ ３ｍｉｎ→９２℃ ２ｍｉｎ→４５℃ ３ｈｒ→Ｗａｓｈ ２ｘＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ ａｔ ２５℃→Ｗａｓｈ ２ ｘ ＳＳＣ ａｔ ２０℃→（Ｒｉｎｓｅ ｗｉｔｈ Ｈ２Ｏ：Ｍａｎｕａｌ）→Ｓｐｉｎ ｄｒｙ
＜微生物の検出（蛍光測定）＞
ハイブリダイゼーション反応終了後のＤＮＡマイクロアレイをＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）を用いて蛍光測定を行った。

この結果得られたプローブ毎の蛍光強度のデータの例を図６〜図８に示す。

図６がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の３種類のサンプルを図４の手順に基づいて実験した結果で、図７、図８が、それぞれＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の３種類のサンプルの解析データとなる。前述したとおり、プローブは６種類／菌なので、全部で１０菌分、計６０個存在する。１つのサンプル由来のデータは、プローブ６０個分の数値データなので、６０次元のベクトルと言い換えることが出来る。なお、図６〜図８に示した数値は、このベクトルのノルムが１となるように正規化したデータである。数式で書くと、正規化前のｉ種類目のプローブごとの蛍光強度データを

、正規化後のｉ種類目のプローブごとの蛍光強度データを

とすると、

に示す式で正規化したデータである。

それぞれの細菌に対して３サンプルずつデータを取るとすると、図６〜図８のような表が１０個できることとなる。この場合、６０次元のベクトルが３０個得られることとなる。

未知のサンプルを図４に示した手順で実験すると、ベクトルが１つ得られる。このベクトルと辞書としてストアした辞書ベクトルとを比較することによって、細菌の判定を行う。

一般に、ベクトル同士の比較、分類は“パターン認識”と呼ばれる技術で行う。その詳しい技術内容は例えば、ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ ｏｎ Ｐａｔｔｅｒｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ２０００，ｐｐ．４−ｐｐ．３７にある“Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”Ａｎｉｌ Ｋ．Ｊａｉｎ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｐ．Ｗ．Ｄｕｉｎ，ａｎｄ Ｊｉａｎｃｈａｎ Ｍａｏ．の論文にレビューされている。本発明の生物種類判定方法にはよく用いられているパターン認識の技術、例えばｋ−Ｎｅａｒｅｓｔ−Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法、分類木、Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍａｃｈｉｎｅ、ベイズ識別法、ブースティング法、ニューラルネットなどが利用できる。

どのアルゴリズムを用いるにしても、まず図６〜図８にあるような答えのわかっているサンプル由来のデータを収集して、そのベクトルからいわゆる「辞書」を作成する必要がある（図１の１０４）。この「辞書」の形式は、用いるアルゴリズムによって異なってくるが、その元となる既知サンプルを集めること自体（図１の１０３）は、どのアルゴリズムを用いても共通に行うこととなる。

従来、この「辞書」を作成するための既知サンプルとして、細菌毎に同じ数だけ収集していたが、本発明では、細菌の変異情報を元に異なる数の辞書サンプルを収集することに特徴がある。

次に、図６〜図８に示したようなベクトルから細菌の変異具合を見積もる方法、つまり図１の１０２を詳しく説明する。

既知サンプルをＳ個ずつ収集したとする。その既知サンプルのｉ種類目のプローブごとの蛍光強度データを

とする。図６〜図８のようにサンプルを３つずつ収集したとすると、

となる。

まず、収集サンプルの平均パターンを求める。平均パターンとは、あるｉ種類目のプローブに着目したとき、個数Ｓでの平均をとった後に得られた

からなるベクトル

である（ただし

）。式で書くと、ｉ番目のプローブ平均値を

とすると

となる。

次に、平均パターンからの各サンプルベクトル

の距離を求める。

式で書くと、サンプルベクトル

と平均パターン

の距離をｄｓとすると

となる。

最後にｄｓをサンプルの個数Ｓで平均して、平均パターンとサンプルベクトルとの平均距離を求める。

平均距離をｄとすると、

の数式で求められる。

例えば、１０種類の異なる細菌についてそれぞれ、この平均距離ｄを求めた例を図９に示す。

平均距離が大きいほうが、変異速度が大きいと考えられるので、平均距離に比例した数をサンプル数として収集すれば、それぞれの生物種の変異速度に応じた数のサンプルを収集できる。例えば、｛整数部分（１００００＊平均距離）｝という計算式で求めたサンプル数を図１０に示す。

このように、異なるｉ種類のサンプルを同数個用意し、ハイブリダイゼーション反応を実行した結果得られたデータを元に平均パターンとサンプルベクトルとの平均距離を算出し、それぞれの生物種の変異速度を見積もることができる。見積もった変異速度に比例した数のうち、実際に収集可能な範囲で辞書サンプルの数を決定することが可能となる。

なお、図１における辞書サンプル収集ステップ１０３では、予備サンプル収集ステップ１０１で収集したサンプルに追加する形でサンプルの収集を行ってもよいし、生物種変異評価ステップ１０２の結果得られた最適サンプル数分のサンプルを新たに収集してもよい。

＜実施例２＞
実施例１では、「平均パターンとサンプルベクトルとの平均距離」という指標を用いて生物種ごとの変異速度を見積もった。この指標は、収集するサンプル数が増えても特に増減しない。

本実施例では、これに対して、既知サンプルの収集数によって増減する指標を用いて、サンプルを収集しながら十分なサンプル数を見積もる方法を提供する。

本実施例の方法を用いると、予備サンプル収集ステップで注意深く無作為にサンプルを集めておけば、辞書を構成する既知サンプルの最適な数を見積もることができる。

図１１に本実施例のフローチャートを示す。生物種変異評価ステップ１１０２において、「各サンプルの解析データ間の最小距離の平均」という指標を用いる。数式を用いて以下説明する。

ｉ種類目の既知サンプルをＳ個収集したとする。その既知サンプルのｉ種類目のプローブごとの蛍光強度データを

とする。図６〜図８のようにサンプルを３つずつ収集したとすると、

となる。

ここで、ａ番目のサンプルとｂ番目のサンプルの距離

を

で定義する。

ｓ番目のサンプルの最小距離（ｄ ｍｉｎ_ｓ）とは、

で定義される。

そして、この最小距離の平均値

を次式で求める。

こうして求めた最小距離の平均値が、閾値より低ければサンプル数は十分と判断し辞書を作成する。もし、閾値より高ければサンプル数が不十分と判断され、サンプルを追加収集する。そして、再度、最小距離の平均値を計算し、閾値より低いかどうかを判断する。（なお、これまで説明してきた計算式で３という数字で示したのは、新たなサンプルの個数で置き換える必要がある。）

Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅの３菌の「最小距離の平均」がサンプル数を増やすと減っていく様子を図１２に示す。

図１２を見てもわかるように、必ずしもサンプル数を増やすと、単調に「最小距離の平均」が現象しているわけではない。しかし、全体でみれば、サンプル数を増やすと減少していく傾向はある。

例えば、図１２で、閾値を０．００１１とすると、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは１０個、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓは９個、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅは５個というのが最適なサンプル数ということになる。

本発明の生物種判定用の辞書作成方法を最もよく表す図 本発明の生物種判定用の辞書作成方法が適用される情報処理装置の構成を示すブロック図 ハイブリダイゼーション反応を説明する図 ＤＮＡマイクロアレイを用いた実験手順 感染症の判定用ＤＮＡマイクロアレイの実験手順 Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの３サンプル由来の解析データ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの３サンプル由来の解析データ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの３サンプル由来の解析データ １０細菌の平均ベクトルからの距離の平均の例 好適なサンプル数の見積もり例 実施例２を実現するフローチャート ３細菌の最小距離の平均値のサンプル数毎の推移を示したグラフ

Claims (5)

1. ターゲットとする全ての生物種の既知サンプルを収集する予備サンプル収集ステップと、
   前記予備サンプル収集ステップによって集められた前記既知サンプルを用いて生物種の核酸配列の変異速度を評価する生物種変異評価ステップと、
   前記生物種変異評価ステップの結果得られた生物種ごとの変異情報に基づいたサンプル数で辞書サンプルを収集する辞書サンプル収集ステップと、
   前記辞書サンプル収集ステップで集めた前記辞書サンプルを元に生物種判定用の辞書を作成する辞書作成ステップを有することを特徴とする生物種判定用の辞書作成方法。
2. 前記生物種変異評価ステップにおいて、前記予備サンプル収集ステップで収集したサンプルに由来の平均パターンとそれぞれの前記サンプル由来のデータとの距離の平均値、を用いて生物種変異を評価することを特徴とする請求項１に記載の生物種判定用の辞書作成方法。
3. ターゲットとする全ての生物種の既知サンプルを収集する予備サンプル収集ステップと、
   前記予備サンプル収集ステップを用いて生物種の核酸配列の変異速度を評価する生物種変異評価ステップと、
   前記生物種変異評価ステップによって評価された生物種の核酸配列の変異速度を元にして定められた辞書サンプル数が十分かどうか判断するステップと、もし不十分と判断された場合、前記辞書サンプルを追加して収集する辞書サンプル追加収集ステップと、前記生物種変異評価ステップの結果、前記辞書サンプル数が十分と判断された場合、前記辞書サンプル数で収集された前記辞書サンプルを元に生物種判定用の辞書を作成する辞書作成ステップを有することを特徴とする生物種判定用の辞書作成方法。
4. 前記生物種変異評価ステップにおいて、前記予備サンプル収集ステップで収集したサンプル由来の解析データ間の最小距離の平均値を用いて生物種変異を評価することを特徴とする請求項１〜３に記載の生物種判定用の辞書作成方法。
5. 請求項１〜４に記載の生物種判定用の辞書作成方法で作成した辞書を用いて生物種を判定することを特徴とする生物種判定方法。

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