CN116113427A - 天然外膜囊泡中的sars-cov-2受体结合结构域 - Google Patents

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Abstract

本披露提供了天然外膜囊泡(NOMV)疫苗，其含有经修饰为脂蛋白的冠状病毒受体结合结构域(RBD)。还提供了包含脑膜炎球菌菌株的组合物，该菌株具有质粒携带的编码经修饰为脂蛋白的SARS‑CoV‑2RBD的基因。还提供了脑膜炎球菌菌株和NOMV疫苗，其含有编码SARS‑CoV‑2RBD的质粒以及提供RBD在哺乳动物细胞中表达的启动子/增强子和聚A序列。

Description

天然外膜囊泡中的SARS-COV-2受体结合结构域
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年7月30日提交的美国临时专利申请号63/059,031的权益，该临时专利申请的披露内容通过引用以其全文并入本文。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)资助的授权号R01AI046464和R44AI124759下由政府支持完成的。政府在本发明中享有一定的权利。
序列表的并入
随此提交了包含在名为“OMV0001-401-PC_ST25”的文件中的序列表并通过引用并入本文，该序列表于2021年7月30日创建，在Microsoft Windows操作系统中测量为111千字节。
背景技术
SARS-CoV-2是一种冠状病毒，是导致人类COVID-19疾病的原因。病毒通过与纤毛细胞上的聚糖结合进入气道上皮细胞。介导结合的蛋白是S(刺突)蛋白。S-蛋白(受体结合结构域或RBD)中的结构域与ACE2受体和聚糖结合。已经确定了S-蛋白单独的结构以及其与ACE2受体复合的结构。另外，还确定了与中和单克隆抗体复合的RBD结构。
天然外膜囊泡(NOMV)由细菌——脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)(Nm)天然形成。先前已经将疫苗菌株进行基因修饰以：(a)过表达通常以低丰度存在的因子H结合蛋白(FHbp)，(b)表达与宿主因子H低结合的突变体FHbp来提高抗体应答，从而阻断导致FH结合的相互作用，以及(c)减弱内毒素，能够在没有通常用于降低反应原性的清洁剂处理的情况下使用NOMV，而且能导致潜在保护性抗原的去除或改变。敲除LpxL1导致含有五酰基化脂寡糖(LOS)的NOMV-FHbp降低人外周血单核细胞(PBMC)中的细胞因子应答，这与已安全施用于数万人类受试者的清洁剂提取的OMV疫苗所引发的细胞因子应答相似或更低。为了进一步增强NOMV-FHbp疫苗的安全性，用于制备疫苗的菌株包含消除其他不希望的抗原(包括B组荚膜多糖、和LOS的衍生物)表达的另外的基因缺失，这些抗原已知与具有相似结构的人类聚糖进行交叉反应。
与相当量单独的重组蛋白相比，在NOMV中存在的抗原的免疫原性大大提高。然而，最有效的抗体应答需要阈值水平的表达，这已经通过使用工程化的启动子产生高转录率，在细菌基因组中插入多个拷贝，并且用多拷贝质粒转化来实现。
含有六酰基化脂寡糖的脑膜炎球菌外膜囊泡产生炎性应答。清洁剂提取可以降低反应原性，然而清洁剂处理可以导致脂蛋白抗原的损失和蛋白质结构的改变。本文所述的用于产生NOMV的Nm菌株具有被破坏的lpxL1基因座，导致五酰基化和六酰基化LOS的产生，从而导致内毒素活性减弱。
NOMV平台还具有增强抗体应答的佐剂特性。总的来说，基于NOMV的疫苗比相应的重组蛋白引发更高的抗体滴度和更广泛的反应性，并且可能更耐受，因为提供有效的保护性抗体应答可能需要更少的蛋白质。
因此，在一方面，本披露提供了NOMV疫苗，其含有经修饰为脂蛋白的冠状病毒受体结合结构域(RBD)。在一个实施例中，冠状病毒受体结合结构域(RBD)是SARS-CoV-2RBD。
在另一方面，本披露提供了包含脑膜炎球菌菌株的组合物，该菌株含有编码经修饰为脂蛋白的SARS-CoV-2RBD的基因，其中该基因在质粒上携带。
在另一方面，本披露提供了包含脑膜炎球菌菌株的组合物，该菌株具有质粒携带的编码经修饰为脂蛋白的SARS-CoV-2RBD以及另外的30个氨基酸的区段的基因。在一个实施例中，质粒包含pFP12-RBD质粒(例如，SEQ ID NO:8，图13)。在另一实施例中，质粒包含pFP12 SV-40RBD-2完整质粒(例如，SEQ ID NO:16，图20)。在另一实施例中，质粒包含pFP12SV40 RBD-2质粒(例如，SEQ ID NO:15，图7)。在另一实施例中，质粒包含pFP12 SV-40RBD-2mobC质粒(例如，SEQ ID NO:17，图21)。在另一实施例中，质粒包含pUC18-Lpxl1KO-FHbp25RBD-KAN质粒(例如，SEQ ID NO:9，图14)。在另一实施例中，质粒包含pGEM-SiaD-GalE-FHbp25RBD-SPC质粒(例如，SEQ ID NO:10，图15)。在另一实施例中，质粒包含pBS-FHbpKO-FHbp25RBD-ERM质粒(例如，SEQ ID NO:11，图16)。
在其他实施例中，将本文所述的一种或多种质粒引入相同的细菌菌株。在其他实施例中，脑膜炎球菌菌株是H44/76或NZ98/254。在另一实施例中，脑膜炎球菌菌株H44/76或NZ98/254不表达孔蛋白PorA。
在另一方面，本披露提供了脑膜炎球菌菌株，其含有编码经修饰为脂蛋白的SARS-CoV-2RBD的基因，其中该基因的表达由在脑膜炎奈瑟菌中产生高基因转录率的强启动子序列驱动。在一个实施例中，启动子包含本文列出的序列，例如包括但不限于，在图6-8、10-21，或SEQ ID NO:1-17中提供的任何序列。在另一实施例中，启动子包含孔蛋白PorA启动子或其衍生物、或富马酸和硝酸还原酶基因(fnr)的启动子。在另一实施例中，启动子包含EH-NT启动子。
在另一方面，本披露提供了含有编码经修饰为脂蛋白的SARS-CoV-2RBD的基因的脑膜炎球菌菌株，其中将该基因和启动子插入该细菌基因组的基因座。在一个实施例中，将基因和启动子插入lpxL1基因座以破坏酰基转移酶基因的表达，使得产生的脂寡糖是五酰基化的而非六酰基化的。在另一实施例中，将基因和启动子插入siaD-galE基因座(siaA同样)以破坏荚膜多糖的表达以及脂寡糖宿主抗原的唾液酸化。在另一实施例中，将基因和启动子插入fhbp基因座(因子H结合蛋白)。在另一实施例中，将基因和启动子插入porA基因座。在一个实施例中，用包含以下的质粒通过同源重组来实现这些基因的失活：pUC18-Lpxl1KO-FHbp25RBD-KAN质粒(例如，SEQ ID NO:9，图14)、pGEM-SiaD-GalE-FHbp25RBD-SPC质粒(例如，SEQ ID NO:10，图15)、或pBS-FHbpKO-FHbp25RBD-ERM质粒(例如，SEQ ID NO:11，图16)。在其他实施例中，将本文所述的一种或多种质粒引入相同的细菌菌株。在另一实施例中，通过将来自Nm因子H结合蛋白(FHbp)的30个氨基酸序列添加至脂蛋白信号序列来进一步修饰SARS-CoV-2RBD脂蛋白以促进RBD转运至细菌的外表面，确保RBD的适当折叠以及通过细菌蛋白酶降低蛋白酶解。在一些实施例中，30个氨基的区段或序列来自FHbp的N末端，其中序列编号从成熟(即加工)蛋白上的脂质修饰的半胱氨酸(Cys)残基开始。在一些实施例中，30个氨基酸的区段或序列来自FHbp变体，例如包括但不限于，ID9。RBD脂蛋白的延伸形式还增加了细菌表面与RBD之间的距离，使其更容易接近人类免疫系统的抗原呈递细胞。在其他采用脂蛋白信号序列的延伸的实施例中，用包含以下的质粒通过同源重组来实现基因的失活：pUC18-Lpxl1KO-FHbp55RBD-KAN质粒(例如，SEQ ID NO:12，图17)、pGEM-SiaD-GalE-FHbp55RBD-SPC质粒(例如，SEQ ID NO:13，图18)、或pBS-FHbpKO-FHbp55RBD-ERM质粒(例如，SEQ ID NO:14，图19)。
在另一实施例中，本披露提供了NOMV疫苗，其含有经修饰为脂蛋白的冠状病毒受体结合结构域(RBD)。
在另一实施例中，本披露提供了NOMV疫苗，其含有经修饰为脂蛋白的SARS-CoV-2RBD。
在另一实施例中，本披露提供了脑膜炎球菌菌株，其含有质粒上携带的编码经修饰为脂蛋白的SARS-CoV-2RBD的基因(特别地pFP12-RBD，示于图13，SEQ ID NO:8)。
在另一方面，保留在Nm中的质粒可以掺入NOMV中。因此，NOMV可以递送蛋白质抗原并且，同时递送DNA用于吸收NOMV疫苗的细胞表达蛋白质，以引发中和抗体。
本披露提供了脑膜炎球菌菌株，其含有编码SARS-CoV-2RBD的质粒，以及提供RBD在哺乳动物细胞中表达的启动子/增强子和聚A序列。
在另一方面，本披露提供了NOMV疫苗，其含有编码SARS-CoV-2RBD的质粒，以及提供RBD在哺乳动物细胞中表达的启动子/增强子和聚A序列。
在其他实施例中，用于RBD在哺乳动物细胞中表达的适用于掺入NOMV中的质粒包含pFP12 SV40 RBD-2质粒(例如，SEQ ID NO:15，图7)、pFP12 SV-40RBD-2完整质粒(例如，SEQ ID NO:16，图20)、或pFP12 SV-40RBD-2mobC质粒(例如，SEQ ID NO:17，图21)。
在另一实施例中，本披露提供了脑膜炎球菌菌株，其含有编码SARS-CoV-2RBD的基因，其中该脑膜炎球菌菌株是H44/76或。
在另一实施例中，本披露提供了脑膜炎球菌菌株，其含有质粒上携带的编码经修饰为脂蛋白的SARS-CoV-2RBD的基因，其中该脑膜炎球菌菌株是不表达孔蛋白PorA的H44/76。
在另一实施例中，本披露提供了脑膜炎球菌菌株，其含有编码经修饰为脂蛋白的SARS-CoV-2RBD的基因，其中该基因的表达由在脑膜炎奈瑟菌中产生高基因转录率的强启动子序列驱动。在一些实施例中，本文提供了如本文所述的强启动子的特定序列，例如在图6-8、10-21，或SEQ ID NO:1-17中提供的。在一些实施例中，强启动子的替代物可以包括但不限于，PorA(参见，例如，美国专利号9,387,239)。在一些实施例中，PorA衍生物可以包括但不限于，在美国专利号9,260,489和加拿大专利号2,861,946中描述的那些。在其他实施例中，如本文所述的有用的启动子可以包括富马酸和硝酸还原酶基因(fnr)的启动子(Oriente等人,J Bacteriol[细菌学杂志]192:691-701,2010)。在一些实施例中，如本文所述的有用的启动子可以包含EH-NT启动子，例如在图12-19中所示的。
在一些实施例中，如本文所述的有用的启动子可以包含人类EF1启动子(hEF1)、或杂合启动子，例如hEF1-HTLV启动子(包含人类延伸因子-1α(hEF-1α)核心启动子和人T细胞白血病病毒(HTLV)的5’非翻译区)，例如在图7和20-21中所示的。可以使用如本文所述的本领域其他已知的或可用的强启动子，只要它们产生编码SARS-CoV-2RBD的基因的转录率高。
在一些实施例中，本披露提供了脑膜炎球菌菌株，其含有编码经修饰为脂蛋白的SARS-CoV-2RBD的基因，其中将该基因和启动子插入lpxL1基因座以破坏酰基转移酶基因的表达，使得产生的脂寡糖是五酰基化的而非六酰基化的。
在一些实施例中，本披露提供了脑膜炎球菌菌株，其含有编码经修饰为脂蛋白的SARS-CoV-2RBD的基因，其中将该基因和启动子插入siaD-galE基因座(siaA同样)以破坏荚膜多糖的表达以及脂寡糖宿主抗原的唾液酸化。
在一些实施例中，本披露提供了脑膜炎球菌菌株，其含有编码经修饰为脂蛋白的SARS-CoV-2RBD的基因，其中将该基因和启动子插入fhbp基因座(因子H结合蛋白)。
在一些实施例中，本披露提供了脑膜炎球菌菌株，其含有编码经修饰为脂蛋白的SARS-CoV-2RBD的基因，其中将该基因和启动子插入porA基因座。
在另一方面，本披露提供了脑膜NOMV疫苗组合物，其包含经修饰为脂蛋白球菌菌株的冠状病毒受体结合结构域(RBD)，该菌株含有编码SARS-CoV-2RBD的质粒以及提供RBD在哺乳动物细胞中表达的启动子/增强子和聚A序列。
在另一方面，本披露提供了NOMV疫苗，其含有编码SARS-CoV-2RBD的质粒，以及提供RBD在哺乳动物细胞中表达的启动子/增强子和聚A序列。
在另一方面，本披露提供了为受试者接种疫苗的方法，该方法包括施用包含经修饰为脂蛋白的冠状病毒受体结合结构域(RBD)的NOMV疫苗组合物。
本披露的这些和其他实施例在以下详细描述。
序列简要说明
SEQ ID NO:1–C链C、刺突糖蛋白受体结合结构域的序列(示于图10)。
SEQ ID NO:2–刺突糖蛋白信号序列、SARS-CoV-2的A链的序列(示于图11)。
SEQ ID NO:3–成熟刺突糖蛋白、SARS-CoV-2的A链的序列(示于图11)。
SEQ ID NO:4–启动子+RBD的DNA序列(示于图12)。
SEQ ID NO:5–NOMV中产生的FHbp25-RBD的蛋白序列。
SEQ ID NO:6–NOMV中产生的FHbp55-RBD的蛋白序列。
SEQ ID NO:7–哺乳动物细胞中表达的RBD。
SEQ ID NO:8–pFP12 RBD质粒的DNA序列(图13)。
SEQ ID NO:9–pUC18-Lpxl1KO-FHbp25RBD-KAN质粒的序列(图14)。
SEQ ID NO:10–pGEM-SiaD-GalE-FHbp25RBD-SPC质粒的序列(图15)。
SEQ ID NO:11–pBS-FHbpKO-FHbp25RBD-ERM质粒的序列(图16)。
SEQ ID NO:12–pUC18-Lpxl1KO-FHbp55RBD-KAN质粒的序列(图17)。
SEQ ID NO:13–pGEM-SiaD-GalE-FHbp55RBD-SPC质粒的序列(图18)。
SEQ ID NO:14–pBS-FHbpKO-FHbp55RBD-ERM质粒的序列(图19)。
SEQ ID NO:15–pFP12 SV40 RBD-2质粒的序列(图7)。
SEQ ID NO:16–pFP12 SV-40RBD-2完整质粒的序列(图20)。
SEQ ID NO:17–pFP12 SV-40RBD-2mobC质粒的序列(图21)。
SEQ ID NO:18–FHbp变体ID9的序列(图22)。
附图说明
图1描绘了PCR引物设计用于扩增插入脑膜炎奈瑟菌菌株H44/76的构建体上游和下游，该构建体携带fhbp、siaD-galE、或lpxL1基因、RBD基因的侧翼区以及抗生素抗性表达盒。
图2示出了抗RBD多克隆抗体(1:1000)与活的脑膜炎奈瑟球菌细菌的表面结合的1个拷贝(左图)、2个拷贝(中间图)、和3个拷贝(右图)的流式细胞术结果。
图3示出了显示RBD是NOMV配制剂中最丰富的蛋白质之一的肽图，且肽占蛋白质的65％，包括在蛋白的N-末端和C-末端处的肽。
图4示出了显示NOMV疫苗中RBD的存在的蛋白质印迹。
图5示出了与单独用氢氧化铝佐剂(空心符号)免疫的小鼠相比，用NOMV-RBD免疫的小鼠产生与RBD和完整的刺突蛋白两者(实心符号)反应的抗RBD特异性抗体。
图6示出了哺乳动物SARS-CoV-2刺突RBD表达盒，其含有SV40增强子、泛素人EF1α-HTLV复合启动子、和SV40多腺苷酸化(pAn)信号。
图7示出了pFP12 SV40 RBD-2质粒(SEQ ID NO:15)，其含有用于转化脑膜炎奈瑟球菌的哺乳动物SARS-CoV-2刺突RBD表达盒(示于图6)。
图8描绘了插入脑膜炎奈瑟球菌菌株H44/76的构建体的上游区和下游区的PCR扩增，该构建体携带siaD-galE、lpxL1基因、和SV40-RBD基因的侧翼区以及抗生素抗性表达盒。
图9示出了来自不同的氯霉素抗性细菌克隆(上小图)和纯化的NOMV克隆(下小图)的加热灭活细胞的PCR扩增。中间小图示出了质粒从转化的氯霉素抗性细菌克隆中的分离。
图10描绘了C链C、刺突糖蛋白受体结合结构域的序列(SEQ ID NO:1)。
图11描绘了C链C、刺突糖蛋白受体结合结构域的序列(SEQ ID NO:1)。箭头指示的突出显示框的残基可以参与聚糖结合。非突出显示框的残基接触ACE2受体。
图12描绘了启动子+RBD的DNA序列(SEQ ID NO:4)。棕色突出显示的核苷酸的阴影指示5个重叠启动子序列的位置。青色、品红色和黄色突出显示的核苷酸指示限制位点。绿色突出显示的核苷酸指示转化开始。
图13描绘了pFP12-RBD质粒图(SEQ ID NO:8)。
图14示出了pUC18-Lpxl1KO-FHbp25RBD-KAN质粒(SEQ ID NO:9)。
图15示出了pGEM-SiaD-GalE-FHbp25RBD-SPC质粒(SEQ ID NO:10)。
图16示出了pBS-FHbpKO-FHbp25RBD-ERM质粒(SEQ ID NO:11)。
图17示出了pUC18-Lpxl1KO-FHbp55RBD-KAN质粒(SEQ ID NO:12)。
图18示出了pGEM-SiaD-GalE-FHbp55RBD-SPC质粒(SEQ ID NO:13)。
图19示出了pBS-FHbpKO-FHbp55RBD-ERM质粒(SEQ ID NO:14)。
图20示出了pFP12 SV-40RBD-2完整质粒(SEQ ID NO:16)。
图21示出了pFP12 SV-40RBD-2mobC质粒。(SEQ ID NO:17)。
图22示出了FHbp变体ID9的序列(SEQ ID NO:18)。“FHbp55-RBD”序列是加下划线的。“FHbp25-RBD”序列对应于前25个氨基酸。
具体实施方式
                         序列表
<110>   G·莫伊
       S·琼蒂尼
<120>   天然外膜囊泡中的SARS-COV-2受体结合结构域
<130>   OMV0001-401-PC
<150>   63/059,031
<151>   2020-07-30
<160>   18
<170>   PatentIn version 3.5
<210>   1
<211>   225
<212>   PRT
<213>   人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>   C链C、刺突糖蛋白受体结合结构域
<400>   1
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1               5                   10                  15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
            20                  25                  30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
        35                  40                  45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
    50                  55                  60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
                85                  90                  95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
            100                 105                 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
        115                 120                 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
    130                 135                 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145                 150                 155                 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
                165                 170                 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
            180                 185                 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
        195                 200                 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Ser
    210                 215                 220
Gly
225
<210>   2
<211>   19
<212>   PRT
<213>   人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>   刺突糖蛋白信号序列、SARS-CoV-2的A链
<400>   2
Met Gly Ile Leu Pro Ser Pro Gly Met Pro Ala Leu Leu Ser Leu Val
1               5                   10                  15
Ser Leu Leu
<210>   3
<211>   1253
<212>   PRT
<213>   人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>   成熟刺突糖蛋白、SARS-CoV-2的A链
<400>   3
Ser Val Leu Leu Met Gly Cys Val Ala Glu Thr Gly Thr Gln Cys Val
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
            20                  25                  30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
        35                  40                  45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
    50                  55                  60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65                  70                  75                  80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
                85                  90                  95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
            100                 105                 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
        115                 120                 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
    130                 135                 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145                 150                 155                 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
                165                 170                 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
            180                 185                 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
        195                 200                 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
    210                 215                 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225                 230                 235                 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
                245                 250                 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
            260                 265                 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
        275                 280                 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
    290                 295                 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305                 310                 315                 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
                325                 330                 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
            340                 345                 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
        355                 360                 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
    370                 375                 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385                 390                 395                 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
                405                 410                 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
            420                 425                 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
        435                 440                 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
    450                 455                 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465                 470                 475                 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
                485                 490                 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
            500                 505                 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
        515                 520                 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
    530                 535                 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545                 550                 555                 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
                565                 570                 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
            580                 585                 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Glu Val
        595                 600                 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
    610                 615                 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625                 630                 635                 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
                645                 650                 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
            660                 665                 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Ser Gly Ala Gly Ser Val Ala
        675                 680                 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
    690                 695                 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705                 710                 715                 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
                725                 730                 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
            740                 745                 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
        755                 760                 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
    770                 775                 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785                 790                 795                 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
                805                 810                 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
            820                 825                 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
        835                 840                 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
    850                 855                 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865                 870                 875                 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
                885                 890                 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
            900                 905                 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
        915                 920                 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
    930                 935                 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945                 950                 955                 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
                965                 970                 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Pro Pro Glu Ala Glu Val Gln
            980                 985                 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg  Leu Gln Ser Leu Gln  Thr Tyr Val
        995                 1000                 1005
Thr Gln  Gln Leu Ile Arg Ala  Ala Glu Ile Arg Ala  Ser Ala Asn
    1010                 1015                 1020
Leu Ala  Ala Thr Lys Met Ser  Glu Cys Val Leu Gly  Gln Ser Lys
    1025                 1030                 1035
Arg Val  Asp Phe Cys Gly Lys  Gly Tyr His Leu Met  Ser Phe Pro
    1040                 1045                 1050
Gln Ser  Ala Pro His Gly Val  Val Phe Leu His Val  Thr Tyr Val
    1055                 1060                 1065
Pro Ala  Gln Glu Lys Asn Phe  Thr Thr Ala Pro Ala  Ile Cys His
    1070                 1075                 1080
Asp Gly  Lys Ala His Phe Pro  Arg Glu Gly Val Phe  Val Ser Asn
    1085                 1090                 1095
Gly Thr  His Trp Phe Val Thr  Gln Arg Asn Phe Tyr  Glu Pro Gln
    1100                 1105                 1110
Ile Ile  Thr Thr Asp Asn Thr  Phe Val Ser Gly Asn  Cys Asp Val
    1115                 1120                 1125
Val Ile  Gly Ile Val Asn Asn  Thr Val Tyr Asp Pro  Leu Gln Pro
    1130                 1135                 1140
Glu Leu  Asp Ser Phe Lys Glu  Glu Leu Asp Lys Tyr  Phe Lys Asn
    1145                 1150                 1155
His Thr  Ser Pro Asp Val Asp  Leu Gly Asp Ile Ser  Gly Ile Asn
    1160                 1165                 1170
Ala Ser  Val Val Asn Ile Gln  Lys Glu Ile Asp Arg  Leu Asn Glu
    1175                 1180                 1185
Val Ala  Lys Asn Leu Asn Glu  Ser Leu Ile Asp Leu  Gln Glu Leu
    1190                 1195                 1200
Gly Lys  Tyr Glu Gln Tyr Ile  Lys Gly Ser Gly Arg  Glu Asn Leu
    1205                 1210                 1215
Tyr Phe  Gln Gly Gly Gly Gly  Ser Gly Tyr Ile Pro  Glu Ala Pro
    1220                 1225                 1230
Arg Asp  Gly Gln Ala Tyr Val  Arg Lys Asp Gly Glu  Trp Val Leu
    1235                 1240                 1245
Leu Ser  Thr Phe Leu
    1250
<210>   4
<211>   976
<212>   DNA
<213>   人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>   启动子+RBD
<400>   4
cctcagcgca tgcatccggg ctctgcgctt gaattgtgtt gtagaaacac aacgtttttg      60
aaaaaataag ctattgtttt atatcaaaat ataatcattt ttaaaataaa ggttgcggca     120
tttatcagat atttgttctg aaatgaagac gtatcgggtg tttgcccgat gtttttaggt     180
ttttatcaaa tttacaaaag gaagcccata tggtgaaccg aactgccttc tgcctttctc     240
tgaccgccgc cctgattctg accgcctgca gcagcggagg gggtggtcgc gtgcagccga     300
ccgaaagcat tgtgcgcttt ccgaacatta ccaacctgtg cccgtttggc gaagtgttta     360
acgcgacccg ctttgcgagc gtgtatgcgt ggaaccgcaa acgcattagc aactgcgtgg     420
cggattatag cgtgctgtat aacagcgcga gctttagcac ctttaaatgc tatggcgtga     480
gcccgaccaa actgaacgat ctgtgcttta ccaacgtgta tgcggatagc tttgtgattc     540
gcggcgatga agtgcgccag attgcgccgg gccagaccgg caaaattgcg gattataact     600
ataaactgcc ggatgatttt accggctgcg tgattgcgtg gaacagcaac aacctggata     660
gcaaagtggg cggcaactat aactatctgt atcgcctgtt tcgcaaaagc aacctgaaac     720
cgtttgaacg cgatattagc accgaaattt atcaggcggg cagcaccccg tgcaacggcg     780
tggaaggctt taactgctat tttccgctgc agagctatgg ctttcagccg accaacggcg     840
tgggctatca gccgtatcgc gtggtggtgc tgagctttga actgctgcat gcgccggcga     900
ccgtgtgcgg cccgaaaaaa agcaccaacc tggtgaaaaa caaatgcgtg aactttagcg     960
gctaaaggcc tgcagg                                                     976
<210>   5
<211>   251
<212>   PRT
<213>   人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>   NOMV中产生的RBD25
<400>   5
Met Val Asn Arg Thr Ala Phe Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1               5                   10                  15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Arg Val Gln Pro Thr Glu
            20                  25                  30
Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu
        35                  40                  45
Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys
    50                  55                  60
Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala
65                  70                  75                  80
Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn
                85                  90                  95
Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly
            100                 105                 110
Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp
        115                 120                 125
Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp
    130                 135                 140
Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile
                165                 170                 175
Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu
            180                 185                 190
Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr
        195                 200                 205
Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu
    210                 215                 220
Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn
225                 230                 235                 240
Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Ser Gly
                245                 250
<210>   6
<211>   280
<212>   PRT
<213>   人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>   NOMV中产生的RBD55
<400>   6
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile Leu
1               5                   10                  15
Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala
            20                  25                  30
Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp
        35                  40                  45
His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val
    50                  55                  60
Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn
65                  70                  75                  80
Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser
                85                  90                  95
Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser
            100                 105                 110
Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys
        115                 120                 125
Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val
    130                 135                 140
Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr
145                 150                 155                 160
Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn
                165                 170                 175
Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu
            180                 185                 190
Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu
        195                 200                 205
Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn
    210                 215                 220
Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val
225                 230                 235                 240
Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His
                245                 250                 255
Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys
            260                 265                 270
Asn Lys Cys Val Asn Phe Ser Gly
        275                 280
<210>   7
<211>   251
<212>   PRT
<213>   人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>   哺乳动物细胞中表达的RBD
<400>   7
Met Glu Ile Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu
1               5                   10                  15
Ala Leu Glu Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn
            20                  25                  30
Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe
        35                  40                  45
Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala
    50                  55                  60
Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys
65                  70                  75                  80
Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val
                85                  90                  95
Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala
            100                 105                 110
Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp
        115                 120                 125
Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser
    130                 135                 140
Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser
145                 150                 155                 160
Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala
                165                 170                 175
Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro
            180                 185                 190
Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro
        195                 200                 205
Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr
    210                 215                 220
Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val
225                 230                 235                 240
Asn Phe Gly Ser Gly His His His His His His
                245                 250
<210>   8
<211>   6683
<212>   DNA
<213>   人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>   pFP12 RBD质粒
<400>   8
ctgcaggccg tctgaaccgc tctaaccgct ttttctcggc ttaatttttc tgtctctgtt      60
ataaaattgc tattcatctt gttcttcttc aaaaaaaagt taagtaaaat acctacctaa     120
atttttacta gttcgcaatc tacgagctta taacctcgtt ttttcaattc atttaaaaaa     180
tcagattttg agcctaattt tgatctattg ctatcgttac ccgctagaaa tacccagtaa     240
ttacgcaaat cttcattggt aactttcgta atatcggtgt aatgatcttc gagtattttt     300
aagcaatctc tagcccataa accgtactcg tgattgctca tcttagggtt ttgcttatcg     360
agtttgacga acttcccata cttgttttta tgtggaaata ctggccgttt tgcaacttct     420
tcaatttttt gagctgttcg ttttttacta ccaatcacaa aatttaaaga gtgaatagta     480
cgcccacgct tgatttgttc aacctcaacg actaaatcag atttctcgtt aatctcagtt     540
attgcaggtt ccaaaacacg ttgatttaat gaattaaatc tagggtattt attttcaacc     600
tgaagccatt cttttagttt ttctactgta atttcacgac taccaacaga gcgatattgt     660
gtaattagct cataaattcg aattgaatgt acactgttga aataagcgat atgtttgagt     720
tgatattgcg tgaattgccc tttaagttgc gttaggtatg gcataacttc atcagtcatt     780
gcaattctaa aacgcccctc tttcttgaaa tatgttctag aggaaaccca acgaaattca     840
gttacacggt ctttatcttc agttttaaca cttcggtcat aaatccgttt tatagccgcc     900
tgaatttgct tataggcgtt atcttggctt atttctggaa actcacggac aaaatcagcc     960
accgtaaaat caaaaatctt ttgattagat ttcggatcca tagtcccaat agttaaagct    1020
aaaattctga tttcatcaat actcaatcgg taattggctt caataaggct attagccttt    1080
acaacaacta aatcatttgg cataagacaa caaatttcct gtttaaaaca acaagcaaaa    1140
tatacctgtt gtttatatat aaaacaacaa gtattttctt aaaagttgtc tataacagga    1200
aatttgttgt cttataacag gaaatttgtt gtcgtataac aggaaatttg ttgtcgtata    1260
acaggaaatt tgttgtcgta taagtttgta acttattgat tttactggtt ttaaaaacgc    1320
cgaaaacaag taaaaaacaa aaatataaaa atatagggac tttcgtccct tttttgggct    1380
ttcagcccta attttttctt tttttcagga tttaaaatta caaaaccctt acagagcaag    1440
taaacttgtt tgcttgttct gcaagggttc agcaaccgta gccgtcaggc gtagggcggt    1500
agcctataaa agccatttaa ttttatcttt aaacttcctt ttaaatgctt tgagtgggtg    1560
tcttttatcg tactcatcaa tccttttttg cattctttcg tttgctttgt gatcggcaaa    1620
ttttgaataa gatttttcca tctcatctaa cattctatca atccgttttt tatgttgcca    1680
tttcaggtaa acataaacac ttatagcaat taaagacaat atcaatacat tgtaaaaaat    1740
gattgttaca atttcgctca cagttatttt ttaccttttt caatttcttc attgataaat    1800
gcactcaatt catcaaattt cttgtcatca ttgataaatt tacgcaactt agggaagttt    1860
ctatctacat ctaaaagagg gttatttatt atttcattta gccaaaaagc ccctaataaa    1920
accttgtaat gcgtagcttt cttacgcttt tctgcttgtt cttttgactt aatcgcacga    1980
attttcgctt tgatttcgtc ctgcttgcgt tgtaaatctg cttgttgctg ttccaatctt    2040
gtaagttttt cgcttgccat actagcccct ttatatagtt agaaattatc gttattttat    2100
tcagtaggtg ctaggcttgc aagtgttctg ttcattacgt taaaataacg taatgcccac    2160
ttatcagttt ctcttcgaga aactggtggg caagcgtacc gcttgaccgt ttcgcaatac    2220
tcaacactat ggcaatctat catttaaacg ttcgctattg cagtaaaagc aaagggcaat    2280
cagctcaagc caaaaacgac tacatcaacc gcaatgataa atattcaaag cggttagatg    2340
atttacagtt ttcaggctat ggtaatatgc caaaatttgc cgaagataat ccgcaagaat    2400
tttggcgatt gtcagatatt tacgagcgag ctaatgcccg agtttgtact gaaattgaat    2460
ttgctttacc tagagaatta accctagaac aacagcaaaa attagtaagt tcgtttatag    2520
aaaatacggt tgatagcggt agcaataaac taccctactc tttcgctatc cataccgata    2580
aaaataatca taatccccat tgtcatttga tattttcaga acgccaactt gacggcatag    2640
accgtacagc cgagcagttt tttaaacgtg ctaatactaa atccccagaa aagggcggag    2700
cgatgaaaac ggcagatttt cgagatcgtg agtttatcca atctgtccga aaaacgtgga    2760
gagagcaagc taatcaagcc ttagagcaat acggatatgc cgcacgaatt gacgaacgta    2820
gctacaagga acaaggcata gagcaagccc caagagcaag aattgacagg gtaacgtggc    2880
aagaattgaa ccgattagag caagaagaac gccaaatcgt gcaagagctt gcacttaaag    2940
gacaagaaat taacaaagaa aaatcctact tgcagaaaat cgaagaaaaa caggctcaag    3000
gaatgggcaa atatgaatcc aaattcgcag ctgcgttttc taaattatcg gaaagtgccc    3060
taaaacacga tttaagcaac gaaaaagaaa aagacagtaa aatacacact caagaagaaa    3120
aagtgcctca aaatcgcatt caggggcttt ctcaagcaga ttttgatcag tttttaattg    3180
atgaatggct acctcaaata gaaaaatacg ttaaagccca agaaaagcgg gacggaatgg    3240
aagtagagat cacgcaatac gacaaggatt tacagcgtat tcagggagac tataacaagc    3300
tcacagataa aaatcagggt tttctcggtt tatgggaaac taaagagcaa aaagcaaaga    3360
aaaaagagct tgaagatgaa tacaaacata cagcagagca acggaacgct aaaagccaag    3420
aattagccga gtatagccaa aaaataaaag catacgaaca gaaaacgcta gagccaatca    3480
acgagaagat tgccaaatat caagctgaca accctgaaat aaaaatgcgg agcttaggat    3540
ttgtgaaaaa aattaaggct caaggggcat ataaagcggc tcaagagcga atggagcgag    3600
aaaaacagca ccaacaggaa aaacaacaga gacatttaga gcgagagagt ggtttgagct    3660
tgtagctaac gccctacgcc tacggcttcg gttgttcaac ccttaaagaa ctcgcaacaa    3720
gttgcaaatt ctttaagggt tcgcaataaa aacaaccgct aaacatttct gcccagcggt    3780
tgaaaattta cctattcacc attacaatga tcaagcagga aatttttttg attgccgtaa    3840
atgtccgtat atctagttga ggcacaaccc gccaaagtca ttgccccaac cagaacggcg    3900
aagctaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac    3960
gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc    4020
actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt    4080
gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagcttcct    4140
cagcgcatgc atccgggctc tgcgcttgaa ttgtgttgta gaaacacaac gtttttgaaa    4200
aaataagcta ttgttttata tcaaaatata atcattttta aaataaaggt tgcggcattt    4260
atcagatatt tgttctgaaa tgaagacgta tcgggtgttt gcccgatgtt tttaggtttt    4320
tatcaaattt acaaaaggaa gcccatatgg tgaaccgaac tgccttctgc ctttctctga    4380
ccgccgccct gattctgacc gcctgcagca gcggaggggg tggtcgcgtg cagccgaccg    4440
aaagcattgt gcgctttccg aacattacca acctgtgccc gtttggcgaa gtgtttaacg    4500
cgacccgctt tgcgagcgtg tatgcgtgga accgcaaacg cattagcaac tgcgtggcgg    4560
attatagcgt gctgtataac agcgcgagct ttagcacctt taaatgctat ggcgtgagcc    4620
cgaccaaact gaacgatctg tgctttacca acgtgtatgc ggatagcttt gtgattcgcg    4680
gcgatgaagt gcgccagatt gcgccgggcc agaccggcaa aattgcggat tataactata    4740
aactgccgga tgattttacc ggctgcgtga ttgcgtggaa cagcaacaac ctggatagca    4800
aagtgggcgg caactataac tatctgtatc gcctgtttcg caaaagcaac ctgaaaccgt    4860
ttgaacgcga tattagcacc gaaatttatc aggcgggcag caccccgtgc aacggcgtgg    4920
aaggctttaa ctgctatttt ccgctgcaga gctatggctt tcagccgacc aacggcgtgg    4980
gctatcagcc gtatcgcgtg gtggtgctga gctttgaact gctgcatgcg ccggcgaccg    5040
tgtgcggccc gaaaaaaagc accaacctgg tgaaaaacaa atgcgtgaac tttagcggct    5100
aaaggcctac tagtcggccg tacgggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt gattaagtgc    5160
ggtcatcttc ggtttccgtg tttcgtaaag tctggaaacg cggaagtccc ctacgtgctg    5220
ctgaagttgc cccaacagag agtggaacca accggtgata ccacgatact atgactgaga    5280
gtcaacgcca tgagcggcct catttcttat tctgagttac aacagtccgc accgctgtcc    5340
ggtagctcct tccggtgggc gcggggcatg actatcgtcg ccgcacttat gactgtcttc    5400
tttatcatgc aactcgtagg acaggtgccg gcagcgccca acagtccccc ggccacgggg    5460
cctgccacca tacccacgcc gaaacaagcg ccctgcacca ttatgttccg gatctgcatc    5520
gcaggatgct gctggctacc ctgtggaaca cctacatctg tattaacgaa gcgctaaccg    5580
tttttatcag gctctgggag gcagaataaa tgatcatatc gtcaattatt acctccacgg    5640
ggagagcctg agcaaactgg cctcaggcat ttgagaagca cacggtcaca ctgcttccgg    5700
tagtcaataa accggtaaac cagcaataga cataagcggc tatttaacga ccctgccctg    5760
aaccgacgac cgggtcgaat ttgctttcga atttctgcca ttcatccgct tattatcact    5820
tattcaggcg tagcaccagg cgtttaaggg caccaataac tgccttaaaa aaattacgcc    5880
ccgccctgcc actcatcgca gtactgttgt aattcattaa gcattctgcc gacatggaag    5940
ccatcacaga cggcatgatg aacctgaatc gccagcggca tcagcacctt gtcgccttgc    6000
gtataatatt tgcccatggt gaaaacgggg gcgaagaagt tgtccatatt ggccacgttt    6060
aaatcaaaac tggtgaaact cacccaggga ttggctgaga cgaaaaacat attctcaata    6120
aaccctttag ggaaataggc caggttttca ccgtaacacg ccacatcttg cgaatatatg    6180
tgtagaaact gccggaaatc gtcgtggtat tcactccaga gcgatgaaac gtttcagttt    6240
gctcatggaa aacggtgtaa caagggtgaa cactatccca tatcaccagc tcaccgtctt    6300
tcattgccat acggaattcc ggatgagcat tcatcaggcg ggcaagaatg tgaataaagg    6360
ccggataaaa cttgtgctta tttttcttta cggtctttaa aaaggccgta atatccagct    6420
gaacggtctg gttataggta cattgagcaa ctgactgaaa tgcctcaaaa tgttctttac    6480
gatgccattg ggatatatca acggtggtat atccagtgat ttttttctcc attttagctt    6540
ccttagctcc tgaaaatctc gataactcaa aaaatacgcc cggtagtgat cttatttcat    6600
tatggtgaaa gttggaacct cttacgtgcc gatcaacgtc tcattttcgc caaaagttgg    6660
cccagggctt cccggtatca aca                                            6683
<210>   9
<211>   5185
<212>   DNA
<213>   人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>   pUC18-Lpxl1KO-FHbp25RBD-KAN质粒
<400>   9
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca      60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg     120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc     180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc     240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat     300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt     360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttatgtgt atcgagatga     420
aatttatatt ttttgtactg tatgttttgc agtttctgcc gtttgcgctg ctgcacaaga     480
ttgccgacct gacgggtttg cttgcctacc ttctggtcaa accgcgccgc cgtatcggcg     540
aaatcaattt ggcaaaatgt ttttccgaat ggagtgagga aaagcgtaaa accgtgttga     600
aacagcattt caaacacatg gcgaaactga tgttggaata cggtttatat tggtacgcgc     660
ctgccggacg tttgaaatcg ctggtgcgct accgcaataa gcattatttg gacgacgcgc     720
tggcggcggg ggaaaaagtc atcatcctgt atccgcactt caccgctgca gttctcgagg     780
cagtgactaa ctaggaggaa taaatggcta aaatgagaat atcaccggaa ttgaaaaaac     840
tgatcgaaaa ataccgctgc gtaaaagata cggaaggaat gtctcctgct aaggtatata     900
agctggtggg agaaaatgaa aacctatatt taaaaatgac ggacagccgg tataaaggga     960
ccacctatga tgtggaacgg gaaaaggaca tgatgctatg gctggaagga aagctgcctg    1020
ttccaaaggt cctgcacttt gaacggcatg atggctggag caatctgctc atgagtgagg    1080
ccgatggcgt cctttgctcg gaagagtatg aagatgaaca aagccctgaa aagattatcg    1140
agctgtatgc ggagtgcatc aggctctttc actccatcga catatcggat tgtccctata    1200
cgaatagctt agacagccgc ttagccgaat tggattactt actgaataac gatctggccg    1260
atgtggattg cgaaaactgg gaagaagaca ctccatttaa agatccgcgc gagctgtatg    1320
attttttaaa gacggaaaag cccgaagagg aacttgtctt ttcccacggc gacctgggag    1380
acagcaacat ctttgtgaaa gatggcaaag taagtggctt tattgatctt gggagaagcg    1440
gcagggcgga caagtggtat gacattgcct tctgcgtccg gtcgatcagg gaggatatcg    1500
gggaagaaca gtatgtcgag ctattttttg acttactggg gatcaagcct gattgggaga    1560
aaataaaata ttatatttta ctggatgaat tgttttagta cccctcagcg catgcatccg    1620
ggctctgcgc ttgaattgtg ttgtagaaac acaacgtttt tgaaaaaata agctattgtt    1680
ttatatcaaa atataatcat ttttaaaata aaggttgcgg catttatcag atatttgttc    1740
tgaaatgaag acgtatcggg tgtttgcccg atgtttttag gtttttatca aatttacaaa    1800
aggaagccca tatggtgaac cgaactgcct tctgcctttc tctgaccgcc gccctgattc    1860
tgaccgcctg cagcagcgga gggggtggtc gcgtgcagcc gaccgaaagc attgtgcgct    1920
ttccgaacat taccaacctg tgcccgtttg gcgaagtgtt taacgcgacc cgctttgcga    1980
gcgtgtatgc gtggaaccgc aaacgcatta gcaactgcgt ggcggattat agcgtgctgt    2040
ataacagcgc gagctttagc acctttaaat gctatggcgt gagcccgacc aaactgaacg    2100
atctgtgctt taccaacgtg tatgcggata gctttgtgat tcgcggcgat gaagtgcgcc    2160
agattgcgcc gggccagacc ggcaaaattg cggattataa ctataaactg ccggatgatt    2220
ttaccggctg cgtgattgcg tggaacagca acaacctgga tagcaaagtg ggcggcaact    2280
ataactatct gtatcgcctg tttcgcaaaa gcaacctgaa accgtttgaa cgcgatatta    2340
gcaccgaaat ttatcaggcg ggcagcaccc cgtgcaacgg cgtggaaggc tttaactgct    2400
attttccgct gcagagctat ggctttcagc cgaccaacgg cgtgggctat cagccgtatc    2460
gcgtggtggt gctgagcttt gaactgctgc atgcgccggc gaccgtgtgc ggcccgaaaa    2520
aaagcaccaa cctggtgaaa aacaaatgcg tgaactttag cggctaaagg cctgcaggga    2580
ataatgagtc gacaggattt cggacgcaac gattcggttt ttgtggattt tttcggtatt    2640
cagacggcaa cgattaccgg attgagccgc attgccgcgc ttgcaaatgc aaaagtgata    2700
cccgccattc ccgtccgcga ggcagacaat acggttacat tgcatttcta ccctgcttgg    2760
aaatcctttc cgggtgaaga cgcgaaagcc gacgcgcagc gcatgaaccg ttttatcgaa    2820
gacagggtgc gcgaacatcc ggaacaatat ttttggctgc acaagcgttt taaaacccgt    2880
ccggaaggca gccccgattt ttactgacta cgtcagacgg ctctagagga tccccgggta    2940
ccgagctcga attcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc    3000
acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga    3060
gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg    3120
tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg    3180
cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg    3240
gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga    3300
aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg    3360
gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag    3420
aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc    3480
gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg    3540
ggaagcgtgg cgctttctca aagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt    3600
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ttcaccgtaa cacgccacat cttgcgaata tatgtgtaga aactgccgga aatcgtcgtg    8100
gtattcactc cagagcgatg aaaacgtttc agtttgctca tggaaaacgg tgtaacaagg    8160
gtgaacacta tcccatatca ccagctcacc gtctttcatt gccatacgga attccggatg    8220
agcattcatc aggcgggcaa gaatgtgaat aaaggccgga taaaacttgt gcttattttt    8280
ctttacggtc tttaaaaagg ccgtaatatc cagctgaacg gtctggttat aggtacattg    8340
agcaactgac tgaaatgcct caaaatgttc tttacgatgc cattgggata tatcaacggt    8400
ggtatatcca gtgatttttt tctccatttt agcttcctta gctcctgaaa atctcgataa    8460
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gtgccgatca acgtctcatt ttcgccaaaa gttggcccag ggcttcccgg tatcaaca      8578
<210>   17
<211>   8275
<212>   DNA
<213>   人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>   pFP12 SV-40 RBD-2 mobC质粒
<400>   17
ctgcaggccg tctgaaccgc tctaaccgct ttttctcggc ttaatttttc tgtctctgtt      60
ataaaattgc tattcatctt gttcttcttc aaaaaaaagt taagtaaaat acctacctaa     120
atttggatcc ttactagttc gcaatctacg agcttataac ctcgtttttt caattcattt     180
aaaaaatcag attttgagcc taattttgat ctattgctat cgttacccgc tagaaatacc     240
cagtaattac gcaaatcttc attggtaact ttcgtaatat cggtgtaatg atcttcgagt     300
atttttaagc aatctctagc ccataaaccg tactcgtgat tgctcatctt agggttttgc     360
ttatcgagtt tgacgaactt cccatacttg tttttatgtg gaaatactgg ccgttttgca     420
acttcttcaa ttttttgagc tgttcgtttt ttactaccaa tcacaaaatt taaagagtga     480
atagtacgcc cacgcttgat ttgttcaacc tcaacgacta aatcagattt ctcgttaatc     540
tcagttattg caggttccaa aacacgttga tttaatgaat taaatctagg gtatttattt     600
tcaacctgaa gccattcttt tagtttttct actgtaattt cacgactacc aacagagcga     660
tattgtgtaa ttagctcata aattcgaatt gaatgtacac tgttgaaata agcgatatgt     720
ttgagttgat attgcgtgaa ttgcccttta agttgcgtta ggtatggcat aacttcatca     780
gtcattgcaa ttctaaaacg cccctctttc ttgaaatatg ttctagagga aacccaacga     840
aattcagtta cacggtcttt atcttcagtt ttaacacttc ggtcgtaaat ccgttttata     900
gccgcctgaa tttgcttata ggcgttatct tggcttattt ctggaaactc acggacaaaa     960
tcagccaccg taaaatcaaa aatcttttga ttagatttcg gatccatagt cccgatagtt    1020
aaagctaaaa ttctgatttc atcaatactc aatcggtaat tggcttcaat aaggctatta    1080
gcctttacaa caactaaatc atttggcata atgccgtctg aaagacaaca aatttcctgt    1140
ttaaaacaac aagcaaaata tacctgttgt ttatatataa aacaacaagt attttcttaa    1200
aagttgtcta taacaggaaa tttgttgtcg tataacagga aatttgttgt cttataacag    1260
gaaatttgtt gtcgtataac aggaaatttg ttgtcgtata agtttgtaac ttattgattt    1320
tactggtttt aaaaacgccg aaaacaagta aaaaacaaaa atataaaaat atagggactt    1380
tcgtcccttt tttgggcttt cagccctaat tttttctttt ttcaggatta aaaattacaa    1440
aacccttaca gagcaagtaa acttgtttgc ttgttctgca agggttcagc aaccgtagcc    1500
gtcaggcgta gggcggtagc ctataaaagc catttaattt tatctttaaa cttcctttta    1560
aatgctttga gtgggtgtct tttatcgtac tcatcaatcc ttttttgcat tctttcgttt    1620
gctttgtgat cggcaaattt tgaataagat ttttccatct catctaacat tctatcaatc    1680
cgttttttat gttgccattt caggtaaaca taaacactta tagcaattaa agacaatatc    1740
aatacattgt aaaaaatgat tgttacaatt tcgctcacag atgccgtctg aacccgggat    1800
gccgtctgaa actagcccct ttatatagtt agaaattatc gttattttat tcagtaggtg    1860
ctaggcttgc aagtgttctg ttcattacgt taaaataacg taatgcccac ttatcagttt    1920
ctcttcgaga aactggtggg caagcgtacc gcttgaccgt ttcgcaatac tcaacactat    1980
gccgtctgaa ctcgagatgg caatctatca tttaaacgtt cgctattgca gtaaaagcaa    2040
agggcaatca gctcaagcca aaaacgacta catcaaccgc aatgataaat attcaaagcg    2100
gttagatgat ttacagtttt caggctatgg taatatgcca aaatttgccg aagataatcc    2160
gcaagaattt tggcgattgt cagatattta cgagcgagct aatgcccgag tttgtactga    2220
aattgaattt gctttaccta gagaattaac cctagaacaa cagcaaaaat tagtaagttc    2280
gtttatagaa aatacggttg atagcggtag caataaacta ccctactctt tcgctatcca    2340
taccgataaa aataatcata atccccattg tcatttgata ttttcagaac gccaacttga    2400
cggcatagac cgtacagccg agcagttttt taaacgtgct aatactaaat ccccagaaaa    2460
gggcggagcg atgaaaacgg cagattttcg agatcgtgag tttatccaat ctgtccgaaa    2520
aacgtggaga gagcaagcta atcaagcctt agagcaatac ggatatgccg cacgaattga    2580
cgaacgtagc tacaaggaac aaggcataga gcaagcccca agagcaagaa ttgacagggt    2640
aacgtggcaa gaattgaacc gattagagca agaagaacgc caaatcgtgc aagagcttgc    2700
acttaaagga caagaaatta acaaagaaaa atcctacttg cagaaaatcg aagaaaaaca    2760
ggctcaagga atgggcaaat atgaatccaa attcgcagct gcgttttcta aattatcgga    2820
aagtgcccta aaacacgatt taagcaacga aaaagaaaaa gacagtaaaa tacacactca    2880
agaagaaaaa gtgcctcaaa atcgcattca ggggctttct caagcagatt ttgatcagtt    2940
tttaattgat gaatggctac ctcaaataga aaaatacgtt aaagcccaag aaaagcggga    3000
cggaatggaa gtagagatca cgcaatacga caaggattta cagcgtattc agggagacta    3060
taacaagctc acagataaaa atcagggttt tctcggttta tgggaaacta aagagcaaaa    3120
agcaaagaaa aaagagcttg aagatgaata caaacataca gcagagcaac ggaacgctaa    3180
aagccaagaa ttagccgagt atagccaaaa aataaaagca tacgaacaga aaacgctaga    3240
gccaatcaac gagaagattg ccaaatatca agctgacaac cctgaaataa aaatgcggag    3300
cttaggattt gtgaaaaaaa ttaaggctcg aggggcatat aaagcggctc aagagcgaat    3360
ggagcgagaa aaacagcacc aacaggaaaa acaacagaga catttagagc gagagagtgg    3420
tttgagcttg tagatgccgt ctgaactaac gccctacgcc tacggcttcg gttgttcaac    3480
ccttaaagaa ctcgcaacaa gttgcaaatt ctttaagggt tcgcaataaa aacaaccgct    3540
aaacatttct gcccagcggt tgaaaattta cctattcacc attacaatga tcaagcagga    3600
aatttttttg attgccgtaa atgtccgtat atctagttga ggcacaaccc gccaaagtca    3660
ttgccccaac cagaacggcg aaagctaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg    3720
attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac    3780
gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg    3840
gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacgggaaa cagctatgac    3900
catgattacg ccaagcttcc tcagcgcatg catccgggca gcagcgcatc ggctcgcacg    3960
aggtctgcgc ttgaattgtg ttgtagaaac acaacgtttt tgaaaaaata agctattgtt    4020
ttatatcaaa atataatcat ttttaaaata aaggttgcgg catttatcag atatttgttc    4080
tgaaatgaag acgtatcggg tgtttgcccg atgtttttag gtttttatca aatttacaaa    4140
aggaagccca tatgctctat cgaaggacct gcagggcctg aaataacctc tgaaagagga    4200
acttggttag gtaccttctg aggcggaaag aaccagctgt ggaatgtgtg tcagttaggg    4260
tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag    4320
tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg    4380
catctcaatt agtcagcaac catagtccca ctagtgctcc ggtgcccgtc agtgggcaga    4440
gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt gaacgggtgc    4500
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ttgcctgacc ctgcttgctc aactctacgt ctttgtttcg ttttctgttc tgcgcagtta    4920
cagatccaag ctgtgaccgg cgcctacctg agatcaccgg tcaccatgga gatcaaggtg    4980
ctgtttgccc tcatctgtat tgctgttgct gaggcactcg agcgggtcca acccaccgaa    5040
agcattgtgc ggttcccaaa tatcaccaat ctgtgtccct ttggcgaagt gttcaatgct    5100
acaaggtttg cttctgtgta cgcatggaat aggaaacgca tctccaattg tgtcgctgat    5160
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accaaactta acgacctgtg cttcactaat gtgtatgccg actcttttgt gatacgaggc    5280
gatgaagtga gacagattgc accagggcag accggcaaaa ttgccgacta caactacaag    5340
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ccctgcacca ttatgttccg gatctgcatc gcaggatgct gctggctacc ctgtggaaca    7140
cctacatctg tattaacgaa gcgctaaccg tttttatcag gctctgggag gcagaataaa    7200
tgatcatatc gtcaattatt acctccacgg ggagagcctg agcaaactgg cctcaggcat    7260
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tacggtcttt aaaaaggccg taatatccag ctgaacggtc tggttatagg tacattgagc    8040
aactgactga aatgcctcaa aatgttcttt acgatgccat tgggatatat caacggtggt    8100
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aaaaaatacg cccggtagtg atcttatttc attatggtga aagttggaac ctcttacgtg    8220
ccgatcaacg tctcattttc gccaaaagtt ggcccagggc ttcccggtat caaca         8275
<210>   18
<211>   259
<212>   PRT
<213>   人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>   FHbp ID9
<400>   18
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp
1               5                   10                  15
Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys
            20                  25                  30
Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn
        35                  40                  45
Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn
    50                  55                  60
Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg
65                  70                  75                  80
Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu
                85                  90                  95
Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr
            100                 105                 110
Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met
        115                 120                 125
Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr
    130                 135                 140
Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr
145                 150                 155                 160
Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp
                165                 170                 175
Phe Ala Val Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro
            180                 185                 190
Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Lys Lys
        195                 200                 205
Arg His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys
    210                 215                 220
Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala
225                 230                 235                 240
Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu
                245                 250                 255
Ala Ala Lys
概述
在一个实施例中，本披露提供了天然外膜囊泡(NOMV)疫苗，其含有经修饰为脂蛋白的冠状病毒受体结合结构域(RBD)。在一个实施例中，冠状病毒受体结合结构域(RBD)是SARS-CoV-2RBD。其他实施例提供了脑膜炎球菌菌株，其含有编码经修饰为脂蛋白的SARS-CoV-2RBD的基因，其中该基因在质粒(例如pFP12-RBD质粒或pFP12 SV-40RBD-2完整质粒、或pFP12质粒)上携带。一些实施例提供了脑膜炎球菌菌株H44/76或菌株NZ98/254。在一些实施例中，脑膜炎球菌菌株H44/76或NZ98/254不表达孔蛋白PorA。其他实施例提供了脑膜炎球菌菌株，其含有编码经修饰为脂蛋白的SARS-CoV-2RBD的基因，其中该基因的表达由在脑膜炎奈瑟菌中产生高基因转录率的强启动子序列驱动，例如具有本文列出的序列的启动子。在一些实施例中，可用于本披露的启动子可以是孔蛋白PorA启动子或其衍生物。其他实施例提供了脑膜炎球菌菌株，其含有编码经修饰为脂蛋白的SARS-CoV-2RBD的基因，其中将该基因和启动子插入细菌基因组的基因座，例如lpxL1基因座以破坏酰基转移酶基因的表达，使得产生的脂寡糖是五酰基化的而非六酰基化的，或siaD-galE基因座(siaA同样)以破坏荚膜多糖的表达以及脂寡糖宿主抗原的唾液酸化，或fhbp基因座(因子H结合蛋白)，或porA基因座。
本披露描述了抗体通过以下增强对RBD的保护作用：(a)在多拷贝质粒上过表达具有新型启动子的基因并且在染色体中插入另外的基因以敲除FHbp、荚膜多糖和LOS唾液酸化，(b)在Nm NOMV中在其表面显示为脂蛋白，(c)在具有另外的氨基酸区段的Nm NOMV中在其表面显示为脂蛋白以促进转运至细菌表面、RBD的适当折叠、蛋白水解稳定性，并且从细菌表面外延伸RBD以增强与抗原呈递细胞的相互作用，(d)在缺少孔蛋白PorA的菌株中产生是免疫显性抗原的NOMV，其可以与荚膜多糖一起降低RBD对免疫系统的可及性，(e)将质粒插入Nm菌株，该菌株含有提供RBD在哺乳动物细胞中表达的启动子/增强子和聚A序列，(f)含有质粒以及提供RBD在哺乳动物细胞中表达的启动子/增强子和聚A序列的NOMV疫苗。
脑膜炎球菌孔蛋白PorA是Nm中高度表达的蛋白之一，并引发抗PorA抗体的高滴度。然而，驱动基因表达的PorA启动子是相可变的，使得在复制过程中插入或缺失聚G段中的碱基可以导致表达的增加或减少。本文诸位发明人已经发现在含有6个有潜力的启动子的Nm中的PorA基因的上游区，其中只有一个含有聚G段。基于这一分析，PorA启动子通过去除含有聚G段的序列进行工程化，从而消除相变异的潜力同时保留驱动高转录水平的能力。工程化启动子构建体用于驱动RBD基因在插入染色体的基因中的每一个以及在多拷贝质粒中的表达。将启动子-RBD基因构建体插入涵盖siaD和galE的区域以消除荚膜多糖的产生以及LOS、fhbp和lpxL1的唾液酸化，以及染色体外质粒中。选择缺少PorA表达的Nm菌株H44/76的变体以提高RBD的可及性，并且消除具有对SARS-CoV-2无保护价值的免疫显性抗原的潜在免疫竞争。在一些实施例中，Nm菌株H44/76对于本披露的用途是有用的菌株。在另一实施例中，Nm菌株NZ98/254对于本披露的用途是有用的菌株。
在NOMV表面显示的蛋白质是具有一个或多个跨膜区段的整合膜蛋白或通过脂肪酸附接至蛋白质的氨基末端经修饰为脂蛋白，以产生脂蛋白，其中该附接的脂肪酸充当对膜的锚。脂蛋白最初转化为前体脂蛋白，其拥有大约20个氨基酸的氨基末端信号肽，其中具有分泌蛋白的信号肽的典型特征。具有共有氨基酸序列[LVI][ASTVI][GAS]C的信号肽的保守序列(称为脂盒)通过二酰基甘油部分共价附接至不可或缺的半胱氨酸残基的侧链上的硫醇基团进行修饰。这一修饰通过酶脂蛋白二酰基甘油基转移酶(Lgt)催化，产生由通过硫酯键连接至蛋白质的二酰基甘油部分组成的前脂蛋白。脂化后，脂蛋白信号肽酶(Lsp或SPase II)负责切割脂化的前脂蛋白的信号序列并且保留脂盒的半胱氨酸作为新的氨基末端残基。在革兰氏阴性细菌(例如脑膜炎奈瑟球菌)中，切割的前脂蛋白通过酰胺连接的酰基基团附接至通过脂蛋白N-酰基转移酶(Lnt)的N-末端半胱氨酸残基进行另外的修饰。二酰基甘油基基团和氨基末端酰基基团源自膜磷脂并且为脂蛋白提供紧密的膜锚定。为了在NOMV上产生RBD作为表面暴露的脂蛋白，诸位发明人构建了RBD编码基因，该基因在5’末端序列编码Nm脂蛋白信号序列。
除了脂蛋白信号序列之外，还可以添加另外的氨基酸序列，例如，因子H结合蛋白，使RBD能够适当折叠和转运到细菌表面。由于适当折叠和转运，RBD也可能通过细菌蛋白酶更能抵抗蛋白酶解。此外，另外的氨基酸区段用于将RBD从细菌表面延伸出去，其中它更容易接近抗原呈递细胞，这可以促进对RBD的抗体应答的改善。
保留位于S蛋白的RBD以及冠状病毒中RBD的功能作用。诸位发明人已经确定SARS-CoV-2RBD在NOMV上可以显示为脂蛋白，并且NOMV-RBD疫苗可以引发对SARS-CoV-2的保护性抗体。预计其他冠状病毒的RBD结构域(包括已知的人类病原体SARS-CoV(72％同一性的RBD氨基酸序列)和MERS-CoV(17％同一性的RBD氨基酸序列))在NOMV上可以相似地显示为脂蛋白，用于作为疫苗在人体内引发中和抗体。
诸位发明人已经确定保留在Nm中的质粒可以掺入NOMV中。因此，含有哺乳动物启动子/增强子和聚A序列的质粒可以用于在接受NOMV的哺乳动物细胞中表达蛋白质。因此，NOMV疫苗可以提供蛋白质抗原以及通过哺乳动物细胞表达的蛋白质抗原两者以在人体中引发中和抗体。
定义
在提供值的范围的情况下，应理解在该范围的上限与下限之间的每个居中值(到下限的十分之一单位，除非上下文中另外明确指明)以及在所陈述范围内的任何其他所陈述的值或居中值均被涵盖在本披露之内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包括在本披露内，遵守所述范围内任何明确排除性限制。在所陈述的范围包括一个或两个限值时，排除了那些被包括的限值的任一个或两个的范围也被包括在本披露之内。
除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语均具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然现在描述优选方法和材料，但类似或等效于本文所述的任何方法和材料也可以用于本披露的实践或测试。将所有本文提及的出版物通过引用并入本文以披露和描述与引用出版物相关的方法和/或材料。仅提供本文所讨论的出版物在本申请的提交日期之前的披露内容。本文中的任何内容均不应被解释为承认本披露无权凭借先前的披露提前公开这种出版物。此外，所提供的公开日期可能与实际公开日期不同，实际公开日期可能需要独立地确认。
如本说明书和所附权利要求中所用，除非上下文另外明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。因此，例如，“活性剂”不仅是指单个的活性剂，而且两个或更多个不同的活性剂的组合，“剂型”是指剂型的组合，以及单个剂型等。
除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的意义。以下定义了对本披露的描述具有特定意义的特定术语。
如本文所用，“不良事件”是指与人类使用本文所述的药物或疫苗相关的任何不良医学事件，不管是否与药物有关。如果AE或疑似不良反应导致以下任何结果，则可以认为它是“严重不良事件”：死亡、或直接死亡风险、住院治疗或现有住院时间延长、持续或显著进行正常生活功能的能力的丧失或严重破坏、先天性异常/出生缺陷。不良事件也可能是重要的医疗事件，它可能不会导致死亡，危及生命，或需要住院治疗，但可能危害患者或受试者，并且可能需要医疗或外科手术干预以防止以上结果之一。在一些实施例中，不良事件是指施用本文所述的药物或疫苗而引起的输注反应。
如本文所用，“过敏性反应”是指可能在几分钟到几小时内发生的严重急性发作的过敏反应。过敏性反应可以累及皮肤、粘膜组织、或两者，并且可以具有包括但不限于以下的一个或多个症状：泛发性荨麻疹，瘙痒(发痒)，潮红，嘴唇、舌头、咽喉或小舌的肿胀，呼吸急促，呕吐，头晕目眩，喘息、血流动力学不稳定性，和皮疹或荨麻疹。另外，过敏性反应可以伴随以下中的至少一个：呼吸受损(例如，呼吸困难、喘息-支气管痉挛、喘鸣、峰值流速降低、低氧血症)，以及血压降低(即，收缩压<90mm Hg或从该个人的基线降低大于30％)或终器衰竭(例如，张力减退[虛脫]、晕厥、失禁)。根据本披露的过敏性反应由国家过敏和传染病研究所/食物过敏和过敏性反应网络(NIAID/FAAN)诊断过敏性反应的临床标准定义。
如本文所用，“共同施用”是指一种或多种药物与另一种药物的同时施用。在其他实施例中，两种药物在相同的时间施用。如本文其他地方所述，共同施用也可以指一种或两种药物的任何特定时间段的施用。例如，如本文所述，药物可以在施用前数小时、数天、数周或数月施用，而且仍被认为是共同施用。在一些实施例中，共同施用可以是指任一种药物的任何时间的施用，使两种药物同时存在于患者体内。在一些实施例中，任一种药物可以在另一种药物之前或之后施用，只要它们两者都存在于患者体内足够的时间使得患者接受预期的临床或药理学益处。
如本文所用，术语“有效量”和“治疗有效量”是指药剂、化合物、药物、组合物或组合的如下量，该量无毒且在向受试者或患者(例如，人受试者或患者)施用后可有效产生某种所希望的治疗效果。
如本文所用，术语“哺乳动物细胞”是指任何哺乳动物或其细胞，例如，人类，其中如本文所述的表达SARS-CoV-2RBD。
通过“药学上可接受的”意指不是生物学上或其他方面不希望的材料，即该材料可以掺入到施用于患者的药物组合物中而不引起任何不希望的生物效应，或不以有害的方式与含有该材料的组合物的任何其他组分相互作用。当术语“药学上可接受的”用于指药物载体或赋形剂时，暗示该载体或赋形剂符合毒理学和制造测试的所需标准，或者该载体或赋形剂包括在由美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug administration)制定的Inactive Ingredient Guide[非活性成分指南]中。如在“药理学活性”(或简称“活性”)衍生物或类似物中的“药理学活性”(或“活性”)是指具有与母体化合物相同类型的药理学活性且在程度上近似相等的衍生物或类似物。术语“药学上可接受的盐”包括酸加成盐，这些酸加成盐是与无机酸(例如，盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的。与游离羧基基团形成的盐也可以衍生自无机碱(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和有机碱(例如，异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。
如本文所用，“降低”是指减少或减轻，例如降低COVID-19疾病或SARS-CoV-2感染症状。在一些实施例中，与未施用这种疫苗的患者相比，施用如本文所述的疫苗(例如NOMV疫苗)可以导致患者症状的“降低”或减轻。“降低”也可以是指如本文所述的治疗单独或与另一种药物共同施用引起的疾病症状的降低。
如本文所用，“受试者”或“个体”或“患者”是指需要对其进行治疗或需要疗法的任何患者，并且通常是指疗法的接受者。
如本文所用，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指降低症状的严重性和/或频率、消除症状和/或潜在病因、以及改善或补救损害。在某些方面，如本文所用，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指预防症状的发生。在其他方面，如本文所用，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指预防与疾病(例如COVID-19疾病)相关的症状的潜在病因。短语“向患者施用”是指经由本领域公认的引入手段将组合物、疫苗或剂型引入患者中的过程。
实例
在以下实例中提供了本披露内容的实施例的实例。以下实例仅以说明的方式呈现，并且帮助本领域普通技术人员使用本披露。这些实例并不旨在以任何方式另外限制本披露内容的范围。
实例1.通过插入编码RBD的基因与脑膜炎球菌脂蛋白信号序列替代fhbp、siaD-galE、和lpxL1基因。
将含有启动子(EH-NT)的DNA区段、来自FHbp ID9的奈瑟球菌因子H结合蛋白(FHbp)脂蛋白前导序列以及RBD序列(称为EH-NT-ID9SS-RBD序列)克隆至载体用于敲除lpxL1(pUC18-lpxL1KO-RBD-KAN质粒)、galE-siaD(pGEM-SiaD-GalE-FHbp25RBD-SPC质粒、SEQ ID NO:10，图15)、和FHbp基因NMB1870(pBS-FHbpKO-FHbp25RBD-ERM质粒，SEQ ID NO:11，图16)。将细菌与3μg的质粒混合，接种至胰蛋白酶大豆培养液(TSB)琼脂板，并且在37℃下孵育6小时。将连续稀释的细菌在分别含有卡那霉素(50μg/mL)、壮观霉素(50μg/mL)、和红霉素(10μg/mL)的TSB琼脂板上再培养。将培养板在37℃下孵育过夜，并且通过使用特异性抗体的流式细胞术测定和使用热灭活细胞的PCR针对RBD表达以及FHbp，荚膜多糖和LpxL1的缺乏筛选所得菌落。将阳性个体菌落在10％脱脂乳(wt/vol)和15％甘油中冷冻，并且在-80℃下储存。
实例2.含有3个编码RBD的染色体拷贝以及编码RBD的多拷贝质粒的脑膜炎奈瑟球菌(Nm)菌株H44/76的突变体的表征，其中每个具有Nm脂蛋白信号序列(PCR，FACS)。
PCR：设计PCR引物以扩增插入脑膜炎奈瑟菌菌株H44/76的构建体上游和下游，该构建体携带fhbp、siaD-galE、或lpxL1基因、RBD基因的侧翼区以及抗生素抗性表达盒(参见图1)。在加热灭活细胞上进行PCR。将来自野生型H44/76的热灭活细胞用作阴性对照。
流式细胞术：通过先前所述的流式细胞术测量抗SARS-COV-2刺突RBD兔多克隆抗体(myBiosurce公司目录号MBS2563840)与活的脑膜炎奈瑟球菌细菌表面的结合(Giuntini等人,Clin Vaccine Immunol[临床及疫苗免疫学]23:698-706,2016)。简而言之，将细菌在化学确定的培养基中生长，OD620nm高达0.6-0.7。为了测量抗RBD抗体结合，将固定浓度的抗RBD抗体或作为阴性对照的10μg/mL的不相关抗体与107个细菌/mL一起孵育。使用AlexaFluor 488缀合的山羊抗兔IgG[F(ab’)2(H+L)]二抗(杰克逊免疫研究实验室(Jackson Immuno Research Laboratories))检测结合的抗体。如图2所示，将每个另外的拷贝引入细菌导致通过流式细胞术检测到荧光的提高。
实例3.含有RBD(蛋白质印迹，LC/MS/MS)的NOMV疫苗的制备和表征。
NOMV制备：
NOMV从用细菌接种的培养基中获得，OD620nm为0.15-0.2，该细菌来自TSB琼脂板上过夜的细菌菌落。将培养物在37℃，5％ CO2下孵育，并且在培养物到达静止期前增加培养基的体积(OD620nm为0.6-0.7，通常每1.5小时一次)。当到达最终体积时，将培养物在带有通风口的摇瓶中再生长15小时。然后将细菌离心(10,000x g，20分钟)，通过玻璃纤维过滤器将上清液过滤以去除碎片，然后无菌过滤(0.22μm过滤器)，并且通过超滤(100k截止过滤器，Amicon)浓缩且添加苯佐纳酶(1000U/L)。在环境温度下继续苯佐纳酶处理至少1小时。将浓缩的滤液离心(202,601x g，1.5小时，4℃)以收集NOMV。将NOMV在10mM Tris·HCl，pH7.4，3％(w/v)蔗糖中悬浮，如先前步骤所述的再一次离心，并且最终在Tris/蔗糖溶液中悬浮至浓度在1至3mg/mL之间的蛋白质，如通过DC蛋白质测定(美国伯乐公司(Bio-Rad))确定的。将NOMV配制剂在-70℃下储存直到使用。
液相色谱法质谱法(LC-MS/MS)肽图：
为了确认具有FHbp ID9脂蛋白信号序列的RBD存在于NOMV-RBD中，将NOMV从溶液(
Figure BDA0004113556920000171
蛋白质沉淀试剂盒，EMDMillipore公司)中沉淀，在6M尿素/5mM二硫苏糖醇中重构，用碘乙酰胺修饰的半胱氨酸残基，并且用Lys-C/胰蛋白酶(普洛麦格公司(Promega))的混合物消化。将所得肽在MacroSpin柱(Nest集团公司(Nest Group,Inc.))上纯化，并提交给威斯康星大学生物技术中心质谱设施(University of WisconsinBiotechnology Center Mass Spectrometry Facility)(麦迪逊市，威斯康星州(Madison,WS))进行肽图分析。所得肽图示出了RBD是NOMV配制剂中最丰富的蛋白质之一，且肽占蛋白质的65％，包括在蛋白的N-末端和C-末端处的肽(图3)。
蛋白质印迹：
为了证明含有RBD的NOMV疫苗(NOMV-RBD)中存在RBD，将纯化的重组RBD的配制剂(义翘神州科技股份有限公司(Sino Biological))、不含RBD的NOMV、以及NOMV-RBD在4％-12％ SDS-PAGE凝胶(NuPAGE，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))中溶解，并且使用半干转移细胞(Trans-
Figure BDA0004113556920000172
SD，伯乐公司(Bio-Rad)，赫拉克勒斯市，加利福尼亚州(Hercules,CA))转移至PVDF膜(
Figure BDA0004113556920000173
-FL，密理博公司(Millipore))用于蛋白质印迹。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲剂中5％全脂乳粉将PVDF膜阻断过夜，然后在环境温度下用抗SARS-COV-2刺突RBD兔多克隆抗体(迈生物资源公司(myBiosource)目录号MBS2563840)将膜在阻断缓冲剂中染色2小时。用PBS缓冲剂洗涤三次后，用
Figure BDA0004113556920000174
685CW-缀合的驴抗山羊IgG(H+L)二抗(立卡公司(LI-COR)，林肯市，内布拉斯加州(Lincoln,NE))检测结合的抗体。在
Figure BDA0004113556920000175
Fc成像系统(LI-COR)上记录凝胶和印迹的图像。如图4所示，重组RBD运行为三聚体、二聚体、和单体的混合物(泳道2)。NOMV中脂化的RBD的存在通过泳道4中的上箭头显示，且非脂化的形式表示为下箭头。泳道3含有不含RBD的NOMV。
免疫接种：
用两剂、间隔三周的配制有100μg/剂量的
Figure BDA0004113556920000181
(体内基因公司(InvivoGen))的10μg/剂量的RBD-NOMV将小鼠免疫。分别作为阳性对照和阴性对照，用配制有100μg/剂量的
Figure BDA0004113556920000182
的10μg/剂量重组RBD(义翘神州科技股份有限公司目录号40592-V08H)或单独的100μg/剂量的
Figure BDA0004113556920000183
将小鼠免疫。
在剂量2后5天收集血液样品并且通过ELISA测试抗RBD抗体。用2μg/mL的重组RBD(义翘神州科技股份有限公司目录号40592-V08H)或重组刺突S1+S2(义翘神州科技股份有限公司目录号40589-V08B1)将板涂覆。
实例4.NOMV-RBD疫苗通过ELISA引发对重组RBD的抗体。
用10μg剂量的NOMV-RBD将7组远系杂交CD1小鼠免疫。3周后获取血液样品。通过如下进行ELISA确定用NOMV-RBD疫苗免疫的小鼠中多克隆抗体的结合活性的提高。在4℃下用2μg/mL重组SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)或完整的刺突蛋白(义翘神州科技股份有限公司)将96孔板(Nunc)涂覆过夜。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中1％BSA(重量/体积)+0.05％Tween 20将板阻断。将来自免疫小鼠的血清在PBS+0.1％Tween 20中稀释并且添加至板中过夜。用碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠IgG F(ab’)2(H+L)(杰克逊免疫研究实验室)(1:3,000稀释)将结合的抗体检测1小时，并且使用对硝基苯基磷酸酯(赛默飞世尔科技公司)发育。在Emax精密度读板器(分子仪器公司(Molecular Devices))上测量在OD405 nm处的吸光度。如图5所示(右小图)，所有7只小鼠都产生了与RBD和完整的刺突蛋白两者(实心符号)反应的抗RBD特异性抗体。单独用氢氧化铝佐剂(空心符号)免疫的小鼠没有对RBD的抗体(右小图)。
实例5.NOMV中携带用于表达哺乳动物细胞中的RBD的质粒的构建。
这一实例中，证明了含有具有信号序列、启动子/增强子序列和聚A尾的RBD的质粒被NOMV吸收。由具有三个RBD拷贝的染色产生的NOMV-RBD以及质粒具有递送蛋白质抗原的潜力以刺激抗体应答，加上细胞内可以被表达的RBD基因，进一步刺激保护性抗体应答。
将多拷贝质粒工程化以包括由以下组成的哺乳动物表达盒：SV40增强子、泛素人类EF1α-HTLV复合启动子、以及SV40多腺苷酸化(pAn)信号(图6)。所得用于转化Nm菌株的质粒的图示于图7。
实例6.脑膜炎奈瑟球菌的转化。
其中siaD-galE、和lpxL1基因失活(H44/76ΔFHbpΔ荚膜ΔlpxL1)的H44/76菌株是通过同源重组制成的，通过质粒pGEM-SiaD/GalEKO-SPC使用壮观霉素选择(50μg/mL)和pUC18-lpxL1KO-KAN使用卡那霉素选择(50μg/mL)和pFP12-SV40-RBD-CAT使用氯霉素(5μg/mL)进行转化。从野生型菌株开始的转化按以下顺序进行：
敲除荚膜基因(pGEM-SiaD-GalE-FHbp25RBD-SPC质粒，SEQ ID NO:10，图15)
敲除lpxL1基因(pUC18-Lpxl1KO-FHbp55RBD-KAN质粒，SEQ ID NO:12，图17)
对RBD的哺乳动物表达盒(pFP12 SV40 RBD-2质粒，SEQ ID NO:15，图7)
H44/76菌株的十至15个菌落选自已经过夜生长的TSB(胰蛋白酶大豆培养液，非动物来源)琼脂板。将细菌的菌落与3μg的质粒混合，接种至TSB琼脂板，并且在37℃下孵育6小时。将连续稀释的细菌在含有抗生素的TSB琼脂板上再培养用于选择。将培养板在37℃下孵育过夜，并且通过使用特异性抗体的流式细胞术测定和使用热灭活细胞的PCR针对荚膜和lpxL1的缺乏筛选菌落。将阳性个体菌落在10％脱脂乳(wt/vol)和15％甘油中冷冻，并且在-80℃下储存。进行使用热灭活细胞的PCR以检测SV40-RBD表达盒的存在。将氯霉素抗性菌落在Frantz和氯霉素中生长过夜，并且第二天将质粒DNA分离且作为SDS-PAGE凝胶运行，以确认多拷贝质粒的存在。
实例7.加热灭活细胞的PCR
设计PCR引物以扩增插入脑膜炎奈瑟菌菌株H44/76的构建体上游和下游，该构建体携带siaD-galE、或lpxL1基因、SV40-RBD基因的侧翼区以及抗生素抗性表达盒(参见图8)。在加热灭活细胞上进行PCR。将来自野生型H44/76的热灭活细胞用作阴性对照。
如图9所示，转化的细菌中的pFP12质粒的存在可以通过热灭活细胞(上小图)以及纯化的NOMV(下小图)中的PCR确认。质粒可以从转化的细菌中分离并且在DNA凝胶(中间小图)中检测。箭头指示期望条带的大小。
实例8.质粒编码的核酸在哺乳动物细胞中的表达
在一些实施例中，本披露提供了脑膜炎球菌菌株或NOMV疫苗，其含有编码SARS-CoV-2RBD的质粒以及提供RBD在哺乳动物细胞中表达的启动子/增强子和聚A序列。如本文所述的，NOMV具有在囊泡外存在的SARS-CoV-2RBD，这将与细胞(例如人类或其他哺乳动物细胞)上的ACE2受体结合。结合后，那些细胞将总体接受NOMV粒子，除了在NOMV表面存在的SARS-CoV-2RBD之外，还含有编码SARS-CoV-2RBD的核酸。与受试者中其他类型的抗原呈递细胞(APC)一起的那些细胞将与NOMV结合，并且将表达SARS-CoV-2RBD，与mRNA或腺病毒类型疫苗相似，其将核酸递送至细胞，导致蛋白质的表达。因此，表达的蛋白质将被表达并且由那些细胞分泌，从而引发受试者的抗体应答。因此，在一些实施例中，抗原(例如，SARS-CoV-2RBD)作为NOMV表面的蛋白质提供，同时也作为核酸提供，导致来自已经吸收NOMV的细胞的表达和分泌。
实例9.NOMV疫苗组合物的施用
本披露提供了为受试者接种疫苗的方法，该方法包括施用包含经修饰为脂蛋白的冠状病毒受体结合结构域(RBD)的NOMV疫苗组合物。疫苗组合物的施用可以包含施用(a)具有在表面显示的SARS-CoV-2RBD的NOMV，或(b)除了表达编码如本文所述的SARS-CoV-2RBD的质粒之外还具有在表面显示的SARS-CoV-2RBD的NOMV。
如本文所述的NOMV疫苗配制剂包含约6μg至约60μg的NOMV单独或吸附至佐剂中的NOMV，例如约0.25mg至约0.6mg的Al3+作为10mM Tris，pH 7.5，含有0.9％ NaCl和3％(重量/体积)蔗糖的缓冲剂中的氢氧化铝(
Figure BDA0004113556920000211
布伦泰格公司(Brentag))。NOMV和佐剂的量可以在施用之前根据临床医生或医师认为合适的情况改变。替代性地，NOMV可以用适用于人类的其他疫苗佐剂配制，例如其他铝盐(例如，氢氧化铝、羟基磷酸铝)，QS-21，铝盐与QS21、CpG
Figure BDA0004113556920000212
(Dynavax)、或水包油佐剂[例如，
Figure BDA0004113556920000213
(GSK)、
Figure BDA0004113556920000214
(GSK)]的混合物。以0.5mL体积间隔至少2个月给予受试者最多3次NOMV疫苗的肌内注射。通过以下测量保护性抗体应答：如实例4所述的ELISA，代用品病毒中和测定(例如，SARS-CoV-2代用品病毒中和测试(sVNT)试剂盒(ProteoGenix公司)；cPassTMSARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒(Genescript公司))，以及在暴露于天然感染的受试者中通过PCR测试的病毒载量的降低。

Claims (27)

1.一种NOMV疫苗组合物，其包含经修饰为脂蛋白的冠状病毒受体结合结构域(RBD)。
2.如权利要求1所述的NOMV疫苗组合物，其中该冠状病毒RBD来自SARS-CoV-2。
3.如权利要求2所述的组合物，其中该组合物包含脑膜炎球菌菌株，该菌株具有质粒携带的编码经修饰为脂蛋白的SARS-CoV-2RBD的基因。
4.如权利要求3所述的组合物，其中该质粒携带的编码经修饰为脂蛋白的SARS-CoV-2RBD的基因包含另外的30个氨基酸的区段。
5.如权利要求4所述的组合物，其中该30个氨基酸的区段来自脑膜炎奈瑟球菌因子H结合蛋白(FHbp)的氨基末端。
6.如权利要求5所述的组合物，其中该30个氨基酸的区段附接至脂蛋白信号序列以促进该RBD转运至脑膜炎球菌菌株的外表面。
7.如权利要求3所述的组合物，其中该质粒包含pFP12-RBD质粒。
8.如权利要求2所述的组合物，其中该质粒包含pFP12 SV-40RBD-2完整质粒。
9.如权利要求2所述的组合物，其中该质粒包含pFP12 SV40 RBD-2质粒。
10.如权利要求2所述的组合物，其中该质粒包含pFP12 SV-40RBD-2mobC质粒。
11.如权利要求3所述的组合物，其中该质粒包含pUC18-Lpxl1KO-FHbp25RBD-KAN质粒。
12.如权利要求3所述的组合物，其中该质粒包含pGEM-SiaD-GalE-FHbp25RBD-SPC质粒。
13.如权利要求3所述的组合物，其中该质粒包含pBS-FHbpKO-FHbp25RBD-ERM质粒。
14.如权利要求3-13所述的组合物，其中该脑膜炎球菌菌株是H44/76或NZ98/254。
15.如权利要求14所述的组合物，其中该脑膜炎球菌菌株不表达孔蛋白A(PorA)。
16.一种包含脑膜炎球菌菌株的组合物，该菌株具有编码经修饰为脂蛋白的SARS-CoV-2RBD的基因，其中该基因的表达由在脑膜炎奈瑟菌中产生高基因转录率的启动子序列驱动。
17.如权利要求16所述的组合物，其中该启动子包含图6-8、10-21，或SEQ ID NO:1-17中列出的序列。
18.如权利要求16所述的组合物，其中该启动子包含孔蛋白A(PorA)或其衍生物的启动子、或富马酸和硝酸还原酶基因(fnr)的启动子。
19.如权利要求16所述的组合物，其中该启动子包含EH-NT启动子。
20.如权利要求16所述的组合物，其中将该基因和启动子插入该细菌基因组的基因座。
21.如权利要求20所述的组合物，其中将该基因和启动子插入lpxL1基因座，并且其中酰基转移酶基因的表达被破坏，使得产生的脂寡糖是五酰基化的而非六酰基化的。
22.如权利要求20所述的组合物，其中将该基因和启动子插入siaD-galE基因座(siaA同样)，并且其中荚膜多糖的表达以及脂寡糖宿主抗原的唾液酸化被破坏。
23.如权利要求20所述的组合物，其中将该基因和启动子插入fhbp基因座(因子H结合蛋白)。
24.如权利要求20所述的组合物，其中将该基因和启动子插入porA基因座。
25.一种脑膜炎球菌菌株，其含有编码SARS-CoV-2RBD的质粒以及提供RBD在哺乳动物细胞中表达的启动子/增强子和聚A序列。
26.一种NOMV疫苗，其含有编码SARS-CoV-2RBD的质粒以及提供RBD在哺乳动物细胞中表达的启动子/增强子和聚A序列。
27.一种为受试者接种疫苗的方法，该方法包括施用如权利要求1所述的组合物。
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