CN102002509A - 一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体及其应用，属于遗传工程领域。该大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，包含如下元件：枯草芽孢杆菌启动子序列、枯草芽孢杆菌信号肽的编码序列、人工设计的能被枯草芽孢识别的核糖体结合序列序列、人工设计的枯草芽孢杆菌信号肽酶的酶切位点、人工设计的多克隆位点、噬菌体终止子序列、枯草芽孢杆菌的复制起始序列、大肠杆菌的复制起始序列。本发明提供的载体既能在大肠杆菌中复制，又能在枯草芽孢杆菌中复制并表达，丰富了可用于枯草芽孢杆菌表达系统的载体；该载体首次使用B.subtilis脱乙酰几丁质酶信号肽，其引导分泌胞外蛋白的能力较强，报告基因为构巢曲霉果胶酸裂解酶基因，其胞外表达量达到600U/mL，高于果胶酸裂解酶基因使用其它载体时的表达水平。

Description

一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体及其应用

技术领域

本发明设计一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)穿梭表达载体及其应用，属于遗传工程领域。

背景技术

在食品工业用酶的表达研究和工业发酵生产中，用微生物表达系统重组表达食品用酶，具有广泛的应用前景。目前大肠杆菌表达系统和酵母表达系统具有方便的来源，多年来很多研究机构开发了多种系列的表达载体和表达宿主菌，而且在多方向对大肠杆菌表达系统和酵母表达系统进行改造。但是大肠杆菌表达系统的许多问题依然存在，如包含体的形成，大肠杆菌表达宿主菌的毒性问题。酵母表达系统表达系统因为能解决部分真核来源异源蛋白表达的翻译后修饰问题，具有独特的优越性，但酵母表达系统低表达效率的问题是其主要的缺陷。

枯草芽孢杆菌表达系统的主要的优点是：1)与革兰氏阴性菌相比，无内毒素，是GRAS，具有安全性。2)它有很多分泌信号肽，枯草杆菌作为表达系统宿主菌可为重组蛋白的分泌提供充分的可选择的分泌信号肽，使得目的蛋白的胞外表达成功效率更高，同时可以降低胞内包涵体的形成概率，提高重组酶正确折叠的效率。3)芽孢杆菌是很多食品用酶的来源菌，该类酶在芽孢杆菌表达系统中的表达效果应该更好，许多同源蛋白重组胞外表达的成功效率可以达到25g/L以上。

但目前枯草芽孢杆菌表达系统尚存在许多问题：

(Ⅰ)虽然许多枯草芽孢杆菌表达载体，已经被构建、改造和使用，但目前可供选择的和可以高效率表达的载体和宿主细胞种类仍然是有限的，可改造性差，其可选择性远低于大肠杆菌表达载体和酵母表达载体。

(Ⅱ)启动子的序列优化，RBS序列的优化，RBS序列和ATG之间的距离待于进一步改进。

(Ⅲ)质粒稳定性差，相对于大肠杆菌表达系统，枯草芽孢杆菌细胞在复制中容易丢失质粒。

(Ⅳ)信号肽对于重组蛋白的有效分泌，起着非常重要的作用，需要发现更加有效的信号肽和发现新的启动子与信号肽组合，使得分泌功能更强，降低包涵体的形成。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体。

本发明提供的表达载体，包括如下元件：人工设计的表达调控元件、枯草芽孢杆菌信号肽的编码序列、大肠杆菌的复制起始序列、抗生素抗性基因。

所述表达载体具有以下1)或2)所示的DNA序列；

1)DNA序列为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；

2)与1)限定的DNA序列具有90％以上同源性。

所述人工设计的表达调控元件由枯草芽孢杆菌P43启动子、枯草芽孢杆菌脱乙酰几丁质酶信号肽的编码序列CSN、F1噬菌体的终止子序列，人工设计的能被枯草芽孢识别的核糖体结合序列序列RSB、人工设计的枯草芽孢杆菌信号肽酶的酶切位点、人工设计的多克隆位点MCS组成。

所述表达调控元件DNA序列如以下3)或4)或5)所示；

3)其DNA序列为SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；

4)在严格条件下与3)限定的DNA序列能够杂交且能促进目的基因转录和翻译的DNA序列；

5)与3)或4)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且能促进目的基因转录和翻译的DNA序列。

所述抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。

所述表达载体的出发载体为pMA5。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供所述表达的载体的应用。

所述表达载体在构建转基因细胞系中的应用。

所述表达载体在构建基因工程菌株中的应用。

所述表达载体促进在目的基因转录和翻译中的应用。

本发明提供的载体既能在大肠杆菌中复制，又能在枯草芽孢杆菌中复制并表达，丰富了可用于枯草芽孢杆菌表达系统的载体；该载体首次使用B.subtilis脱乙酰几丁质酶信号肽，其引导分泌胞外蛋白的能力较强，报告基因为构巢曲霉果胶酸裂解酶基因，其胞外表达量达到600U/mL，远高于果胶酸裂解酶基因使用其它载体时的表达水平。

附图说明

图1表达调控元件模型(P43/CSN/F1T)

图2P43PCR电泳图

图3RBS-CSN-MCS-6His-TAATAA(B)合成电泳图

图4P43-RBS-CSN-MCS-6His-TAATAA合成电泳图

图5pBSCWZ表达载体物理图谱

具体实施方式

实施例1表达调控元件的设计

选用B.subtilis P43启动子，来自B.subtilis chitosanase的信号肽(CSN)，使用来自F1噬菌体的终止子序列，根据B.subtilis核糖体序列设计的RBS序列，通过比较分析多种蛋白中的B.subtilis信号肽酶切位点特征设计信号肽酶酶切位点，选用五种酶切位点构成MCS。该套表达调控元件全序列见SEQ ID No.2，该序列组成模型见图1。

实施例2表达载体的构建

1、表达调控元件的合成

由于该表达调控元件不是连续来自于一个模板，而且其部分序列是完全人工设计，故采用人工重叠PCR技术。首先提取B.subtilis的基因组DNA，通过PCR1程序(用zqxP43S和zqxP43AS做引物，B.subtilis的基因组DNA为模板，Tm＝55℃)，合成P43启动子(记为A，图2)。

然后化学合成7个34-65bp长的寡核苷酸序列(见表1)，通过重叠PCR2程序(以zqxrsmS1，zqxrsmS2、zqxrsmS3、zqxrsmAs1、zqxrsmAs2、zqxrsmAs3、zqxrsmAs4为模板，zqxrsmS1和zqxrsmAs4做引物，Tm＝50℃)，得到RSB-CSN-MCS-6His tag-TAATGA片段(记为B，图3)。

最后，通过PCR3程序(以A和B为模板，以zqxP43S和zqxrsmAs4为引物，Tm＝68℃)，得到完整的表达调控元件P43/CSN/F1T中的P43/CSN(图4)片段。切胶回收P43/CSN DNA与pMD18T载体连接，转化JM109，转化产物涂布含100ug/mL氨苄青霉素的LB平板，经过37℃培养过夜，挑选单克隆转化子，经过菌落PCR鉴定，质粒酶切鉴定和测序鉴定，表明合成预期表达调控元件DNA的全长为454bp，测定的序列和设计序列完全相同。

表1合成的寡核苷酸序列和引物

zqxP34S	ATTAATTGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTG(VspI)
		zqxP34AS	GTTTTTCATATGTCCTCCTTACTATAATGGTACCGCTATCACT
zqxrsmS1	TAAGGAGGACATATGAAAAACATGTCTTGCAAACTTGTTGTATCAGTCAC
		zqxrsmS2	TCTGTTTTTCAGTTTTCTCACCATAGGCCCTCTCGCTCATGCGGCCGAATTCGTCGACCC3
zqxrsmS3	CGGGAAGCTTGCGGCCGCGATATCTCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGATAAGGATCC
		zqxrsmAs1	GCAAGACATGTTTTTCATATGTCCTCCTTA
zqxrsmAs2	GGGCCTATGGTGAGAAAACTGAAAAACAGAGTGACTGATACAACAAGTTT
		zqxrsmAs3	TCGCGGCCGCAAGCTTCCCGGGGTCGACGAATTCGGCCGCATGAGCGAGA
zqxrsmAs4	ATTAAT GGATCCTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTG CTCG

2、表达载体的构建

携带表达调控元件P43/CSN的载体是pMA5(Dartois V，CoppMe JY，Colson C，Baulard A.Genetic analysis and overexpression of lipolytic activity in Bacillus subtilis.Appl EnvironMicrobiol，1994，60：1670-1673.)，该载体是用pUB110(Keggins KM，Lovett PS，Duvall EJ.Molecular cloning of genetically active fragments of Bacillus DNA in Bacillus subtilis andproperties ofthe vector plasmid pUB110.Proc Natl Acad Sci U S A.1978，75：1423-1427.)和pUC18(Messing J.New M13 vectors for cloning.Methods Enzymol.，1983，101：20-78.)构建的，pMA5载体本身携带大肠杆菌的复制位点和在大肠杆菌表达的AMP抗性基因，该载体还携带B.suntilis识别的DNA复制位点rep和在B.suntilis中可表达的Kana抗性基因。合成的表达调控元件DNA二端含有VspI的切点，VspI与NdeI(pMA5载体的NdeI下游带有噬菌体F1的终止子序列)是同尾酶，所以用VspI消化表达调控元件P43/CSN DNA-PMD18T质粒，得到的片段与NdeI消化的PMA5片段相连，得到表达调控元件P43/CSN/F1T-pMA5表达载体，命名为pBSCWZ(图5)，表达调控元件的序列如SEQ ID NO.2所示，或在严格条件下(Tm-10～15℃)与SEQ ID NO.1限定的DNA序列能够杂交且能促进目的基因转录和翻译的DNA序列，或与SEQ ID NO.1限定的DNA序列高于90％同源性且能促进目的基因转录和翻译的DNA序列；pBSCWZ载体序列为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或与SEQ ID NO.1限定的DNA序列具有90％以上同源性的DNA序列。

实施例3表达调控元件的酶切位点的分析

通过酶切分析和测序分析确认该载体MCS中的NdeI，SalI，NotI，XhoI，BamHI可以作为基因的插入位点，NdeI后要带CSN信号肽编码序列，BamHI前有6His编码序列。

实施例4表达载体用于报告基因的表达

果胶酸裂解酶能够降解果胶酸，因此在果胶降解过程中，果胶酸裂解酶起着重要的作用。果胶酸裂解酶以β-消旋机制裂解果胶，其产物的非还原端残基的C4-C5之间会形成不饱和双键。根据NCBI核酸数据库中米曲霉(Aspergillus oryzae)果胶酸裂解酶(pectate lyase，PelA)基因不含信号肽的cDNA序列(NCBI accession number：EF452421)设计特异引物对

S1：5′-GTCGACTCACCTGCGCCGGACCTC-3′(下划线为Sal I切点)；

S2：5′-GCGGCCGCTCACCTGCGCCGGACCTC-3′(下划线为Not I点)。使用高保真的PfuUltraTM DNA聚合酶(Stratagene)、上述特异引物和米曲霉基因组为模板通过扩增得到不含信号肽的pela cDNA；然后将pela cDNA序列连接到pMD 18T Vector(TaKaRa)，构建pela-pMD 18T1质粒转化DH5α，得到pela-pMD 18T-DH5α阳性转化子；用限制性内切酶Sal I和Not I将不含信号肽的pela cDNA片段从pela-pMD 18T上切下，连接到pBSCWZ表达载体上，转化B.subtilis WB600细胞，得到pela-pBSCWZ-B.subtilis WB600转化子。

将pela-pBSCWZ-B.subtilis WB600，再在100g/mL Kana的LB平板，经过37℃培养过夜，经过菌落PCR鉴定，得到单克隆转化子pela-pBSCWZ-B.subtilis WB600。将pela-pBSCWZ-B.subtilis WB600接种在TB培养基(甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K₂HPO₄ 12.54g/L，KH₂PO₄ 2.31g/L)中37℃液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基37℃培养6h时产酶达400U/mL，摇瓶发酵的酶活产率为600U/mL，所得酶活均为未优化发酵条件的数据。

PelA酶活性检测的反应体系为：0.5mL反应液，内含50mM AcNa(pH 5.0)，0.1％果胶酸酯和适量的PelA，在50℃反应10min。反应结束后，加1ml 0.02mol HCl终止反应，然后在235nm检测光吸收值的变化。一个酶活单位定义为每min释放的1μmol不饱和半乳糖醛酸的酶量。在235nm，不饱和半乳糖醛酸光吸收系数为5200M^-1cm^-1。

核苷酸序列表

<110>江南大学

 

<120>一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体及其应用

 

<160>2

 

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>7670

<212>DNA

<213>pBSCWZ

 

<400>1

tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt    60

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ttagtaatta tcatggctgt catggcgcat taacggaata aagggtgtgc ttaaatcggg    6660

ccattttgcg taataagaaa aaggattaat tatgagcgaa ttgaattaat aataaggtaa    6720

tagatttaca ttagaaaatg aaaggggatt ttatgcgtga gaatgttaca gtctatcccg    6780

gcattgccag tcggggatat taaaaagagt ataggttttt attgcgataa actaggtttc    6840

actttggttc accatgaaga tggattcgca gttctaatgt gtaatgaggt tcggattcat    6900

ctatgggagg caagtgatga aggctggcgc tctcgtagta atgattcacc ggtttgtaca    6960

ggtgcggagt cgtttattgc tggtactgct agttgccgca ttgaagtaga gggaattgat    7020

gaattatatc aacatattaa gcctttgggc attttgcacc ccaatacatc attaaaagat    7080

cagtggtggg atgaacgaga ctttgcagta attgatcccg acaacaattt gattagcttt    7140

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tacactagaa aaccgaaaga caataaaaat tttattcttg ctgagtctgg ctttcggtaa    7320

gctagacaaa acggacaaaa taaaaattgg caagggttta aaggtggaga ttttttgagt    7380

gatcttctca aaaaatacta cctgtccctt gctgattttt aaacgagcac gagagcaaaa    7440

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agaaaggtct taaaggtttt atggttttgg tcggcactgc cgacagcctc gcagagcaca    7560

cactttatga atataaagta tagtgtgtta tactttactt ggaagtggtt gccggaaaga    7620

gcgaaaatgc ctcacatttg tgccacctaa aaaggagcga tttacataat               7670

 

<210>2

<211>464

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>根据基因序列设计，用于调控表达。

<400>2

attaattgat aggtggtatg ttttcgcttg aacttttaaa tacagccatt gaacatacgg    60

ttgatttaat aactgacaaa catcaccctc ttgctaaagc ggccaaggac gctgccgccg    120

gggctgtttg cgtttttgcc gtgatttcgt gtatcattgg tttacttatt tttttgccaa    180

agctgtaatg gctgaaaatt cttacattta ttttacattt ttagaaatgg gcgtgaaaaa    240

aagcgcgcga ttatgtaaaa tataaagtga tagcggtacc attatagtaa ggaggacata    300

tgaaaaacat gtcttgctaa cttgttgtat cagtcactct gtttttcagt tttctcacca    360

taggccctct cgctcatgcg gccgaattcg tcgaccccgg gaagcttgcg gccgcgatat    420

ctctcgagca ccaccaccac caccactaat aaggatccat taat                     464

Claims (9)

1.一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，包括如下元件：人工设计的表达调控元件、枯草芽孢杆菌信号肽的编码序列、大肠杆菌的复制起始序列、抗生素抗性基因。

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于其DNA序列如以下1)或2)所示；

1)DNA序列为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；

2)与1)限定的DNA序列具有90％以上同源性。

3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述人工设计的表达调控元件由枯草芽孢杆菌P43启动子、枯草芽孢杆菌脱乙酰几丁质酶信号肽的编码序列CSN、F1噬菌体的终止子序列，人工设计的能被枯草芽孢识别的核糖体结合序列序列RSB、人工设计的枯草芽孢杆菌信号肽酶的酶切位点、人工设计的多克隆位点MCS组成。

4.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于所述表达调控元件DNA序列如以下3)或4)或5)所示；

3)其DNA序列为SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；

4)在严格条件下与3)限定的DNA序列能够杂交且能促进目的基因转录和翻译的DNA序列；

5)与3)或4)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且能促进目的基因转录和翻译的DNA序列。

5.根据权利要求1-4任一所述的表达载体，其特征在于所述抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。

6.根据权利要求1-4任一所述的表达载体，其特征在于所述表达载体的出发载体为pMA5。

7.含有权利要求1-4任一所述表达载体的转基因细胞系。

8.含有权利要求1-4任一所述表达载体的基因工程菌株。

9.权利要求1-4任一所述表达载体在促进在目的基因转录和翻译中的应用。

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