JP5659143B2 - 細菌性細胞中の遺伝子座を増幅する方法 - Google Patents
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Description
外因性のポリペプチドの発現及び組み換え体生産は広く用いられている技術である。大量の所望ポリペプチドの発現及び生産のための外因性の目的ポリペプチドをコードする核酸により、細胞を形質転換可能なことはよく知られている。いくつかの適用において、前記方法は、基となる生物により自然に生産されるポリペプチド以上の莫大な量のポリペプチドを生産するために使用される。実際は、内因性の配列の過剰発現と同様に外因性の核酸配列の発現も、現代のバイオテクノロジーにおいて広範囲に用いられている。
別途記載のない限り、本明細書で用いられる全ての技術及び科学上の用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるものと同様の意味を持つ。本明細書に記載の方法及び材料と同様のまたは同等の方法及び材料が本発明の実施または試験のために使用されるが、好ましい方法及び材料が本明細書に記載される。
上述のように、ゲノム遺伝子座を増幅する方法が提供される。本発明に係る方法のいくつかの一般的な特徴が、図1で示される。図1に関して、前記方法で使用される細菌性宿主細胞は、構造A1−P−M−A2の増幅単位を含むゲノム遺伝子座を含むことが出来る。ここで、A1とA2は繰り返し配列であり、Pは目的ポリペプチドのコーディング配列を含み、Mは細胞に必須である酵素のコーディング配列を含む。式A1−P−M−A2は、P及びMに関する一方の方向に配向する繰り返し配列を含むゲノム遺伝子座を包含することが意図される。
taaagtagcggttatcgacagcggtatcgattcttctcatcctgatttaaaggtagcaggcggagccagcatggttccttctgaaacaaatcctttccaagacaacaactctcacggaactcacgttgccggcacagttgcggctcttaataactcaatcggtgtattaggcgttgcgccaagcgcatcactttacgctgtaaaagttctcggtgctgacggttccggccaatacagctggatcattaacggaatcgagtgggcgatcgcaaacaatatggacgttattaacatgagcctcggcggaccttctggttctgctgctttaaaagcggcagttgataaagccgttgcatccggcgtcgtagtcgttgcggcagccggtaacgaaggcacttccggcagctcaagcacagtgggctaccctggtaaatacccttctgtcattgcagtaggcgctgttgacagcagcaaccaaagagcatctttctcaagcgtaggacctgagcttgatgtcatggcacctggcgtatctatccaaagcacgcttcctggaaacaaatacggcgcgttgaacggtacatcaatggcatctccgcacgttgccggagcggctgctttgattctttctaagcacccgaactggacaaacactcaagtccgcagcagtttagaaaacaccactacaaaacttggtgattctttctactatggaaaagggctgatcaacgtacaggcggcagctcagtaaaacataaaaaaccggccttggccccgccggttttttattatttttcttcctccgcatgttcaatccgctccataatcgacggatggctccctctgaaaattttaacgagaaacggcgggttgacccggctcagtcccgtaacggccaagtcctgaaacgtctcaatcgccgcttcccggtttccggtcagctcaatgccgtaacggtcggcggcgttttcctgataccgggagacttttcgttagacat
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ここで、反復単位A1及びA2は下線で示し、目的タンパク質、すなわち、ズブチリシンFNAをコードするポリヌクレオチド配列は太字で示す。また、必須酵素、例えば、アラニンラセマーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、イタリック体で示す。プロモーター配列は、太字の大文字で示す。
上述のように、前記増幅単位は、目的ポリペプチドの発現及び必須酵素の発現を提供する。そのため、前記増幅単位は一般に、少なくとも2個の発現カセットを含む。すなわち、目的ポリペプチドの発現に用いられる第1発現カセット及び必須酵素の発現に用いられる第2発現カセットである。各発現カセットは、操作可能な連結でプロモーター、コーディング配列及びターミネーターを含む。所定の場合において、前記増幅単位の領域Pは第1発現カセットを含むことができ、また前記増幅単位の領域Mは第2発現カセットを含むことが出来る。他の場合において、また上述のように、領域Pに隣接する繰り返し配列は、領域Pのコーディング配列と操作可能に連結するプロモーターを含むことが出来る。所定の場合において、前記領域Pの隣接ヌクレオチド配列及び前記領域Pに隣接する繰り返し配列は、宿主細胞に内因性である(すなわち、宿主細胞のゲノムに存在する)ことが出来る。特定の実施態様において、領域Mのコーディング配列は、領域Pのプロモーターと操作可能に連結することが出来る。
第1発現カセットは、プロモーター及び目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド(すなわち、コーディング配列)を含むことが出来る。ここで、前記単離された核酸がポリヌクレオチドの転写及び目的タンパク質の生産を引き起こすように、前記プロモーター及びポリヌクレオチドは操作可能に連結される。
VRSKKLWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQAAGKSNGEKKYIVGFKQTMSTMSAAKKKDVISEKGGKVQKQFKYVDAASATLNEKAVKELKKDPSVAYVEEDHVAHAYAQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGALNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ (配列番号8)である。ズブチリシンのプレ・プロ(pre−pro)領域はイタリック体で示され、成熟領域は太字で示される(配列番号12)。FNAをコードするポリヌクレオチドの一例は、
gtgagaagcaaaaaattgtggatcagtttgctgtttgctttagcgttaatctttacgatggcgttcggcagcacatcctctgcccaggcggcagggaaatcaaacggggaaaagaaatatattgtcgggtttaaacagacaatgagcacgatgagcgccgctaagagaaagatgtcatttctgaaaaaggcgggaaagtgcaaaagcaattcaaatatgtagacgcagcttcagctacattaaacgaaaaagctgtaaaagaattgaaaaaagacccgagcgtcgcttacgttgaagaagatcacgtagcacatgcgtacgcgcagtccgtgccttacggcgtatcacaaattaaagcccctgctctgcactctcaaggctacactggatcaaatgttaaagtagcggttatcgacagcggtatcgattcttctctcctgatttaaaggtagcaggcggagccagcatggttccttctgaaacaaatcctttccaagacaacaactctcacggaactcacgttgccggcacagttgcggctcttaataactcaatcggtgtattaggcgttgcgccaagcgcatcactttacgctgtaaaagttctcggtgctgacggttccggccaatacagctggatcattaacggaatcgagtgggcgatcgcaaacaatatggacgttattaacatgagcctcggcggaccttctggttctgctgctttaaaagcggcagttgataaagccgttgcatccggcgtcgtagtcgttgcggcagccggtaacgaaggcacttccggcagctcaagcacagtgggctaccctggtaaatacccttctgtcattgcagtaggcgctgttgacagcagcaaccaaagagcatctttctcaagcgtaggacctgagcttgatgtcatggcacctggcgtatctatccaaagcacgcttcctggaaacaaatacggcgcgttgaacggtacatcaatggcatctccgcacgtt
gccggagcggctgctttgattctttctaagcacccgaactggacaaacactcaagtccgcagcagtttagaaaacaccactacaaaacttggtgattctttctactatggaaaagggctgatcaacgtacaggcggcagctcagtaa (配列番号9)である。
第2発現カセットは、必須酵素の発現を提供する。ここで、上述のように、必須酵素は細胞増殖に用いられる細胞で必要とされる。特定の実施態様において、前記必須酵素は、所定の条件下(例えば、必須酵素のいかなる損失も取消す外因性化合物が欠失する等)でのみ細胞増殖に必要とされる、条件付きで必須とされることが出来る。所定の場合において、条件的に必須な酵素(それは酵素をコードする遺伝子の不活性化によるか、または細胞を酵素の阻害剤と接触させることにより作られてもよい)の活性を欠く細胞は、外因性化合物を加えることにより培養中で増殖することが出来る。前記外因性化合物は、所定の場合において酵素または代替炭素源の生産物であることが出来る。従って、所定の場合において、第2発現カセット内で使用される前記必須酵素は、細胞内で不在の場合に、細胞を特定の化合物に対して栄養要求的にするか、1以上の特定の炭素源を利用できなくする酵素であることが出来る。
ccgct gccgttaaag aatctaatgg tccactgcgc gaacagcgcc gctggactcc ggctgaaaaa aggctttttt aatgcagtca gattcggcat cggcatgtat ggccttcgcc cgtctgctga catgtcggac gagataccgt ttcagctgcg tccggcattt accctgcatt cgacactgtc acatgtcaaa ctgatcagaa aaggcgagag cgtcagctac ggagccgagt acacagcgga aaaagacaca tggatcggga cggtgcctgt aggctatgcg gacggctggc tccgaaaatt gaaagggacc gacatccttg tgaagggaaa acgcctgaaa attgccggcc gaatttgcat ggaccaattt atggtggagc tggatcagga atatccgccg ggcacaaaag tcacattaat aggccggcag ggggatgaat atatttccat ggatgagatt gcaggaaggc tcgaaaccat taactatgag gtggcctgta caataagttc ccgtgttccc cgtatgtttt tggaaaatgg gagtataatg gaagtaagaa atcctttatt gcaggtaaat ataagcaatt aa (配列番号10)である。前記ポリヌクレオチドは、D−アラニンラセマーゼ
MSTKPFYRDTWAEIDLSAIKENVSNMKKHIGEHVHLMAVVKANAYGHGDAETAKAALDAGASCLAVAILDEAISLRKKGLKAPILVLGAVPPEYVAIAAEYDVTLTGYSVEWLQEAARHTKKGSLHFHLKVDTGMNRLGVKTEEEVQNVMAILDRNPRLKCKGVFTHFATADEKERGYFLMQFERFKELIAPLPLKNLMVHCANSAAGLRLKKGFFNAVRFGIGMYGLRPSADMSDEIPFQLRPAFTLHSTLSHVKLIRKGESVSYGAEYTAEKDTWIGTVPVGYADGWLRKLKGTDILVKGKRLKIAGRICMDQFMVELDQEYPPGTKVTLIGRQGDEYISMDEIAGRLETINYEVACTISSRVPRMFLENGSIMEVRNPLLQVNISN (配列番号11)をコードする。
本明細書で用いられる細菌性宿主細胞は、グラム陽性菌またはグラム陰性菌になり得、バチルス種細菌、例えば、バチルス・クラウジイ、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・シルクランス、バチルス・コアグランス、バチルス・ラウタス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステロサーモフィラス、バチルス・ズブチリスまたはバチルス・チューリンゲンシス細菌等、ストレプトミセス種細菌、例えば、S.リビダンス、S.カルボフィラス、S.ヘルバチカス、S.ルビギノサスまたはS.ムリナス細菌等、シュードモナス種細菌及び大腸菌を含むが、それらに限られない。特定の場合において、前記細菌性宿主細胞は、、GRAS状態、すなわち、通常FDAにより安全であると認識される状態にある、タンパク質の生産に利用される使用歴のある株の細胞とすることが出来る。
上記の細胞を用いた方法も提供される。所定の実施態様において、本発明に係る方法は、細胞の集団を培養し、第1発現カセットによりコードされる目的タンパク質を生産する工程を含む。所定の実施態様において、また上述するように、前記目的タンパク質は培養地へ分泌されることが出来る。前記方法の特定の実施態様は、培養地から目的タンパク質を回収する工程を含む。
以下の実施例は、本発明の所定の好ましい実施態様及び側面を実証及びさらに例証するために提供され、それらの範囲を限定するように解釈されない。
DNAの操作に使用した実験技術は、分子生物学の分野では標準的技術であった(Sambrook他、分子クローニング:ラボラトリーマニュアル(Molecular cloning:A Laboratory Manual))。プラスミドを調製し、挿入断片をキアゲン・キット(キアゲン社)を用いて精製した。制限エンドヌクレアーゼ及び他の酵素を、ロッシュ・アプライド・サイエンス(インディアナポリス、インディアナ州)から購入し、メーカーが推奨するように用いた。Ferrari E.及びB.Miller(バチルスの発現:遺伝子発現系におけるグラム陽性型:発現分野の性質の利用(Bacillus expression:a Gram−Positive Model.In Gene Expression Systems:Using Nature for the Art of Expression.)、1999年、アカデミックプレス、ニューヨーク州)で説明されるように、コンピテントB.ズブチリス細胞を調製した。
ズブチリシンの定量を、従前に説明されるように(Estell,D.V.、Graycar,T.P.、Wells, J.A.、1985年、J.Biol.Chem.、第260巻、6518−6521頁)、1.6mM N−スクシニル−L−Ala−L−Ala−L−Pro−L−Phe−p−ニトロアニリド(ベガ・バイオケミカルズ)を含む0.1Mトリス緩衝液、pH8.6中で行った。前記定量では、p−ニトロアニリンの放出による410nm/分での吸収の増加を測定した。定量を、初速度条件下で行った。プロテアーゼ単位は、410nmでの吸光度を増加させるプロテアーゼ酵素の量として定義される。前記量は、25℃で、1cmのビーム路程があるキュベット内の上述する標準液の分当たりの1吸光度単位(AU)により、定義される。
大腸菌MM294:endA thiA hsdR17 supE44
バチルス・ズブチリス株BG2190(alr−)及びBG2189(alr−CmR)は、Ferrari及びYang(バチルス・ズブチリス由来のアラニンラセマーゼ遺伝子の単離及びB.ズブチリス内のプラスミド維持のためのその用途(Isolation of an alanine racemase gene from Bacillus subtilis and its use for plasmid maintenance in B. subtilis.)、Biotechnology、第3巻、1003−1007頁、1985年)で説明されている。
B.ズブチリス株BG3594comK:この株は、WO02/14490で説明されるようなxylR−PxylA−comK構成を含むB.ズブチリスBG3594である。前記構成は、この株がスーパーコンピテント(すなわち、細胞集団の1%以上は染色体バチルスDNAと形質転換可能である)に作成されることを可能にする。
pDALsub1は、Ferrari他、1985年で説明されている。このプラスミドは、alrを発現する(Ferrari及びYang、Biotechnology、第3巻、1003−1007頁、1985年)。
LB及びLB寒天(LA)を、Ausubel,F.M.他編集、「分子生物学における最新プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」、John Wiley and Sons出版、1995年で説明されるように調製した。LBG1%は、10g/lグルコースが補給されたLBである。LBSMは、1.6%スキムミルクが補給されたLB寒天である。プロテアーゼ生産の研究のために用いられるFNII培地は、WO05052146A2で説明される。Alr−株は、LB寒天+100mg/L D−アラニン上で増殖される。
生産される目的ポリペプチド(例えば、ズブチリシン)をコードする遺伝子のコピー数を定量するqPCRを、ABIプリズム7000シークエンス・ディテクション・システム(ABI Prism 7000 Sequence Detection System)(アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア州)で行った。TaqMan(登録商標)遺伝子発現マスター・ミックス・キット(TaqMan(登録商標) Gene Expression Master Mix kit)を、メーカー(アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア州)が指示するように用いた。
試験する株を、37℃及び250rpmで、10mlチューブ中の5mlのLBG1%で増殖した。約1以下のOD600において、2.5mlの培養地を、250mlエルレンマイアー振盪フラスコ内の25mlのFNII培地に植菌するために用いた。37℃及び250rpmで、前記振盪フラスコを保温し、培養液サンプルを、ズブチリシン活性の測定のために規則的に採取した。
バチルス・ズブチリスBG3594及びBG3594,pDALsub1のβ−クロロ−D−アラニン(CDA)への感受閾値の測定
第1段階において、B.ズブチリスの増殖の阻害に必要なβ−クロロ−D−アラニン(CDA)の濃度を、異なる濃度のCDAを含むLB寒天プレート上にLB増殖株BG3594の稀釈液をプレートすることにより測定した。表1で示すように、BG3594は、20mg/Lの濃度でも増殖可能であるが、50mg/Lの濃度では完全に増殖は阻害される。第2段階において、pDalsub1をBG3594に転換し、alrの過剰発現が阻害濃度のCDAでの細胞の増殖を回復出来るか判定した。表1で示すように、alr表現プラスミドの存在は、試験する全てのCDA濃度での増殖を可能にする。この結果は、増幅が起こる場合のみ、染色体にコードされた発現カセット「目的ポリペプチド−alr」を含む株が、20mg/Lを超えるCDA濃度で増殖することが出来ることを示す。CDAの代わりに、シクロセリンのような他のアラニンラセマーゼ阻害剤を用いることも出来る。
染色体にコードされた発現カセット「目的ポリペプチド・マーカー」を含む株の構築(株BG4010(comK)及びBG4020)
プラスミドpBSFNAalr(配列番号2)を、pBSFNACm(配列番号1)から以下のように構築した。特有のプロモーターを有するB.ズブチリスalr遺伝子を、鋳型としての染色体DNAを用いて、PCR増幅した。使用したプライマーは、EcoRIDrdIalrF(DrdI部位を有する、gaagaattcg actaggttgt cttttcgtta gacatcgttt ccctttagc、配列番号3)及びSmaI−alrR(SmaI部位を有する、ggttcccggg ttaattgctt atatttacct gcaataaagg、配列番号4)であった。PCR生産物を、DrdI/SmaIで消化し、BsmI/StuI−消化pBSFNACmのより大きな断片と再連結した。連結体を、大腸菌株MM294内に形質転換し、カルベニシリン50ppm上にプレートした。この形質転換体からの4個のコロニーを、プラスミド精製のために5ml LB+カルベニシリン50ppmに植菌した。得られた構成物を、pBSFNAalr(配列番号2)とした。
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
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gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca 660
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cttctgctat caaaataaca gactcgtgat tttccaaacg agctttcaaa aaagcctctg 780
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gtagcacatg cgtacgcgca gtccgtgcct tacggcgtat cacaaattaa agcccctgct 1680
ctgcactctc aaggctacac tggatcaaat gttaaagtag cggttatcga cagcggtatc 1740
gattcttctc atcctgattt aaaggtagca ggcggagcca gcatggttcc ttctgaaaca 1800
aatcctttcc aagacaacaa ctctcacgga actcacgttg ccggcacagt tgcggctctt 1860
aataactcaa tcggtgtatt aggcgttgcg ccaagcgcat cactttacgc tgtaaaagtt 1920
ctcggtgctg acggttccgg ccaatacagc tggatcatta acggaatcga gtgggcgatc 1980
gcaaacaata tggacgttat taacatgagc ctcggcggac cttctggttc tgctgcttta 2040
aaagcggcag ttgataaagc cgttgcatcc ggcgtcgtag tcgttgcggc agccggtaac 2100
gaaggcactt ccggcagctc aagcacagtg ggctaccctg gtaaataccc ttctgtcatt 2160
gcagtaggcg ctgttgacag cagcaaccaa agagcatctt tctcaagcgt aggacctgag 2220
cttgatgtca tggcacctgg cgtatctatc caaagcacgc ttcctggaaa caaatacggc 2280
gcgttgaacg gtacatcaat ggcatctccg cacgttgccg gagcggctgc tttgattctt 2340
tctaagcacc cgaactggac aaacactcaa gtccgcagca gtttagaaaa caccactaca 2400
aaacttggtg attctttcta ctatggaaaa gggctgatca acgtacaggc ggcagctcag 2460
taaaacataa aaaaccggcc ttggccccgc cggtttttta ttatttttct tcctccgcat 2520
gttcaatccg ctccataatc gacggatggc tccctctgaa aattttaacg agaaacggcg 2580
ggttgacccg gctcagtccc gtaacggcca agtcctgaaa cgtctcaatc gccgcttccc 2640
ggtttccggt cagctcaatg ccgtaacggt cggcggcgtt ttcctgatac cgggagacgg 2700
cattcgtaat cggatcctct agagtcgatt tttacaagaa ttagctttat ataatttctg 2760
tttttctaaa gttttatcag ctacaaaaga cagaaatgta ttgcaatctt caactaaatc 2820
catttgattc tctccaatat gacgtttaat aaatttctga aatacttgat ttctttgttt 2880
tttctcagta tacttttcca tgttataaca cataaaaaca acttagtttt cacaaactat 2940
gacaataaaa aaagttgctt tttccccttt ctatgtatgt tttttactag tcatttaaaa 3000
cgatacatta ataggtacga aaaagcaact ttttttgcgc ttaaaaccag tcataccaat 3060
aacttaaggg taactagcct cgccggcaat agttaccctt attatcaaga taagaaagaa 3120
aaggattttt cgctacgctc aaatccttta aaaaaacaca aaagaccaca ttttttaatg 3180
tggtctttat tcttcaacta aagcacccat tagttcaaca aacgaaaatt ggataaagtg 3240
ggatattttt aaaatatata tttatgttac agtaatattg acttttaaaa aaggattgat 3300
tctaatgaag aaagcagaca agtaagcctc ctaaattcac tttagataaa aatttaggag 3360
gcatatcaaa tgaactttaa taaaattgat ttagacaatt ggaagagaaa agagatattt 3420
aatcattatt tgaaccaaca aacgactttt agtataacca cagaaattga tattagtgtt 3480
ttataccgaa acataaaaca agaaggatat aaattttacc ctgcatttat tttcttagtg 3540
acaagggtga taaactcaaa tacagctttt agaactggtt acaatagcga cggagagtta 3600
ggttattggg ataagttaga gccactttat acaatttttg atggtgtatc taaaacattc 3660
tctggtattt ggactcctgt aaagaatgac ttcaaagagt tttatgattt atacctttct 3720
gatgtagaga aatataatgg ttcggggaaa ttgtttccca aaacacctat acctgaaaat 3780
gctttttctc tttctattat tccatggact tcatttactg ggtttaactt aaatatcaat 3840
aataatagta attaccttct acccattatt acagcaggaa aattcattaa taaaggtaat 3900
tcaatatatt taccgctatc tttacaggta catcattctg tttgtgatgg ttatcatgca 3960
ggattgttta tgaactctat tcaggaattg tcagataggc ctaatgactg gcttttataa 4020
tatgagataa tgccgactgt actttttaca gtcggttttc taatgtcact aacctgcccc 4080
gttagttgaa gaaggttttt atattacagc tccagatcca tatccttctt tttctgaacc 4140
gacttctcct ttttcgcttc tttattccaa ttgctttatt gacgttgagc ctcggaaccc 4200
ttaacaatcc caaaacttgt cgaatggtcg gcttaatagc tcacgctatg ccgacattcg 4260
tctgcaagtt tagttaaggg ttcttctcaa cgcacaataa attttctcgg cataaatgcg 4320
tggtctaatt tttattttta ataaccttga tagcaaaaaa tgccattcca atacaaaacc 4380
acatacctat aatcgaccgg aattaattct ccattttctt ctgctatcaa aataacagac 4440
tcgtgatttt ccaaacgagc tttcaaaaaa gcctctgccc cttgcaaatc ggatgcctgt 4500
ctataaaatt cccgatattg gttaaacagc ggcgcaatgg cggccgcatc tgatgtcttt 4560
gcttggcgaa tgttcatctt atttcttcct ccctctcaat aattttttca ttctatccct 4620
tttctgtaaa gtttattttt cagaatactt ttatcatcat gctttgaaaa aatatcacga 4680
taatatccat tgttctcacg gaagcacacg caggtcattt gaacgaattt tttcgacagg 4740
aatttgccgg gactcaggag catttaacct aaaaaagcat gacatttcag cataatgaac 4800
atttactcat gtctattttc gttcttttct gtatgaaaat agttatttcg agtctctacg 4860
gaaatagcga gagatgatat acctaaatag agataaaatc atctcaaaaa aatgggtcta 4920
ctaaaatatt attccatcta ttacaataaa ttcacagaat agtcttttaa gtaagtctac 4980
tctgaatttt tttatcaagc ttatcgatac cgtcgacctc gagggggggc ccggtaccca 5040
gcttttgttc cctttagtga gggttaattg cgcgcttggc gtaatcatgg tcatagctgt 5100
ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa 5160
agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac 5220
tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 5280
cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 5340
gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 5400
ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 5460
ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 5520
atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 5580
aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 5640
gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 5700
ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 5760
ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 5820
acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 5880
gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 5940
ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 6000
ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 6060
gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 6120
ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 6180
agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 6240
ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 6300
gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 6360
catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat 6420
cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg 6480
cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata 6540
gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta 6600
tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt 6660
gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 6720
tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 6780
gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 6840
gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 6900
taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 6960
tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 7020
ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 7080
taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 7140
tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 7200
aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccac(配列番号1) 7239
pBSFNAalr(配列番号2)
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca 660
ccgcggtggc ggccgctcta gaactagtgg atcccccggg ctgcaggaat tctccatttt 720
cttctgctat caaaataaca gactcgtgat tttccaaacg agctttcaaa aaagcctctg 780
ccccttgcaa atcggatgcc tgtctataaa attcccgata ttggttaaac agcggcgcaa 840
tggcggccgc atctgatgtc tttgcttggc gaatgttcat cttatttctt cctccctctc 900
aataattttt tcattctatc ccttttctgt aaagtttatt tttcagaata cttttatcat 960
catgctttga aaaaatatca cgataatatc cattgttctc acggaagcac acgcaggtca 1020
tttgaacgaa ttttttcgac aggaatttgc cgggactcag gagcatttaa cctaaaaaag 1080
catgacattt cagcataatg aacatttact catgtctatt ttcgttcttt tctgtatgaa 1140
aatagttatt tcgagtctct acggaaatag cgagagatga tatacctaaa tagagataaa 1200
atcatctcaa aaaaatgggt ctactaaaat attattccat ctattacaat aaattcacag 1260
aatagtcttt taagtaagtc tactctgaat ttttttaaaa ggagagggta aagagtgaga 1320
agcaaaaaat tgtggatcag tttgctgttt gctttagcgt taatctttac gatggcgttc 1380
ggcagcacat cctctgccca ggcggcaggg aaatcaaacg gggaaaagaa atatattgtc 1440
gggtttaaac agacaatgag cacgatgagc gccgctaaga agaaagatgt catttctgaa 1500
aaaggcggga aagtgcaaaa gcaattcaaa tatgtagacg cagcttcagc tacattaaac 1560
gaaaaagctg taaaagaatt gaaaaaagac ccgagcgtcg cttacgttga agaagatcac 1620
gtagcacatg cgtacgcgca gtccgtgcct tacggcgtat cacaaattaa agcccctgct 1680
ctgcactctc aaggctacac tggatcaaat gttaaagtag cggttatcga cagcggtatc 1740
gattcttctc atcctgattt aaaggtagca ggcggagcca gcatggttcc ttctgaaaca 1800
aatcctttcc aagacaacaa ctctcacgga actcacgttg ccggcacagt tgcggctctt 1860
aataactcaa tcggtgtatt aggcgttgcg ccaagcgcat cactttacgc tgtaaaagtt 1920
ctcggtgctg acggttccgg ccaatacagc tggatcatta acggaatcga gtgggcgatc 1980
gcaaacaata tggacgttat taacatgagc ctcggcggac cttctggttc tgctgcttta 2040
aaagcggcag ttgataaagc cgttgcatcc ggcgtcgtag tcgttgcggc agccggtaac 2100
gaaggcactt ccggcagctc aagcacagtg ggctaccctg gtaaataccc ttctgtcatt 2160
gcagtaggcg ctgttgacag cagcaaccaa agagcatctt tctcaagcgt aggacctgag 2220
cttgatgtca tggcacctgg cgtatctatc caaagcacgc ttcctggaaa caaatacggc 2280
gcgttgaacg gtacatcaat ggcatctccg cacgttgccg gagcggctgc tttgattctt 2340
tctaagcacc cgaactggac aaacactcaa gtccgcagca gtttagaaaa caccactaca 2400
aaacttggtg attctttcta ctatggaaaa gggctgatca acgtacaggc ggcagctcag 2460
taaaacataa aaaaccggcc ttggccccgc cggtttttta ttatttttct tcctccgcat 2520
gttcaatccg ctccataatc gacggatggc tccctctgaa aattttaacg agaaacggcg 2580
ggttgacccg gctcagtccc gtaacggcca agtcctgaaa cgtctcaatc gccgcttccc 2640
ggtttccggt cagctcaatg ccgtaacggt cggcggcgtt ttcctgatac cgggagactt 2700
ttcgttagac atcgtttccc tttagccttt aattttagta tgatatgtaa atgatattga 2760
ataaaagcta ggaagtgtcg taatgagcac aaaacctttt tacagagata cgtgggcgga 2820
aattgacttg tccgcgataa aggaaaatgt cagcaatatg aaaaaacata tcggtgaaca 2880
tgtccacttg atggcagttg tgaaagcaaa cgcctacggg catggtgatg cagaaacagc 2940
aaaggctgct cttgacgcag gtgcttcatg cttggccgtg gccattttgg atgaagcgat 3000
ttcactgcgc aaaaagggat tgaaggcgcc tatattggtg cttggcgcgg ttcccccgga 3060
gtatgtggca atcgctgctg agtatgacgt gaccttaaca ggttattctg ttgaatggct 3120
tcaggaggca gcccgccaca cgaaaaaagg ttctcttcat tttcatctga aggtcgatac 3180
ggggatgaac agacttggtg taaaaacaga ggaagaagtt cagaacgtga tggcaattct 3240
tgaccgcaac cctcgtttaa agtgcaaagg ggtatttacc cattttgcga cagcggatga 3300
aaaagaaaga ggctatttct taatgcagtt tgagcgcttt aaagagctga ttgctccgct 3360
gccgttaaag aatctaatgg tccactgcgc gaacagcgcc gctggactcc ggctgaaaaa 3420
aggctttttt aatgcagtca gattcggcat cggcatgtat ggccttcgcc cgtctgctga 3480
catgtcggac gagataccgt ttcagctgcg tccggcattt accctgcatt cgacactgtc 3540
acatgtcaaa ctgatcagaa aaggcgagag cgtcagctac ggagccgagt acacagcgga 3600
aaaagacaca tggatcggga cggtgcctgt aggctatgcg gacggctggc tccgaaaatt 3660
gaaagggacc gacatccttg tgaagggaaa acgcctgaaa attgccggcc gaatttgcat 3720
ggaccaattt atggtggagc tggatcagga atatccgccg ggcacaaaag tcacattaat 3780
aggccggcag ggggatgaat atatttccat ggatgagatt gcaggaaggc tcgaaaccat 3840
taactatgag gtggcctgta caataagttc ccgtgttccc cgtatgtttt tggaaaatgg 3900
gagtataatg gaagtaagaa atcctttatt gcaggtaaat ataagcaatt aacctaatga 3960
ctggctttta taatatgaga taatgccgac tgtacttttt acagtcggtt ttctaatgtc 4020
actaacctgc cccgttagtt gaagaaggtt tttatattac agctccagat ccatatcctt 4080
ctttttctga accgacttct cctttttcgc ttctttattc caattgcttt attgacgttg 4140
agcctcggaa cccttaacaa tcccaaaact tgtcgaatgg tcggcttaat agctcacgct 4200
atgccgacat tcgtctgcaa gtttagttaa gggttcttct caacgcacaa taaattttct 4260
cggcataaat gcgtggtcta atttttattt ttaataacct tgatagcaaa aaatgccatt 4320
ccaatacaaa accacatacc tataatcgac ctgcaggaat taattcctcc attttcttct 4380
gctatcaaaa taacagactc gtgattttcc aaacgagctt tcaaaaaagc ctctgcccct 4440
tgcaaatcgg atgcctgtct ataaaattcc cgatattggc ttaaacagcg gcgcaatggc 4500
ggccgcatct gatgtctttg cttggcgaat gttcatctta tttcttcctc cctctcaata 4560
attttttcat tctatccctt ttctgtaaag tttatttttc agaatacttt tatcatcatg 4620
ctttgaaaaa atatcacgat aatatccatt gttctcacgg aagcacacgc aggtcatttg 4680
aacgaatttt ttcgacagga atttgccggg actcaggagc atttaaccta aaaaagcatg 4740
acatttcagc ataatgaaca tttactcatg tctattttcg ttcttttctg tatgaaaata 4800
gttatttcga gtctctacgg aaatagcgag agatgatata cctaaataga gataaaatca 4860
tctcaaaaaa atgggtctac taaaatatta ttccatctat tacaataaat tcacagaata 4920
gtcttttaag taagtctact ctgaattttt ttatcaagct tatcgatacc gtcgacctcg 4980
agggggggcc cggtacccag cttttgttcc ctttagtgag ggttaattgc gcgcttggcg 5040
taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 5100
atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 5160
ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 5220
taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 5280
tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 5340
aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 5400
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 5460
ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 5520
acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 5580
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 5640
tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 5700
tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 5760
gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 5820
agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 5880
tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 5940
agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 6000
tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 6060
acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 6120
tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 6180
agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 6240
tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 6300
acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 6360
tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 6420
ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 6480
agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 6540
tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 6600
acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 6660
agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 6720
actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 6780
tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 6840
gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 6900
ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 6960
tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 7020
aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 7080
tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 7140
tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccac 7198
(配列番号2)
pBSFNAalrを、ゲル上に流す際にNotI/ScaI(バッファーH)で消化し、4つの断片を作成した。断片のサイズは、3660−2263−1105−174であった。カセット5’−FNA−alr−5’を含む最も大きな断片を、ゲル精製し、それ自身に連結させた。前記連結は、「ラピッド・ライゲーション(rapid ligation)」キット(ロッシュ)を用いて行った。得られたDNAの環状断片を、ローリングサークル反応(アマシャム・キット)に用い、CP3590またはCP3591のいずれかのコンピテント細胞に形質転換し、LA+1.6%スキムミルク上にプレートした。また、BG3594またはBG3594comKのいずれかのコンピテント細胞に形質転換し、LA+1.6%スキムミルク+50ppm CDA上にプレートした。適正な構成を有する株は、それらのプレート上で増殖し、発現されたプロテアーゼがスキムミルクを透明化することにより輪形を示す。
qPCRを用いた、株BG4020におけるズブチリシン遺伝子のコピー数の測定
染色体DNAを、株CP3591、CP3592、CP3593、BG4020、増幅されたBG4020及びHyper1から抽出した。DNA濃度を測定し、各サンプルで均一の濃度に希釈した。次に、ズブチリシン遺伝子にアニールするプライマー(FNA−R2、ccagtgtagc cttgagag、配列番号5及びFNA−F2、acaatgagca cgatgagc、配列番号6)を用いて、各株の均一量のDNAをqPCR反応に使用した。
Cmまたはalr−含有カセットを用いて増幅された株からの目的ポリペプチドの生産
試験する株を、37℃及び250rpmで、10mlチューブ内の5mlのLBG1%で増殖した。1以下のOD600において、2.5mlの培養地を、250mlエルレンマイアー振盪フラスコ内の25mlのFNII培地に植菌するために用いた。37℃及び250rpmで、前記振盪フラスコを保温し、培養液サンプルを、ズブチリシン活性の測定のために規則的に採取した。4株をこの方法で試験した。すなわち、前記4株は、BG3591(ズブチリシン遺伝子の1コピーを含む株、増幅不可)、MDT01−138(クロラムフェニコールを用いて増幅された株)、BG4020(カセット5’−ズブチリシンalr−5’が導入された株)、増幅されたBG4020(増加濃度のCDAに再度線状に付けられたBG4020株)である。MDT01−138は、Hyper1と同質遺伝子型の株であって、クロラムフェニコール・マーカー遺伝子を含む。
Claims (17)
- ゲノム遺伝子座を増幅する方法であって、
(a)必須酵素の阻害剤に、構造
A1−P−M−A2
のゲノム遺伝子座を含む細菌性宿主細胞の集団を接触させる工程であって、ここで、A1とA2が繰り返し配列であり、Pは目的タンパク質のコーディング配列を含み、Mは、必須酵素のコーディング配列を含む前記工程、及び
(b)前記阻害剤に耐性のある細胞を選択する工程であって、
前記阻害剤に耐性のある細胞が増幅単位の複数のコピーを有する前記工程
を含む、前記方法。 - 前記細菌性宿主細胞が、バチルス種細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記必須酵素が、前記細胞に内因性の野生型酵素である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記細菌性宿主細胞が、前記必須酵素をコードする不活性化された遺伝子をさらに含み、前記不活性化された遺伝子が、前記細胞に内因性であって、構造A1−P−M−A2の前記ゲノム遺伝子座と異なるゲノム遺伝子座にある、請求項1−3のいずれかの方法。
- Pが発現カセットを含む、請求項1−4のいずれかの方法。
- A1がPのコーディング配列と操作可能に連結されたプロモーターを含む、請求項1−5のいずれかの方法。
- 前記必須酵素の前記コーディング配列が、前記コーディング配列に内因性のプロモーターに連結される、請求項1−6のいずれかの方法。
- 前記目的タンパク質がズブチリシンである、請求項1−7のいずれかの方法。
- 前記必須酵素がD−アラニンラセマーゼである、請求項1の方法。
- 前記必須酵素がD−アラニンラセマーゼであり、前記阻害剤がβ−クロロ−D−アラニンである、請求項1−8のいずれかの方法。
- 構造
A1−P−M−A2
の増幅単位を含むゲノム遺伝子座を含む細菌性宿主細胞であり、
A1とA2は繰り返し配列であり、Pは目的タンパク質のコーディング配列を含み、Mは
必須酵素のコーディング配列を含む、前記細菌性宿主細胞。 - 構造
A1−P−M−A2
の増幅単位の複数のコピーを含むゲノム遺伝子座を含む細菌性宿主細胞であって、
A1とA2は繰り返し配列であり、Pは目的タンパク質の第1コーディング配列を含み、
Mは必須酵素の第2コーディング配列を含み、前記第1コーディング配列が、繰り返し配
列A1に存在するプロモーターと操作可能に連結される、前記細菌性宿主細胞。 - 前記目的タンパク質がズブチリシンであり、前記必須酵素がアラニンラセマーゼである、
請求項11または12の細菌性宿主細胞。 - 前記増幅単位が配列番号7で示す配列を有する、請求項11−13のいずれかの細菌性宿主細胞。
- 増殖培地、及び
請求項11−14のいずれかの細菌性細胞の集団
を含む細菌性細胞培地。 - 前記目的タンパク質の生産に適した条件下で、請求項15の細胞の培地を維持する工程
を含む方法。 - 前記培地から前記目的タンパク質を回収する工程をさらに含む、請求項16の方法。
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