CN101451147A

CN101451147A - 一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体及其应用

Info

Publication number: CN101451147A
Application number: CNA2008102473678A
Authority: CN
Inventors: 温廷益; 邓爱华; 张芸; 于雷
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2008-12-30
Filing date: 2008-12-30
Publication date: 2009-06-10

Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌－枯草芽孢杆菌穿梭表达载体及其应用。本发明的大肠杆菌－枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，包括如下元件：分泌型信号肽的编码序列、枯草芽孢杆菌的复制起始蛋白的编码序列、枯草芽孢杆菌的启动子序列、大肠杆菌的复制起始序列。本发明的载体既能在大肠杆菌内稳定复制，又能在枯草芽孢杆菌内复制并表达。本发明的载体可应用于建立蛋白质突变体基因库，先将突变基因连入载体，使各种突变基因在大肠杆菌中复制，再将其转入枯草芽孢杆菌中进行表达和筛选，构建突变库的效率相当于大肠杆菌操作系统，不但可以简单灵活的控制库容量大小，而且可以充分利用枯草芽孢杆菌宿主细胞的外分泌表达能力，方便突变库性能的检测和筛选。

Description

一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体及其应用。

背景技术

蛋白定向进化是指通过模拟自然进化机制、人为创造特殊进化条件，从一个或多个已存在的亲本蛋白出发，经过基因突变和重组来改变蛋白基因序列和创造蛋白分子的多样性，从而构建人工蛋白质突变体基因库，进一步结合灵敏的、高通量的筛选技术可以迅速获得理想的进化蛋白，所以又称为蛋白体外分子进化(Kolkman JA，Stemmer W P C.Directed evolution of proteins by exon shuffling.NatureBiotechnology，19：423-428，2001.)。蛋白质的定向进化可以引起蛋白的结构发生多种变化，其功能也相应出现一些精细的改变，从而产生具有许多优良性状的蛋白质，可以极大地发展和丰富蛋白质资源。许多天然蛋白质、酶、抗体或细胞因子经改造后，其特性和活性都得到了明显的改进，如改变了蛋白质分子的空间结构，提高了蛋白质的耐热性和(或)稳定性，延长了半衰期，提高了酶分子的酶活性、专一性和对极端环境的耐受性，增强了对变性剂和表面活性剂的抗性或与其相应配体的亲和性，改变了对辅因子的需求以及对抗体的亲和性等，从而更适于临床或工业用途(Shoeb Ahmada，Md.Zahid Kamal，Rajan Sankaranarayanan，and N.Madhusudhana Rao.Thermostable Bacillus subtilis Lipases：In VitroEvolution and Structural Insight.Journal of Molecular Biology.38l(2)：324-340，2008)。

应用各种基因突变方法改造蛋白质基因和构建基因突变库需要高效的表达载体和表达系统。原核表达系统由于具有操作简单、生长繁殖快、价格低廉、外源基因表达产物水平高等优点而得到广泛应用。其中大肠杆菌表达系统是研究最为深入、发展最为完善、使用最为广泛的表达系统，但是在表达异源蛋白时易形成无活性的包涵体。枯草芽孢杆菌是一种好氧、产孢子的革兰氏阳性细菌，广泛存在于土壤与植物中，是一种安全的工程菌株。枯草芽孢杆菌含有多种类型信号肽，能直接将许多蛋白分泌到胞外，如Sac型信号肽、双精氨酸信号肽、脂蛋白信号肽等(Tjalsma H，Bolhuis A，Jongbloed J D H，et al.Signal peptide dependent proteintransport in Bacillus subtilis：A genome based survey of the secretome[J].Microbiol Mol Biol R.64：515-547，2000)，重组蛋白常常能以可溶的形式分泌到培养基中，并具有活性，因此枯草芽孢杆菌表达系统在各种工业生产中得到越来越广泛的应用(De Boer AS，Diderichsen B.On the safety of Bacillus subtilisand B.amyloliquefaciens：a review.Appl Microbiol Biotechnol.36：1-4，1991.)。例如利用枯草芽孢杆菌生产α-淀粉酶的产量可以达到1-3g/L、酯酶A产量达到600mg/L，胰岛素原的产量达到1g/L，葡聚糖内切酶的产量达到8300U/L等(Westers L，Westers H，Quax WJ.Bacillus subtilis as cell factoryfor pharmaceutical proteins：a biotechnological approach to optimize thehost organism.Biochim Biophys Acta.1694(1-3)：299-310，2004)。随着分子生物学和基因工程的发展，枯草芽孢杆菌作为基因工程表达系统越来越受到人们的关注，但枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，外源DNA的转化效率低，而且可用的表达载体相当有限，所以采用传统方法在枯草芽孢杆菌操作系统内建立蛋白质突变体基因库具有一定的难度。

发明内容

本发明的目的是提供一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体及其应用。

本发明提供的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，包括如下元件：枯草芽孢杆菌的复制起始蛋白的编码序列、枯草芽孢杆菌的启动子序列、分泌型信号肽的编码序列、大肠杆菌的复制起始序列。

所述分泌型信号肽具体可为果聚糖蔗糖转移酶基因信号肽，所述枯草芽孢杆菌的复制起始蛋白具体可为RepB蛋白、所述枯草芽孢杆菌的启动子序列具体可为P43启动子序列、所述大肠杆菌的复制起始序列具体可为pBR322复制起始序列。

所述果聚糖蔗糖转移酶基因信号肽具体可为如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。

所述RepB蛋白具体可为如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的由序列5衍生的蛋白质。

所述果聚糖蔗糖转移酶基因信号肽的编码序列具体可为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子；

所述RepB蛋白的编码序列具体可为如下4)或5)或6)的DNA分子：

4)其编码序列是序列表中序列4所示的DNA分子；

5)在严格条件下与4)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

6)与4)或5)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子；

所述P43启动子序列具体可为如下7)或8)的DNA分子：

7)其编码序列是序列表中序列6所示的DNA分子；

8)与7)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA分子；

所述pBR322复制起始序列具体可为如下9)或10)的DNA分子：

9)其编码序列是序列表中序列7所示的DNA分子；

10)与9)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA分子。

所述载体还可包括抗菌素编码基因和多克隆位点序列；所述多克隆位点序列与所述分泌型信号肽的编码序列相接，且位于所述分泌型信号肽的下游。

所述抗菌素编码基因具体可为卡那霉素抗性基因和/或氨苄青霉素抗性基因。

具体来说，所述穿梭表达载体自上游至下游依次可以包括以下元件：果聚糖蔗糖转移酶基因信号肽的编码序列、多克隆位点序列、复制起始蛋白RepB的编码序列、卡那霉素抗性基因、P43启动子序列、氨苄青霉素抗性基因、pBR322复制起始序列。

所述穿梭表达载体优选图1所示的重组表达载体。

具体来说，以果聚糖蔗糖转移酶基因信号肽序列起始密码子ATG的A作为质粒的第一位，沿顺时针方向，所述穿梭表达载体的元件如下：自1至87位为果聚糖蔗糖转移酶基因信号肽的编码序列，因此重组蛋白能分泌到细胞外；自78至106位为多克隆位点序列，用于外源蛋白编码基因的插入；自481至1485位为复制起始蛋白RepB的编码序列，因此能在枯草芽孢杆菌内自主复制；自1645至2415位为卡那霉素抗性基因，因此具有卡那霉素抗性，便于筛选；自3420至3724位为P43启动子序列，由两个重叠启动子组成，能被枯草芽孢杆菌的ε-27和ε-55RNA聚合酶识别，因此能在枯草芽孢杆菌内大量表达外源蛋白；自4363至5223位为氨卞青霉素抗性基因，因此具有氨苄青霉素抗性，便于筛选；自5378至5997位为pBR322复制起始序列，因此能在大肠杆菌内自主复制。

所述的穿梭表达载体可应用于外源基因的克隆表达中。

本发明还保护所述穿梭表达载体在获得重组枯草芽孢杆菌中的应用。

本发明还提供了一种建立蛋白质突变体基因库的方法，包括如下步骤：

1)对目的蛋白的编码基因进行突变；

2)将突变基因插入所述穿梭表达质粒中，得到重组质粒；

3)用重组质粒转化大肠杆菌，筛选含有重组质粒的大肠杆菌，提取质粒并转化至枯草芽胞杆菌内；

4)筛选含有所述突变基因的枯草芽孢杆菌，得到蛋白质突变体基因库。

所述步骤1)中，对目的蛋白的编码基因进行突变的方法可为如下方法的任意一种：易错聚合酶链式反应(Error-prone PCR)、基因重排(DNA shuffling)、基因家族重排(family shuffling)、交错延伸、随机引物聚合酶链式反应、临时模板随机嵌合生长、异源重组。

所述目的蛋白不仅限于实施例中所涉及的碱性蛋白酶，还可为其它酶，如蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、半乳糖酶等；所述目的蛋白还可为酶分子以外的蛋白质，如抗体、细胞因子和生长因子等。

本发明中所涉及的转化过程既可是化学转化法也可是电穿孔转化方法，可以根据已知的技术灵活操作。

对目的蛋白的编码基因进行突变是在分子水平上进行的一种反复突变、重组的过程，其得到的重排产物的集合称为基因突变库，将基因突变库中的突变基因进行克隆、连接载体、转化至宿主细胞中，其得到的所有含突变基因的转化子的集合称为蛋白质突变体基因库。通过筛选、分析及多轮筛选，进一步对突变体基因库进行筛选，选择改良的突变体组成下一轮突变的模板，重复上述步骤进行多次重排和筛选，最终获得理想的性状。

本发明构建的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，既能在大肠杆菌内稳定复制，又能在枯草芽孢杆菌内稳定复制，可以快速有效地在枯草芽孢杆菌表达体系内建立蛋白质突变体基因库，从而为筛选性状优良的蛋白质提供了有效的途径。

本发明提供的构建蛋白基因突变库的方法包括：首先将突变基因连入表达质粒pBSST385中，使各种突变基因在大肠杆菌DH_5α中复制，再将其转入枯草芽孢杆菌中进行表达和筛选。本发明的基因突变库是以枯草芽孢杆菌表达体系为基础构建的，由于枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌，外源DNA的转化效率很低，故采用传统方法直接将基因突变产物连接至载体上转化枯草芽孢杆菌细胞时很难达到理想的突变库容量。而本发明借助于转化效率高的大肠杆菌DH_5α，建立突变库的效率相当于大肠杆菌，并且可以简单灵活的控制库容量大小，同时充分利用了枯草芽孢杆菌宿主细胞的外分泌表达能力，从而方便了突变库性能的检测和筛选。

本发明所提供的质粒和构建突变库的方法有效地增加了枯草芽孢杆菌表达系统突变库的库容量，进而可以有效快速地筛选所需蛋白。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

附图说明

图1为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体pBSST385的质粒图谱。

图2为pBSST385-apr质粒酶切电泳图。

图3为重组质粒转化子的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图4为易错PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图5为易错PCR产物的脱氧核糖核苷酸酶(DNaseI)酶切鉴定图。

图6为无引物PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图7为有引物PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图8为本发明的方法建立突变库的效果。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中的试验材料，如无特殊说明，均为市售常规试剂，可从生化试剂商店购得。

实施例1、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体的构建

一、果聚糖蔗糖转移酶基因信号肽序列和P43启动子序列的克隆

选用携带有EcoR I、Sac II酶切位点的引物A和携带有HindIII、Sph I酶切位点的引物B，以枯草芽孢杆菌W168(中国普通微生物保藏管理中心，保藏号为CGMCC1.1390)(Kunst F，Ogasawara N，Moszer I，Albertini AM，Alloni G，Azevedo V，Bertero MG，Bessières P，Bolotin A，Borchert S，Borriss R，Boursier L，Brans A，Braun M，Brignell SC，Bron S，Brouillet S，Bruschi CV，Caldwell B，Capuano V，Carter NM，Choi SK，Codani JJ，Connerton IF，Danchin A，et al.The complete genomesequence of the gram-positive bacteriumBacillus subtilis.Nature.390(6657)：249-56，1997)(中国科学院微生物研究所)的基因组DNA为模板，通过多聚酶链式反应(PCR)扩增果聚糖蔗糖转移酶基因信号肽序列。

引物A：5’-ATGAATTCACCGCGGAGGAGGGCTGGAAGAA-3’；

引物B：5’CGGCATGCAAGCTTAGTTGCGCCTCCTGCCAG3’。

电泳纯化PCR产物，通过测序验证所获得的DNA序列，结果表明PCR产物含有正确的果聚糖蔗糖转移酶基因信号肽序列(SEQ ID No：1)。

选用携带有EcoR I酶切位点的引物C和携带有Sac II酶切位点的引物D，以枯草芽孢杆菌W168的基因组DNA为模板扩增P43启动子。

引物C：5’-GCCGAATTCGAGCTCAGCATTATTGAGTGG-3’；

引物D：5’-GTGCCGCGGGCTATCACTTTATATTTTACAT-3’。

电泳纯化PCR产物，通过测序验证所获得的DNA序列，结果表明PCR产物含有正确的P43启动子序列(SEQ ID No：6)。

二、P43启动子-SacB信号肽-多克隆位点序列的克隆

将步骤一获得的果聚糖蔗糖转移酶(SacB)基因信号肽序列连入到pMD19T载体(宝生物工程(大连)有限公司，产品编号：D102A)上，获得含有SacB信号肽的质粒，命名为pSacT。用HindIII和Sph I完全消化pSacT；将合成的多克隆位点序列(SEQ ID No：3)用同样的酶进行酶切；连接纯化的酶切产物，然后转化大肠杆菌DH_5α(宝生物工程(大连)有限公司，产品编号：D9057)，获得含有果聚糖蔗糖转移酶基因信号肽和多克隆位点的质粒，命名为pSacMT。将pSacMT质粒和P43启动子分别用Sac II和EcoR I完全消化，连接后转入大肠杆菌DH5α，获得含有SacB信号肽、多克隆位点和P43启动子的质粒，命名为pSacMPT。用引物A和多克隆位点序列作为引物进行PCR扩增，获得P43启动子-SacB信号肽-多克隆位点序列。

二、pBSST385载体的构建

选用携带有Sph I酶切位点的引物E和携带有EcoR I酶切位点的引物F，以pDG148-StuI质粒(购自美国芽孢遗传保藏中心(BGSC)，质粒菌编号：ECE148)(Joseph P，Fantino JR，Herbaud ML，Denizot F.Rapid orientated cloning ina shuttle vector allowing modulated gene expression in Bacillus subtilis.FEMS Microbiol Lett.205(1)：91-97，2001.)(中国科学院微生物研究所)为模板，PCR扩增后得到RepB-卡那霉素基因序列(测序结果表明其中的RepB如序列表的序列4所示)。将获得的PCR产物用Sph I和EcoR I完全酶切，然后与用Sph I和EcoR I完全酶切的P43启动子-SacB信号肽-多克隆位点序列相连接，然后转化至枯草芽孢杆菌WB600(购自江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心，编号：B0033)中，获得质粒pBSS38。引物E：5’-AGGCATGCAAGCTAGCTTCAGCACA-3’，引物F：5’-CTGAATTCGCCACCTCAGCAAAGGG-3’。

选用携带有Sac II酶切位点的引物G和携带有Sac II酶切位点的引物H，以pUC19(大宝生物工程(大连)有限公司，产品编号为：D3219)质粒为模板，PCR扩增获得pBR322-氨苄青霉素基因序列(测序结果表明其中的pBR322如序列表的序列7所示)。将所获得的PCR产物用Sac II完全酶切，克隆至质粒pBSS38的Sac II酶切位点间，得到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，将其命名为pBSST385，其结构示意图见图1。引物G：5’-GTACCGCGGTTCACTGGCCGTCGTTTTAC-3’；引物H：5’-ATACCGCGGAATCGTCGAACGGCAGGC-3’。

实施例2、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体的蛋白表达水平检测

一、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(apr)序列克隆

设计含有Xho I和Kpn I酶切位点的引物对如下：

正向引物：5’-ATCGCTCGAGTGCCGGAAAAAGCAGTACAGA-3’；反向引物：5’-CTAGGGTACCTTATTGTGCAGCTGCTTGT-3’。

以枯草芽孢杆菌W168基因组DNA为模板，按以下条件进行PCR反应。

PCR扩增体系(50μl)如下：含有5μl 10×PCR缓冲液，4μl 2.5mM dNTP混合物，0.5μl正向引物，0.5μl反向引物，0.5μl模板DNA，0.5μl ExTaq DNA聚合酶，加灭菌水39μl，使最终体积为50μl。

PCR反应条件：94℃预变性5分钟；继续进行30循环：94℃30秒、55℃30秒、72℃1分30秒；最后72℃延伸5分钟，转入22℃保存。切胶回收PCR扩增产物，进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物含有序列表的序列7所示的核苷酸序列，序列7为碱性蛋白酶基因apr(GenBank Accession Number：NC_000964自5′末端第1103814至1104872位核苷酸)自5’末端第1-1059位核苷酸，编码序列表的序列8所示的氨基酸序列。

二、酶连及其转化

1、用Xho I和Kpn I完全消化碱性蛋白酶基因和实施例1制备的pBSST385载体，回收酶切产物。

2、连接酶切纯化的pBSST385和碱性蛋白酶基因，分别转入大肠杆菌DH_5α与枯草芽孢杆菌WB600(六个蛋白酶基因缺失菌株)感受态细胞内，获得含重组质粒的转化子pBSST-apr/DH_5α和pBSST-apr/WB600。

分别提取两个转化子的质粒DNA，用Xho I和Kpn I进行酶切验证。结果见图2。图2中，1：质粒pBSST385；2：从转化子pBSST-apr/DH_5α中提取的重组质粒pBSST-apr；3：从转化子pBSST-apr/WB600中提取的重组质粒pBSST-apr；M：DNAmarker 15,000；5：Xho I和Kpn I双酶切质粒pBSST385的酶切产物；6：Xho I和Kpn I双酶切泳道2重组质粒的酶切产物；7：Xho I和Kpn I双酶切泳道3重组质粒的酶切产物。酶切结果显示，重组质粒酶切得到片段大约为7000bp与1000bp，与预期大小一致。

分别将pBSST385空载体导入DH_5α大肠杆菌和WB600枯草芽孢杆菌，得到转化子pBSST385/DH_5α和转化子pBSST385/WB600，作为对照。

三、重组菌株发酵表达碱性蛋白酶

挑取转化子pBSST-apr/DH_5α、pBSST385/DH_5α、pBSST-apr/WB600和pBSST385/WB600于LB液体培养基(含有20μg/ml卡那霉素)，培养(37℃、220转每分钟)24小时。10000rpm离心10min，收集上清；超声波破碎菌体，12000rpm离心10min收集上清液。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

结果见图3；图3中，1：蛋白Marker；2：重组质粒转化子pBSST-apr/WB600的胞内蛋白；3：质粒转化子pBSST385/WB600的胞内蛋白；4：重组质粒转化子pBSST-apr/WB600的胞外蛋白；5：质粒转化子pBSST385/WB600的胞外蛋白；6和7：重组质粒转化子pBSST-apr/DH_5α的胞内蛋白；8：质粒转化子pBSST385/DH5α胞内蛋白；9：重组质粒转化子pBSST-apr/DH_5α的胞外蛋白；10：质粒转化子pBSST385/DH_5α的胞外蛋白。

结果表明：碱性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中大量表达并分泌于培养液中(见泳道4)，而在细胞内并没有碱性蛋白酶的存在；在大肠杆菌的细胞内外均未检测到碱性蛋白酶基因的表达；在质粒转化子pBSST385/WB600和质粒转化子pBSST385/DH₅ _α的细胞内外均未检测到碱性蛋白酶基因的表达。

实施例3、碱性蛋白酶突变体基因库的建立

一、碱性蛋白酶基因apr随机突变和基因重排(DNA shuffling)

(一)易错PCR突变碱性蛋白酶基因

易错PCR反应体系：

10×PCR缓冲液 5μl

8mM MnSO₄ 4μl

2mM dGTP 5μl

50×dNTP混合物 1μl

正向引物 0.75μl

反向引物 0.75μl

模板DNA(实施例2制备的碱性蛋白酶基因apr) 0.5μl

Taq DNA聚合酶 1μl

加灭菌水32μl，使最终体积为50μl。

易错PCR反应条件：94℃预变性30秒；然后94℃30秒、55℃1分钟、72℃1分20秒进行30个循环；最后72℃延伸5分钟，转入4℃保存。

琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果见图4。结果表明：PCR产物大小约为1000bp，与碱性蛋白酶apr基因的大小相一致。

(二)碱性蛋白酶基因的基因重排

1、小片段DNA的纯化和回收

回收碱性蛋白酶基因apr易错PCR产物，用0.001 U DNaseI进行随机酶切(10-15℃酶切10min)，反应完成后用2μl 0.5mol/L EDTA(pH8.0)和2μl 10×DNALoading buffer终止，酶切产物进行低密度琼脂糖电泳。结果见图5。回收酶切产物中约50～250bp的片段。

2、无引物PCR

PCR体系(25μl)：步骤1中所回收的DNA片段(50-250bp)，10mM dNTP，超纯水，PCR缓冲液和0.5U Taq酶。

PCR条件：94℃预变性5min；然后94℃变性1min、48℃退火2min、72℃延伸1min，35循环；最后72℃延伸10min；转入4℃保存。

琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果见图6。结果表明：得到了从100-2000bp的弥散条带。

(3)有引物PCR

PCR体系(50μl)：无引物PCR产物35μl，2.5mM dNTP 4μl，上下游引物1μl，无菌超纯水4.5μl，PCR缓冲液5μl，5 U/μl Ex Taq酶0.5μl。

PCR条件：94℃预变性5min；然后94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min，30个循环；然后72℃延伸10min；转入4℃保存。

琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果见图7。结果表明：得到大小约为1000bp的条带为碱性蛋白酶基因重排产物，与碱性蛋白酶apr的大小相一致。

二、碱性蛋白酶基因突变库I的建立方法

1、用Xho I和Kpn I完全酶切碱性蛋白酶基因apr随机突变产物，回收酶切产物；用Xho I和Kpn I酶切实施例1制备的pBSST385载体，回收酶切产物。

2、切胶纯化步骤1得到的两种酶切产物，用快速连接试剂盒(宝生物(大连)工程有限公司，产品目录号D6022)连接1小时。

3、将步骤2得到的连接液转入大肠杆菌DH_5α感受态细胞中，涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养14-16小时，得到转化子。

4、用含有50μg/ml氨苄青霉素的2YT培养液(每升培养液中含有氯化钠5克，胰蛋白胨16克，酵母浸粉10克，pH值7.0)洗涤平板上的大肠杆菌转化子，37℃摇床培养3-4小时。

5、室温下12,000转/分钟离心2分钟，收集菌体，提取质粒DNA。

6、将提取的质粒转入枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中，涂布于含20μg/ml卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-14小时，挑取平板上的转化子进行筛选，保存突变子，即为碱性蛋白酶基因突变文库，将其保存于-80℃。

转化率的计算公式为：转化率＝转化子/微克突变基因。上述的方法构建基因突变文库，重复三次，计算所得的平均转化率为10⁶个转化子/微克突变基因(见图8)。三、碱性蛋白酶基因突变库II的建立方法

1、用Xho I和Kpn I完全酶切碱性蛋白酶基因重排产物，回收酶切产物；用XhoI和Kpn I酶切实施例1制备的pBSST385载体，回收酶切产物。

2-6步骤采用同步骤二的操作。

上述的方法构建基因突变文库，重复三次，计算所得的平均转化率为10⁶个转化子/微克突变基因。

四、建立碱性蛋白酶基因突变库的传统方法

1、设计含有Xba I和Sph I酶切位点的引物对如下：

正向引物：5’-ATCGTCTAGCTGCCGGAAAAAGCAGTACAGA-3’；

反向引物：5’-CTAGGCATGTTATTGTGCAGCTGCTTGT-3’。

以枯草芽孢杆菌W168基因组DNA为模板，PCR扩增含Xba I和Sph I酶切位点的枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因。

3、含Xba I和Sph I酶切位点的碱性蛋白酶基因apr随机突变和基因重排同步骤一。

2、用Xba I和Sph I完全酶切碱性蛋白酶基因apr随机突变产物或基因重排产物，回收酶切产物；用Xba I和Sph I酶切pDG148-StuI质粒(购自美国芽孢遗传保藏中心(BGSC)，质粒菌编号：ECE148)，回收酶切产物。

3、切胶纯化酶切产物，用快速连接试剂盒(大连宝生物公司)连接1小时。

3、将步骤2得到的连接液转入枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中，涂布于含10μg/ml卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-14小时，挑取平板上的转化子进行筛选，保存突变子，即为用传统方法构建的碱性蛋白酶基因突变文库，将其保存于-80℃。

4、重复上述步骤三次，计算平均转化率为50个转化子/微克突变基因(见图8)。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体及其应用

<130>CGGNARY82115

<160>9

<210>1

<211>87

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>1

<210>2

<211>29

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>2

<210>3

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

<210>4

<211>1005

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

<210>5

<211>334

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

<210>6

(211>305

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>6

<210>7

<211>620

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

<210>8

<211>1059

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>8

<210>9

<211>352

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>9

Claims

1、一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，包括如下元件：分泌型信号肽的编码序列、枯草芽孢杆菌的复制起始蛋白的编码序列、枯草芽孢杆菌的启动子序列、大肠杆菌的复制起始序列。

2、如权利要求1所述的穿梭表达载体，其特征在于：所述分泌型信号肽为果聚糖蔗糖转移酶基因信号肽，所述枯草芽孢杆菌的复制起始蛋白为RepB蛋白、所述枯草芽孢杆菌的启动子序列为P43启动子序列、所述大肠杆菌的复制起始序列为pBR322序列。

3、如权利要求2所述的穿梭表达载体，其特征在于：所述果聚糖蔗糖转移酶基因信号肽是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质；

所述RepB蛋白具体可为如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

4、如权利要求3所述的穿梭表达载体，其特征在于：所述果聚糖蔗糖转移酶基因信号肽的编码序列为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

所述RepB蛋白的编码序列为如下4)或5)或6)的DNA分子：

4)其编码序列是序列表中序列4所示的DNA分子；

所述P43启动子序列为如下7)或8)的DNA分子：

7)其编码序列是序列表中序列6所示的DNA分子；

所述pBR322复制起始序列为如下9)或10)的DNA分子：

9)其编码序列是序列表中序列7所示的DNA分子；

10)与9)或限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA分子。

5、如权利要求1至4中任一所述的穿梭表达载体，其特征在于：所述载体还包括抗菌素编码基因和多克隆位点序列；所述多克隆位点序列与所述分泌型信号肽的编码序列相接，且位于所述分泌型信号肽的下游。

6、如权利要求5所述的穿梭表达载体，其特征在于：所述抗菌素编码基因为卡那霉素抗性基因和/或氨苄青霉素抗性基因。

7、如权利要求6所述的穿梭表达载体，其特征在于：所述穿梭表达载体自上游至下游依次包括以下元件：蔗糖酶信号肽的编码序列、多克隆位点序列、复制起始蛋白RepB的编码序列、卡那霉素抗性基因、P43启动子序列、氨苄青霉素抗性基因、pBR322复制起始序列；所述穿梭表达载体优选图1所示的重组表达载体。

8、权利要求1至7中任一所述穿梭表达载体在获得重组枯草芽孢杆菌中的应用。

9、一种建立蛋白质突变体基因库的方法，包括如下步骤：

1)对目的蛋白的编码基因进行突变；

2)将突变基因插入权利要求1至7中任一所述穿梭表达质粒中，得到重组质粒；

4)筛选含有所述突变基因的枯草芽胞杆菌，得到蛋白质突变体基因库。

10、如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述目的蛋白为酶或酶以外的蛋白质；所述酶为蛋白酶、淀粉酶、果胶酶或半乳糖酶；所述酶以外的蛋白质为抗体、细胞因子或生长因子；所述蛋白酶为碱性蛋白酶。