JP2023536834A - 天然外膜小胞中のｓａｒｓ－ｃｏｖ－２受容体結合ドメイン - Google Patents
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Abstract
本開示は、リポタンパク質であるように修飾されたコロナウイルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含有する天然外膜小胞（ＮＯＭＶ）ワクチンを提供する。リポタンパク質であるように修飾されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードするプラスミド由来遺伝子を有する髄膜炎菌株を含む組成物も提供される。哺乳動物細胞内のＲＢＤの発現を提供するプロモーター／エンハンサー及びポリＡ配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードするプラスミドを含有する髄膜炎菌株及びＮＯＭＶワクチンも提供される。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年７月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／０５９，０３１号明細書の利益を主張するものであり、この仮特許出願の開示内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、２０２０年７月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／０５９，０３１号明細書の利益を主張するものであり、この仮特許出願の開示内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって与えられた助成金番号Ｒ０１ＡＩ０４６４６４及びＲ４４ＡＩ１２４７５９の下で政府支援を受けて作製された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって与えられた助成金番号Ｒ０１ＡＩ０４６４６４及びＲ４４ＡＩ１２４７５９の下で政府支援を受けて作製された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
配列表の援用
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓオペレーティングシステムで測定した際に１１１キロバイトであり、２０２１年７月３０日に作成された「ＯＭＶ０００１－４０１－ＰＣ＿ＳＴ２５」という名称のファイルに含まれる配列表は、本明細書と共に電子的に提出され、参照により本明細書に援用される。
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓオペレーティングシステムで測定した際に１１１キロバイトであり、２０２１年７月３０日に作成された「ＯＭＶ０００１－４０１－ＰＣ＿ＳＴ２５」という名称のファイルに含まれる配列表は、本明細書と共に電子的に提出され、参照により本明細書に援用される。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ヒトにおけるＣＯＶＩＤ－１９疾患の原因であるコロナウイルスである。ウイルスは、線毛細胞上のグリカンに結合することによって気道上皮細胞に侵入する。結合を媒介するタンパク質は、Ｓ（スパイク）タンパク質である。Ｓ－タンパク質内のドメイン（受容体結合ドメイン又はＲＢＤ）は、ＡＣＥ２受容体及びグリカンに結合する。単独での及びＡＣＥ２受容体と複合したＳ－タンパク質の構造が決定されている。さらに、中和モノクローナル抗体と複合したＲＢＤの構造が決定されている。
天然外膜小胞（ＮＯＭＶ）は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（Ｎｍ）細菌に天然に由来するブレブである。以前に、ワクチン株は、（ａ）通常、少量で存在するＨ因子結合タンパク質（ＦＨｂｐ）を過剰発現し、（ｂ）ＦＨ結合を引き起こす相互作用をブロックする抗体応答を増加させるために、宿主Ｈ因子との低い結合で突然変異体ＦＨｂｐを発現し、及び（ｃ）弱毒化したエンドトキシンを有し、通常、反応原性を低下させるために使用される界面活性剤処理なしでのＮＯＭＶの使用を可能にするが、潜在的に防御的な抗原の除去又は変化ももたらすように遺伝子組み換えされている。ＬｐｘＬ１をノックアウトすることから得られるペンタアシル化リポオリゴ糖（ＬＯＳ）を有するＮＯＭＶ－ＦＨｂｐは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるサイトカイン応答を低減し、これは、何万人ものヒト対象に安全に投与されている界面活性剤抽出ＯＭＶワクチンによって引き起こされるものと同様であるか又はそれより低かった。ＮＯＭＶ－ＦＨｂｐワクチンの安全性をさらに強化するために、ワクチンを調製するために使用される株は、Ｂ群莢膜多糖及びＬＯＳの誘導体（これらは、類似の構造を有するヒトグリカンと交差反応することが知られている）を含む、他の望ましくない抗原の発現をなくすさらなる遺伝子欠失を組み込む。
ＮＯＭＶ中に存在する抗原の免疫原性は、同等の量の単独の組み換えタンパク質と比べて大幅に増加される。しかしながら、最も有効な抗体反応は、高い転写率を生じるように操作されたプロモーターを使用すること、細菌ゲノムに多重コピーを挿入すること及びマルチコピープラスミドによる形質転換によって達成された閾値レベルの発現を必要とする。
ヘキサアシル化リポオリゴ糖を含有する髄膜炎菌外膜小胞は、炎症反応を生じる。反応原性は、界面活性剤抽出によって低下され得るが、界面活性剤処理は、リポタンパク質抗原の損失及びタンパク質構造の変化をもたらし得る。本明細書に記載されるＮＯＭＶを生成するために使用されるＮｍ株は、ｌｐｘＬ１遺伝子座が破壊されており、ヘキサアシル化ＬＯＳと比べてペンタアシル化ＬＯＳの産生をもたらし、これは、弱毒化されたエンドトキシン活性をもたらす。
ＮＯＭＶプラットフォームは、抗体反応を促進する補助特性も有する。概して、ＮＯＭＶベースのワクチンは、有効な防御抗体反応を得るために少ないタンパク質が必要とされ得るため、対応する組み換えタンパク質より広く反応性であり、抗体のより高い力価を引き起こし、忍容性がより良好であり得る。
したがって、一態様において、本開示は、リポタンパク質であるように修飾されたコロナウイルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含有するＮＯＭＶワクチンを提供する。一実施形態において、コロナウイルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤである。
別の態様において、本開示は、リポタンパク質であるように修飾されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする遺伝子を含有する髄膜炎菌株を含む組成物を提供し、ここで、遺伝子は、プラスミド上にある。
別の態様において、本開示は、さらなる３０アミノ酸セグメントを有するリポタンパク質であるように修飾されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードするプラスミド由来遺伝子を有する髄膜炎菌株を含む組成物を提供する。一実施形態において、プラスミドは、ｐＦＰ１２－ＲＢＤプラスミド（例えば、配列番号８、図１３）を含む。別の実施形態において、プラスミドは、ｐＦＰ１２ ＳＶ－４０ ＲＢＤ－２完全プラスミド（例えば、配列番号１６、図２０）を含む。別の実施形態において、プラスミドは、ｐＦＰ１２ ＳＶ４０ ＲＢＤ－２プラスミド（例えば、配列番号１５、図７）を含む。別の実施形態において、プラスミドは、ｐＦＰ１２ ＳＶ－４０ ＲＢＤ－２ ｍｏｂＣプラスミド（例えば、配列番号１７、図２１）を含む。別の実施形態において、プラスミドは、ｐＵＣ１８－Ｌｐｘｌ１ＫＯ－ＦＨｂｐ２５ＲＢＤ－ＫＡＮプラスミド（例えば、配列番号９、図１４）を含む。別の実施形態において、プラスミドは、ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥ－ＦＨｂｐ２５ＲＢＤ－ＳＰＣプラスミド（例えば、配列番号１０、図１５）を含む。別の実施形態において、プラスミドは、ｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＦＨｂｐ２５ＲＢＤ－ＥＲＭプラスミド（例えば、配列番号１１、図１６）を含む。
他の実施形態において、本明細書に記載される１つ以上のプラスミドは、同じ細菌株中に導入される。他の実施形態において、髄膜炎菌株は、Ｈ４４／７６又はＮＺ９８／２５４である。別の実施形態において、髄膜炎菌株Ｈ４４／７６又はＮＺ９８／２５４は、ポリンＰｏｒＡを発現しない。
別の態様において、本開示は、リポタンパク質であるように修飾されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする遺伝子を含有する髄膜炎菌株を提供し、ここで、遺伝子の発現は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）における高い遺伝子転写率を生じる強力なプロモーター配列によって駆動される。一実施形態において、プロモーターは、例えば、限定はされないが、図６～８、１０～２１又は配列番号１～１７に示される任意の配列を含む、本明細書に記載される配列を含む。別の実施形態において、プロモーターは、ポリンＰｏｒＡプロモーター若しくはその誘導体又はフマル酸及び硝酸レダクターゼ遺伝子（ｆｎｒ）のプロモーターを含む。別の実施形態において、プロモーターは、ＥＨ－ＮＴプロモーターを含む。
別の態様において、本開示は、リポタンパク質であるように修飾されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする遺伝子を含有する髄膜炎菌株を提供し、ここで、遺伝子及びプロモーターは、細菌ゲノムの遺伝子座中に挿入される。一実施形態において、遺伝子及びプロモーターは、生成されるリポオリゴ糖がヘキサアシル化の代わりにペンタアシル化されるように、アシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を妨げるためにｌｐｘＬ１遺伝子座中に挿入される。別の実施形態において、遺伝子及びプロモーターは、莢膜多糖の発現及びリポオリゴ糖宿主抗原のシアリル化を妨げるためにｓｉａＤ－ｇａｌＥ遺伝子座（ｓｉａＡとも呼ばれる）中に挿入される。別の実施形態において、遺伝子及びプロモーターは、ｆｈｂｐ遺伝子座（Ｈ因子結合タンパク質）中に挿入される。別の実施形態において、遺伝子及びプロモーターは、ｐｏｒＡ遺伝子座中に挿入される。一実施形態において、相同的組み換えによるこれらの遺伝子の不活性化は、ｐＵＣ１８－Ｌｐｘｌ１ＫＯ－ＦＨｂｐ２５ＲＢＤ－ＫＡＮプラスミド（例えば、配列番号９、図１４）、ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥ－ＦＨｂｐ２５ＲＢＤ－ＳＰＣプラスミド（例えば、配列番号１０、図１５）又はｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＦＨｂｐ２５ＲＢＤ－ＥＲＭプラスミド（例えば、配列番号１１、図１６）を含むプラスミドにより達成される。他の実施形態において、本明細書に記載される１つ以上のプラスミドは、同じ細菌株中に導入される。別の実施形態において、細菌の外面へのＲＢＤの輸送を促進し、ＲＢＤの適切なフォールディングを確実にし、且つ細菌プロテアーゼによるタンパク質分解を低減するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤリポタンパク質は、Ｎｍ Ｈ因子結合タンパク質（ＦＨｂｐ）に由来する３０アミノ酸配列をリポタンパク質シグナル配列に付加することによってさらに修飾される。ある実施形態において、３０アミノセグメント又は配列は、ＦＨｂｐのＮ末端に由来し、ここで、配列は、成熟した（すなわちプロセシングされた）タンパク質上の脂質修飾システイン（Ｃｙｓ）残基から開始して番号付けられる。ある実施形態において、３０アミノ酸セグメント又は配列は、例えば、限定はされないが、ＩＤ９を含むＦＨｂｐ変異体に由来する。伸長形態ＲＢＤリポタンパク質は、細菌表面とＲＢＤとの間の距離も増加させ、それによりヒト免疫系の抗原提示細胞によってアクセスしやすくなる。リポタンパク質シグナル配列の伸長を用いる他の実施形態において、相同的組み換えによる遺伝子の不活性化は、ｐＵＣ１８－Ｌｐｘｌ１ＫＯ－ＦＨｂｐ５５ＲＢＤ－ＫＡＮプラスミド（例えば、配列番号１２、図１７）、ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥ－ＦＨｂｐ５５ＲＢＤ－ＳＰＣプラスミド（例えば、配列番号１３、図１８）又はｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＦＨｂｐ５５ＲＢＤ－ＥＲＭプラスミド（例えば、配列番号１４、図１９）を含むプラスミドにより達成される。
別の実施形態において、本開示は、リポタンパク質であるように修飾されたコロナウイルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含有するＮＯＭＶワクチンを提供する。
別の実施形態において、本開示は、リポタンパク質であるように修飾されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤを含有するＮＯＭＶワクチンを提供する。
別の実施形態において、本開示は、プラスミド（特に図１３、配列番号８に示されるｐＦＰ１２－ＲＢＤ）上にあるリポタンパク質であるように修飾されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする遺伝子を含有する髄膜炎菌株を提供する。
別の態様において、Ｎｍ中で維持されるプラスミドは、ＮＯＭＶの内部に組み込まれ得る。したがって、ＮＯＭＶは、タンパク質抗原及び同時にＮＯＭＶワクチンを取り込む細胞によるタンパク質の発現のためのＤＮＡを送達して、中和抗体を誘発することができる。
本開示は、哺乳動物細胞内のＲＢＤの発現を提供するプロモーター／エンハンサー及びポリＡ配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードするプラスミドを含有する髄膜炎菌株を提供する。
別の態様において、本開示は、哺乳動物細胞内のＲＢＤの発現を提供するプロモーター／エンハンサー及びポリＡ配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードするプラスミドを含有するＮＯＭＶワクチンを提供する。
他の実施形態において、哺乳動物細胞内のＲＢＤの発現のためのＮＯＭＶ中への組み込みに好適なプラスミドは、ｐＦＰ１２ ＳＶ４０ ＲＢＤ－２プラスミド（例えば、配列番号１５、図７）、ｐＦＰ１２ ＳＶ－４０ ＲＢＤ－２完全プラスミド（例えば、配列番号１６、図２０）又はｐＦＰ１２ ＳＶ－４０ ＲＢＤ－２ ｍｏｂＣプラスミド（例えば、配列番号１７、図２１）を含む。
別の実施形態において、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする遺伝子を含有する髄膜炎菌株を提供し、ここで、髄膜炎菌株は、Ｈ４４／７６又はである。
別の実施形態において、本開示は、プラスミド上にあるリポタンパク質であるように修飾されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする遺伝子を含有する髄膜炎菌株を提供し、ここで、髄膜炎菌株は、ポリンＰｏｒＡを発現しないＨ４４／７６である。
別の実施形態において、本開示は、リポタンパク質であるように修飾されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする遺伝子を含有する髄膜炎菌株を提供し、ここで、遺伝子の発現は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）における高い遺伝子転写率を生じる強力なプロモーター配列によって駆動される。ある実施形態において、本明細書に記載される強力なプロモーターのための特定の配列は、本明細書において、例えば図６～８、１０～２１又は配列番号１～１７に示される。ある実施形態において、強力なプロモーターの代替例は、限定はされないが、ＰｏｒＡ（例えば、米国特許第９，３８７，２３９号明細書を参照）を含み得る。ある実施形態において、ＰｏｒＡ誘導体は、限定はされないが、米国特許第９，２６０，４８９号明細書及びカナダ特許第２，８６１，９４６号明細書に記載されるものを含み得る。他の実施形態において、本明細書に記載される有用なプロモーターは、フマル酸及び硝酸レダクターゼ遺伝子（ｆｎｒ）のプロモーターを含み得る（Ｏｒｉｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９２：６９１－７０１，２０１０）。ある実施形態において、本明細書に記載される有用なプロモーターは、例えば、図１２～１９に示されるようなＥＨ－ＮＴプロモーターを含み得る。
ある実施形態において、本明細書に記載される有用なプロモーターは、例えば、図７及び２０～２１に示されるような、ヒトＥＦ１プロモーター（ｈＥＦ１）又はハイブリッドプロモーター、例えばヒト延長因子－１α（ｈＥＦ－１α）コアプロモーター及びヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）の５’非翻訳領域を含むｈＥＦ１－ＨＴＬＶプロモーターを含み得る。当技術分野において公知であるか又は入手可能である他の強力なプロモーターは、それらがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする遺伝子の高い転写率を生じる限り、本明細書に記載されるように使用され得る。
ある実施形態において、本開示は、リポタンパク質であるように修飾されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする遺伝子を含有する髄膜炎菌株を提供し、ここで、遺伝子及びプロモーターは、生成されるリポオリゴ糖がヘキサアシル化の代わりにペンタアシル化されるように、アシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を妨げるためにｌｐｘＬ１遺伝子座中に挿入される。
ある実施形態において、本開示は、リポタンパク質であるように修飾されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする遺伝子を含有する髄膜炎菌株を提供し、ここで、遺伝子及びプロモーターは、莢膜多糖の発現及びリポオリゴ糖宿主抗原のシアリル化を妨げるためにｓｉａＤ－ｇａｌＥ遺伝子座（ｓｉａＡとも呼ばれる）中に挿入される。
ある実施形態において、本開示は、リポタンパク質であるように修飾されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする遺伝子を含有する髄膜炎菌株を提供し、ここで、遺伝子及びプロモーターは、ｆｈｂｐ遺伝子座（Ｈ因子結合タンパク質）中に挿入される。
ある実施形態において、本開示は、リポタンパク質であるように修飾されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする遺伝子を含有する髄膜炎菌株を提供し、ここで、遺伝子及びプロモーターは、ｐｏｒＡ遺伝子座中に挿入される。
別の態様において、本開示は、哺乳動物細胞内のＲＢＤの発現を提供するプロモーター／エンハンサー及びポリＡ配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードするプラスミドを含有するリポタンパク質であるように修飾されたコロナウイルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏ）ＮＯＭＶワクチン組成物を提供する。
別の態様において、本開示は、哺乳動物細胞内のＲＢＤの発現を提供するプロモーター／エンハンサー及びポリＡ配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードするプラスミドを含有するＮＯＭＶワクチンを提供する。
別の態様において、本開示は、対象にワクチン接種する方法であって、リポタンパク質であるように修飾されたコロナウイルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むＮＯＭＶワクチン組成物を投与することを含む方法を提供する。
本開示のこれらの及び他の実施形態は、以下に詳細に説明される。
配列の簡単な説明
配列番号１ － Ｃ鎖Ｃ、スパイク糖タンパク質受容体結合ドメインの配列（図１０に示される）。
配列番号２ － スパイク糖タンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の鎖Ａのためのシグナル配列の配列（図１１に示される）。
配列番号３ － 成熟スパイク糖タンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の鎖Ａの配列（図１１に示される）。
配列番号４ － プロモーター＋ＲＢＤのＤＮＡ配列（図１２に示される）。
配列番号５ － ＮＯＭＶにおいて生成されるＦＨｂｐ２５－ＲＢＤのタンパク質配列。
配列番号６ － ＮＯＭＶにおいて生成されるＦＨｂｐ５５－ＲＢＤのタンパク質配列。
配列番号７ － 哺乳動物細胞内で発現されるＲＢＤ。
配列番号８ － ｐＦＰ１２ ＲＢＤプラスミドのＤＮＡ配列（図１３）。
配列番号９ － ｐＵＣ１８－Ｌｐｘｌ１ＫＯ－ＦＨｂｐ２５ＲＢＤ－ＫＡＮプラスミドの配列（図１４）。
配列番号１０ － ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥ－ＦＨｂｐ２５ＲＢＤ－ＳＰＣプラスミドの配列（図１５）。
配列番号１１ － ｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＦＨｂｐ２５ＲＢＤ－ＥＲＭプラスミドの配列（図１６）。
配列番号１２ － ｐＵＣ１８－Ｌｐｘｌ１ＫＯ－ＦＨｂｐ５５ＲＢＤ－ＫＡＮプラスミドの配列（図１７）。
配列番号１３ － ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥ－ＦＨｂｐ５５ＲＢＤ－ＳＰＣプラスミドの配列（図１８）。
配列番号１４ － ｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＦＨｂｐ５５ＲＢＤ－ＥＲＭプラスミドの配列（図１９）。
配列番号１５ － ｐＦＰ１２ ＳＶ４０ ＲＢＤ－２プラスミドの配列（図７）。
配列番号１６ － ｐＦＰ１２ ＳＶ－４０ ＲＢＤ－２完全プラスミドの配列（図２０）。
配列番号１７ － ｐＦＰ１２ ＳＶ－４０ ＲＢＤ－２ ｍｏｂＣプラスミドの配列（図２１）。
配列番号１８ － ＦＨｂｐ変異体ＩＤ９の配列（図２２）。
配列番号１ － Ｃ鎖Ｃ、スパイク糖タンパク質受容体結合ドメインの配列（図１０に示される）。
配列番号２ － スパイク糖タンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の鎖Ａのためのシグナル配列の配列（図１１に示される）。
配列番号３ － 成熟スパイク糖タンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の鎖Ａの配列（図１１に示される）。
配列番号４ － プロモーター＋ＲＢＤのＤＮＡ配列（図１２に示される）。
配列番号５ － ＮＯＭＶにおいて生成されるＦＨｂｐ２５－ＲＢＤのタンパク質配列。
配列番号６ － ＮＯＭＶにおいて生成されるＦＨｂｐ５５－ＲＢＤのタンパク質配列。
配列番号７ － 哺乳動物細胞内で発現されるＲＢＤ。
配列番号８ － ｐＦＰ１２ ＲＢＤプラスミドのＤＮＡ配列（図１３）。
配列番号９ － ｐＵＣ１８－Ｌｐｘｌ１ＫＯ－ＦＨｂｐ２５ＲＢＤ－ＫＡＮプラスミドの配列（図１４）。
配列番号１０ － ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥ－ＦＨｂｐ２５ＲＢＤ－ＳＰＣプラスミドの配列（図１５）。
配列番号１１ － ｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＦＨｂｐ２５ＲＢＤ－ＥＲＭプラスミドの配列（図１６）。
配列番号１２ － ｐＵＣ１８－Ｌｐｘｌ１ＫＯ－ＦＨｂｐ５５ＲＢＤ－ＫＡＮプラスミドの配列（図１７）。
配列番号１３ － ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥ－ＦＨｂｐ５５ＲＢＤ－ＳＰＣプラスミドの配列（図１８）。
配列番号１４ － ｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＦＨｂｐ５５ＲＢＤ－ＥＲＭプラスミドの配列（図１９）。
配列番号１５ － ｐＦＰ１２ ＳＶ４０ ＲＢＤ－２プラスミドの配列（図７）。
配列番号１６ － ｐＦＰ１２ ＳＶ－４０ ＲＢＤ－２完全プラスミドの配列（図２０）。
配列番号１７ － ｐＦＰ１２ ＳＶ－４０ ＲＢＤ－２ ｍｏｂＣプラスミドの配列（図２１）。
配列番号１８ － ＦＨｂｐ変異体ＩＤ９の配列（図２２）。
概説
一実施形態において、本開示は、リポタンパク質であるように修飾されたコロナウイルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む天然外膜小胞（ＮＯＭＶ）ワクチンを提供する。一実施形態において、コロナウイルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤである。他の実施形態は、リポタンパク質であるように修飾されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする遺伝子を含有する髄膜炎菌株を提供し、ここで、遺伝子は、ｐＦＰ１２－ＲＢＤプラスミド又はｐＦＰ１２ ＳＶ－４０ ＲＢＤ－２完全プラスミド又はｐＦＰ１２プラスミドなどのプラスミド上にある。ある実施形態は、髄膜炎菌株Ｈ４４／７６又は株ＮＺ９８／２５４を提供する。ある実施形態において、髄膜炎菌株Ｈ４４／７６又はＮＺ９８／２５４は、ポリンＰｏｒＡを発現しない。他の実施形態は、リポタンパク質であるように修飾されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする遺伝子を含有する髄膜炎菌株を提供し、ここで、遺伝子の発現は、本明細書に記載される配列を有するプロモーターなどの、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）における高い遺伝子転写率を生じる強力なプロモーター配列によって駆動される。ある実施形態において、本開示に有用なプロモーターは、ポリンＰｏｒＡプロモーター又はその誘導体であり得る。他の実施形態は、リポタンパク質であるように修飾されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする遺伝子を含有する髄膜炎菌株を提供し、ここで、遺伝子及びプロモーターは、細菌ゲノムの遺伝子座、例えば生成されるリポオリゴ糖がヘキサアシル化の代わりにペンタアシル化されるように、アシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を妨げるためにｌｐｘＬ１遺伝子座又は莢膜多糖の発現及びリポオリゴ糖宿主抗原のシアリル化を妨げるためにｓｉａＤ－ｇａｌＥ遺伝子座（ｓｉａＡとも呼ばれる）、又はｆｈｂｐ遺伝子座（Ｈ因子結合タンパク質）、又はｐｏｒＡ遺伝子座中に挿入される。
一実施形態において、本開示は、リポタンパク質であるように修飾されたコロナウイルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む天然外膜小胞（ＮＯＭＶ）ワクチンを提供する。一実施形態において、コロナウイルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤである。他の実施形態は、リポタンパク質であるように修飾されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする遺伝子を含有する髄膜炎菌株を提供し、ここで、遺伝子は、ｐＦＰ１２－ＲＢＤプラスミド又はｐＦＰ１２ ＳＶ－４０ ＲＢＤ－２完全プラスミド又はｐＦＰ１２プラスミドなどのプラスミド上にある。ある実施形態は、髄膜炎菌株Ｈ４４／７６又は株ＮＺ９８／２５４を提供する。ある実施形態において、髄膜炎菌株Ｈ４４／７６又はＮＺ９８／２５４は、ポリンＰｏｒＡを発現しない。他の実施形態は、リポタンパク質であるように修飾されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする遺伝子を含有する髄膜炎菌株を提供し、ここで、遺伝子の発現は、本明細書に記載される配列を有するプロモーターなどの、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）における高い遺伝子転写率を生じる強力なプロモーター配列によって駆動される。ある実施形態において、本開示に有用なプロモーターは、ポリンＰｏｒＡプロモーター又はその誘導体であり得る。他の実施形態は、リポタンパク質であるように修飾されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする遺伝子を含有する髄膜炎菌株を提供し、ここで、遺伝子及びプロモーターは、細菌ゲノムの遺伝子座、例えば生成されるリポオリゴ糖がヘキサアシル化の代わりにペンタアシル化されるように、アシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を妨げるためにｌｐｘＬ１遺伝子座又は莢膜多糖の発現及びリポオリゴ糖宿主抗原のシアリル化を妨げるためにｓｉａＤ－ｇａｌＥ遺伝子座（ｓｉａＡとも呼ばれる）、又はｆｈｂｐ遺伝子座（Ｈ因子結合タンパク質）、又はｐｏｒＡ遺伝子座中に挿入される。
本開示は、（ａ）マルチコピープラスミドにおける新規なプロモーターを有する遺伝子を過剰発現すること及びＦＨｂｐをノックアウトするための染色体におけるさらなる遺伝子の挿入、莢膜多糖及びＬＯＳのシアリル化、（ｂ）Ｎｍ ＮＯＭＶ中のリポタンパク質として表面上にそれを提示すること、（ｃ）細菌表面への輸送を促進し、ＲＢＤの適切なフォールディング、タンパク質分解安定性及び抗原提示細胞との相互作用を強化するために細菌の表面からＲＢＤを伸長するために、さらなるアミノ酸セグメントを有するＮｍ ＮＯＭＶ中のリポタンパク質として表面上にそれを提示すること、（ｄ）莢膜多糖と共に、免疫系へのＲＢＤのアクセス性を低下させ得る免疫優勢抗原である、ポリンＰｏｒＡを欠く株においてＮＯＭＶを産生すること、（ｅ）哺乳動物細胞内のＲＢＤの発現を提供するプロモーター／エンハンサー及びポリＡ配列を含有するＮｍ株中にプラスミドを挿入すること、（ｆ）哺乳動物細胞内のＲＢＤの発現を提供するプロモーター／エンハンサー及びポリＡ配列を有するプラスミドを含有するＮＯＭＶワクチンによる、ＲＢＤに対する抗体の強化された防御効果を記載する。
髄膜炎菌ポリンタンパク質ＰｏｒＡは、Ｎｍ中で最も高度に発現されるタンパク質の１つであり、抗ＰｏｒＡ抗体の高い力価を生じさせる。しかしながら、遺伝子の発現を駆動するＰｏｒＡプロモーターは、複製中のポリＧトラクトにおける塩基の挿入又は欠失が発現の増加又は低下をもたらし得るように位相可変である。ここで、本発明者らは、Ｎｍ中のＰｏｒＡ遺伝子の上流の領域が６つの潜在的なプロモーターを含有し、そのうちの１つのみがポリＧトラクトを含有することを発見した。この分析に基づいて、ポリＧトラクトを含有する配列を除去し、それにより高いレベルの転写を駆動する能力を保持しながら位相変化の可能性をなくすことにより、ＰｏｒＡプロモーターを操作した。操作されたプロモーター構築物を用いて、染色体及びマルチコピープラスミドに挿入された遺伝子のそれぞれにおいてＲＢＤ遺伝子の発現を駆動した。プロモーター－ＲＢＤ遺伝子構築物を、莢膜多糖の生成及びＬＯＳのシアリル化をなくすためにｓｉａＤ及びｇａｌＥ、ｆｈｂｐ及びｌｐｘＬ１を包含する領域並びに染色体外プラスミドに挿入した。ＰｏｒＡ発現を欠くＮｍ株Ｈ４４／７６の変異体は、ＲＢＤのアクセス性を高め、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する防御にとって無価値である免疫優勢抗原との潜在的な免疫学的競合をなくすように選択された。ある実施形態において、Ｎｍ株Ｈ４４／７６は、本開示と共に使用するのに有用な株である。別の実施形態において、Ｎｍ株ＮＺ９８／２５４は、本開示と共に使用するのに有用な株である。
ＮＯＭＶの表面に提示されるタンパク質は、１つ以上の膜貫通セグメントを有する内在性膜タンパク質であるか、又はタンパク質のアミノ末端への脂肪酸の結合によってリポタンパク質であるように修飾されて、結合された脂肪酸が膜へのアンカーとして作用するリポタンパク質を生成する。リポタンパク質は、プレプロリポタンパク質として最初に翻訳され、これは、分泌タンパク質のシグナルペプチドの典型的な特有の特徴を有する約２０アミノ酸のアミノ末端シグナルペプチドを有する。コンセンサスアミノ酸配列［ＬＶＩ］［ＡＳＴＶＩ］［ＧＡＳ］Ｃを有する、リポボックスと呼ばれるシグナルペプチドの保存配列は、不可欠なシステイン残基の側鎖におけるチオール基へのジアシルグリセロール部分の共有結合によって修飾される。この修飾は、酵素リポタンパク質ジアシルグリセリルトランスフェラーゼ（Ｌｇｔ）によって触媒され、タンパク質へのチオエステル結合によって連結されたジアシルグリセロール部分からなるプロリポタンパク質をもたらす。脂質化後、リポタンパク質シグナルペプチダーゼ（Ｌｓｐ又はＳＰａｓｅ ＩＩ）は、脂質化プロリポタンパク質のシグナル配列を切断することに関与し、リポボックスのシステインを新たなアミノ末端残基として残す。髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）などのグラム陰性菌において、切断されたプロリポタンパク質は、リポタンパク質Ｎ－アシルトランスフェラーゼ（Ｌｎｔ）によるＮ末端システイン残基へのアミド連結されたアシル基の結合によるさらなる修飾を生じる。ジアシルグリセリル基及びアミノ末端アシル基は、膜リン脂質に由来し、膜へのリポタンパク質のしっかりとした係留を提供する。ＮＯＭＶにおける表面露出したリポタンパク質としてＲＢＤを生成するために、本発明者らは、Ｎｍリポタンパク質シグナル配列をコードする配列を５’末端に有するＲＢＤコード遺伝子を構築した。
リポタンパク質シグナル配列に加えて、さらなるアミノ酸配列が例えばＨ因子結合タンパク質から付加され、適切なフォールディング及び細菌表面へのＲＢＤの輸送を可能にし得る。適切なフォールディング及び輸送により、ＲＢＤは、細菌プロテアーゼによるタンパク質分解に対してより抵抗性でもあり得る。アミノ酸のさらなるセグメントは、それが抗原提示細胞によりアクセスしやすい細菌表面からＲＢＤを伸長させる役割も果たし、それによりＲＢＤに対する改善された抗体反応を促進することができる。
Ｓ－タンパク質内に位置するＲＢＤ及びコロナウイルスにおけるＲＢＤの機能的役割は保存される。本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤがＮＯＭＶにおけるリポタンパク質として提示され得、ＮＯＭＶ－ＲＢＤワクチンがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する防御抗体を誘発し得ることを証明した。公知のヒト病原体ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（７２％同一のＲＢＤアミノ酸配列）及びＭＥＲＳ－ＣｏＶ（１７％同一のＲＢＤアミノ酸配列）を含む他のコロナウイルスのＲＢＤドメインは、ヒトにおける中和抗体を誘発するワクチンとして使用するためのリポタンパク質としてＮＯＭＶにおいて同様に提示され得ることが予測される。
本発明者らは、Ｎｍ中で維持されるプラスミドがＮＯＭＶ中に組み込まれ得ることを証明した。結果として、哺乳動物プロモーター／エンハンサー及びポリＡ配列を含有するプラスミドを用いて、ＮＯＭＶを取り込む哺乳動物細胞内でタンパク質を発現することができる。したがって、ＮＯＭＶワクチンは、タンパク質抗原及びヒトにおいて中和抗体を誘発するために哺乳動物細胞によって発現されるタンパク質抗原の両方を提供し得る。
定義
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間において、文脈上特に明記されない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値並びにその記載された範囲内の任意の他の記載された又は介在値が本開示の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さい範囲に含まれ得、また記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界を条件として本開示の範囲内に包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか又は両方を除外した範囲も本開示に含まれる。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間において、文脈上特に明記されない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値並びにその記載された範囲内の任意の他の記載された又は介在値が本開示の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さい範囲に含まれ得、また記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界を条件として本開示の範囲内に包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか又は両方を除外した範囲も本開示に含まれる。
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての専門用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び材料も、本開示の実施又は試験に使用され得るが、好ましい方法及び材料がここで記載される。本明細書において言及される全ての刊行物は、関連して刊行物が引用される方法及び／又は材料を開示及び説明するために参照により本明細書に援用される。本明細書に記載される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書中のいずれも、本開示が先行する開示によってこのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、提供された公開日は、独立して確認される必要があり得る実際の公開日と異なる場合がある。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される際、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、文脈上特に明記されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「活性薬剤」は、単一の活性薬剤だけでなく、２つ以上の異なる活性薬剤の組合せも指し、「剤形」は、単一の剤形だけでなく、剤形の組合せを指すなどである。
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての専門用語及び科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本開示の説明にとって特に重要な特定の用語が以下に定義される。
本明細書において使用される際、「有害事象」は、薬物に関連すると見なされるか否かにかかわらず、ヒトにおける本明細書に記載される薬物又はワクチンの使用に関連する何らかの好ましくない医療上の出来事を指す。ＡＥ又は疑わしい有害反応は、以下の転帰のいずれかをもたらす場合、「深刻な有害事象」と見なされ得る：死亡又は死亡の差し迫ったリスク、入院患者の入院又は既存の入院期間の延長、通常の生活機能を遂行する能力の持続的若しくは重大な機能不全又は実質的な障害、先天性異常／先天性欠損。有害事象は、死亡をもたらさないか、生命を脅かさないか又は入院を必要としない場合もあるが、患者又は対象を危険に曝すことがあり、上記の転帰の１つを防ぐために医療的又は外科的介入を必要とし得る重大な医療事象であり得る。ある実施形態において、有害事象は、本明細書に記載される薬物又はワクチンの投与の結果としてのインフュージョンリアクションを指す。
本明細書において使用される際、「アナフィラキシー」は、数分間から数時間にわたって起こり得る重篤な急性のアレルギー反応を指す。アナフィラキシーは、皮膚、粘膜組織又は両方に関与し得、限定はされないが、全身性じんましん、掻痒（かゆみ）、顔面潮紅、口唇、舌、咽喉又は口蓋垂の腫脹、息切れ、嘔吐、立ちくらみ、喘鳴、血行動態不安定及び発疹又はじんましんを含む１つ以上の症状を有し得る。さらに、アナフィラキシーは、以下の少なくとも１つを伴い得る：呼吸機能障害（例えば、呼吸困難、喘鳴－気管支けいれん、喘鳴、最大呼気流量の低下、低酸素症）及び血圧の低下（すなわち＜９０ｍｍ Ｈｇの収縮期血圧若しくはその人のベースラインから３０％超の低下）又は末端臓器不全の関連する症状（例えば、低血圧［虚脱］、失神、失禁）。本開示に係るアナフィラキシーは、アナフィラキシーを診断するためのアメリカ国立アレルギー・感染症研究所／食物アレルギー・アナフィラキシーネットワーク（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ／Ｆｏｏｄ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ）（ＮＩＡＩＤ／ＦＡＡＮ）臨床基準によって定義される。
本明細書において使用される際、「共投与」は、１つ以上の薬物の互いに同時の投与を指す。他の実施形態において、両方の薬物は、同時に投与される。本明細書の他の箇所に記載されるように、共投与は、いずれかの薬物又は両方の薬物の投与の任意の特定の期間も指し得る。例えば、本明細書に記載されるように、薬物は、別の薬物の投与の数時間、数日、数週間又は数か月前に投与され得、依然として共投与されたものと見なされる。ある実施形態において、共投与は、両方の薬物が患者の身体内に同時に存在するような、いずれかの薬物の投与の任意の時点を指し得る。ある実施形態において、いずれかの薬物は、患者が意図される臨床的又は薬理学的効果を受けるのに十分な時間にわたってそれらが両方とも患者内に存在する限り、他の薬物の前又は後に投与され得る。
本明細書において使用される際、「有効量」及び「治療有効量」という用語は、非毒性であり、対象又は患者（例えば、ヒト対象又は患者）への投与時にいくらかの所望の治療効果を生じるのに有効である、薬剤、化合物、薬物、組成物又は組合せの量を指す。
本明細書において使用される際、「哺乳動物細胞」という用語は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤが本明細書に記載されるように発現される任意の哺乳動物又はその細胞、例えばヒトを指す。
「薬学的に許容される」とは、生物学的に又は他の形で有害でない材料を意味し、すなわち、材料は、何らかの望ましくない生物学的作用を生じさせるか、又はそれが含まれる組成物の他の成分のいずれかと有害な形で相互作用することなく、患者に投与される医薬組成物中に組み込まれ得る。「薬学的に許容される」という用語が医薬担体又は賦形剤を指すために使用される場合、担体又は賦形剤が毒性及び製造試験の必要な基準を満たしていること、又はそれが、米国食品医薬品局によって作製されたＩｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｇｕｉｄｅに含まれることが示唆される。「薬理活性」（又は「活性」）誘導体又は類似体のような「薬理活性」（又は単に「活性」）は、親化合物と同じタイプの薬理学的活性及びほぼ同等の程度を有する誘導体又は類似体を指す。「薬学的に許容される塩」という用語は、例えば、塩酸又はリン酸などの無機酸又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸と共に形成される酸付加塩を含む。遊離カルボキシル基と共に形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は鉄水酸化物などの無機塩基及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基からも誘導され得る。
本明細書において使用される際、「低減する」は、ＣＯＶＩＤ－１９疾患又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の症状を低減することなどの、低下又は減少させることを指す。ある実施形態において、ＮＯＭＶワクチンなどの本明細書に記載されるワクチンの投与は、このようなワクチンを投与されていない患者と比較して、患者において「低減された」又は減少された症状をもたらし得る。「低減する」は、単独で又は別の薬物と共投与される、本明細書に記載される処置の結果としての疾患の症状の低減も指し得る。
本明細書において使用される際、「対象」又は「個体」又は「患者」は、治療が所望される任意の患者を指し、一般に、治療のレシピエントを指す。
本明細書において使用される際の「処置する」及び「処置」という用語は、症状の重症度及び／若しくは頻度の低下、症状及び／若しくは根底にある原因の解消及び損傷の改善又は修復を指す。特定の態様において、本明細書において使用される際の「処置する」及び「処置」という用語は、症状の発生の防止を指す。他の態様において、本明細書において使用される際の「処置する」及び「処置」という用語は、ＣＯＶＩＤ－１９疾患などの疾患に関連する症状の根底にある原因の防止を指す。「患者に投与する」という語句は、当技術分野において認識されている導入手段により、組成物、ワクチン又は剤形を患者中に導入するプロセスを指す。
本開示の実施形態の実施例が以下の実施例において提供される。以下の実施例は、あくまでも例示として且つ本開示を用いる際に当業者を補助するために示される。実施例は、本開示の範囲を限定することを決して意図されない。
実施例１．髄膜炎菌リポタンパク質シグナル配列を有するＲＢＤをコードする遺伝子の挿入による、ｆｈｂｐ、ｓｉａＤ－ｇａｌＥ及びｌｐｘＬ１遺伝子の置き換え
プロモーター（ＥＨ－ＮＴ）、ＦＨｂｐ ＩＤ９からのナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌ）Ｈ因子結合タンパク質（ＦＨｂｐ）リポタンパク質リーダー配列及びＲＢＤ配列（ＥＨ－ＮＴ－ＩＤ９ ＳＳ－ＲＢＤ配列と呼ばれる）を含有するＤＮＡセグメントを、ｌｐｘＬ１（ｐＵＣ１８－ｌｐｘＬ１ＫＯ－ＲＢＤ－ＫＡＮプラスミド）、ｇａｌＥ－ｓｉａＤ（ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥ－ＦＨｂｐ２５ＲＢＤ－ＳＰＣプラスミド、配列番号１０、図１５）及びＦＨｂｐ遺伝子ＮＭＢ１８７０（ｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＦＨｂｐ２５ＲＢＤ－ＥＲＭプラスミド、配列番号１１、図１６）をノックアウトするためにベクターへとクローニングした。細菌を３μｇのプラスミドと混合し、トリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）寒天プレート上で平板培養し、３７℃で６時間インキュベートした。細菌の連続希釈物を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）及びエリスロマイシン（１０μｇ／ｍＬ）のそれぞれを含有するＴＳＢ寒天プレート上で再度培養した。培養プレートを３７℃で一晩インキュベートし、得られたコロニーを、特定の抗体を用いたフローサイトメトリーアッセイ及び熱殺菌された細胞を用いたＰＣＲにより、ＲＢＤ発現及びＦＨｂｐ、莢膜多糖及びＬｐｘＬ１の欠如についてスクリーニングした。陽性の個々のコロニーを１０％の脱脂粉乳（ｗｔ／ｖｏｌ）及び１５％のグリセロール中で凍結させ、－８０℃で貯蔵した。
プロモーター（ＥＨ－ＮＴ）、ＦＨｂｐ ＩＤ９からのナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌ）Ｈ因子結合タンパク質（ＦＨｂｐ）リポタンパク質リーダー配列及びＲＢＤ配列（ＥＨ－ＮＴ－ＩＤ９ ＳＳ－ＲＢＤ配列と呼ばれる）を含有するＤＮＡセグメントを、ｌｐｘＬ１（ｐＵＣ１８－ｌｐｘＬ１ＫＯ－ＲＢＤ－ＫＡＮプラスミド）、ｇａｌＥ－ｓｉａＤ（ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥ－ＦＨｂｐ２５ＲＢＤ－ＳＰＣプラスミド、配列番号１０、図１５）及びＦＨｂｐ遺伝子ＮＭＢ１８７０（ｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＦＨｂｐ２５ＲＢＤ－ＥＲＭプラスミド、配列番号１１、図１６）をノックアウトするためにベクターへとクローニングした。細菌を３μｇのプラスミドと混合し、トリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）寒天プレート上で平板培養し、３７℃で６時間インキュベートした。細菌の連続希釈物を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）及びエリスロマイシン（１０μｇ／ｍＬ）のそれぞれを含有するＴＳＢ寒天プレート上で再度培養した。培養プレートを３７℃で一晩インキュベートし、得られたコロニーを、特定の抗体を用いたフローサイトメトリーアッセイ及び熱殺菌された細胞を用いたＰＣＲにより、ＲＢＤ発現及びＦＨｂｐ、莢膜多糖及びＬｐｘＬ１の欠如についてスクリーニングした。陽性の個々のコロニーを１０％の脱脂粉乳（ｗｔ／ｖｏｌ）及び１５％のグリセロール中で凍結させ、－８０℃で貯蔵した。
実施例２．それぞれＮｍリポタンパク質シグナル配列（ＰＣＲ、ＦＡＣＳ）を有する、ＲＢＤをコードする３つの染色体コピー及びＲＢＤをコードするマルチコピープラスミドを含有する髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（Ｎｍ）株Ｈ４４／７６の突然変異体の特性評価
ＰＣＲ：ＰＣＲプライマーは、ｆｈｂｐ、ｓｉａＤ－ｇａｌＥ又はｌｐｘＬ１遺伝子、ＲＢＤ遺伝子の隣接領域及び抗生物質耐性カセットを保有する髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株Ｈ４４／７６に挿入された構築物の上流及び下流を増幅するために設計された（図１を参照）。ＰＣＲを、熱殺菌された細胞において行った。野生型Ｈ４４／７６からの熱殺菌された細胞を陰性対照として使用した。
ＰＣＲ：ＰＣＲプライマーは、ｆｈｂｐ、ｓｉａＤ－ｇａｌＥ又はｌｐｘＬ１遺伝子、ＲＢＤ遺伝子の隣接領域及び抗生物質耐性カセットを保有する髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株Ｈ４４／７６に挿入された構築物の上流及び下流を増幅するために設計された（図１を参照）。ＰＣＲを、熱殺菌された細胞において行った。野生型Ｈ４４／７６からの熱殺菌された細胞を陰性対照として使用した。
フローサイトメトリー：生きた髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌の表面への抗ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクＲＢＤウサギポリクローナル抗体（ｍｙＢｉｏｓｕｒｃｅ Ｃａｔ＃ ＭＢＳ２５６３８４０）の結合を、既に記載されるようにフローサイトメトリーによって測定した（Ｇｉｕｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３：６９８－７０６，２０１６）。簡潔に述べると、細菌を０．６～０．７のＯＤ６２０ｎｍまで既知組成培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）中で増殖させた。抗ＲＢＤ抗体結合を測定するために、一定の濃度の抗ＲＢＤ抗体又は陰性対照として１０μｇ／ｍＬの非関連抗体を１０７個の細菌／ｍＬと共にインキュベートした。結合抗体を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ［Ｆ（ａｂ’）２（Ｈ＋Ｌ）］二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて検出した。図２に示されるように、細菌中に導入された各さらなるコピーは、フローサイトメトリーによって検出される増加した蛍光をもたらした。
実施例３．ＲＢＤ（ウエスタンブロット、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を含有するＮＯＭＶワクチンの調製及び特性評価
ＮＯＭＶ調製：
ＮＯＭＶは、ＴＳＢ寒天プレート上で細菌の一晩コロニーから０．１５～０．２のＯＤ６２０ｎｍまで細菌を接種した培地から得られた。培養物を５％のＣＯ２中において３７℃でインキュベートし、培地の体積は、培養物が静止期に達する（０．６～０．７のＯＤ６２０ｎｍ、通常、１．５時間置き）前に増加された。最終体積に達したとき、培養物を、通気口付きエンクロージャを備えた振とうフラスコ中でさらに１５時間増殖させた。次に、細菌を遠心分離し（１０，０００×ｇ、２０分間）、上清をガラス繊維フィルタに通してろ過して、残屑を除去し、次に滅菌ろ過し（０．２２μｍフィルタ）、限外ろ過（１００ｋカットオフフィルタ、Ａｍｉｃｏｎ）によって濃縮し、ベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（１０００Ｕ／Ｌ）を加えた。ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）処理を周囲温度で少なくとも１時間続けた。濃縮されたろ液を遠心分離して（２０２，６０１×ｇ、１．５時間、４℃）、ＮＯＭＶを収集した。ＮＯＭＶを１０ｍＭのトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．４、３％（ｗ／ｖ）スクロース中で懸濁させ、前の工程に記載されるように再度遠心分離し、最後にＤＣタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって決定した際に１～３ｍｇ／ｍＬのタンパク質の濃度までトリス／スクロース溶液中で懸濁させた。ＮＯＭＶ調製物を使用されるまで－７０℃で貯蔵した。
ＮＯＭＶ調製：
ＮＯＭＶは、ＴＳＢ寒天プレート上で細菌の一晩コロニーから０．１５～０．２のＯＤ６２０ｎｍまで細菌を接種した培地から得られた。培養物を５％のＣＯ２中において３７℃でインキュベートし、培地の体積は、培養物が静止期に達する（０．６～０．７のＯＤ６２０ｎｍ、通常、１．５時間置き）前に増加された。最終体積に達したとき、培養物を、通気口付きエンクロージャを備えた振とうフラスコ中でさらに１５時間増殖させた。次に、細菌を遠心分離し（１０，０００×ｇ、２０分間）、上清をガラス繊維フィルタに通してろ過して、残屑を除去し、次に滅菌ろ過し（０．２２μｍフィルタ）、限外ろ過（１００ｋカットオフフィルタ、Ａｍｉｃｏｎ）によって濃縮し、ベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（１０００Ｕ／Ｌ）を加えた。ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）処理を周囲温度で少なくとも１時間続けた。濃縮されたろ液を遠心分離して（２０２，６０１×ｇ、１．５時間、４℃）、ＮＯＭＶを収集した。ＮＯＭＶを１０ｍＭのトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．４、３％（ｗ／ｖ）スクロース中で懸濁させ、前の工程に記載されるように再度遠心分離し、最後にＤＣタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって決定した際に１～３ｍｇ／ｍＬのタンパク質の濃度までトリス／スクロース溶液中で懸濁させた。ＮＯＭＶ調製物を使用されるまで－７０℃で貯蔵した。
液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）ペプチドマッピング：
ＦＨｂｐ ＩＤ９リポタンパク質シグナル配列を有するＲＢＤがＮＯＭＶ－ＲＢＤ中に存在することを確認するために、ＮＯＭＶを溶液（ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）から沈殿させ、６Ｍの尿素／５ｍＭのジチオスレイトール中で再構成し、システイン残基をヨードアセトアミドで修飾し、Ｌｙｓ－Ｃ／トリプシンの混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ）により消化した。得られたペプチドをＭａｃｒｏＳｐｉｎカラム（Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ、Ｉｎｃ．）上で精製し、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター質量分析施設（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＳ）でペプチドマッピングに供した。得られたペプチドマップは、ＲＢＤがＮＯＭＶ調製物中の最も豊富なタンパク質の１つであり、ペプチドが、タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方にペプチドを含むタンパク質の６５％を占めることを示した（図３）。
ＦＨｂｐ ＩＤ９リポタンパク質シグナル配列を有するＲＢＤがＮＯＭＶ－ＲＢＤ中に存在することを確認するために、ＮＯＭＶを溶液（ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）から沈殿させ、６Ｍの尿素／５ｍＭのジチオスレイトール中で再構成し、システイン残基をヨードアセトアミドで修飾し、Ｌｙｓ－Ｃ／トリプシンの混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ）により消化した。得られたペプチドをＭａｃｒｏＳｐｉｎカラム（Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ、Ｉｎｃ．）上で精製し、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター質量分析施設（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＳ）でペプチドマッピングに供した。得られたペプチドマップは、ＲＢＤがＮＯＭＶ調製物中の最も豊富なタンパク質の１つであり、ペプチドが、タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方にペプチドを含むタンパク質の６５％を占めることを示した（図３）。
ウエスタンブロット：
ＲＢＤ（ＮＯＭＶ－ＲＢＤ）を含有するＮＯＭＶワクチン中のＲＢＤの存在を示すために、精製された組み換えＲＢＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＲＢＤなしのＮＯＭＶ及びＮＯＭＶ－ＲＢＤの調製物を４％～１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（ＮｕＰＡＧＥ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で分解し、ウエスタンブロット法のために半乾燥転送細胞（Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ（登録商標）ＳＤ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いてＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）－ＦＬ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。ＰＶＤＦ膜を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液中５％の全脂粉乳を用いて一晩ブロックし、次に膜を、抗ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクＲＢＤウサギポリクローナル抗体（ｍｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｃａｔ＃ ＭＢＳ２５６３８４０）を用いて周囲温度で２時間にわたってブロッキングバッファー中で染色した。ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、結合抗体を、ＩＲＤｙｅ（登録商標）６８５ＣＷコンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（ＬＩ－ＣＯＲ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）を用いて検出した。ゲル及びブロットの画像をＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）Ｆｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ－ＣＯＲ）で記録した。図４に示されるように、組み換えＲＢＤは、三量体、二量体及びモノマーの混合物として実行される（レーン２）。ＮＯＭＶ中の脂質化ＲＢＤの存在がレーン４中の上側の矢印によって示され、非脂質化形態が下側の矢印で示される。レーン３は、ＲＢＤを含有しないＮＯＭＶを含有する。
ＲＢＤ（ＮＯＭＶ－ＲＢＤ）を含有するＮＯＭＶワクチン中のＲＢＤの存在を示すために、精製された組み換えＲＢＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＲＢＤなしのＮＯＭＶ及びＮＯＭＶ－ＲＢＤの調製物を４％～１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（ＮｕＰＡＧＥ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で分解し、ウエスタンブロット法のために半乾燥転送細胞（Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ（登録商標）ＳＤ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いてＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）－ＦＬ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。ＰＶＤＦ膜を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液中５％の全脂粉乳を用いて一晩ブロックし、次に膜を、抗ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクＲＢＤウサギポリクローナル抗体（ｍｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｃａｔ＃ ＭＢＳ２５６３８４０）を用いて周囲温度で２時間にわたってブロッキングバッファー中で染色した。ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、結合抗体を、ＩＲＤｙｅ（登録商標）６８５ＣＷコンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（ＬＩ－ＣＯＲ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）を用いて検出した。ゲル及びブロットの画像をＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）Ｆｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ－ＣＯＲ）で記録した。図４に示されるように、組み換えＲＢＤは、三量体、二量体及びモノマーの混合物として実行される（レーン２）。ＮＯＭＶ中の脂質化ＲＢＤの存在がレーン４中の上側の矢印によって示され、非脂質化形態が下側の矢印で示される。レーン３は、ＲＢＤを含有しないＮＯＭＶを含有する。
免疫化：
１００μｇ／投与のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）により配合された１０μｇ／投与のＲＢＤ－ＮＯＭＶの、３週間の間隔を空けた２回の投与により、マウスを免疫化した。陽性及び陰性対照のそれぞれとして、１００μｇ／投与のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）又は１００μｇ／投与のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）のみにより配合された組み換えＲＢＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃａｔ．＃４０５９２－Ｖ０８Ｈ）１０μｇ／投与により、マウスを免疫化した。
１００μｇ／投与のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）により配合された１０μｇ／投与のＲＢＤ－ＮＯＭＶの、３週間の間隔を空けた２回の投与により、マウスを免疫化した。陽性及び陰性対照のそれぞれとして、１００μｇ／投与のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）又は１００μｇ／投与のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）のみにより配合された組み換えＲＢＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃａｔ．＃４０５９２－Ｖ０８Ｈ）１０μｇ／投与により、マウスを免疫化した。
血液サンプルを２回目の投与の５日後に収集し、ＥＬＩＳＡによって抗ＲＢＤ抗体について試験した。プレートを２μｇ／ｍＬの組み換えＲＢＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃａｔ．＃４０５９２－Ｖ０８Ｈ）又は組み換えスパイクＳ１＋Ｓ２（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃａｔ＃ ４０５８９－Ｖ０８Ｂ１）で被覆した。
実施例４．ＮＯＭＶ－ＲＢＤワクチンは、ＥＬＩＳＡによって組み換えＲＢＤに対する抗体を誘発する
７匹の非近交系ＣＤ１マウスの群を１０μｇの用量のＮＯＭＶ－ＲＢＤにより免疫化した。血液サンプルを３週間後に得た。ＮＯＭＶ－ＲＢＤワクチンにより免疫化されたマウスにおいて生じたポリクローナル抗体の結合活性を、以下のように行われるＥＬＩＳＡによって決定した。９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を２μｇ／ｍＬの組み換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）又は完全なスパイクタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）で４℃において一晩被覆した。プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１％のＢＳＡ（重量／体積）＋０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０でブロックした。免疫化されたマウスからの血清をＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ ２０中で希釈し、一晩プレートに加えた。結合抗体を１時間にわたってアルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１：３，０００希釈）により検出し、ｐ－ニトロフェニルリン酸（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて発色させた。ＯＤ４０５ｎｍにおける吸光度をＥｍａｘ精密プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。図５（右側のパネル）に示されるように、７匹全てのマウスは、ＲＢＤ及び完全なスパイクタンパク質の両方と反応性の抗ＲＢＤ特異的抗体を生じた（黒色の記号）。水酸化アルミニウムアジュバント単独により免疫化されたマウス（白色の記号）のいずれも、ＲＢＤに対する抗体を有していなかった（右側のパネル）。
７匹の非近交系ＣＤ１マウスの群を１０μｇの用量のＮＯＭＶ－ＲＢＤにより免疫化した。血液サンプルを３週間後に得た。ＮＯＭＶ－ＲＢＤワクチンにより免疫化されたマウスにおいて生じたポリクローナル抗体の結合活性を、以下のように行われるＥＬＩＳＡによって決定した。９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を２μｇ／ｍＬの組み換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）又は完全なスパイクタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）で４℃において一晩被覆した。プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１％のＢＳＡ（重量／体積）＋０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０でブロックした。免疫化されたマウスからの血清をＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ ２０中で希釈し、一晩プレートに加えた。結合抗体を１時間にわたってアルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１：３，０００希釈）により検出し、ｐ－ニトロフェニルリン酸（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて発色させた。ＯＤ４０５ｎｍにおける吸光度をＥｍａｘ精密プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。図５（右側のパネル）に示されるように、７匹全てのマウスは、ＲＢＤ及び完全なスパイクタンパク質の両方と反応性の抗ＲＢＤ特異的抗体を生じた（黒色の記号）。水酸化アルミニウムアジュバント単独により免疫化されたマウス（白色の記号）のいずれも、ＲＢＤに対する抗体を有していなかった（右側のパネル）。
実施例５．哺乳動物細胞内のＲＢＤの発現のためにＮＯＭＶの内部に保有されるプラスミドの構築
この実施例において、シグナル配列、プロモーター／エンハンサー配列及びポリＡテイルを有するＲＢＤを含有するプラスミドがＮＯＭＶの内部に取り込まれることが実証される。ＲＢＤ及びプラスミドの３つのコピーを有する株から生成されたＮＯＭＶ－ＲＢＤは、抗体反応を刺激するためのタンパク質抗原及びＲＢＤ遺伝子を、遺伝子が発現され得る細胞の内部に送達して、防御抗体反応をさらに刺激する可能性を有する。
この実施例において、シグナル配列、プロモーター／エンハンサー配列及びポリＡテイルを有するＲＢＤを含有するプラスミドがＮＯＭＶの内部に取り込まれることが実証される。ＲＢＤ及びプラスミドの３つのコピーを有する株から生成されたＮＯＭＶ－ＲＢＤは、抗体反応を刺激するためのタンパク質抗原及びＲＢＤ遺伝子を、遺伝子が発現され得る細胞の内部に送達して、防御抗体反応をさらに刺激する可能性を有する。
マルチコピープラスミドを、ＳＶ４０エンハンサー、偏在性のヒトＥＦ１α－ＨＴＬＶ複合プロモーター及びＳＶ４０ポリアデニル化（ｐＡｎ）シグナルから構成される哺乳動物発現カセットを含むように操作した（図６）。Ｎｍ株を形質転換するために使用される得られたプラスミドのマップが図７に示される。
実施例６．髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の形質転換
ｓｉａＤ－ｇａｌＥ及びｌｐｘＬ１遺伝子が不活性化されたＨ４４／７６株（Ｈ４４／７６ΔＦＨｂｐ ΔＣａｐｓｕｌｅ ΔｌｐｘＬ１）を、スペクチノマイシン選択を用いたプラスミドｐＧＥＭ－ＳｉａＤ／ＧａｌＥＫＯ－ＳＰＣ（５０μｇ／ｍＬ）及びカナマイシン選択を用いたｐＵＣ１８－ｌｐｘＬ１ＫＯ－ＫＡＮ（５０μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコールを用いたｐＦＰ１２－ＳＶ４０－ＲＢＤ－ＣＡＴ（５μｇ／ｍＬ）を用いた形質転換による相同的組み換えによって作製した。野生型株から開始する形質転換をこの順序で行った。
ｓｉａＤ－ｇａｌＥ及びｌｐｘＬ１遺伝子が不活性化されたＨ４４／７６株（Ｈ４４／７６ΔＦＨｂｐ ΔＣａｐｓｕｌｅ ΔｌｐｘＬ１）を、スペクチノマイシン選択を用いたプラスミドｐＧＥＭ－ＳｉａＤ／ＧａｌＥＫＯ－ＳＰＣ（５０μｇ／ｍＬ）及びカナマイシン選択を用いたｐＵＣ１８－ｌｐｘＬ１ＫＯ－ＫＡＮ（５０μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコールを用いたｐＦＰ１２－ＳＶ４０－ＲＢＤ－ＣＡＴ（５μｇ／ｍＬ）を用いた形質転換による相同的組み換えによって作製した。野生型株から開始する形質転換をこの順序で行った。
莢膜遺伝子をノックアウトした（ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥ－ＦＨｂｐ２５ＲＢＤ－ＳＰＣプラスミド、配列番号１０、図１５）。
ｌｐｘＬ１遺伝子をノックアウトした（ｐＵＣ１８－Ｌｐｘｌ１ＫＯ－ＦＨｂｐ５５ＲＢＤ－ＫＡＮプラスミド、配列番号１２、図１７）。
ＲＢＤのための哺乳動物発現カセット（ｐＦＰ１２ ＳＶ４０ ＲＢＤ－２プラスミド、配列番号１５、図７）。
Ｈ４４／７６株の１０～１５のコロニーを、一晩増殖させたＴＳＢ（トリプシン大豆ブロス、非動物由来）寒天プレートから選択した。細菌のコロニーを３μｇのプラスミドと混合し、ＴＳＢ寒天プレート上で平板培養し、３７℃で６時間インキュベートした。細菌の連続希釈物を、選択のために抗生物質を含有するＴＳＢ寒天プレート上で再度培養した。培養プレートを３７℃で一晩インキュベートし、コロニーを、特定の抗体を用いたフローサイトメトリーアッセイ及び熱殺菌された細胞を用いたＰＣＲにより、莢膜及びｌｐｘＬ１の欠如についてスクリーニングした。陽性の個々のコロニーを１０％の脱脂粉乳（ｗｔ／ｖｏｌ）及び１５％のグリセロール中で凍結させ、－８０℃で貯蔵した。熱殺菌された細胞を用いたＰＣＲを、ＳＶ４０－ＲＢＤカセットの存在を検出するために行った。クロラムフェニコール耐性コロニーをＦｒａｎｔｚ及びクロラムフェニコール中で一晩増殖させ、プラスミドＤＮＡを翌日に単離し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルとして電気泳動させて、マルチコピープラスミドの存在を確認した。
実施例７．熱殺菌された細胞におけるＰＣＲ
ＰＣＲプライマーを、ｓｉａＤ－ｇａｌＥ又はｌｐｘＬ１遺伝子、ＳＶ４０－ＲＢＤ遺伝子の隣接領域及び抗生物質耐性カセットを保有する髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株Ｈ４４／７６に挿入された構築物の上流及び下流を増幅するために設計した（図８を参照）。ＰＣＲを、熱殺菌された細胞において行った。野生型Ｈ４４／７６からの熱殺菌された細胞を陰性対照として使用した。
ＰＣＲプライマーを、ｓｉａＤ－ｇａｌＥ又はｌｐｘＬ１遺伝子、ＳＶ４０－ＲＢＤ遺伝子の隣接領域及び抗生物質耐性カセットを保有する髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株Ｈ４４／７６に挿入された構築物の上流及び下流を増幅するために設計した（図８を参照）。ＰＣＲを、熱殺菌された細胞において行った。野生型Ｈ４４／７６からの熱殺菌された細胞を陰性対照として使用した。
図９に示されるように、形質転換された細菌中のｐＦＰ１２プラスミドの存在は、熱殺菌された細胞（上側のパネル）及び精製されたＮＯＭＶ（下側のパネル）におけるＰＣＲによって確認され得る。プラスミドは、形質転換された細菌から単離され、ＤＮＡゲルにおいて検出され得る（中央のパネル）。矢印は、伸長したバンドのサイズを示す。
実施例８．哺乳動物細胞内のプラスミドでコードされた核酸の発現
ある実施形態において、本開示は、哺乳動物細胞内のＲＢＤの発現を提供するプロモーター／エンハンサー及びポリＡ配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードするプラスミドを含有する髄膜炎菌株又はＮＯＭＶワクチンを提供する。本明細書に記載されるように、ＮＯＭＶは、小胞の外部に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤを有し、これは、ヒト又は他の哺乳動物細胞などの細胞におけるＡＣＥ２受容体に結合するであろう。結合の際、それらの細胞は、全体としてＮＯＭＶ粒子を取り込み、これは、ＮＯＭＶ表面上に提示されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤに加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする核酸も含有する。それらの細胞は、対象における他のタイプの抗原提示細胞（ＡＰＣ）と共に、ＮＯＭＶに結合し、核酸を細胞に送達して、タンパク質の発現をもたらす、ｍＲＮＡ又はアデノウイルス型ワクチンと同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤを発現するであろう。したがって、発現されたタンパク質は、それらの細胞によって発現及び分泌され、対象における抗体反応を誘発する。したがって、ある実施形態において、抗原（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ）がＮＯＭＶの表面におけるタンパク質として提供される一方、ＮＯＭＶを取り込んだ細胞からの発現及び分泌をもたらす核酸としても提供される。
ある実施形態において、本開示は、哺乳動物細胞内のＲＢＤの発現を提供するプロモーター／エンハンサー及びポリＡ配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードするプラスミドを含有する髄膜炎菌株又はＮＯＭＶワクチンを提供する。本明細書に記載されるように、ＮＯＭＶは、小胞の外部に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤを有し、これは、ヒト又は他の哺乳動物細胞などの細胞におけるＡＣＥ２受容体に結合するであろう。結合の際、それらの細胞は、全体としてＮＯＭＶ粒子を取り込み、これは、ＮＯＭＶ表面上に提示されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤに加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする核酸も含有する。それらの細胞は、対象における他のタイプの抗原提示細胞（ＡＰＣ）と共に、ＮＯＭＶに結合し、核酸を細胞に送達して、タンパク質の発現をもたらす、ｍＲＮＡ又はアデノウイルス型ワクチンと同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤを発現するであろう。したがって、発現されたタンパク質は、それらの細胞によって発現及び分泌され、対象における抗体反応を誘発する。したがって、ある実施形態において、抗原（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ）がＮＯＭＶの表面におけるタンパク質として提供される一方、ＮＯＭＶを取り込んだ細胞からの発現及び分泌をもたらす核酸としても提供される。
実施例９．ＮＯＭＶワクチン組成物の投与
本開示は、対象にワクチン接種する方法であって、リポタンパク質であるように修飾されたコロナウイルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むＮＯＭＶワクチン組成物を投与することを含む方法を提供する。ワクチン組成物の投与は、（ａ）表面に提示されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤを有するＮＯＭＶ、又は（ｂ）本明細書に記載されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードするプラスミドを発現することに加えて、表面に提示されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤを有するＮＯＭＶを投与することを含み得る。
本開示は、対象にワクチン接種する方法であって、リポタンパク質であるように修飾されたコロナウイルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むＮＯＭＶワクチン組成物を投与することを含む方法を提供する。ワクチン組成物の投与は、（ａ）表面に提示されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤを有するＮＯＭＶ、又は（ｂ）本明細書に記載されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードするプラスミドを発現することに加えて、表面に提示されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤを有するＮＯＭＶを投与することを含み得る。
本明細書に記載されるＮＯＭＶワクチン製剤は、約６μｇ～約６０μｇのＮＯＭＶ単独を含むか、又は１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、０．９％のＮａＣｌ及び３％（重量／体積）のスクロースを含有する緩衝液中の水酸化アルミニウム（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、Ｂｒｅｎｔａｇ）としての約０．２５ｍｇ～約０．６ｍｇのＡｌ３＋などのアジュバントに吸着される。ＮＯＭＶ及びアジュバントの量は、臨床医又は医師によって適切であると見なされる際、投与前に変化され得る。代わりに、ＮＯＭＶは、ヒトにおいて使用するのに好適な他のワクチンアジュバント、例えば他のアルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム、アルミニウムヒドロキシホスフェート）、ＱＳ－２１、アルミニウム塩と、ＱＳ２１、ＣｐＧ １０１８（登録商標）（Ｄｙｎａｖａｘ）との混合物又は水中油型アジュバント［例えば、ＭＦ５９（登録商標）（ＧＳＫ）、ＡＳ０３（登録商標）（ＧＳＫ）］と共に製剤化され得る。対象に、少なくとも２か月の間隔において、０．５ｍＬの体積中のＮＯＭＶワクチン３回までの筋肉内注射を与える。防御抗体反応は、実施例４に記載されるようにＥＬＩＳＡ、代理ウイルス中和アッセイ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ（ｓＶＮＴ）Ｋｉｔ（ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘ）；ｃＰａｓｓ（商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ））及び自然感染に曝された対象におけるＰＣＲ検査によるウイルス量の減少によって測定される。
Claims (27)
- リポタンパク質であるように修飾されたコロナウイルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むＮＯＭＶワクチン組成物。
- 前記コロナウイルスＲＢＤは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する、請求項１に記載のＮＯＭＶワクチン組成物。
- リポタンパク質であるように修飾された前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードするプラスミド由来遺伝子を有する髄膜炎菌株を含む、請求項２に記載の組成物。
- リポタンパク質であるように修飾された前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする前記プラスミド由来遺伝子は、さらなる３０アミノ酸セグメントを含む、請求項３に記載の組成物。
- 前記３０アミノ酸セグメントは、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｈ因子結合タンパク質（ＦＨｂｐ）のアミノ末端に由来する、請求項４に記載の組成物。
- 前記３０アミノ酸セグメントは、前記髄膜炎菌株の外面への前記ＲＢＤの輸送を促進するためにリポタンパク質シグナル配列に結合される、請求項５に記載の組成物。
- 前記プラスミドは、ｐＦＰ１２－ＲＢＤプラスミドを含む、請求項３に記載の組成物。
- プラスミドは、ｐＦＰ１２ ＳＶ－４０ ＲＢＤ－２完全プラスミドを含む、請求項２に記載の組成物。
- プラスミドは、ｐＦＰ１２ ＳＶ４０ ＲＢＤ－２プラスミドを含む、請求項２に記載の組成物。
- プラスミドは、ｐＦＰ１２ ＳＶ－４０ ＲＢＤ－２ ｍｏｂＣプラスミドを含む、請求項２に記載の組成物。
- 前記プラスミドは、ｐＵＣ１８－Ｌｐｘｌ１ＫＯ－ＦＨｂｐ２５ＲＢＤ－ＫＡＮプラスミドを含む、請求項３に記載の組成物。
- 前記プラスミドは、ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥ－ＦＨｂｐ２５ＲＢＤ－ＳＰＣプラスミドを含む、請求項３に記載の組成物。
- 前記プラスミドは、ｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＦＨｂｐ２５ＲＢＤ－ＥＲＭプラスミドを含む、請求項３に記載の組成物。
- 前記髄膜炎菌株は、Ｈ４４／７６又はＮＺ９８／２５４である、請求項３～１３のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記髄膜炎菌株は、ポリンＡ（ＰｏｒＡ）を発現しない、請求項１４に記載の組成物。
- リポタンパク質であるように修飾されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードする遺伝子を有する髄膜炎菌株を含む組成物であって、前記遺伝子の発現は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）における高い遺伝子転写率を生じるプロモーター配列によって駆動される、組成物。
- 前記プロモーターは、図６～８、１０～２１又は配列番号１～１７に記載される配列を含む、請求項１６に記載の組成物。
- 前記プロモーターは、ポリンＡ（ＰｏｒＡ）のプロモーター若しくはその誘導体又はフマル酸及び硝酸レダクターゼ遺伝子（ｆｎｒ）のプロモーターを含む、請求項１６に記載の組成物。
- 前記プロモーターは、ＥＨ－ＮＴプロモーターを含む、請求項１６に記載の組成物。
- 前記遺伝子及びプロモーターは、細菌ゲノムの遺伝子座中に挿入される、請求項１６に記載の組成物。
- 前記遺伝子及びプロモーターは、ｌｐｘＬ１遺伝子座中に挿入され、アシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は、生成されるリポオリゴ糖がペンタアシル化され、且つヘキサアシル化されないように妨げられる、請求項２０に記載の組成物。
- 前記遺伝子及びプロモーターは、ｓｉａＤ－ｇａｌＥ遺伝子座（ｓｉａＡとも呼ばれる）中に挿入され、莢膜多糖の発現及びリポオリゴ糖宿主抗原のシアリル化は、妨げられる、請求項２０に記載の組成物。
- 前記遺伝子及びプロモーターは、ｆｈｂｐ遺伝子座（Ｈ因子結合タンパク質）中に挿入される、請求項２０に記載の組成物。
- 前記遺伝子及びプロモーターは、ｐｏｒＡ遺伝子座中に挿入される、請求項２０に記載の組成物。
- 哺乳動物細胞内のＲＢＤの発現を提供するプロモーター／エンハンサー及びポリＡ配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードするプラスミドを含有する髄膜炎菌株。
- 哺乳動物細胞内のＲＢＤの発現を提供するプロモーター／エンハンサー及びポリＡ配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをコードするプラスミドを含有するＮＯＭＶワクチン。
- 対象にワクチン接種する方法であって、請求項１に記載の組成物を投与することを含む方法。
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