JP2002357606A

JP2002357606A - 核酸のハイブリダイゼーション親和性を予測するための方法およびコンピューターソフトウエア製品

Info

Publication number: JP2002357606A
Application number: JP2001355292A
Authority: JP
Inventors: Nathaniel Hunt; ハントナサニエル
Original assignee: Affymetrix Inc
Current assignee: Affymetrix Inc
Priority date: 2000-11-21
Filing date: 2001-11-20
Publication date: 2002-12-13
Also published as: EP1209612A3; CA2363518A1; US20060178842A1; EP1209612A2

Abstract

(57)【要約】【課題】核酸ハイブリダイゼーション親和性を予測す
るための方法およびコンピューターソフトウエア製品を
提供することである。【解決手段】核酸ハイブリダイゼーション親和性を予
測するための方法およびコンピューターソフトウエア製
品を提供する。１つの実施形態において、ハイブリダイ
ゼーション強度（Ｉ）は、Ｉ＝ｅｘｐ［Σ_iＰ_iＳ_i］を
使用して決定される。ここでＰｉはｉ番目パラメーター
の値であり、Ｓｉはプローブの配列に由来する値であ
る。本発明の方法は、変異体検出、プローブ選択および
プローブアレイ製造品質調節を増強するために使用され
得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、米国国立衛生研究
所から助成金番号で政府の援助の下でなされた。
従って、米国政府は、本発明において一定の権利を有す
る。

【０００２】本発明は、ＤＮＡマイクロアレイデータを
解析するための方法、およびＤＮＡマイクロアレイを設
計するための方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】米国特許第５，４２４，１８６号は、特
に、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ペプチド、多糖、お
よび他の物質のような分子の高密度アレイを形成し、そ
して使用するための草分けとなる技術を記載する。本特
許は、本明細書によって、あらゆる目的のために参考と
して援用される。

【０００４】例えば、オリゴヌクレオチドまたはペプチ
ドのアレイは、表面から光除去可能な基を逐次的に除去
し、モノマーを表面の露出領域にカップリングし、そし
てこのプロセスを反復することにより、表面上に形成さ
れる。これらの技術は、オリゴヌクレオチド、ペプチ
ド、および他の物質の極度に密なアレイを形成するため
に使用されてきた。本発明と関連した合成技術は、「Ｖ
ＬＳＩＰ^TM」または「非常に大規模な固定化ポリマー合
成（ＶｅｒｙＬａｒｇｅＳｃａｌｅＩｍｍｏｂｉ
ｌｉｚｅｄＰｏｌｙｍｅｒＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）」
技術として知られるようになった。

【０００５】このようなアレイを形成し、そして使用す
るためのさらなる技術は、米国特許第５，３８４，２６
１号および同第６，０４０，１９３号（これらもまた、
あらゆる目的のために参考として援用される）に記載さ
れている。このような技術は、基材（またはチップ）の
部分を機械的に保護するためのシステム、および材料を
選択的に脱保護し／基材にカップリングするためのシス
テムを含む。アレイ合成のためのなおさらなる技術が、
米国特許出願第０８／３２７，５１２号（これもまた、
本明細書中にあらゆる目的のために参考として援用され
る）において提供される。

【０００６】核酸プローブアレイは、遺伝子発現モニタ
リング、遺伝子型分類、および変異検出における広範な
適用が見出された。例えば、核酸アレイ技術を用いる大
規模並行遺伝子発現モニタリング法が、多数の遺伝子の
発現をモニタリングするために開発された（例えば、米
国特許第５，８７１，９２８号、同第５，８００，９９
２号および同第６，０４０，１３８号；ｄｅＳａｉｚ
ｉｅｕら，１９９８，ＢａｃｔｅｒｉａＴｒａｎｓｃ
ｒｉｐｔＩｍａｇｉｎｇｂｙＨｙｂｒｉｄｉｚａ
ｔｉｏｎｏｆｔｏｔａｌＲＮＡｔｏＯｌｉｇ
ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＡｒｒａｙｓ，ＮＡＴＵＲＥ
ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１６：４５−４８；
Ｗｏｄｉｃｋａら，１９９７，Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ
ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇｉｎ
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，
ＮＡＴＵＲＥＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ１５：１
３５９−１３６７；Ｌｏｃｋｈａｒｔら，１９９６，Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇｂｙＨ
ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｔｏＨｉｇｈＤｅｎｓ
ｉｔｙＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＡｒｒａｙ
ｓ．ＮＡＴＵＲＥＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ１４：
１６７５−１６８０；Ｌａｎｄｅｒ，１９９９，Ａｒ
ｒａｙｏｆＨｏｐｅ，ＮＡＴＵＲＥ−ＧＥＮＥＴ
ＩＣＳ，２１（補遺），ａｔ３，（これら全ては、
本明細書中にあらゆる目的のために参考として援用され
る））。高密度オリゴヌクレオチドアレイ（ＤＮＡチッ
プ）を用いる高スループット変異解析のためのハイブリ
ダイゼーションに基づく方法が開発された（Ｈａｃｉａ
ら，１９９６，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｈｅｔｅｒ
ｏｚｙｇｏｕｓｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎＢＲＣＡ
１ｕｓｉｎｇｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙｏｌｉｇｏ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｒｒａｙｓａｎｄｔｗｏ−
ｃｏｌｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｎａｌｙｓ
ｉｓ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１４：４４１−４４７，Ｈ
ａｃｉａら，ＮｅｗａｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏＢ
ＲＣＡ１ｍｕｔａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｂ
ｒｅａｓｔＤｉｓｅａｓｅ１０：４５−５９ａｎ
ｄＲａｍｓｅｙ１９９８，ＤＮＡｃｈｉｐｓ：Ｓｔ
ａｔｅ−ｏｆ−Ａｒｔ，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ．１６：４０−４４を参照のこと、これら全ては、本
明細書中にあらゆる目的のために参考として援用され
る）。オリゴヌクレオチドアレイは、例えば、ＣＦＴＲ
遺伝子（米国特許第６，０２７，８８０号、Ｃｒｏｎｉ
ｎら，１９９６，Ｃｙｓｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓｍ
ｕｔａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｂｙｈｙｂｒ
ｉｄｉｚａｔｉｏｎｔｏｌｉｇｈｔ−ｇｅｎｅｒａ
ｔｅｄＤＮＡｐｒｏｂｅａｒｒａｙｓ．Ｈｕｍ．
Ｍｕｔ．７：２４４−２５５（両方とも、参考として援
用される））、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）逆
転写酵素およびプロテアーゼ遺伝子（米国特許第５，８
６２，２４２号、およびＫｏｚａｌら，１９９６，Ｅｘ
ｔｅｎｓｉｖｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｏｂｓ
ｅｒｖｅｄｉｎＨＩＶ−１ｃｌａｄｅＢｐｒ
ｏｔｅａｓｅｇｅｎｅｕｓｉｎｇｈｉｇｈｄｅｎ
ｓｉｔｙｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｒｒａ
ｙｓ．ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．１：７３５−７５９（両
方とも、本明細書中にあらゆる目的のために参考として
援用される））、ミトコンドリアゲノム（Ｃｈｅｅら、
１９９６，Ａｃｃｅｓｓｉｎｇｇｅｎｅｔｉｃｉｎ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎｗｉｔｈｈｉｇｈｄｅｎｓｉ
ｔｙＤＮＡａｒｒａｙｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２７
４：６１０−６１４）およびＢＲＣＡ１遺伝子（米国特
許第６，０１３，４４９号（これは、本明細書中にあら
ゆる目的のために参考として援用される）における配列
のバリエーションをスクリーニングするために使用され
てきた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＤＮＡマイ
クロアレイデータを解析するための方法、およびＤＮＡ
マイクロアレイを設計するための方法に関する。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、遺伝子発現を
モニタリングするプローブを選択するためのコンピュー
ターで実行される方法に関し、方法は、ａ）複数の候補
プローブおよびそれらの対応するコントロールプローブ
のハイブリダイゼーション強度を予測する工程；および
ｂ）その対応するコントロールプローブに対して最も高
い強度差を有する候補プローブを選択する工程、を包含
する。

【０００９】好適な実施形態においては、上記ハイブリ
ダイゼーション強度（Ｉ）が、以下の式：

【００１０】

【数５】を使用して決定される方法であって、ここでＰｉが、ｉ
番目のパラメーターの値であり、そしてＳｉが、そのプ
ローブの配列に由来する値である。

【００１１】好適な実施形態においては、上記Ｐｉが、
Ａ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群より選択される参照塩基
に比較しての、上記配列の所定の位置における塩基の自
由エネルギーである。

【００１２】好適な実施形態においては、上記Ｓｉが上
記配列の汎関数である。

【００１３】好適な実施形態においては、上記Ｐｉが経
験的に決定される。

【００１４】好適な実施形態においては、上記Ｐｉが、
トレーニングデータセットを使用する最小二乗フィット
によって決定される。

【００１５】好適な実施形態においては、Ｐｉが、Ｃｈ
ｏｌｅｓｋｙ分解を使用して決定される。

【００１６】好適な実施形態においては、所定のヌクレ
オチド型についての上記Ｓｉが、プローブ塩基数の平滑
化関数で置換される。

【００１７】好適な実施形態においては、上記平滑化関
数が多項関数である。

【００１８】好適な実施形態においては、所定のヌクレ
オチド型についての上記Ｓｉが、中心位置に対する塩基
の差の平滑化関数で置換される。

【００１９】好適な実施形態においては、上記平滑化関
数が多項関数である。

【００２０】好適な実施形態においては、上記式が、プ
ローブ−プローブハイブリダイゼーションを記述する少
なくとも１つのパラメーターを含む。

【００２１】好適な実施形態においては、上記式が、ヘ
アピン形成を記述する少なくとも１つのパラメーターを
含む。

【００２２】好適な実施形態においては、上記式が、最
隣接相互作用を記述するパラメーターを含む。

【００２３】好適な実施形態においては、上記Ｐｉが特
異値分解を使用して決定される。

【００２４】本発明はまた、その標的に対するプローブ
のハイブリダイゼーション親和性を予測するためのコン
ピューターで実行される方法に関し、方法は、以下の
式：

【００２５】

【数６】を使用してハイブリダイゼーション強度（Ｉ）を計算す
る工程を包含し、ここで、Ｐｉがｉ番目のパラメーター
の値であり、そしてＳｉがそのプローブの配列に由来す
る値である。

【００２６】好適な実施形態においては、上記Ｐｉが、
Ａ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群より選択される参照塩基
に比較しての、上記配列の所定の位置における塩基の自
由エネルギーである。

【００２７】好適な実施形態においては、上記Ｓｉが上
記配列の汎関数である。

【００２８】好適な実施形態においては、上記Ｐｉが経
験的に決定される。

【００２９】好適な実施形態においては、上記Ｐｉが、
トレーニングデータセットを使用する最小二乗フィット
によって決定される。

【００３０】好適な実施形態においては、Ｐｉが、Ｃｈ
ｏｌｅｓｋｙ分解を使用して決定される。

【００３１】好適な実施形態においては、所定のヌクレ
オチド型についての上記Ｓｉが、プローブ塩基数の平滑
化関数で置換される。

【００３２】好適な実施形態においては、上記平滑化関
数が多項関数である。

【００３３】好適な実施形態においては、所定のヌクレ
オチド型についての上記Ｓｉが、中心位置に対する塩基
の差の平滑化関数で置換される。

【００３４】好適な実施形態においては、上記平滑化関
数が多項関数である。

【００３５】好適な実施形態においては、上記式が、プ
ローブ−プローブハイブリダイゼーションを記述する少
なくとも１つのパラメーターを含む。

【００３６】好適な実施形態においては、上記式が、ヘ
アピン形成を記述する少なくとも１つのパラメーターを
含む。

【００３７】好適な実施形態においては、上記式が、最
隣接相互作用を記述するパラメーターを含む。

【００３８】好適な実施形態においては、上記Ｐｉが特
異値分解を使用して決定される。

【００３９】好適な実施形態においては、上記プローブ
が固相基材上に固定化される。

【００４０】本発明はまた、その標的に対するプローブ
のハイブリダイゼーション親和性を予測するためのコン
ピューターソフトウエア製品に関し、製品は、以下の
式：

【００４１】

【数７】を使用してハイブリダイゼーション強度（Ｉ）を計算す
るためのコンピュータープログラムコード、ここでＰｉ
がｉ番目のパラメーターの値であり、そしてＳｉがその
プローブの配列に由来する値であり；およびコンピュー
タープログラムコードを格納するコンピューターで読み
取り可能な媒体、を備えるコンピューターソフトウエア
製品に関する。

【００４２】好適な実施形態においては、上記Ｐｉが、
Ａ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群より選択される参照塩基
に比較しての、上記配列の所定の位置における塩基の自
由エネルギーである。

【００４３】好適な実施形態においては、上記Ｓｉが上
記配列の汎関数である。

【００４４】好適な実施形態においては、上記Ｐｉが経
験的に決定される。

【００４５】好適な実施形態においては、上記Ｐｉが、
トレーニングデータセットを使用する最小二乗フィット
によって決定される。

【００４６】好適な実施形態においては、Ｐｉが、Ｃｈ
ｏｌｅｓｋｙ分解を使用して決定される。

【００４７】好適な実施形態においては、所定のヌクレ
オチド型についての上記Ｓｉが、プローブ塩基数の平滑
化関数で置換される。

【００４８】好適な実施形態においては、上記平滑化関
数が多項関数である。

【００４９】好適な実施形態においては、所定のヌクレ
オチド型についての上記Ｓｉが、中心位置に対する塩基
の差の平滑化関数で置換される。

【００５０】好適な実施形態においては、上記平滑化関
数が多項関数である。

【００５１】好適な実施形態においては、上記式が、プ
ローブ−プローブハイブリダイゼーションを記述する少
なくとも１つのパラメーターを含む。

【００５２】好適な実施形態においては、上記式が、ヘ
アピン形成を記述する少なくとも１つのパラメーターを
含む。

【００５３】好適な実施形態においては、上記式が、最
隣接相互作用を記述するパラメーターを含む。

【００５４】好適な実施形態においては、上記Ｐｉが特
異値分解を使用して決定される。

【００５５】本発明はまた、遺伝子発現をモニタリング
するプローブを選択するためのコンピューターソフトウ
エア製品に関し、製品は、複数の候補プローブおよびそ
れらの対応するコントロールプローブのハイブリダイゼ
ーション強度を予測するためのコンピュータープログラ
ムコード；対応するコントロールプローブに対して最も
強い強度差を有する候補プローブを選択するためのコン
ピュータープログラムコード；およびコードを格納する
ためのコンピューターで読み取り可能な媒体、を備える
コンピューターソフトウエア製品に関する。

【００５６】好適な実施形態においては、コンピュータ
ーソフトウエア製品に関し、ここでハイブリダイゼーシ
ョン強度（Ｉ）を予測するための上記コンピューターコ
ードが、以下の式：

【００５７】

【数８】を使用して計算するためのコードを備え、ここで、Ｐｉ
がｉ番目のパラメーターの値であり、そしてＳｉがその
プローブの配列に由来する値である、コンピューターソ
フトウエア製品に関する。

【００５８】好適な実施形態においては、上記Ｐｉが、
Ａ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群より選択される参照塩基
に比較しての、上記配列の所定の位置における塩基の自
由エネルギーである。

【００５９】好適な実施形態においては、上記Ｓｉが上
記配列の汎関数である。

【００６０】好適な実施形態においては、上記Ｐｉが経
験的に決定される。

【００６１】好適な実施形態においては、上記Ｐｉが、
トレーニングデータセットを使用する最小二乗フィット
によって決定される。

【００６２】好適な実施形態においては、Ｐｉが、Ｃｈ
ｏｌｅｓｋｙ分解を使用して決定される。

【００６３】好適な実施形態においては、所定のヌクレ
オチド型についての上記Ｓｉが、プローブ塩基数の平滑
化関数で置換される。

【００６４】好適な実施形態においては、上記平滑化関
数が多項関数である。

【００６５】好適な実施形態においては、所定のヌクレ
オチド型についての上記Ｓｉが、中心位置に対する塩基
の差の平滑化関数で置換される。

【００６６】好適な実施形態においては、上記平滑化関
数が多項関数である。

【００６７】好適な実施形態においては、上記式が、プ
ローブ−プローブハイブリダイゼーションを記述する少
なくとも１つのパラメーターを含む。

【００６８】好適な実施形態においては、上記式が、ヘ
アピン形成を記述する少なくとも１つのパラメーターを
含む。

【００６９】好適な実施形態においては、上記式が、最
隣接相互作用を記述するパラメーターを含む。

【００７０】好適な実施形態においては、上記Ｐｉが特
異値分解を使用して決定される。

【００７１】

【発明の実施の形態】（発明の要旨）本発明は、その標
的に対する核酸プローブのハイブリダイゼーション親和
性を推定するための方法およびソフトウェア製品を提供
する。好ましい実施形態では、プローブは、固体基材上
に固定化される。最も好ましい実施形態では、プローブ
は、核酸プローブアレイの一部であり、例えば、ガラス
基材上、光ファイバーまたはビーズ上の合成オリゴヌク
レオチドである。本方法およびソフトウェアは、変異検
出を増強すること、プローブアレイのためのプローブを
選択すること、およびプローブアレイ製造プロセスの品
質管理を増強することにおいて広い適用を有する。

【００７２】本発明の１つの局面では、その標的に対し
てプローブのハイブリダイゼーション親和性を予測する
ためのコンピューター実行方法が提供される。この方法
は、ハイブリダイゼーション強度（Ｉ）を以下の式を用
いて計算する工程：

【００７３】

【数９】（ここで、Ｐｉは、ｉ番目のパラメーターの値であり、
そしてＳｉは、プローブの配列に由来する値である）を
含む。いくつかの実施形態では、Ｐｉは、Ａ、Ｃ、Ｇ、
およびＴからなる群から選択される参照塩基に比較し
た、配列の所定の位置における塩基の自由エネルギーで
ある。Ｓｉは、上記配列の汎関数（ｆｕｎｃｔｉｏｎａ
ｌ）であり得る。Ｐｉは、経験的に、例えば、トレーニ
ングデータセットの最小二乗フィットを用いて、決定さ
れ得る。Ｐｉ値は、Ｃｈｏｌｅｓｋｙ分解を用いて決定
され得る。いくつかの実施形態では、所定のヌクレオチ
ド型についてのＳｉは、プローブ塩基数の平滑化関数で
置換される。この平滑化関数は、多項関数であり得る。
いくつかの他の実施形態では、所定のヌクレオチド型に
ついてのＳｉは、中心位置に対する塩基の差の平滑化関
数で置換される。いくつかのさらなる実施形態では、こ
の式は、プローブ−プローブハイブリダイゼーションを
記述する少なくとも１つのパラメーターおよび／または
ヘアピン形成を記述する少なくとも１つのパラメーター
を含む。いくつかの他の好ましい実施形態では、式は、
最隣接相互作用を記述するパラメーターを含む。このよ
うな実施形態では、Ｐｉ値は、特異値分解を用いて決定
され得る。

【００７４】本発明の別の局面では、遺伝子発現モニタ
リングについてのプローブを選択するためのコンピュー
ター実行方法が提供される。この方法は、複数の候補プ
ローブおよびそれらの対応するコントロールプローブの
ハイブリダイゼーション強度を予測する工程；ならびに
その対応するコントロールプローブを超える最も高い強
度差を有する候補プローブを選択する工程を含む。ある
いは、この強度差は、直接的に予測され得る。

【００７５】ハイブリダイゼーション強度（Ｉ）は、以
下の式を用いて決定される：

【００７６】

【数１０】ここでＰｉはｉ番目のパラメーターの値であり、Ｓｉ
は、プローブの配列に由来する値である。Ｐｉは、Ａ、
Ｃ、Ｇ、およびＴからなる群より選択される参照塩基と
比較した、上記配列の所定の位置の塩基の自由エネルギ
ーである。Ｓｉは、プローブの配列の汎関数である。Ｐ
ｉは、経験的に、例えば、トレーニングデータセットの
最小二乗フィットを用いて決定される。Ｐｉ値は、Ｃｈ
ｏｌｅｓｋｙ分解を用いて決定され得る。いくつかの実
施形態において、所定のヌクレオチド型についてのＳｉ
は、プローブ塩基数の平滑化関数で置換される。典型的
な平滑化関数には、多項関数が含まれる。いくつかの他
の実施形態において、所定のヌクレオチド型についての
Ｓｉは、中心位置に対する塩基の差の平滑化関数で置換
される。いくつかのさらなる実施形態において、この式
は、プローブ−プローブハイブリダイゼーションを記述
する少なくとも１つのパラメーター、ヘアピン形成を記
述する少なくとも１つのパラメーター、および／または
最隣接相互作用を記述するパラメーターを含む。この式
が最隣接相互作用を記述するパラメーターを含む場合、
Ｐｉ値は、特異値分解を使用して決定され得る。

【００７７】本発明の別の局面において、その標的に対
するプローブのハイブリダイゼーション親和性を予測す
るためのコンピュータソフトウェア製品が提供される。
そのソフトウェアは、種々の適切なコンピュータプログ
ラミング言語（例えば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｆｏｒｔｒａｎ、
Ｂａｓｉｃ、およびＪａｖａ（登録商標））のいずれか
で書かれ得る。ソフトウェアコンポーネント（例えば、
Ｊａｖａ（登録商標）Ｂｅａｎｓ、ｅｎｔｅｒｐｒｉｓ
ｅＪａｖａ（登録商標）Ｂｅａｎｓなど）は、本発
明のソフトウェア製品のアーキテクチャの一部として使
用され得る。

【００７８】そのソフトウェア製品は、以下の式：

【００７９】

【数１１】を用いて、ハイブリダイゼーション強度（Ｉ）を計算す
るためのコンピュータプログラムコードを含み、ここで
Ｐｉはｉ番目のパラメーターの値であり、Ｓｉはプロー
ブの配列およびコンピュータプログラムコードを格納す
るためのコンピュータ読みとり可能な媒体に由来する値
である。当業者は、計算の結果を示すコードもまた含ま
れ得ることを理解する。Ｐｉは、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ
からなる群より選択される参照塩基と比較した、上記配
列の所定の位置の塩基の自由エネルギーである。Ｓｉは
配列の汎関数である。Ｐｉは、経験的に、例えば、トレ
ーニングデータセットを用いる最小二乗フィットによっ
て、Ｃｈｏｌｅｓｋｙ分解を用いて決定される。いくつ
かの実施形態において、所定のヌクレオチド型について
のＳｉは、プローブ塩基数の平滑化関数（例えば、多項
関数）で置換される。いくつかの他の実施形態におい
て、所定のヌクレオチド型についてのＳｉは、中心位置
に対する塩基の差の平滑化関数で置換される。いくつか
の実施形態において、この式は、プローブ−プローブハ
イブリダイゼーションを記述する少なくとも１つのパラ
メーター、ヘアピン形成を記述する少なくとも１つのパ
ラメーター、および／または最隣接相互作用を記述する
パラメーターを含む。この式が最隣接相互作用を記述す
るパラメーターを含む場合、Ｐｉ値は、特異値分解を使
用して決定される。

【００８０】本発明のなお別の局面において、遺伝子発
現モニタリングのためにプローブを選択するためのコン
ピュータソフトウェア製品が提供される。このソフトウ
ェア製品は、複数の候補プローブおよびそれらの対応す
るコントロールプローブのハイブリダイゼーション強度
を予測するためのコンピュータプログラムコード；対応
するコントロールプローブを超えて最も高い強度差を有
する候補プローブを選択するためのコンピュータプログ
ラムコード；およびそのコードを格納するためのコンピ
ュータ読みとり可能な媒体を含む。ハイブリダイゼーシ
ョン強度（Ｉ）を予測するためのコンピュータコード
は、以下の式：

【００８１】

【数１２】を用いて計算するためのコードを含み、ここでＰｉはｉ
番目のパラメーターの値であり、Ｓｉは上記プローブの
配列に由来する値である。いくつかの実施形態におい
て、Ｐｉは、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴからなる群より選択
される参照塩基と比較した、上記配列の所定の位置の塩
基の自由エネルギーである。Ｓｉは、プローブの配列の
汎関数である。Ｐｉ値は、経験的に、例えば、Ｃｈｏｌ
ｅｓｋｙ分解を用いるトレーニングデータセットの最小
二乗フィットによって決定される。所定のヌクレオチド
型についてのＳｉは、プローブ塩基数の平滑化関数で置
換される。その平滑化関数は、多項関数であり得る。他
の実施形態において、所定のヌクレオチド型についての
Ｓｉは、中心位置に対する塩基の差の平滑化関数で置換
される。いくつかの実施形態において、この式は、プロ
ーブ−プローブハイブリダイゼーションを記述する少な
くとも１つのパラメーター、ヘアピン形成を記述する少
なくとも１つのパラメーター、および／または最隣接相
互作用を記述するパラメーターを含み得る。この式が最
隣接相互作用を記述するパラメーターを含む場合、Ｐｉ
値は、特異値分解を使用して決定され得る。

【００８２】（好適な実施形態の詳細な説明）ここで、
本発明の好適な実施形態を詳細に述べる。本発明は、好
適な実施形態に関連して記載されるが、そのことが本発
明をこれらの実施形態に限定することを意図するもので
はないことが理解される。逆に、本発明は、本発明の精
神および範囲に包含され得る、代替物、変更物、および
均等物を網羅することが意図される。

【００８３】当業者に理解されるように、本発明は、方
法、データ処理システム、またはプログラム製品として
具現化され得る。したがって、本発明は、データ解析シ
ステム、方法、解析ソフトウエア、などの形態を採り得
る。本発明に従って記述されたソフトウエアは、ある種
の形態のコンピュータで読み取り可能な媒体（例えば、
メモリまたはＣＤＲＯＭ）に格納されるか、またはネ
ットワーク上で伝送され、そしてプロセッサにより実行
されべきである。

【００８４】コンピュータソフトウエア製品は、種々の
適切なプログラミング言語（例えば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｆｏ
ｒｔｒａｎ、およびＪａｖａ（登録商標））のうちの任
意のもので記述され得る。コンピュータソフトウエア製
品はデータ入力およびデータディスプレイモジュールを
有する独立のアプリケーションであり得る。あるいは、
コンピュータソフトウエア製品は、配布されたオブジェ
クトとしてインスタンス化され得るクラスであり得る。
コンピュータソフトウエア製品はまた、コンポーネント
ソフトウエア（例えば、Ｊａｖａ（登録商標）Ｂｅａ
ｎｓ、ＥｎｔｅｒｐｒｉｓｅＪａｖａ（登録商標）
Ｂｅａｎｓ（ＥＪＢ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商
標）ＣＯＭ／ＤＣＯＭなど）であり得る。

【００８５】図１は、本発明の実施形態のソフトウエア
を実行するために使用され得るコンピュータシステムの
例を示す。図１は、ディスプレイ３、スクリーン５、キ
ャビネット７、キーボード９、およびマウス１１を備え
るコンピュータシステム１を示す。マウス１１は、グラ
フィカルユーザーインターフェイスでインターラクトす
るため１またはそれ以上のボタンを有し得る。キャビネ
ット７は、本発明を実施するコンピュータコード組み込
みソフトウエアプログラム、本発明と共に使用するため
のデータなどを格納および取り出すために利用され得
る、ＣＤ−ＲＯＭまたはＤＶＤ−ＲＯＭドライブ１３、
システムメモリおよびハードドライブ（図２を参照）を
収納する。ＣＤ１５は例示的なコンピュータ読み取り可
能媒体として示されるが、他のコンピュータ読み取り可
能記録媒体（フロッピー（登録商標）ディスク、テー
プ、フラッシュメモリ、システムメモリ、およびハード
ドライブを含む）が利用され得る。さらに、（例えば、
インターネットを含むネットワークにおいて）搬送波中
に具現化されるデータ信号が、コンピュータ読み取り可
能記録媒体であり得る。

【００８６】図２は、本発明の実施形態のソフトウエア
を実行するために使用されるコンピュータシステム１の
システムブロック線図を示す。図１のように、コンピュ
ータシステム１は、モニタ３、キーボード９、およびマ
ウス１１を備える。コンピュータシステム１はさらにサ
ブシステム（例えば、中央処理装置５１、システムメモ
リ５３、固定記憶装置５５（例えば、ハードドライ
ブ）、取り外し可能記憶装置５７（例えば、ＣＤ−ＲＯ
Ｍ）、ディスプレイアダプタ５９、サウンドカード６
１、スピーカ６３、およびネットワークインターフェー
ス６５）を備える。本発明と共に使用するに適切な他の
コンピュータシステムは、追加のサブシステムを備えて
もよいし、より少ないサブシステムを備えていてもよ
い。例えば、別のコンピュータシステムは、１より多い
プロセッサ５１を備えてもよいし、キャッシュメモリを
備えていてもよい。本発明と共に使用するに適切なコン
ピュータシステムはまた、測定器具に組み込まれ得る。

【００８７】（Ｉ．用語解説）「核酸」は、本発明に従
えば、ヌクレオシドまたはヌクレオチド（ピリミジン塩
基およびプリン塩基、好ましくはそれぞれ、シトシン、
チミン、およびウラシル、ならびに、アデニンおよびグ
アニンを含む）の任意のポリマーもしくはオリゴマーを
含み得る。ＡｌｂｅｒｔＬ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐ
ＲＩＮＣＩＰＬＥＳＯＦＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲ
Ｙ、７９３−８００頁（ＷｏｒｔｈＰｕｂ．１９８
２）を参照。確かに、本発明は、任意のデオキシリボヌ
クレオチド、リボヌクレオチドまたはペプチド核酸成
分、およびそれらの任意の化学的改変体（例えば、メチ
ル化、ヒドロキシメチル化またはグルコシル化形態のこ
れらの塩基）などを企図する。ポリマーまたはオリゴマ
ーは、組成において不均質であり得るし、均質でもあり
得、そして天然に存在する供給源から単離され得るか、
または人工的もしくは化学的に製造され得る。米国特許
出願第０８／６３０，４２７号（あらゆる目的のために
その全体が参考として本明細書中で援用される）を参
照。さらに、核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそ
れらの混合物であり得、そして一本鎖もしくは二本鎖の
形態（ホモ二重鎖、ヘテロ二重鎖、およびハイブリッド
状態を含む）で永続的もしくは一過性に存在し得る。オ
リゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドはこの定義に
含まれ、そしてポリヌクレオチド中の２以上の核酸を指
す。

【００８８】「プローブ」は、本明細書中で使用される
場合、１以上の型の化学結合により、通常は相補的塩基
対形成により、通常は水素結合形成により、相補的配列
の標的核酸に結合し得る核酸（例えば、オリゴヌクレオ
チド）として定義される。本明細書中で使用される場
合、プローブは天然塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、
またはＴ）または改変塩基（７−デアザグアノシン、イ
ノシンなど）を含み得る。さらに、プローブ中の塩基
は、それがハイブリダイゼーションを妨げない限り、ホ
スホジエステル結合以外の連結により結合され得る。し
たがって、プローブは、構成塩基がホスホジエステル連
結よりむしろペプチド結合により結合されているペプチ
ド核酸であり得る。

【００８９】「標的核酸」は、これに対し特異的にハイ
ブリダイズするようプローブが設計された核酸（しばし
ば生物学的サンプルに由来する）をいう。検出されるべ
きは標的核酸の存在または不在であるか、または定量さ
れるべきは標的核酸の量である。標的核酸は、その標的
に指向させた対応するプローブの核酸配列に相補的であ
る配列を有する。用語標的核酸は、プローブを指向させ
た、より長い核酸の特異的な部分配列をいってもよい
し、またはその発現レベルを検出することが所望される
全体配列（例えば、遺伝子またはｍＲＮＡ）をいっても
よい。用法の差は文脈から明らかになる。

【００９０】「アレイ」は、固体支持体に付着したペプ
チドまたは核酸プローブを有するその固体支持体を含み
得る。アレイは、代表的には、基材の表面に異なる既知
の位置に結合した、複数の異なる核酸またはペプチドプ
ローブを含む。これらのアレイ（「マイクロアレイ」ま
たは口語表現では「チップ」とも記述される）は、当該
分野において、例えば、米国特許第５，１４３，８５４
号、同第５，４４５，９３４号、同第５，７４４，３０
５号、同第５，６７７，１９５号、同第６，０４０，１
９３号、同第５，４２４，１８６号、およびＦｏｄｏｒ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７−７７７（１９９
１）に一般的に記載されている。これらのそれぞれがあ
らゆる目的のためにその全体が参考として援用される。
これらのアレイは、一般に、機械的合成法、または写真
平板法と固相合成法との組合せを組み入れる光指向合成
法を使用して作製され得る。機械的合成法を使用するこ
れらアレイの合成技術は、例えば、米国特許第５，３８
４，２６１号および同第６，０４０，１９３号（これら
はあらゆる目的のためにその全体が本明細書中で参考と
して援用される）に記載されている。平面アレイ表面が
好ましいが、アレイは、実質的に任意の形状の表面上
に、あるいは複数の表面上にさえ組み立てられ得る。ア
レイは、ビーズ、ゲル、ポリマー性表面、ファイバー
（例えば、光ファイバー）、ガラス、または任意の他の
適切な基材（米国特許第５，７７０，３５８号、同第
５，７８９，１６２号、同第５，７０８，１５３号、同
第６，０４０，１９３号および同第５，８００，９９２
号（あらゆる目的のためにその全体が本明細書によって
参考として援用される）を参照）上のペプチドまたは核
酸であり得る。アレイは、全てを含んだデバイス（例え
ば、米国特許第５，８５６，１７４号および同第５，９
９２，５９１号および同第５，９４５，３３４号（あら
ゆる目的のためにその全体が本明細書中で参考として援
用される）を参照）における診断またはその他の操作を
可能にする様式でパッケージされ得る。アレイ、その製
造、およびその特徴に関するさらなる情報については、
米国特許出願第０９／５４５，２０７号（あらゆる目的
のためにその全体が本明細書中で参考として援用され
る）もまた参照。これはあらゆる目的のためにその全体
が本明細書中で参考として援用される。

【００９１】（ＩＩ．モデルおよびコンピュータによる
方法）本発明は、部分的に、核酸ハイブリダイゼーショ
ンの配列依存性のモデルに基づく。本発明の１つの局面
は、核酸プローブ間のハイブリダイゼーション親和性を
予測するための方法、システムおよびソフトウェア製品
を提供する。この方法、システムおよびソフトウェア製
品は、ヘテロ接合性変異の検出のためにフットプリント
のシグナル損失を増強するため、および遺伝子発現チッ
プの設計のためにプローブ強度を予測するために、特に
有用である。この研究はまた、他の強度標準化アプリケ
ーション、チップ製造の品質管理、およびチップ上のハ
イブリダイゼーションの熱力学の基礎的理解における広
範な適用を見出す。

【００９２】ハイブリダイゼーションの傾向が、プロー
ブ配列に由来するエネルギーパラメーターによって記載
され得、そしてハイブリダイゼーションのバリエーショ
ンおよびチップ製造条件が、検出され得、そして補正さ
れ得る、これらのパラメーターにおける変化を生じる。

【００９３】本発明の１つの局面において、核酸ハイブ
リダイゼーションの親和性を予測するかまたはフィット
するための、エネルギーパラメーターを使用するモデル
を開発する。核酸ハイブリダイゼーションは、プローブ
および標的核酸を含み得る。プローブとは、一般に、標
的核酸を定性的または定量的に決定するために使用され
る核酸をいう。標的核酸は、目的の核酸である。標的分
子は、都合の良い自由エネルギーΔＧ（配列の関数であ
る）で、プローブとハイブリダイズする。プローブ分子
と標的分子との間のハイブリダイゼーション親和性は、
特定の測定値を反映し得る。例えば、プローブが固体基
材上に固定される場合、標的がマーカーで標識され得、
そして固定化基材と接触させられ得、そしてハイブリダ
イゼーションが起こり得る。ハイブリダイゼーション親
和性は、基材を洗浄した後に残存するマーカーの相対的
レベルを決定することによって測定され得る。好ましい
実施形態において、標的分子が、蛍光マーカーを用いて
標識される。蛍光強度を決定することによって、洗浄後
に残存する蛍光マーカーの量、従って、ハイブリダイゼ
ーション親和性が、決定され得る。なぜなら、この残存
する強度は、ハイブリダイゼーション親和性と比例する
からである。

【００９４】ハイブリダイゼーション親和性は、ボルツ
マンの式ｅｘｐ（ΔＧ／ＲＴ）で与えられ得、ここでＴ
は、絶対温度であり、そしてＲは気体定数である。従っ
て、強度の対数Ｉは、ΔＧに線形で相関する：ｌｏｇ（Ｉ）＝ｃ＋ΔＧ（式１）ここで、ｃは、定数であり、標的の濃度の対数と比例
し、そしてＲＴの単位に変換され得る（本明細書を通じ
て、「対数」とは、底ｅを有する自然対数をいう）。

【００９５】プローブ配列に対するΔＧの依存性は、非
常に複雑であり得るが、ΔＧについての比較的単純なモ
デルが、良好な結果を生じている。一般に、ΔＧは、以
下の形式のプローブ配列の関数である： ΔＧ（ｓｅｑ）＝Σ_iＰ_iＳ_I（式２）ここで、和を、１からパラメーターの数まで行う；以下
に説明するように、Ｐｉは、ｉ番目のパラメーターの値
であり、そしてＳ_Iは、プローブ配列に由来する値に対
応する。多次元空間中の点に対して、スカラー量の値を
割り当てる関数を、空間の汎関数と呼ぶ。Ｓ_Iの関数
は、プローブ配列の汎関数である。

【００９６】例えば、Ｓの値を与えることによって、５
マーのプローブについて使用し得る。パラメーターを各
プローブ配列位置およびヌクレオチドのタイプに割り当
てる場合、ＧＡＣＴＡ配列を有するプローブについて、
以下のＳの値について試み得る：

【００９７】

【表１】このモデルおよびデータは、相対的な自由エネルギーの
推定を可能にする。数学的には、上記のＳについての選
択は、配列を過剰に特定し、そして特異的な方程式を生
じる。各プローブ位置は、４つのヌクレオチドのタイプ
の１つを有するので、プローブの１つの位置について３
つの自由度のみが存在する。この問題に関して、多くの
可能な方法が存在する。いくつかの実施形態において、
この問題は、１つのヌクレオチドのタイプを参照として
選択して、より少ないパラメーターを使用することによ
って解決される。塩基Ｔを参照として選択する場合、Ｓ
値は、以下の通りである：

【００９８】

【表２】この説明において、Ｐ_iは、所定の位置における、同一
の位置でのＴと比較した塩基の自由エネルギーである。

【００９９】ΔＧ（ｓｅｑ）について選択された解析表
を用いて（すなわち、選択した関数Ｓ_iのセットを用い
て）、チップから１セットのデータにおける観察された
強度にベストフィットを与えるパラメーターの値を決定
し得る。フィット強度Ｉ_fitは、以下の式

【０１００】

【化１】のＩ_fitである。

【０１０１】ここで、合計が全体にわたる場合、パラメ
ーターＰ_iおよびＳ_iは、プローブ配列に対応する関数で
ある。このＰ_iは、以下の式

【０１０２】

【化２】を最小にするように選択される。

【０１０３】ここで、Ｉ_mdsは測定強度、Ｐ_iは決定され
るパラメーターであり、そしてＳｉは、各プローブ配列
から得られる。これは、測定強度の対数に対する最小二
乗フィットである。上記のようにＩ_fitを選択すること
により、線形最小二乗法がパラメーターを推定するため
に使用され得る。

【０１０４】Ｐ_iを決定するための最小二乗フィット
は、Ｃｈｏｌｅｓｋｙ分解（例えば、ＧｅｎｅＨ．Ｇ
ｏｌｕｂａｎｄＣｈａｒｌｅｓＦ．ｖａｎＬｏ
ａｎ：ＭａｔｒｉｘＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎｓ第２
版、ＴｈｅＪｏｈｎＨｏｐｌｉｎｓＵｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，１９８９（全ての目的のため
に、本明細書中で援用される）を参照のこと）を使用す
る正規方程式の直接解により、典型的なチップからの数
万のデータポイントに関して計算的に扱いやすい。いく
つかの数値的な方法のテキストが正規方程式の直接解に
対して警告するが、本発明者は、パラメーターが適切に
見積もられた場合に、単精度であったとしてもこれらが
模範的であることを見出した。好ましい実施形態では、
倍精度が使用され、そして数値的な問題は観測されなか
った。

【０１０５】いくつかの実施形態において、ハイブリダ
イゼーション親和性の測定値であるハイブリダイゼーシ
ョン強度は、以下の式：

【０１０６】

【数１３】を使用して推定される。このＰ_i値は、例えば、トレー
ニングデータセットを使用して得られる。一旦Ｐ_i値が
得られると、プローブのハイブリダイゼーション強度
は、式１を使用して計算される。当業者は、Ｐ_i値がハ
イブリダイゼーション条件（例えば、ハイブリダイゼー
ションおよび引き続く洗浄温度、イオン強度など）に依
存し得ることを理解する。従って、所定のＰ_i値は、所
定のハイブリダイゼーション条件にのみ適用可能であり
得る。

【０１０７】（ＩＩ．モデルの改良）当業者は、上記で
概要を述べたハイブリダイゼーションモデルについての
多くの可能性のある改変が存在することを理解する。第
１は、データを記載するのに必要とされるパラメーター
数を減少するための多項式フィットの使用である。第２
は、標的分子に対するヘアピン形成を記載するパラメー
ターの追加である。第３の改良は、ハイブリダイゼーシ
ョンの記載を改良するための「最隣接（ｎｅａｒｅｓｔ
ｎｅｉｇｈｂｏｒ）」パラメーターの使用である。

【０１０８】（Ａ．パラメーターの数の減少）特定の適
用およびデータのサイズに依存して、このフィットにお
けるパラメーターの数を減少することが所望され得る。
パラメーターを減少する１つの方法は、パラメーターの
セットをプローブ塩基数の平滑化関数を用いて、所定の
ヌクレオチド型に置き換えることである。５マーの例お
よび配列ＧＡＣＴＡを有するプローブに戻るために、二
次式にフィットするように選択し得る。各ヌクレオチド
型についてのエネルギー性パラメーターは、塩基数の二
次関数になるように採用される。Ｓの値は以下である：

【０１０９】

【表３】この提示は、５マーのプローブについてのパラメーター
の数を１６から１０に減少する。

【０１１０】数値的な理由から、１つの好ましい実行
は、上で与えられた実行とはわずかに異なる。このフィ
ットは、プローブの位置に対してではなく、中央位置か
らの差に対してなされ、そして単純な冪級数ではなく、
ルジャンドルの多項式が使用される。

【０１１１】２５マーのプローブについて、いくつかの
好ましい実施形態では、４次のルジャンドルの多項式が
使用され、多項式フィットを用いない場合の７６とは対
照的に、合計１６のパラメーターを生じた。

【０１１２】（Ｂ．プローブ−プローブハイブリダイゼ
ーションおよびヘアピン情報）データが上記規定にフィ
ットする場合、フィットされかつ測定された強度が一致
しない顕著な領域が存在する。これらの領域の多くは、
プローブハイブリダイゼーションまたは標的もしくはプ
ローブのいずれかにおけるヘアピン形成に起因する。本
発明の１つの局面では、プローブ−プローブスコアおよ
びヘアピンスコアを使用して、これらの現象のハイブリ
ダイゼーション強度に対する効果を記載する。この配列
における２つのスコアの差は、ヘアピンを形成するため
に少なくとも４つの塩基のループを有するはずである
が、一方、２分子のプローブ−プローブ相互作用のため
にそのような必要性は存在しない。

【０１１３】（Ｃ．最隣接パラメーター）ハイブリダイ
ゼーションの自由エネルギーは、関与する塩基の個性だ
けでなく、それらの順序にも依存する。特に、連続する
塩基間に有意なスタッキング効果が存在する。これらの
効果は、「最隣接」相互作用と呼ばれ、そしてこれら
は、異なるジヌクレオチド型に対して異なるハイブリダ
イゼーションの自由エネルギーを評価することにより定
量化され得る。従って、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼ
ーションは、通常、ＡＡ、ＡＣ、ＡＧ、ＡＴ、Ｃ
Ａ、．．．、ＴＧ、ＴＴについての１６の異なる自由エ
ネルギーを用いて記載される。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリ
ダイゼーション（溶液中）は、二本鎖の間の対称性に起
因して、８つのパラメーターしか必要としない。

【０１１４】フィットハイブリダイゼーションデータに
対して最隣接記載を適用することは、数学的な変化を必
要とする。上記モデルが、最隣接効果を含むように拡張
され、そして１−２位についてパラメーターをＡＡ、Ａ
Ｃ、ＡＧ、ＡＴ、ＣＡ、．．．、ＴＣ、ＴＧに当てはめ
（かつＴＴは基準としてそのままにする）、次いで２４
−２５位までの全ての位置について同じことを行う場
合、得られる正規方程式は、１つである。このことは、
パラメーターが、真の配列の空間より大きい空間を記載
することに起因する。例えば、１−２位にＡＡを、そし
て２−３位にＧＧを同時に有することは可能ではない
が、パラメーターはそのような状況を記載し得る。

【０１１５】１つの解は、Ｃｈｏｌｅｓｋｙ分解以外の
特異値分解を用いて正規方程式を解くことである。実際
には、コンピューターが、不可能な配列に対応するヌル
空間を排除する基礎セットを構築し、そして低次元空間
を保ったまま最適な解を見出す。

【０１１６】本発明の１つの局面では、コンピューター
ソフトウェア製品が提供され、ハイブリダイゼーション
強度予測を実行する。このソフトウェア製品は、以下の
式：

【０１１７】

【数１４】を使用する予測を実行するコードを含む。このコード
は、適切な媒体に格納され得、そして適切なデジタルコ
ンピューターにおいて実行され得る。いくつかの実施形
態では、この式は、プローブ−プローブ相互作用、ヘア
ピン形成、最隣接効果を説明するように改変され得る。
この式はまた、上記のようにパラメーターの数を減少す
るように改変され得る。

【０１１８】このソフトウェアは、Ｓｉを入力するコー
ドを含み得る。このＳｉは、プローブの配列に関与する
パラメーターである。Ｓ値の代入値を、表１〜３に例示
する。このソフトウェアはまた、Ｐｉ値を入力するため
のコードを含み得る。このＰｉ値は、上記のように経験
的に決定される。さらに、このソフトウェアは、プロー
ブに関して得られた強度値を表示するためのコードを含
み得る。１つの例示的なソフトウエア製品では、ソフト
ウェアは、プローブの配列を入力し、配列に基づくＳ値
を代入するようにコードが実行され、Ｐｉ値は、リレー
ショナルデータベースまたはフラットファイルから入力
される。強度値は計算され、そしてディスプレイに出力
されるか、またはソフトウェアの構成要素に使用され
る。例えば、強度値は、ソフトウェア製品の別のモジュ
ールにおけるプローブ選択（以下に記載される）のため
に使用され得る。

【０１１９】（ＩＩＩ．変異体検出への適用）本発明の
１つの局面において、上記で開発したハイブリダイゼー
ションのモデル、核酸ハイブリダイゼーションを予測す
るための方法およびコンピューターソフトウェアを、改
変して、２つの核酸プローブアレイの間のハイブリダイ
ゼーション条件または製造条件下でのバリエーションを
補正する。いくつかの実施形態において、この方法およ
びコンピューターソフトウェアを用いて変異体、特にヘ
テロ接合性変異体の検出を改善する。いくつかの好まし
い実施形態において、この方法およびソフトウェアを用
いて、所定の野生型配列のすべての可能性のある変異体
（置換、挿入および欠失）に対して感受性のシグナル損
失（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｓｉｇｎａｌ）アッセイの解析を
改善し得る。しかし、この方法およびソフトウェアはま
た、この変異型がタイル方式検出および変異体検出のよ
り詳細な記述のためにタイル化される場合、シグナルの
利得を検出するために適用され得る。例えば、以下を参
照のこと：タイル化プローブセットを設計、選択および
作製するための方法は、例えば、１９９５年５月４日公
開、ＷＯ９５／１１９９５（全ての目的のために参考と
して本明細書において援用される）に記載されている。
Ｈａｃｉａら（１９９６，「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ
ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓｍｕｔａｔｉｏｎｓｉ
ｎＢＲＣＡ１ｕｓｉｎｇｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔ
ｙｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｒｒａｙｓ
ａｎｄｔｗｏ−ｃｏｌｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃ
ｅａｎａｌｙｓｉｓ」Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１４：４
４１〜４４７）は、オン−チップ参照およびオフ−チッ
プ参照ならびに２つの異なる蛍光標識を利用するシグナ
ル損失アッセイを記載している。この「二色（ｔｗｏ−
ｃｏｌｏｒ）」アッセイにおいて、未知の標的サンプル
を１つの型の蛍光標識（例えば、赤）で標識するが、一
方、野生型の参照を、第２の蛍光標識（例えば、緑）で
標識する。第２のチップにおいて、野生型標的を赤およ
び緑の両方で標識し、そしてこのチップにハイブリダイ
ズする。標的に対して相補的であるように設計される各
々の完全マッチ（ｐｅｒｆｅｃｔ−ｍａｔｃｈ）プロー
ブについて、強度の比を、以下の式で算出する：比＝［Ｉ（１，ｗｔ，ｇｒｅｅｎ）Ｉ（２，ｗｔ，ｒｅ
ｄ）］／［Ｉ（１，ｕｎｋ，ｒｅｄ）Ｉ（２，ｗｔ，ｇ
ｒｅｅｎ）］（式４）ここで、Ｉ（１，ｕｎｋ，ｒｅｄ）は、チップ１上の未
知の標的の強度であり、Ｉ（１，ｗｔ，ｇｒｅｅｎ）
は、同じチップ上の野生型参照の強度であり、Ｉ（２，
ｗｔ，ｒｅｄ）は、参照チップ上の赤で標識した野生型
サンプルの強度であり、そしてＩ（２，ｗｔ，ｇｒｅｅ
ｎ）は、参照チップ上の緑で標識した野生型サンプルの
強度である。この比を、チップ間のバリエーションの効
果、および２つの型の蛍光標識の間の差に起因する効果
を無効にするように構築する。次いで、Ｈａｃｉａら
は、変異体の存在のシグナルに対する、この比の五つの
位置の移動するウインドウの平均をとった。変異体を示
すために、域値をこえるウインドウ−平均化比の値をと
った。

【０１２０】配列に基づく標準化スキームは、上記のエ
ネルギー性のパラメーターと比を（一色または二色のい
ずれかで）フィットさせる工程を包含する。ハイブリダ
イゼーション条件における差は、配列−標準化比が形成
される場合、大部分は無効にされる。ここで、Ｐｉは、
比に対するフィットのｉ番目のパラメーターであり、そ
してＳｉは、プローブ配列の値または機能に対応する。標準化比＝比^*ｅｘｐ［−［Σ_iＰ_iＳ_I］（式５）これを示す別の方法は、標準化比が比に対するフィット
で測定された比を割ったもの（すなわち、残存率）であ
るということである。この標準化は、一色アッセイの能
力の大いなる改善、および二色アッセイの能力における
より小幅な改善を生じる。配列に基づく標準化を用いる
一色アッセイの結果により、７つのサンプル中７つの真
の陽性のうち６つを生じた。この各々は、ＭＳＨ２およ
びＭＬＨ１遺伝子の３５エキソンおよび５．５ｋｂの配
列から構成される。これらの結果は、この方法が、予備
的スクリーニング（必要とされる、ゲルに基づく配列決
定の量を大きく制限する）として、その現在の形態にお
いて非常に有用であり得ることを示唆する。完全マッチ
プローブの複数のコピーを組み込む新しいチップ設計に
より、能力のさらなる改善が可能である。

【０１２１】二色アッセイは、配列に基づく標準化なし
に、非常に良好に実行する。誤差の率は十分低いようで
ある。それを特定するのに、そしてまたどんな改良型の
配列に基づく標準化が生じるかを特定するために、かな
り大量のデータ（おそらく数百サンプル）を必要とす
る。それにもかかわらず、シグナル対ノイズ比に基づ
く、配列に基づく標準化は、二色アッセイの誤差率を同
様に減らすようである。

【０１２２】（ＩＶ．遺伝子発現のためのプローブ選択
への適用）本明細書において開発されたモデルは、遺伝
子発現のためのプローブ選択に有用なプローブ強度の予
想を行い得る。

【０１２３】遺伝子発現モニタリングアレイの１つの実
行において（全ての目的のために参考として本明細書に
おいて援用される、米国特許第５，８００，９２２号お
よび同第６，０４０，１３８号を参照のこと）。それぞ
れの遺伝子をプローブ対の群により問い合わせる。それ
ぞれのプローブ対は、その標的に相補的であるように設
計されている（完全マッチ）プローブ、およびその標的
に対するミスマッチを含むように設計されているミスマ
ッチプローブから構成される。各プローブ対の強度の差
（完全マッチ−ミスマッチ）を、上記のモデルを用いて
推定する。図８は、このストラテジーの有効性を示す。
このデータは、遺伝子発現チップに対してハイブリダイ
ズされた酵母ｍＲＮＡ由来である。強度差をＢＲＣＡ１
データに対する最隣接フィットに基づいて予測する。こ
のプロットは、遺伝子発現チップの設計のためのプロー
ブを選択する手段として、予測された強度の差を用いる
効果を示す。強度の差が大きいプローブ対が所望され
る。ゼロ百分位数カットオフ値は、全てのプローブ対が
含まれることを意味するが、５０ｔｈのパーセンタイル
カットオフ値は、推定の上位半分中の推定強度を有する
プローブ対のみが含まれることを意味する。現実の強度
差における２倍の因子は、この方法により容易に得られ
る。

【０１２４】（Ｖ．チップ製造品質管理への適用）一般
に、パラメーターおよびハイブリダイゼーションの強度
はまた、チップ製造プロセスにおけるバリエーションを
反映する。合成工程のカップリング効率性におけるバリ
エーションは、ハイブリダイゼーション自由エネルギー
におけるバリエーション同様、プローブ強度に対して乗
法的効果を有するはずである。例えば、０．９のカップ
リング効率性を有する合成工程後の０．８５効率性を有
する合成工程は、０．９×０．８５のプローブ（両方の
合成工程を首尾よく完了させる）を生じる。エネルギー
性項を有する場合にそうであるように、絶対的な効率性
ではなく、相対的な効率性のみが本明細書に示される方
法により検出され得る。

【０１２５】シフトマスク（ｓｈｉｆｔ−ｍａｓｋ）プ
ロセスを用いて製造されたチップについて、プローブ配
列数および塩基型に対応するエネルギー性パラメーター
はまた、製造プロセスにおける特定のサイクルに対応す
る。図１ｂにおけるパラメーターは、この場合の例であ
る。他よりも効率が実質的に低い合成工程が存在した場
合、当業者は、図１ｂにおけるその工程に対応するパラ
メーターで落下（ｄｉｐ）を予期する。シフトマスクで
作製してないチップについては、特定のサイクルに対応
するパラメーターがまた構築され得る。低収率のサイク
ルは、測定された強度をフィットさせることに由来する
対応するパラメーター中の比較的低い値により検出可能
であるはずである。

【０１２６】

【実施例】ＢＲＣＡ１遺伝子における変異を調査する実
験からのデータを用いて、本発明の方法のいくつかの実
施形態を検討した。

【０１２７】ＢＲＣＡ１における生殖細胞系列変異体
は、乳ガンおよび卵巣ガンを有する近親者の５０〜６０
％に存在し、一般の集団における全ての乳癌の約２〜５
％の症例の原因であり得る（Ｈａｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ２５０，１６８４〜１６８９（１９９０）、Ｎａｒ
ｏｄら、Ｌａｎｃｅｔ３３８、８２〜８３（１９９
１）、Ｅａｓｔｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ
ｔ．５２、６７８〜７０１（１９９３）、Ｒｏｗｅｌｌ
ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５５，８６１〜８
６５（１９９４））。ヘテロ接合性キャリアは、早期の
乳癌ガンおよび卵巣ガンに著しく罹りやすく、そしてま
た、結腸ガンおよび前立腺ガンを発症する中程度に増加
した危険性がある（Ｆｏｒｄら、Ｌａｎｃｅｔ３４
３、６９２〜６９５（１９９４））。ＢＲＣＡ１のタン
パク質コード領域は、ゲノムＤＮＡの１００ｋｂにわた
って広がったコードしている２２のエキソン中に５，５
９２ｂｐを含む（Ｍｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６
６、６６〜７１（１９９４））。この遺伝子全体に分布
された１１１を超える特有のＢＲＣＡ１変異体は、文献
中に記載されている（Ｓｈａｔｔｕｃｋ−Ｅｉｄｅｎｓ
ら、Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２７３，５３５〜５４
１（１９９５）およびＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＩ
ｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＣｏｒｅＤａｔａｂａｓｅ
（ｔｈｅＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂａｔｈｔ
ｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｈｇｒ．ｎｉｈ−ｇｏｖ／Ｉｎ
ｔｒａｍｕｒａｌ−ｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｌａｂ−ｔｒａ
ｎｓｆｅｒ／Ｂｉｃ／．にある））。これらのほとんど
は、正常なリーディングフレーム（読み取り枠）の破壊
を生じるフレームシフト改変体、ノンセンス改変体、ま
たはスプライシング改変体である。２つの変異体がＢＲ
ＣＡ１改変のほとんどの原因である、Ａｓｈｋｅｎａｚ
ｉＪｅｗｉｓｈ集団を除いて（Ｓｔｒｕｅｗｉｎｇ
ら、ＡｍＪ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５７，１〜７（１９
９５）；Ｓｔｒｕｅｗｉｎｇら，ＮａｔｕｒｅＧｅｎ
ｅｔ．１１，１９８〜２００（１９９５）；Ｔｏｎｉｎ
ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５７、１８９（１
９９５）；Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇ
ｅｎｅｔ．５７、１２８４〜１２９７（１９９５）；Ｆ
ｉｔｚＧｅｒａｌｄら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３
３４、１４３〜１４９（１９９６）；Ｏｆｆｉｔら、Ｌ
ａｎｃｅｔ３４７、１６４３〜１６４５（１９９
６））、対立遺伝子異質性は、以前に記載された変異体
の有限のセットのみを検出する方法（例えば、対立遺伝
子特異的オリゴヌクレオチド［ＡＳＯ］ハイブリダイゼ
ーション）により、ＢＲＣＡ１変異体キャリアを同定す
る能力を混同する。

【０１２８】（Ａ．方法）（ａ）ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡ標的調製物からのＰＣ
Ｒ以下のプライマー：１１ＦＴ３５’−ＡＴＴＡＡＣＣ
ＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＧ
ＡＧＴＡＴＧＡＧＣ−３’および１１ＲＴ７５’−ＴＡ
ＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＣＴＣ
ＣＣＡＡＡＡＧＣＡＴＡＡＡ−３’（それぞれ、Ｔ３お
よびＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含
む）を備えるＥＸＰＡＮＤ^TMＬｏｎｇＲａｎｇｅＰ
ＣＲＫｉｔ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ
ｍ）を用いて、ゲノムサンプルにおいて、ＰＣＲ反応を
実施した。参照サンプルおよび試験サンプルとして、そ
れぞれ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ転写緩衝液（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ）、０．７ＭＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよ
びＵＴＰ、１０ＭＭＤＴＴ、０．７ＭＭフルオレ
セイン−１２−ＵＴＰまたは０．１５ＭＭビオチン−
１６−ＵＴＰ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ
ｍ）を、そして示されるように１ＯＵＴ３またはＴ７
ＲＮＡポリメラーゼを用いて、１０Ｌの反応溶液中
で、これらのエキソン１１アンプリコンテンプレートか
らのインビトロ転写反応を実行した。

【０１２９】（ｂ）標的調製および解析参照テンプレートを、ＢＲＣＡ１ｃＤＮＡクローン由
来のエキソン１１のＰＣＲ増幅から作製した。参照転写
産物および試験サンプル転写産物を、２５ｌの３０ｍｍ
ＭｇＣｌ₂溶液中に最終濃度１００ｎＭで希釈した。反
応物を９４℃で７０分間インキュベートし、標的をフラ
グメント化した（Ｌｉｐｓｈｕｔｚら、ＢｉｏＴｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ１９、４４２−４４７（１９９５）；Ｋ
ｏｚａｌら、ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．２、７５３−７５
９（１９９６））。同時にフラグメント化した標的を、
３００ｐｌの容量のハイブリダイゼーション緩衝液（３
ＭＴＭＡＣ−Ｃｌ（塩化テトラメチルアンモニウム）、
１×ＴＥｐＨ７．４、０．００１％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００、１ｎＭ５’−フルオレセイン標識化コン
トロールオリゴヌクレオチド５’−ＣＧＧＴＡＧＣＡＴ
ＣＴＴＧＡＣ−３’）に１００倍に希釈した。このコン
トロールオリゴヌクレオチドを、イメージアライメント
を助けるために特定の表面プローブにハイブリダイズす
るように設計する。標的を、２５０ｌの容量においてこ
のチップと３５℃で４時間ハイブリダイズした。このチ
ップ表面を、１０ｍｌの洗浄緩衝液（６×ＳＳＰＥ、
０．００１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を用いて洗
浄し、そしてフィコエリトリン−ストレプトアビジン結
合体（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）（洗浄緩衝
液中２μｇ／ｍｌ）を用いて室温で５分間染色した。こ
のチップを、１０ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄し、そして記
載のようにスキャンした（Ｌｉｐｓｈｕｔｚら、Ｂｉｏ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１９，４４２−４４７（１９９
５）；Ｋｏｚａｌら、ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．２，７５
３−７５９（１９９６））。ハイブリダイゼーションシ
グナルを、それぞれフルオレセイン参照サンプル（緑）
およびビオチン試験サンプル（赤）について５１５ｎｍ
〜５４５ｎｍの帯域通過放出フィルターおよび５６０ｎ
ｍの長通過（ｌｏｎｇｐａｓｓ）放出フィルターを用い
て光電子増倍管によって検出した（Ｃｒｏｎｉｎら、Ｈ
ｕｍ．Ｍｕｔ．７，２４４−２５５（１９９６）；Ｃｈ
ｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４，６１０−６１４（１
９９６））。

【０１３０】（ｄ）ジデオキシ配列決定解析ＰＣＲプライマーの４つの対

【０１３１】

【化３】を設計し、４つの部分的に重複するアンプリコンを生成
した。このアンプリコンは、エキソン１１の全配列をカ
バーし、そしていずれかの鎖の５’末端においてＭ１３
順方向配列およびＭ１３逆方向配列を含む。解析される
べき領域に依存して、４つアンプリコンのうち１つを、
推奨プロトコルを用いるＥＸＰＡＮＤ^TMＬｏｎｇＲａ
ｎｇｅＰＣＲｋｉｔ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａ
ｎｎｈｅｉｍ）を用いて適切なゲノムサンプルから生成
した。色素プライマージデオキシ配列決定反応を、推奨
プロトコルを用いるＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡＰｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅＦＳｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍ
ｅｒ）およびＭ１３順方向またはＭ１３逆方向のいずれ
かのＤＹＥｎａｍｉｃ^TMエネルギー移動色素プライマー
（ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）を用
いて実行した。

【０１３２】（ｄ）データ解析光電子増倍管出力シグナルを、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録
商標）ソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎ
ｃ．，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ）を用いて、比例
する、空間的に指定されたピクセル値に変換し、計数化
した蛍光イメージを作製した。参照標的および試験標的
の、各々のプローブシグナルに対する相対的寄与を、実
験での緑参照イメージおよび赤試験イメージの各セット
から抽出し、そしてＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ
７．０ａワークシートに取り込んだ。

【０１３３】（Ｂ．結果）（ａ）ハイブリダイゼーション親和性の予測図３ａは、ＢＲＣＡ１チップからの実験データおよびフ
ィット（予測）した強度のサブセットを示す。ＢＲＣＡ
１配列の（全５．６ｋｂの中からの）４００塩基につい
て測定された強度およびフィットした強度（ハイブリダ
イゼーション親和性の測定）を示す。フィットしたパラ
メーターを、図３ｂに示す。９７のパラメーターを、こ
のフィットにおいて使用する−−７５個の塩基型および
位置のパラメーター（２５個のプローブの位置の各々に
おける各非Ｔ塩基についてのパラメーター）および２２
個のエキソンの各々についての１つの標準化パラメータ
ー。各々のエキソンについての別個の標準化パラメータ
ーは、異なるエキソンが、おそらく異なる濃度で存在し
ているという事実を考慮する。この全配列にわたるＩ
_fitおよびＩ_msdの（自然）対数の平方二乗平均（ｒ．
ｍ．ｓ．）偏差は、０．８５６５であり、この値は、フ
ィットを示す。

【０１３４】図３ｂにおけるパラメーターは、単純な解
釈を有する。例えば、１０番目の位置のＣは、約０．４
６の値を有する。これは、１０番目の位置においてＣを
有するプローブについてのＩ_fitの対数が、１０番目の
位置におけるＴおよび他の２４個の位置全てにおいて同
一の塩基を有するプローブについてのＩ_fitの対数より
も０．４６大きいことを意味する。このデータにおい
て、標的がＲＮＡである場合、一般的にこのプローブに
おけるＣが、最も好都合なハイブリダイゼーション自由
エネルギーを有し、続いてＧ、Ａ、ついでＴが好都合な
ハイブリダイゼーション自由エネルギーを有すること
を、図３ｂを検討することによって理解し得る。

【０１３５】図３ｂにおける曲線の形状は、点変異に起
因するフットプリントの形状（または「スマイルプロッ
ト」）と大まかに一致している。フットプリントから理
解されるように、この曲線の頂点は、プローブ配列の中
央に近く、これは、この中央に近い位置が、ハイブリダ
イゼーションの際に最も大きな影響を有することを示
す。

【０１３６】（ｂ）パラメーターの減少図４ｂは、図４ａにおいて使用されたフィットパラメー
ターから導いた塩基依存性ハイブリダイゼーション自由
エネルギーおよび位置依存性ハイブリダイゼーション自
由エネルギーを示す。各曲線は、フィットパラメーター
のうちの５つによって特定された４次式である。３７個
のパラメーターを、このフィットにおいて使用する−−
１５個は、ハイブリダイゼーションの塩基依存性および
位置依存性を説明している３つの４次式を特定し、そし
て残りの２２個は、２２個のエキソンの各々についての
標準化パラメーターである。これらの曲線は、図３ｂに
おいて示された曲線のより低い情報量バージョンであ
る。この全配列にわたるＩ_fi _tおよびＩ_msdの対数のｒ．
ｍ．ｓ．偏差は、０．８７１２である。パラメーター数
の大きな減少にもかかわらず、このフィットの質はほと
んど低下しない。

【０１３７】（ｃ）プローブ−プローブハイブリダイゼ
ーションおよびヘアピン形成図５ａおよび５ｂは、プローブ−プローブスコアおよび
ヘアピンスコアに対応するパラメーターがまた、このフ
ィットにおいて含まれたことを除いては、図４ａおよび
４ｂと同一である。３９個のパラメーターを、このフィ
ットにおいて使用する−−３７個のパラメーターは、図
４において見られ、そして２つのさらなるパラメーター
は、プローブ−プローブ相互作用およびヘアピン形成を
説明する。この全配列にわたるＩ_fitおよびＩ_msdの対数
のｒ．ｍ．ｓ．偏差は、０．８２７４である。このフィ
ットを改善する、１つの領域は、配列番号１９８０周辺
である。位置１９８０の周辺の配列の試験は、プローブ
−プローブ相互作用およびヘアピンの両方が、おそらく
存在することを示す。

【０１３８】（ｄ）最隣接パラメーター図６ａ〜ｄは、最隣接自由エネルギーに対する４次式フ
ィットを用いる特異値分解方法を用いる結果を示す。９
９個のパラメーターを、このフィットにおいて使用する
−−７５個は、非参照最隣接項の各々の塩基依存性およ
び位置依存性を説明する１５個の４次式を特定し、２個
は、プローブ−プローブ相互作用およびヘアピン形成を
説明し、そして２２個は、２２個のエキソンの各々につ
いての標準化パラメーターである。この全配列にわたる
Ｉ_fitおよびＩ_msdの対数のｒ．ｍ．ｓ．偏差は、０．７
４３６である。図６ｂ〜ｄは、図６ａにおいて使用され
るフィットパラメーターから導かれる塩基依存性最隣接
ハイブリダイゼーション自由エネルギーおよび位置依存
性最隣接ハイブリダイゼーション自由エネルギーを示
す。

【０１３９】（ｅ）変異検出における適用図７ａは、ＢＲＣＡ１の配列の一部についての一色の比
に対する配列に基づく標準化の効果を示す。この配列に
基づく標準化は、可能性のある偽陽性からのシグナルを
減少するが、位置２７９８における真の変異からのシグ
ナルは、減少しない。図７ｂは、野生型ＢＲＣＡ１サン
プルの、配列に基づく標準化による偽陽性の排除を示
す。

【０１４０】（ｄ）遺伝子発現のためのプローブ選択図８は、プローブ強度の予測に基づくプローブ選択の有
効性を示す。このデータは、遺伝子発現チップに対して
ハイブリダイズした酵母ｍＲＮＡのデータである。各プ
ローブ対の強度の差（完全な一致からミスマッチを引
く）を、ＢＲＣＡ１データに対する最隣接フィットに基
づいて予測する。このプロットは、遺伝子発現チップの
設計のためのプローブを選択する手段として予測された
強度の差を用いることが効果的であることを示す。大き
な強度の差を有するプローブ対が望ましい。ゼロ百分位
数カットオフとは、全てのプローブ対が含まれることを
意味するが、５０百分位数カットオフ手段とは、予測さ
れた強度を有するこれらのプローブ対であってこの予測
の上位半分あるもののみを含むことを意味する。実際の
強度の差の２倍の増加因数は、この方法によって容易に
得られる。（結論）本発明は、核酸ハイブリダイゼーション親和性
を予測するため、変異を検出するため、プローブを選択
するため、およびプローブアレイ製造の品質管理を改善
するための方法およびコンピューターソフトフェア製品
を提供する。上記は、例示であって、そして制限ではな
いことを意図することが理解される。本発明の多くのバ
リエーションは、上記を検討することで当業者に明らか
である。例示を目的として、本発明は、主に高密度オリ
ゴヌクレオチドアレイの使用に関して記載されている
が、この方法が、他の固定化プローブ（例えば、光ファ
イバーもしくはその他の支持体上に固定化されているプ
ローブ）のハイブリダイゼーション親和性を予測するた
めに使用され得ることは、当業者によって容易に認識さ
れる。本発明のこの基本的な方法およびコンピューター
ソフトウェアをまた使用して溶液に基づくハイブリダイ
ゼーションを予測し得る。従って、本発明の範囲は、上
記を参照せずに決定されるべきであるが、その代わり
に、添付の特許請求の範囲に対して権利として与えられ
る等価物の全範囲とともに添付の特許請求の範囲を参照
して決定されるべきである。

【０１４１】

【発明の効果】核酸ハイブリダイゼーション親和性を予
測するための方法およびコンピューターソフトウエア製
品を提供する。１つの実施形態において、ハイブリダイ
ゼーション強度（Ｉ）は、以下の式：

【０１４２】

【数１５】を使用して決定される。ここでＰｉはｉ番目のパラメー
ターの値であり、Ｓｉはプローブの配列に由来する値で
ある。本発明の方法は、変異体検出、プローブ選択およ
びプローブアレイ製造品質調節を増強するために使用さ
れ得る。

【図面の簡単な説明】

本明細書に援用されかつ本明細書の一部を形成する添付
の図面は、本発明の実施形態を例証し、そして本明細書
の記載と一緒に、本発明の原理を記述する役割を果た
す。

【図１】図１は、本発明の１つの実施形態のソフトウェ
アを実行するために使用され得るコンピュータシステム
の一例を図示する。

【図２】図２は、図１のコンピュータシステムのシステ
ムブロック図を図示する。

【図３ａ】図３ａは、ＢＲＣＡ１配列の（全部で５．６
ｋｂのうちの）４００塩基についての測定されかつフィ
ットした強度を示す。フィットにおいて９７のパラメー
タを使用する−７５の塩基型および位置パラメータ（２
５プローブ位置の各々において各Ｔでない塩基について
のパラメータ）および２２エキソンの各々についての１
つの標準化パラメータ。各エキソンについての別々の標
準化パラメータは、異なるエキソンが異なる濃度で存在
し得るという事実を許容する。配列全体にわたるＩ_fit
およびＩ_msdの（自然）対数の平方根二乗平均（ｒ．
ｍ．ｓ．）偏差は、０．８５６５である。

【図３ｂ】図３ｂは、図３ａにおいてフィットした強度
を計算するために使用した７５の塩基および位置特異的
パラメータを示す。

【図４ａ】図４ａは、ＢＲＣＡ１配列の部分についての
測定されかつフィットした強度を示す。フィットにおい
て３７のパラメータを使用する−１５は、ハイブリダイ
ゼーションの塩基依存性および位置依存性を記述する３
つの４次多項式を特定し、そして残りの２２は、２２エ
キソンの各々についての標準化パラメータである。配列
全体にわたるＩ_fitおよびＩ_msdの対数のｒ．ｍ．ｓ．偏
差は、０．８７１２である。

【図４ｂ】図４ｂは、図４ａにおいて使用されたフィッ
ティングパラメータに由来する、塩基および位置依存的
ハイブリダイゼーション自由エネルギーを示す。各曲線
は、５のフィッティングパラメータによって特定される
４次多項式である。これらの曲線は、図３ｂに示される
曲線のより少ない情報量のバージョンである。

【図５ａ】図５ａは、ＢＲＣＡ１配列の部分についての
測定されかつフィットした強度を示す。フィットにおい
て３９のパラメータを使用する−それらのうちの３７は
図４に示された通りであり、そして２つのさらなるパラ
メータは、プローブ−プローブ相互作用およびヘアピン
形成を記述する。配列全体にわたるＩ_fitおよびＩ_m _sdの
対数のｒ．ｍ．ｓ．偏差は、０．８２７４である。

【図５ｂ】図５ｂは、図５ａにおいて使用されたフィッ
ティングパラメータに由来する、塩基および位置依存的
ハイブリダイゼーション自由エネルギーを示す。

【図６ａ】図６ａは、ＢＲＣＡ１配列の部分についての
測定されかつフィットした強度を示す。フィットにおい
て９９のパラメータを使用する−７５は、非参照最隣接
タームの各々の塩基依存性および位置依存性を記述する
１５の４次多項式を特定し、２つはプローブ−プローブ
相互作用およびヘアピン形成を記述し、そして２２は、
２２エキソンの各々についての標準化パラメータであ
る。配列全体にわたるＩ_fitおよびＩ_msdの対数のｒ．
ｍ．ｓ．偏差は、０．７４３６である。

【図６ｂ】図６ｂは、図６ａにおいて使用されたフィッ
ティングパラメータに由来する、塩基および位置依存的
最隣接ハイブリダイゼーション自由エネルギーを示す。

【図６ｃ】図６ｃは、図６ａにおいて使用されたフィッ
ティングパラメータに由来する、塩基および位置依存的
最隣接ハイブリダイゼーション自由エネルギーを示す。

【図６ｄ】図６ｄは、図６ａにおいて使用されたフィッ
ティングパラメータに由来する、塩基および位置依存的
最隣接ハイブリダイゼーション自由エネルギーを示す。

【図７ａ】図７ａは、ＢＲＣＡ１配列の部分についての
標準化されてない一色比（ｏｎｅ−ｃｏｌｏｒｒａｔ
ｉｏ）および配列に基づいて標準化された一色比を示
す。配列に基づく標準化は、図５において用いられた同
じ３７のパラメータ型を使用した。１．３より上の比が
変異と呼ばれる。配列に基づく標準化は、２７９８位の
真の変異のシグナルを減少しないままで、配列数２３０
０よりすぐ下の擬陽性を除外する。

【図７ｂ】図７ｂは、ＢＲＣＡ１配列の部分についての
規格化していないおよび配列に基づいて規格化した一色
比（ｏｎｅ−ｃｏｌｏｒｒａｔｉｏ）を示す。規格化
スキームは図７ａと同様である。配列に基づく規格化
は、この野生型サンプルのいくつかの偽陽性を消去す
る。規格化比曲線の破断は、エキソン境界に生じる。

【図８】図８は、推定強度差が、大きな強度差を有する
プローブ対を選択するために使用されることを示す。強
度差は、ＢＲＣＡ１データセットから導かれる最隣接パ
ラメータを使用して推定される。カットオフ値を超える
推定強度差を有するプローブ対が選択される。ここで、
カットオフは全ての推定強度差の百分位数として表現さ
れる。０位の百分位数でのカットオフが、推定強度差に
かかわらず、全てのプローブ対を受容することに合致す
る。５０位の百分位数のカットオフが、全ての推定強度
差のうちの上位半分の推定強度差を有するプローブ対の
みを選択することに合致する。測定される強度差は、遺
伝子発現チップにハイブリダイズしたｍＲＮＡに由来す
る。大きな推定強度差を有するプローブ対を選択するこ
とによって、より大きな実際の強度差を有するプローブ
対が得られる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】遺伝子発現をモニタリングするプローブ
を選択するためのコンピューターで実行される方法であ
って、該方法は、ａ）複数の候補プローブおよびそれらの対応するコント
ロールプローブのハイブリダイゼーション強度を予測す
る工程；およびｂ）その対応するコントロールプローブに対して最も高
い強度差を有する候補プローブを選択する工程、を包含
する、方法。
【請求項２】前記ハイブリダイゼーション強度（Ｉ）
が、以下の式：【数１】を使用して決定される、請求項１に記載の方法であっ
て、ここで該Ｐｉが、ｉ番目のパラメーターの値であ
り、そしてＳｉが、そのプローブの配列に由来する値で
ある、方法。
【請求項３】前記Ｐｉが、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴからな
る群より選択される参照塩基に比較しての、前記配列の
所定の位置における塩基の自由エネルギーである、請求
項２に記載の方法。
【請求項４】前記Ｓｉが前記配列の汎関数である、請
求項３に記載の方法。
【請求項５】前記Ｐｉが経験的に決定される、請求項
３に記載の方法。
【請求項６】前記Ｐｉが、トレーニングデータセット
を使用する最小二乗フィットによって決定される、請求
項５に記載の方法。
【請求項７】Ｐｉが、Ｃｈｏｌｅｓｋｙ分解を使用し
て決定される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】所定のヌクレオチド型についての前記Ｓ
ｉが、プローブ塩基数の平滑化関数で置換される、請求
項７に記載の方法。
【請求項９】前記平滑化関数が多項関数である、請求
項８に記載の方法。
【請求項１０】所定のヌクレオチド型についての前記
Ｓｉが、中心位置に対する塩基の差の平滑化関数で置換
される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】前記平滑化関数が多項関数である、請
求項８に記載の方法。
【請求項１２】前記式が、プローブ−プローブハイブ
リダイゼーションを記述する少なくとも１つのパラメー
ターを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】前記式が、ヘアピン形成を記述する少
なくとも１つのパラメーターを含む、請求項７に記載の
方法。
【請求項１４】前記式が、最隣接相互作用を記述する
パラメーターを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】前記Ｐｉが特異値分解を使用して決定
される、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】その標的に対するプローブのハイブリ
ダイゼーション親和性を予測するためのコンピューター
で実行される方法であって、該方法は、以下の式：【数２】を使用してハイブリダイゼーション強度（Ｉ）を計算す
る工程を包含し、ここで、該Ｐｉがｉ番目のパラメータ
ーの値であり、そしてＳｉがそのプローブの配列に由来
する値である、方法。
【請求項１７】前記Ｐｉが、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴから
なる群より選択される参照塩基に比較しての、前記配列
の所定の位置における塩基の自由エネルギーである、請
求項１６に記載の方法。
【請求項１８】前記Ｓｉが前記配列の汎関数である、
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】前記Ｐｉが経験的に決定される、請求
項１８に記載の方法。
【請求項２０】前記Ｐｉが、トレーニングデータセッ
トを使用する最小二乗フィットによって決定される、請
求項１９に記載の方法。
【請求項２１】Ｐｉが、Ｃｈｏｌｅｓｋｙ分解を使用
して決定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】所定のヌクレオチド型についての前記
Ｓｉが、プローブ塩基数の平滑化関数で置換される、請
求項２１に記載の方法。
【請求項２３】前記平滑化関数が多項関数である、請
求項２２に記載の方法。
【請求項２４】所定のヌクレオチド型についての前記
Ｓｉが、中心位置に対する塩基の差の平滑化関数で置換
される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】前記平滑化関数が多項関数である、請
求項２４に記載の方法。
【請求項２６】前記式が、プローブ−プローブハイブ
リダイゼーションを記述する少なくとも１つのパラメー
ターを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】前記式が、ヘアピン形成を記述する少
なくとも１つのパラメーターを含む、請求項２１に記載
の方法。
【請求項２８】前記式が、最隣接相互作用を記述する
パラメーターを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】前記Ｐｉが特異値分解を使用して決定
される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】前記プローブが固相基材上に固定化さ
れる、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】その標的に対するプローブのハイブリ
ダイゼーション親和性を予測するためのコンピューター
ソフトウエア製品であって、該製品は、以下の式：【数３】を使用してハイブリダイゼーション強度（Ｉ）を計算す
るためのコンピュータープログラムコード、ここで該Ｐ
ｉがｉ番目のパラメーターの値であり、そしてＳｉがそ
のプローブの配列に由来する値であり；および該コンピ
ュータープログラムコードを格納するコンピューターで
読み取り可能な媒体、を備えるコンピューターソフトウ
エア製品。
【請求項３２】前記Ｐｉが、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴから
なる群より選択される参照塩基に比較しての、前記配列
の所定の位置における塩基の自由エネルギーである、請
求項３１に記載のコンピューターソフトウエア製品。
【請求項３３】前記Ｓｉが前記配列の汎関数である、
請求項３２に記載のコンピューターソフトウエア製品。
【請求項３４】前記Ｐｉが経験的に決定される、請求
項３３に記載のコンピューターソフトウエア製品。
【請求項３５】前記Ｐｉが、トレーニングデータセッ
トを使用する最小二乗フィットによって決定される、請
求項３４に記載のコンピューターソフトウエア製品。
【請求項３６】Ｐｉが、Ｃｈｏｌｅｓｋｙ分解を使用
して決定される、請求項３５に記載のコンピューターソ
フトウエア製品。
【請求項３７】所定のヌクレオチド型についての前記
Ｓｉが、プローブ塩基数の平滑化関数で置換される、請
求項３６に記載のコンピューターソフトウエア製品。
【請求項３８】前記平滑化関数が多項関数である、請
求項３７に記載のコンピューターソフトウエア製品。
【請求項３９】所定のヌクレオチド型についての前記
Ｓｉが、中心位置に対する塩基の差の平滑化関数で置換
される、請求項３６に記載のコンピューターソフトウエ
ア製品。
【請求項４０】前記平滑化関数が多項関数である、請
求項３９に記載のコンピューターソフトウエア製品。
【請求項４１】前記式が、プローブ−プローブハイブ
リダイゼーションを記述する少なくとも１つのパラメー
ターを含む、請求項３６に記載のコンピューターソフト
ウエア製品。
【請求項４２】前記式が、ヘアピン形成を記述する少
なくとも１つのパラメーターを含む、請求項３６に記載
のコンピューターソフトウエア製品。
【請求項４３】前記式が、最隣接相互作用を記述する
パラメーターを含む、請求項３５に記載のコンピュータ
ーソフトウエア製品。
【請求項４４】前記Ｐｉが特異値分解を使用して決定
される、請求項１８に記載のコンピューターソフトウエ
ア製品。
【請求項４５】遺伝子発現をモニタリングするプロー
ブを選択するためのコンピューターソフトウエア製品で
あって、該製品は、複数の候補プローブおよびそれらの対応するコントロー
ルプローブのハイブリダイゼーション強度を予測するた
めのコンピュータープログラムコード；対応するコント
ロールプローブに対して最も強い強度差を有する候補プ
ローブを選択するためのコンピュータープログラムコー
ド；および該コードを格納するためのコンピューターで
読み取り可能な媒体、を備えるコンピューターソフトウ
エア製品。
【請求項４６】請求項４５に記載のコンピューターソ
フトウエア製品であって、ここでハイブリダイゼーショ
ン強度（Ｉ）を予測するための前記コンピューターコー
ドが、以下の式：【数４】を使用して計算するためのコードを備え、ここで、該Ｐ
ｉがｉ番目のパラメーターの値であり、そしてＳｉがそ
のプローブの配列に由来する値である、コンピューター
ソフトウエア製品。
【請求項４７】前記Ｐｉが、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴから
なる群より選択される参照塩基に比較しての、前記配列
の所定の位置における塩基の自由エネルギーである、請
求項４６に記載のコンピューターソフトウエア製品。
【請求項４８】前記Ｓｉが前記配列の汎関数である、
請求項４７に記載のコンピューターソフトウエア製品。
【請求項４９】前記Ｐｉが経験的に決定される、請求
項４７に記載のコンピューターソフトウエア製品。
【請求項５０】前記Ｐｉが、トレーニングデータセッ
トを使用する最小二乗フィットによって決定される、請
求項４９に記載のコンピューターソフトウエア製品。
【請求項５１】Ｐｉが、Ｃｈｏｌｅｓｋｙ分解を使用
して決定される、請求項５０に記載のコンピューターソ
フトウエア製品。
【請求項５２】所定のヌクレオチド型についての前記
Ｓｉが、プローブ塩基数の平滑化関数で置換される、請
求項５１に記載のコンピューターソフトウエア製品。
【請求項５３】前記平滑化関数が多項関数である、請
求項５２に記載のコンピューターソフトウエア製品。
【請求項５４】所定のヌクレオチド型についての前記
Ｓｉが、中心位置に対する塩基の差の平滑化関数で置換
される、請求項５２に記載のコンピューターソフトウエ
ア製品。
【請求項５５】前記平滑化関数が多項関数である、請
求項５２に記載のコンピューターソフトウエア製品。
【請求項５６】前記式が、プローブ−プローブハイブ
リダイゼーションを記述する少なくとも１つのパラメー
ターを含む、請求項５１に記載のコンピューターソフト
ウエア製品。
【請求項５７】前記式が、ヘアピン形成を記述する少
なくとも１つのパラメーターを含む、請求項５１に記載
のコンピューターソフトウエア製品。
【請求項５８】前記式が、最隣接相互作用を記述する
パラメーターを含む、請求項５１に記載のコンピュータ
ーソフトウエア製品。
【請求項５９】前記Ｐｉが特異値分解を使用して決定
される、請求項５８に記載のコンピューターソフトウエ
ア製品。