KR20100138969A - 박테리아 세포 내 로커스 증폭 방법 - Google Patents

Abstract

본원의 일부 측면은 유전체 로커스를 증폭시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 하기 구조: A₁-P-M-A₂ (식 중, A₁ 및 A₂ 는 동향 반복서열이며, P 는 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열을 포함하며, M 은 필수 효소에 대한 코딩 서열을 포함함) 의 유전체 로커스를 포함하는 박테리아 숙주 세포의 개체군을 필수 효소의 저해제와 접촉시키는 단계; 및 b) 상기 저해제에 내성인 세포가 상기 증폭 단위의 다중 복제본을 갖는, 상기 저해제에 내성인 세포를 선별하는 단계.

Description

박테리아 세포 내 로커스 증폭 방법 {METHOD FOR AMPLIFYING LOCUS IN BACTERIAL CELL}

우선권

본 출원은 2008년 3월 28일 출원된 미국 가특허출원 제 61/040,456 호에 대한 우선권을 주장한다.

기술분야

본 발명은 항생제를 사용하지 않는 유전체 로커스 (locus) 증폭 방법을 제공한다. 특히 본 발명은 관심 폴리펩타이드를 인코딩 (encoding) 하는 DNA 서열의 생체내 증폭 방법, 상기 증폭 DNA 서열의 다중 복제본을 갖는 세포, 및 상기 방법에서 사용될 DNA 구축물을 갖는 벡터에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 상술된 바와 같이 세포를 배양하여 관심 폴리펩타이드, 예를 들어, 효소를 제조하는 방법에 관한 것이다.

외래적 폴리펩타이드의 발현 및 재조합 제조는 널리 사용되는 기술이다. 다량의 목적 폴리펩타이드의 발현 및 제조를 위해 외래적 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산으로 세포를 형질변환시킬 수 있음이 잘 알려져 있다. 일부 출원에서, 상기 방법은 발원 생물에 의해 자연 생산될 수 있는 것을 능가하는 막대한 양의 폴리펩타이드를 제조하기 위해 사용된다. 실로, 외래적 핵산 서열의 발현, 및 또한 내재적 서열의 과발현은 현대 생명공학에서 널리 사용되어 왔다.

분자 생물학 및 단백질 공학의 발달에도 불구하고, 숙주 세포 내 폴리펩타이드의 발현 수준을 증가시키는 새로운 방법 및 조성물에 대한 필요가 여전히 남아있다.

개요

유전체 로커스 증폭 방법이 본원에서 기술된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: a) 하기 구조: A₁-P-M-A₂ (식 중, A₁ 및 A₂ 는 동향 반복서열이며, P 는 관심 폴리펩타이드에 대한 코딩 (coding) 서열을 포함하며, M 은 필수 효소에 대한 코딩 서열을 포함함) 의 유전체 로커스를 포함하는 박테리아 숙주 세포의 개체군을 필수 효소의 저해제와 접촉시키는 단계; 및 b) 상기 저해제에 내성인 세포가 증폭 단위의 다중 복제본을 갖는, 상기 저해제에 내성인 세포를 선별하는 단계. 박테리아 숙주 세포는 바실러스 (Bacillus) 종 세포일 수 있지만, 기타 박테리아 세포 종류, 예를 들어, 스트렙토마이시즈 (Streptomyces) 종도 고려된다. 일부 구현예에서는, 관심 폴리펩타이드가 서브틸리신 (subtilisin), 예를 들어 SEQ ID NO:8 의 서브틸리신, 또는 SEQ ID NO:12 에 기재된 그의 성숙 형태이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 항생제 마커 (marker) 및 항생제 사용을 회피하며, 항생제-기반 증폭 시스템에 대한 대안을 제공한다. 일부 구현예에서, 필수 효소는 세포에 내재적인 효소, 예를 들어 야생형 효소의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 방법에서 사용되는 박테리아 숙주 세포는 필수 효소를 인코딩하는 불활성화 내재적 유전자를 함유하거나 함유하지 않을 수 있는데, 상기 불활성화 유전자는 하기 구조: A₁-P-M-A₂ 의 유전체 로커스와 상이한 유전체 로커스에 있을 수 있다. 일부 경우, 필수 효소는 알라닌 라세미화효소, 예를 들어 SEQ ID NO:11 일 수 있으며, 저해제는 β-클로로-D-알라닌 또는 시클로세린일 수 있지만, 기타 효소/저해제 조합도 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 증폭 단위는 SEQ ID NO:7 에 기재된 서열을 포함한다.

증폭 단위는 M 구역에 의해 인코딩된 필수 효소의 발현을 가능하게 한다. 특정 구현예에서, M 은 필수 효소에 대한 코딩 서열 및 상기 코딩 서열에 작용가능하게 연결된 (operably linked) 프로모터를 포함할 수 있으며, 상기 프로모터는 필수 효소에 대한 코딩 서열에 본래적이다. 일부 구현예에서, 코딩 서열 및 프로모터는 숙주 세포에 내재적일 수 있다. 증폭 단위는 또한 P 구역에 의해 인코딩되는 관심 단백질의 발현을 가능하게 한다. 특정 구현예에서, P 의 코딩 서열은 인접한 동향 반복서열 (A₁) 내에 존재하는 내재적 또는 비(非)-내재적 프로모터에 작용가능하게 연결될 수 있다. 기타 구현예에서는, P 에 대한 프로모터가 인접한 동향 반복서열 내에 존재하지 않을 수 있다. 오히려, 상기 프로모터가 P 구역 내에 존재할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명은 하기 구조: A₁-P-M-A₂ (식 중, A₁ 및 A₂ 는 동향 반복서열이며, P 는 관심 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열을 포함하며, M 은 필수 효소에 대한 코딩 서열을 포함함) 의 증폭 단위를 포함하는 유전체 로커스를 포함하는 박테리아 숙주 세포를 제공한다. 상기 구현예에서, 증폭 단위는 필수 효소의 현저한 발현을 가능하게 한다. 박테리아 숙주 세포는 바실러스 종 세포일 수 있지만, 기타 박테리아 세포 유형, 예를 들어, 스트렙토마이시즈 종도 고려된다. 일부 구현예에서, 관심 폴리펩타이드는 서브틸리신, 예를 들어 SEQ ID NO:8 의 서브틸리신, 또는 SEQ ID NO:12 에 기재된 그의 성숙 형태이다. 일부 경우, 상기 방법은 항생제 마커 및 항생제 사용을 회피하며, 항생제-기반 증폭 시스템에 대한 대안을 제공한다. 일부 구현예에서, 필수 효소는 세포에 내재적인 효소, 예를 들어 야생형 효소의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 박테리아 숙주 세포는 필수 효소를 인코딩하는 불활성화 내재적 유전자를 함유하거나 함유하지 않을 수 있는데, 상기 불활성화 유전자는 하기 구조: A₁-P-M-A₂ 의 유전체 로커스와 상이한 유전체 로커스에 있을 수 있다. 일부 경우, 상기 필수 효소는 알라닌 라세미화효소, 예를 들어 SEQ ID NO:11 일 수 있으며, 저해제는 β-클로로-D-알라닌 또는 시클로세린일 수 있지만, 기타 효소/저해제 조합도 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 증폭 단위는 SEQ ID NO:7 에 기재된 서열을 포함한다.

기타 구현예에서, 본 발명의 박테리아 숙주 세포는 하기 구조: A₁-P-M-A₂ (식 중, A₁ 및 A₂는 동향 반복서열이며, P 는 관심 폴리펩타이드에 대한 제 1 코딩 서열을 포함하며, M 은 필수 효소에 대한 제 2 코딩 서열을 포함함) 의 증폭 단위의 다중 복제본을 포함하는 유전체 로커스를 포함한다. 일부 구현예에서, 증폭 단위는 SEQ ID NO:7 에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 코딩 서열은 동향 반복서열 A₁ 내에 존재하는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 특정 구현예에서, 박테리아 숙주 세포는 하기 식: (A₁-P-M)_n-A₂ (식 중, n 은 2 이상이며, A₁ 및 A₂ 는 동향 반복서열이며, P 는 관심 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열을 포함하며, M 은 필수 효소를 인코딩하는데, 상기 M 의 코딩 서열은 내재적 또는 비-내재적 프로모터에 작동가능하게 연결됨) 으로 기술되는 증폭 단위의 다중 복제본을 포함하는 유전체 로커스를 포함한다. 일 구현예에서, M 의 코딩 서열 및 프로모터는 숙주 세포에 내재적일 수 있다. 일부 구현예에서, 박테리아 숙주 세포는 SEQ ID NO:7 의 증폭 단위의 다중 복제본, 예를 들어 2 개 이상의 복제본을 포함하는 유전체 로커스를 포함한다. 증폭 단위는 관심 폴리펩타이드, 예를 들어 서브틸리신, 및 필수 효소 모두의 발현을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 발현된 관심 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:8 에 기재된 서브틸리신 FNA, 또는 SEQ ID NO:12 에 기재된 그의 성숙 형태이며, 필수 효소는 SEQ ID NO:11 에 기재된 알라닌 라세미화효소이다. 특정 구현예에서, P 의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 인접한 동향 반복서열 (A₁) 의 일부일 수 있다. 또 다른 구현예에서, P 구역의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 인접한 동향 반복서열 내보다 P 구역 내에 존재한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 A₁-P-M-A₂ 구조 (상기 A₁ 및 A₂ 는 동향 반복서열이며, P 는 관심 단백질에 대한 제 1 코딩 서열을 포함하며, M 은 필수 효소의 제 2 코딩 서열을 포함함) 의 증폭 단위의 1 개 이상, 2 개 이상의 복제본을 포함하는 박테리아 숙주 세포 개체군 및 성장 배지를 포함하는 박테리아 세포 배양물을 포함한다. 상술된 바, 증폭 단위는 관심 폴리펩타이드, 예를 들어 서브틸리신, 및 필수 효소 모두의 발현을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 발현된 관심 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:8 에 기재된 서브틸리신 FNA, 또는 SEQ ID NO:12 에 기재된 그의 성숙 형태이며, 필수 효소는 SEQ ID NO:11 에 기재된 알라닌 라세미화효소이다. 또 다른 구현예에서, 박테리아 세포 배양물은, 코딩 서열에 의해 인코딩되는 관심 폴리펩타이드를 제조하기에 적합한 조건 하에 대상 세포의 배양물을 유지하는 단계를 포함하는 단백질 제조법에 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 배양 배지로부터 관심 폴리펩타이드를 회수하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

도 1 은 본원에 기술된 구현예의 일부 특징을 도식으로 예시한다.
도 2 는 pBSFNAalr 플라스미드 (SEQ ID NO:2) 의 지도를 나타낸다.
도 3 은 qPCR 교정곡선을 나타낸다.
도 4 는 다양한 숙주 균주로부터의 서브틸리신 FNA 발현 수준을 나타내는 도표이다.
정의
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명의 당업자가 보통 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동일한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 기술된다.
본원에 참조된 특허 및 공보에 개시된 모든 서열을 포함하는 모든 특허 및 공보는 명백히 참조로서 인용된다.
숫자 범위는 그 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 핵산은 5' 에서 3' 배향으로 좌측에서 우측으로 표기되고; 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 배향으로 좌측에서 우측으로 각각 표기된다.
본원에 기술된 제목은 본 발명의 다양한 측면 또는 구현예의 한정이 아니다. 따라서, 하기에 정의된 용어는 전체적인 명세서에 대한 참조에 의해 더욱 완전하게 정의된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명의 당업자에게 통상 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. [Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994)], 및 [Hale & Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N. Y. (1991)] 은 당업자에게 본원에서 사용되는 용어 대부분의 일반적인 의미를 제공한다. 그럼에도 불구하고, 일부 용어는 명확성 및 참조 용이성을 위해 하기 정의된다.
용어 "재조합" 은 숙주 세포에서 자연 발생하지 않는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 재조합 분자는 자연 발생하지 않는 방식으로 서로 연결된 자연 발생 서열 둘 이상을 함유할 수 있다. 재조합 세포는 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 함유한다.
용어 "이종" 은 정상적으로 서로 관련되지 않은 요소를 지칭한다. 예를 들어, 숙주 세포가 이종 단백질을 제조한다면, 그 단백질은 상기 숙주 세포에서 정상적으로 제조되지 않는다. 마찬가지로, 이종 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 야생형 숙주 세포에서 보통 작동가능하게 연결되지 않는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터이다. 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질에 관련된 용어 "동종" 은 숙주 세포에서 자연 발생하는 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질을 지칭한다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩타이드" 는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
"신호 서열" 은 세포로부터 성숙 형태의 단백질의 분비를 용이하게 하는 단백질의 N-말단 부위에 존재하는 아미노산의 서열이다. 신호 서열의 정의는 기능적이다. 세포외 단백질의 성숙 형태는 분비 과정 동안 분리제거되는 신호 서열이 결핍된다.
용어 "핵산" 은 DNA, RNA, 단일 가닥 또는 이중 가닥 및 그의 화학적 변형을 포함한다. 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드" 는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
"벡터"는 핵산이 하나 이상의 숙주 세포 내로 도입되도록 고안된 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 벡터는 각색의 숙주 세포에서 자동 복제할 수 있으며, 클로닝 벡터, 발현 벡터, 셔틀 (shuttle) 벡터, 플라스미드, 파지 입자, 카세트 (cassette) 등을 포함한다. 기타 구현예에서 벡터는 숙주 세포 유전체 내로 혼입될 수 있다.
"프로모터" 는 하부방향 (downstream) 핵산의 전사를 개시하는 조절 서열이다.
용어 "작동가능하게 연결된" 은 요소들이 서로 기능적으로 연관되도록 하는 배치를 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 서열의 전사를 제어한다면 상기 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다.
용어 "선별 마커" 는 도입된 핵산 또는 벡터를 함유하는 숙주의 선별 용이성을 부여하는, 숙주 내 발현가능한 단백질을 지칭한다. 선별 마커의 예는, 항균제 (예컨대, 하이그로마이신, 블레오마이신, 또는 클로람페니콜) 및/또는 숙주 세포에 영양상의 이점과 같은 대사상 이점을 부여하는 유전자를 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 용어 "회수된", "단리된" 및 "분리된" 은 자연적으로 결합된 하나 이상의 구성 성분으로부터 제거되는 단백질, 세포, 핵산 또는 아미노산을 지칭한다.
본원에서 사용된 바, 세포와 관련하여 사용되는 용어 "형질전환된", "안정적으로 형질전환된" 및 "유전자 이식된 (transgenic)" 은, 세포가 여러 세대에 걸쳐 유지되는 에피솜 플라스미드 또는 유전체 내로 혼입된 비(非)-본래적 (예를 들어, 이종) 핵산 서열을 갖는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바, "발현" 은 유전자의 핵산 서열에 기초하여 폴리펩타이드가 제조되는 과정을 지칭한다. 상기 과정은 전사 및 번역을 모두 포함한다.
핵산 서열을 세포 내로 삽입하는 맥락에서 용어 "도입"이란, "트랜스펙션 (transfection)", 또는 "형질전환" 또는 "형질도입 (transduction)" 을 의미하며, 핵산 서열의 진핵 세포 및 원핵 세포 내로의 도입에 대한 언급을 포함하며, 상기 핵산 서열은 세포의 유전체 (예를 들어, 염색체, 플라스미드, 플라스티드 또는 미토콘드리아 DNA) 내로 도입되거나, 자동 레플리콘 (replicon) 으로 전환되거나, 또는 일시적으로 발현 (예컨대, 트랜스펙션된 mRNA) 될 수 있다.
용어 "혼성화" 는 당업계에 공지된 바와 같이 핵산 한 가닥이 염기 짝짓기를 통해 상보성 가닥과 연결되는 과정을 지칭한다. 핵산이 참조 핵산 서열에 보통 내지 높은 엄격도 혼성화 및 세척 조건 하에서 서로 특이적으로 혼성화하면, 상기 핵산은 참조 핵산 서열에 "선택적으로 혼성화가능한" 것으로 고려된다. 보통 내지 높은 엄격도 혼성화 조건은 공지되어 있다 (예를 들어, [Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons 1995] 및 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, 2001 Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조). 높은 엄격도 조건의 하나의 예는 50% 포름아미드, 5X SSC, 5X 덴하르트 (Denhardt) 용액, 0.5% SDS 및 100 ㎍/ml 변성 운반체 DNA 중 약 42℃ 에서 혼성화한 후, 2X SSC 및 0.5% SDS 중 실온에서 2 회 세척한 후, 0.1 X SSC 및 0.5% SDS 중 42℃ 에서 2 회 추가로 세척하는 것을 포함한다.
"코딩 서열" 은 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA 분절이다.
본원에 사용된 바, "발현 카세트" 는 적절한 숙주 세포 내에서 단백질의 발현을 실행시킬 수 있는, 적절한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 단백질-코딩 구역을 포함하는 DNA 구축물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 실행하는 프로모터, mRNA 제조를 위한 전사를 조절하는 선택적 작동자 서열, mRNA 상에 적절한 리보솜 결합 부위를 인코딩하는 서열, 및 증강자, 및 전사 및 번역의 종료를 조절하는 기타 서열을 포함할 수 있다.
"숙주 세포에 본래적인" 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 미변형 숙주 세포 내에 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 동일한 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일부 경우에, 세포는 그 세포에 본래적인 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 코딩 서열) 를 함유하는 재조합 핵산을 함유할 수 있다. 상기 경우, 세포는 상이한 로커스에, 미변형된 형태의 숙주 세포 (즉, 임의의 유전자 녹아웃 (knockout) 을 함유하지 않는 숙주 세포) 내에도 존재하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 핵산을 함유한다. 일부 경우, 세포는 그 세포에 자생하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 핵산을 함유할 수 있다. 상기 경우, 세포는 미변형된 형태의 숙주 세포 (즉, 임의의 유전자 녹아웃을 함유하지 않는 숙주 세포) 에서 발견되는 폴리펩타이드의 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 핵산을 함유한다. 용어 "내재적" 은 용어 "본래적인" 과 동의어이다.
그의 본래적 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 서열과 관련하여 "본래적 프로모터" 는, 그 세포 내에서 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 야생형 숙주 세포의 프로모터를 지칭한다.
용어 "동향 반복서열" 은 동일한 배향으로 존재하며, 세포 내에서 상동 재조합을 일으킬 수 있는 2 개 이상의 서열 요소를 지칭한다. 동향 반복서열은 50 개 이상의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 100 개 이상, 200 개 이상 또는 500 개 이상의 뉴클레오타이드에 대해 동일하거나 거의 동일한 뉴클레오타이드 서열 (예를 들어, 98% 이상 또는 99% 서열 일치도) 을 갖는다.
용어 "저해제" 는 경쟁성 저해 또는 비(非)-경쟁성 저해 (예를 들어, 알로스테릭성) 중 어느 하나에 의해 효소를 가역 저해시키는 화합물을 지칭한다.
용어 "필수 효소" 는 세포의 성장에 필수적인 효소이다.
용어 "필수 효소의 현저한 발현을 가능하게 하는 발현 카세트" 는 내재적 필수 효소에 대한 유전자가 세포 내에서 야생형 (즉, 불활성화되지 않음) 인 경우, 그 내재적 필수 효소 수준의 50% 초과 (예를 들어, 70% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상, 1000% 이하) 인 수준으로 필수 효소의 발현을 가능하게 하는 발현 카세트를 지칭한다.
용어 "알라닌 라세미화효소" 는 L-알라닌 및 D-알라닌의 상호전환을 촉매화하는 효소를 지칭한다. 알라닌 라세미화효소는 IUBMB 효소 명명법에 따라, EC 5.1.1.1 에 기술된 활성을 갖는다. 알라닌 라세미화효소를 인코딩하는 유전자는 "alr", "alrA" 또는 "dal" 유전자로 표기될 수 있다.
기타 용어의 정의는 본원의 전반에 걸쳐 나타날 수 있다.

상술된 바와 같이, 유전체 로커스를 증폭시키는 방법이 제공된다. 본 방법의 몇 가지 일반적인 특징이 도 1 에 예시된다. 도 1 에 대해, 방법에 사용되는 박테리아 숙주 세포는 하기 구조: A₁-P-M-A₂ (식 중, A₁ 및 A₂ 는 동향 반복서열이며, P 는 관심 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열을 포함하며, M 은 세포에 필수적인 효소에 대한 코딩 서열을 포함함) 의 증폭 단위를 포함하는 유전체 로커스를 포함할 수 있다. 상기 식 A₁-P-M-A₂ 는 P 및 M 에 대해 양쪽 방향으로 배향되는 동향 반복서열을 함유하는 유전체 로커스를 포함하는 것을 의미한다.

증폭 단위는 세포 내 관심 폴리펩타이드 및 필수 효소의 발현을 가능하게 한다. 일부 경우, P 구역 및 M 구역은 각각 관심 폴리펩타이드 및 필수 효소에 대한 발현 카세트 (즉, 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 서열) 를 독립적으로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증폭 단위는 관심 폴리펩타이드를 발현시키기 위한 제 1 발현 카세트 및 필수 효소를 발현시키기 위한 제 2 카세트를 포함한다. 기타 구현예에서, P 구역의 코딩 서열은 인접하는 동향 반복서열 내에 존재하는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 하기에 더욱 상세히 기술될 바와 같이, 본 구현예에서, 필수 효소에 대한 코딩 서열 및 동향 반복서열의 혼합된 뉴클레오타이드 서열은 세포에 내재적일 수 있다, 즉, 숙주 세포의 유전체 내에서 발견될 수 있다. 특정 구현예에서, M 구역의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 그 코딩 서열에 내재적 또는 비-내재적일 수 있다. 특정 구현예에서, M 구역의 코딩 서열은 P 의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터에 의해 작동될 수 있다.

매우 명백한 바와 같이, 본원에 기술된 임의의 핵산 내의 P 및 M 의 배향은 반대 배향 (즉, A₁-M-P-A₂) 일 수 있다. 상기 반대 배향에서 및 일부 구현예에서, M 구역의 코딩 서열은 동향 반복서열 A₁ 내의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, M 구역의 코딩 서열은 M 구역 내에 존재하는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.

상기 세포의 개체군을 필수 효소의 저해제와 접촉시키고, 저해제에 내성인 세포 (즉, 저해제의 존재 하에서 성장 및 분열하여 집락을 형성할수 있는 세포) 를 선별하였다. 표 1 에 나타난 바와 같이, 선별된 세포는 증폭 단위의 다중 복제본을 함유하는 유전체 로커스를 가지며, 상기 유전체 로커스는 식 (A₁-P-M)_n-A₂ 로 기술될 수 있으며, 식 중, A₁ 및 A₂ 는 동향 반복서열이며, n 은 2 이상이다. n 은 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10 이상, 예를 들어, 10 내지 50, 또는 50 내지 100 의 범위, 또는 그 이상일 수 있다. 선별된 세포는 비(非)-선별 세포에 비하여, 필수 효소의 코딩 서열 (예를 들어, 저해제의 결합 부위에) 또는 그 코딩 서열에 연결된 프로모터 내에 돌연변이를 갖지 않는다. 오히려, 선별된 세포는 증폭 단위의 복제수가 증가하며, 이는 세포가 저해제의 존재 하에서 성장하는 것을 가능하게 한다. 일부 경우, 세포의 개체군은 선별의 각 회마다 저해제의 농도를 연속적으로 증가 (예를 들어, 저해제 농도의 연속적인 배가) 시키는, 수회의 선별을 거칠 수 있다. 일부 구현예에서, A₁-P-M-A₂ 증폭 단위는 SEQ ID NO:7 에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다:

여기서, 반복 단위 A₁ 및 A₂ 는 밑줄로 표시되며, 관심 단백질, 즉, 서브틸리신 FNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 볼드체로 표시되며, 필수 효소, 예를 들어 알라닌 라세미화효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 이탤릭체로 표시된다. 프로모터 서열은 볼드체 대문자로 표시된다.

상기 방법으로 수득되는 숙주 세포는 더 많은 제 1 발현 카세트의 복제본을 함유하므로, 세포는 A₁-P-M-A₂ 증폭 단위의 단일 복제본을 갖는 숙주 세포보다 더 많은 제 1 발현 카세트에 의해 인코딩되는 관심 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 특정 구현예에서, 결과의 숙주 세포는 A₁-P-M-A₂ 증폭 단위의 단일 복제본을 갖는, 그 외에는 동일한 숙주 세포와 비교하여 20% 이상, 40% 이상, 60% 이상, 80% 이상, 100% 이상, 2 배 이상, 3 배 이상, 4 배 이상, 5 배 이상 또는 10 배 이상, 약 100 배 이하의 더 많은 단백질을 제조할 수 있다.

대상 방법에서 사용되는 저해제의 농도는, 사용되는 필수 효소 및 저해제의 효능에 따라 변화할 수 있다. 특정 구현예에서, 저해제는 1 μM 내지 100 mM 의 범위, 예를 들어, 5 μM 내지 10 mM, 20 μM 내지 1 mM 의 범위의 농도일 수 있지만, 상기 범위 외의 저해제 농도도 고려된다. 저해제는 박테리아를 성장시키는 액체 배양액에 첨가하거나, 고체 배지 (예를 들어, 아가 배지) 에 존재할 수 있다. 상술된 바와 같이, 세포의 개체군은 선별의 각 회마다 저해제의 농도를 연속적으로 증가 (예를 들어, 저해제 농도의 연속적인 배가) 시키는, 수회의 선별을 거칠수 있다.

특정 구현예에서, 증폭 단위는 항생제 내성 마커를 함유하지 않으며, 세포 선별은 무(無)항생제 배지에서 수행될 수 있다.

제 1 및 제 2 발현 카세트 및 숙주 세포는 하기에 더욱 상세하게 기술된다.

발현 카세트

상술된 바와 같이, 증폭 단위는 관심 폴리펩타이드 및 필수 효소의 발현을 가능하게 한다. 그러한 것으로서, 증폭 단위는 일반적으로 2 개 이상의 발현 카세트를 함유한다: 관심 폴리펩타이드의 발현을 위한 제 1 발현 카세트, 및 필수 유전자의 발현을 위한 제 2 발현 카세트. 각 발현 카세트는 작동가능한 연결에 하기를 함유한다: 프로모터, 코딩 서열 및 종료자. 일부 경우, 증폭 단위의 P 구역이 제 1 발현 카세트를 포함할 수 있으며, 증폭 단위의 M 구역이 제 2 발현 카세트를 포함할 수 있다. 기타 경우 및 상술된 바와 같이, P 구역에 인접한 동향 반복서열은 P 구역의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 경우, P 구역의 근접 뉴클레오타이드 서열 및 P 구역에 인접한 동향 반복서열은 숙주 세포에 내재적 (즉, 숙주 세포의 유전체 내에 존재함) 일 수 있다. 특정 구현예에서, M 구역의 코딩 서열은 P 구역의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.

본원에서 기술되는 각 발현 카세트는 하기의 요소들을 작동가능한 연결로 함유할 수 있으며, 상기 발현 카세트는 숙주 세포 내에서의 단백질 제조에 충분하다: 프로모터, 코딩 서열 및 종료자 서열. 하기에 더욱 상세하게 기술될 바와 같이, 제 1 발현 카세트의 코딩 서열은 재조합 단백질, 예를 들어, 소위 "산업 효소" 로 칭하는 치료 단백질을 인코딩할 수 있다. 특정 구현예에서, 코딩 서열은 세포로부터 단백질의 분비를 가능하게 하는 신호 서열을 갖는 단백질을 인코딩할 수 있다. 상술된 바, 및 하기에 더욱 상세하게 기술될 바와 같이, 제 2 발현 카세트는 필수 효소의 발현을 가능하게 한다.

프로모터, 종료자 및 신호 서열의 선택은, 사용된다면, 사용되는 숙주 세포에 주로 의존한다. 숙주 세포는 바실러스 종 숙주 세포, 스트렙토마이시즈 종 숙주 세포, E. 콜라이 (coli) 및 기타 박테리아 숙주 세포를 포함한다. 상술된 바와 같이, 전형적인 구현예에서, 스트렙토마이시즈 숙주 세포가 사용될 수 있으며, 이러한 경우 신호 서열은, 사용된다면, celA 신호 서열일 수 있다. 일부 경우, celA 신호 서열은 [Kluepfel et al. (Nature Biotechnol. 1996 14:756-759)] 에 의해 기술된 바와 같이 S. 리비댄즈 (S. lividans) 셀룰라아제 A 유전자, CelA 에 의해 인코딩되는 신호 서열일 수 있다. 바실러스 숙주 세포가 사용되는 기타 전형적인 구현예에서, 신호 서열은 바실러스 숙주 세포의 분비 경로로 융합 단백질을 안내할 수 있는 임의의 아미노산 서열일 수 있다. 일부 경우, 사용될 수 있는 신호 서열은 야생형 바실러스 세포로부터 분비되는 단백질의 신호 서열을 포함한다. 상기 신호 서열은 α-아밀라아제, 프로테아제, 예를 들어, aprE 또는 서브틸리신 E, 또는 β-락타마아제 유전자에 의해 인코딩되는 신호 서열을 포함한다. 전형적인 신호 서열은 B. 스테아로서모필러스 (stearothermophilus), B. 리체니포르미스 (licheniformis), B. 클라우시이 (clausii), B. 서브틸리스 (subtilis) 및 B. 아밀로리퀴파시엔스 (amyloliquefaciens) 를 포함하나 이에 한정되지 않는, 임의의 적절한 바실러스 종으로부터의 α-아밀라아제 유전자, 서브틸리신 유전자, β-락타마아제 유전자, 중성 프로테아제 유전자 (예를 들어, nprT , nprS , nprM), 또는 prsA 유전자에 의해 인코딩되는 신호 서열을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 일 구현예에서, 신호 서열은 ([Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003 62:369-73] 에 기술된 바와 같이) B. 서브틸리스의 aprE 유전자에 의해 인코딩된다. 추가의 신호 펩타이드는 [Simonen and Palva (Microbiological Reviews 1993 57:109-137)] 및 기타 문헌에 기술된다.

바실러스 및 스트렙토마이시즈 숙주 세포에서의 사용을 위한 적절한 프로모터 및 종료자가 공지되어 있으며 하기를 포함한다: apr (알칼리성 프로테아제), npr (중성 프로테아제), amy (α-아밀라아제) 및 β-락타마아제 유전자, 및 또한 B. 서브틸리스 레반수크라아제 유전자 (sacB), B. 리체니포르미스 알파-아밀라아제 유전자 (amyL), B. 스테아로서모필러스 단성 아밀라아제 유전자 (amyM), B. 아밀로리퀴파시엔스 알파-아밀라아제 유전자 (amyQ), B. 리체니포르미스 페니실리나아제 유전자 (penP), B. 서브틸리스 xylA 및 xylB 유전자의 프로모터 및 종료자, 제 WO 93/10249 호, 제 WO 98/07846 호, 및 제 WO 99/43835 호에 기재된 프로모터 및 종료자. 스트렙토마이시즈 숙주 세포에서의 사용을 위한 발현 카세트는 예를 들어, [Hopwood et al (Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratories, 1985)], [Hopwood et al (Regulation of Gene Expression in Antibiotic-producing Streptomyces. In Booth, I. and Higgins, C. (Eds) Symposium of the Society for General Microbiology, Regulation of Gene Expression, Cambridge University Press, 1986 pgs. 251-276)], [Fornwald et al (Proc. Natl. Acad. Sci. 1987 84: 2130-2134)], [Pulido et al (Gene. 1987 56:277-82)]; [Dehottay et al (Eur. J. Biochem. 1987 166:345-50)], [Taguchi (Gene. 1989 84:279-86)], [Schmitt-John et al (Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992 36:493-8)], [Motamedi (Gene 1995 160:25-31)] 및 [Binnie (Protein Expr. Purif. 1997 11:271-8)] 에 기재된 프로모터 및 종료자를 사용하여 구축될 수 있다. 일 구현예에서, A4 프로모터가 사용될 수 있으며, 이 프로모터는 본원에 참조로서 인용된 제 WO 06/054997 호에 기술된다.

특정 구현예에서, 사용된 숙주 세포 내에서 관심 폴리펩타이드의 발현을 위해 코딩 서열 중 어느 하나가 코돈 최적화될 수 있다. 다수의 세포 내에서 각 코돈의 사용을 열거하는 코돈 사용 표가 당업계에 공지되어 있거나 (예를 들어, [Nakamura et al, Nucl. Acids Res. 2000 28: 292] 참조), 또는 용이하게 수득될 수 있으므로, 이러한 핵산을 용이하게 고안하여, 발현될 단백질의 아미노산 서열을 수득할 수 있다.

스트렙토마이시즈 및 바실러스 숙주 세포 내에서 재조합 단백질의 발현을 위한 시스템은 당업계에 공지되어 있으며, 상기에 기재된 것보다 더 상세하게 설명할 필요가 없다.

제 1 발현 카세트

제 1 발현 카세트는 프로모터 및 관심 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 (즉, 코딩 서열) 을 포함할 수 있으며, 상기 상기 프로모터 및 폴리뉴클레오타이드는, 단리된 핵산이 폴리뉴클레오타이드의 전사 및 관심 단백질의 제조를 초래하도록 작동가능하게 연결되어 있다.

인코딩된 관심 단백질은 소위 "산업 효소", 치료 단백질, 리포터 (reporter) 단백질, 식품 첨가제 또는 식품 등일 수 있다.

일 구현예에서, 관심 단백질은 효소, 예를 들어, 탄수화물분해효소, 예컨대 액화 및 당화 α-아밀라아제, 알칼리성 α-아밀라아제, β-아밀라아제, 셀룰라아제; 덱스트라나아제, α-글루코시다아제, α-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 헤미셀룰라아제, 펜토사나아제, 자일라나아제, 인베르타아제, 락타아제, 나린가나아제, 펙티나아제 또는 풀룰라나아제; 프로테아제 예컨대 산 프로테아제, 알칼리 프로테아제, 브로멜라인, 피신, 중성 프로테아제, 파파인, 펩신, 펩티다아제, 렌넷, 레닌, 키모신, 서브틸리신, 서몰리신, 아스파르트산 프로테이나아제, 또는 트립신; 리파아제 또는 에스테라아제, 예컨대 트리글리세리다아제, 포스포리파아제, 전위 (pregastric) 에스테라아제, 포스파타아제, 피타아제, 아미다아제, 이미노아실라아제, 글루타미나아제, 라이소자임, 또는 페닐실린 아실라아제; 이소메라아제 예컨대 글루코스 이소메라아제; 산화환원효소, 예를 들어, 아미노산 옥시다아제, 카탈라아제, 클로로퍼옥시다아제, 글루코스 옥시다아제, 히드록시스테로이드 데히드로게나아제 또는 퍼옥시다아제; 분해효소 예컨대 아세토락테이트 데카르복실라아제, 아스파르트산 β-데카르복실라아제, 푸마라아제 또는 히스타다아제; 트랜스페라아제 예컨대 시클로덱스트린 글리코실트랜스페라아제; 또는 연결효소일 수 있다. 특정 구현예에서, 단백질은 예를 들어, 아미노펩티다아제, 카르복시펩티다아제, 키티나아제, 큐티나아제, 디옥시리보뉴클레아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, 라카아제, 만노시다아제, 뮤타나아제, 펙틴용해성 효소, 폴리페놀옥시다아제, 리보뉴클레아제 또는 트랜스글루타미나아제일 수 있다.

특정 구현예에서, 제 1 발현 카세트에 의해 인코딩되는 관심 단백질은 세제-첨가제 단백질, 즉 a) 세포로부터 분비되며, b) 세탁 세제에 첨가될 단백질 (예를 들어, 효소) 이다. 전형적인 세제-첨가제 단백질은 프로테아제, 예를 들어, 서브틸리신, α-아밀라아제 및 리파아제를 포함한다. 서브틸리신, 즉, 세포외 알칼리성 세린 프로테아제가 특히 관심을 끈다. 서브틸리신은 야생형 유전체 내에서 발견되는 아미노산 서열을 갖거나 (즉, 서브틸리신은 자연-발생 서브틸리신일 수 있다), 또는 자연-발생 서브틸리신의 이형일 수 있으며, 이에 따라 야생형 유전체에 의해 인코딩되는 서브틸리신과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 일치하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 전형적인 서브틸리신은 하기를 포함한다: Alcanase® (Novozymes), FNA™ (Genencor), Savinase® (Novozymes), Purafect™ (Genencor), KAP™ (Kao), Everlase™ (Novozymes), Purafect OxP™ (Genencor), FN4™ (Genencor), BLAP S™ (Henkel), BLAP X™ (Henkel), Esperase® (Novozymes), Kannase™ (Novozymes) 및 Prosperase™ (Genencor). 기타 구현예에서, 서브틸리신은 서브틸리신 168, 서브틸리신 BPN', 서브틸리신 Carlsberg, 서브틸리신 DY, 서브틸리신 147 또는 서브틸리신 309 (예를 들어, 제 EP414279B 호, 제 WO89/06279 호 및 [Stahl et al., J. Bacteriol. 1984 159:811-818] 참조) 일 수 있다. 일부 구현예에서, 제 1 발현 카세트에 의해 인코딩되는 서브틸리신은 FNA:

이다. 서브틸리신의 전-pro 구역은 이탤릭체로 표기되어 있으며, 성숙 구역은 볼드체로 표기되어 있다 (SEQ ID NO: 12). FNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 예는 하기이다:

본원에서 사용될 수 있는 전형적인 서브틸리신 및 기타 프로테아제는 제 WO 99/20770 호; 제 WO 99/20726 호; 제 WO 99/20769 호; 제 WO 89/06279 호; RE 34,606; 미국 특허 제 4,914,031 호; 미국 특허 제 4,980,288 호; 미국 특허 제 5,208,158 호; 미국 특허 제 5,310,675 호; 미국 특허 제 5,336,611 호; 미국 특허 제 5,399,283 호; 미국 특허 제 5,441,882 호; 미국 특허 제 5,482,849 호; 미국 특허 제 5,631,217 호; 미국 특허 제 5,665,587 호; 미국 특허 제 5,700,676 호; 미국 특허 제 5,741,694 호; 미국 특허 제 5,858,757 호; 미국 특허 제 5,880,080 호; 미국 특허 제 6,197,567 호; 및 미국 특허 제 6,218,165 호에 기재된 것들을 포함한다. 일반적인 서브틸리신은 [Siezen (Protein Sci. 1997 6:501-523)] 에 매우 상세히 기술되어 있으며, 세제-첨가제 서브틸리신은 [Bryan (Biochim. Biophys. Acta 2000 1543:203-222)], [Maurer (Current Opinion in Biotechnology 2004 15:330-334)] 및 [Gupta (Appl Microbiol Biotechnol. 2002 59: 15-32)] 에 기술되어 있다. 일부 관심 서브틸리신은 IUBMB 효소 명명법에 따라, EC 3.4.4.16 에 기술된 활성을 갖는다.

기타 구현예에서, 관심 단백질은 치료 단백질 (즉, 치료적 생물학적 활성을 갖는 단백질) 일 수 있다. 적절한 치료 단백질의 예는 하기를 포함한다: 에리스로포이에틴, 사이토카인 예컨대 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 인터페론-o, 및 과립구-CSF, GM-CSF, 응고 인자 예컨대 인자 VIII, 인자 IX, 및 인간 단백질 C, 항트롬빈 III, 트롬빈, 가용성 IgE 수용체 α-사슬, IgG, IgG 단편, IgG 융합체, IgM, IgA, 인터루킨, 유로키나아제, 키마아제, 및 요소 트립신 저해제, IGF-결합 단백질, 표피세포 성장 인자, 성장호르몬-방출 인자, 아넥신 V 융합 단백질, 앤지오스타틴, 혈관 내피 성장 인자-2, 골수 전구체 저해 인자-1, 오스테오프로테게린, α-1-항트립신, α-태아 단백질, DNase II, 인간 플라스미노겐의 크링글 3, 글루코세레브로시다아제, TNF 결합 단백질 1, 난포 자극 호르몬, 세포독성 T 림프구 관련 항원 4-Ig, 트랜스멤브레인 활성제 및 칼슘 조절인자 및 시클로필린 리간드, 가용성 TNF 수용체 Fc 융합체, 글루카곤 유사 단백질 1 및 IL-2 수용체 작용제. 항체 단백질, 예를 들어 인간화될 수 있는 단일클론 항체가 특히 관심을 끈다.

추가의 구현예에서, 관심 단백질은 리포터 단백질일 수 있다. 상기 리포터 단백질은 예를 들어 시각적으로 검지가능하거나 색채생성성 (colorigenic) 일 수 있다. 상기 구현예에서, 단백질은 β-갈락토시다아제 (lacZ), β-글루쿠로니다아제 (GUS), 루시페라아제, 알칼리성 포스파타아제, 노팔린 합성효소 (NOS), 클로람페니콜 아세틸트랜스페라아제 (CAT), 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP) 또는 형광 단백질, 예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP), 또는 그의 유도체일 수 있다.

상술된 바와 같이, 코딩 서열은 융합 단백질을 인코딩할 수 있다. 상기 구현예의 일부에서, 융합 단백질은, 관심 단백질이 발현되는 숙주 세포로부터 관심 단백질의 분비를 가능하게 할 수 있으며, 그러한 것으로서 관심 단백질의 N-말단에 작동가능하게 연결되어 있는 신호 서열을 함유할 수 있는데, 상기 신호 서열은 단백질을 숙주 세포의 분비 시스템으로 안내하는 아미노산 서열을 함유하여, 숙주 세포로부터 숙주 세포가 성장하고 있는 배지로 단백질이 분비되는 결과를 초래한다. 신호 서열은 관심 단백질의 분비 전 융합 단백질로부터 절단된다.

제 2 발현 카세트

제 2 발현 카세트는 필수 효소의 발현을 가능하게 하며, 상기 필수 효소는 상술된 바와 같이 세포 성장을 위해 세포에 의해 요구된다. 특정 구현예에서, 필수 효소는 오로지 특정 조건 (예를 들어, 필수 효소의 손실을 무효화하는 외래적 화합물의 부재) 하에서만 세포 성장을 위해 요구되는 점에 있어서 조건적 필수일 수 있다. 일부 경우, 조건적 필수 효소의 활성이 결핍된 세포 (효소를 인코딩하는 유전자를 불활성화하거나, 효소의 저해제와 세포를 접촉시켜 수득될 수 있음) 는, 일부 경우에 효소의 산물 또는 대체 탄소원일 수 있는, 외래적 화합물을 첨가하여 배양 중 성장시킬 수 있다. 따라서, 일부 경우, 제 2 발현 카세트에서 사용되는 필수 효소는 세포로부터 결핍된 경우, 세포가 특정 화합물에 대해 영양요구성이 되게 하거나, 하나 이상의 특정 탄소원을 활용할 수 없게 만드는 효소일 수 있다.

상기 필수 효소/저해제 조합의 예는 공지되어 있으며, 예를 들어 하기를 포함한다: 아미노산 합성에 관여하는 효소 및 그의 각각의 저해제; 특정 탄소원의 활용에 관여하는 효소 및 그의 각각의 저해제. 상기 효소/저해제 조합의 예는 하기에 기술된다. 아미노산의 합성에 관여하는 효소를 인코딩하는 유전자의 불활성화는 그 아미노산에 대한 영양요구성을 초래한다. 마찬가지로, 특정 탄소원의 활용에 관여하는 효소를 인코딩하는 유전자의 불활성화는 또 다른 탄소원에 대한 영양요구성을 초래한다. 효소는 저해제를 절단하지 않는다. 오히려, 저해제가 효소의 촉매 활성을 가역적 및 특이적으로, 경쟁적 또는 비경쟁적으로 저해한다.

일 구현예에서, 효소는 시클로류신 [Chiang et al Molecular characterization of Plasmodium falciparum S- adenosylmethionine synthetase. Biochem J. 1999 344:571-6] 및 또한 메티오닌 유사체, 퓨린 유사체, 8-아자구아닌 및 아자티오프린 [Berger et al Characterisation of methionine adenosyltransferase from Mycobacterium smegmatis and M. tuberculosis BMC Microbiol. 2003; 3: 12] 에 의해 저해될 수 있는 S-아데노실-메티오닌 합성효소 (metE 에 의해 인코딩됨; Genbank 등록 번호. U52812; [Yocum et al, Cloning and characterization of the metE gene encoding S- adenosylmethionine synthetase from Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 1996 178:4604] 참조) 일 수 있다. S-아데노실-메티오닌 합성효소 유전자의 불활성화는 메티오닌 영양요구성을 초래한다.

또 다른 구현예에서, 효소는 3-카르복시-2-히드록시-4-메틸펜타노에이트의 3-카르복시-4-메틸-2-옥소펜타노에이트로의 전환을 촉매화하는 3-이소프로필말레이트 데히드로게나아제일 수 있다. 상기 효소는 leuB 에 의해 인코딩되며, leuB-결핍 균주는 루신 영양요구성이다. 3-이소프로필말레이트 데히드로게나아제는 예를 들어 O-이소부테닐 옥살릴히드록사메이트 [Singh et al The High-resolution Structure of LeuB (Rv2995c) from Mycobacterium tuberculosis Journal of Molecular Biology 2005 346: Pages 1-11] 에 의해 저해될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 효소는 메소-2,6-디아미노헵탄디오에이트의 L-라이신으로의 전환을 촉매화하며 lysA 에 의해 인코딩되는 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제일 수 있다. lysA-결핍 균주는 라이신 영양요구성일 것이다. 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제의 저해제는 란티오닌 술폭시드, 란티오닌 술폰의 메소 및 LL-이성체, 란티오닌, N-히드록시디아미노피멜레이트 4 및 N-아미노디아미노피멜레이트 5 를 포함하는 N-변형 유사체를 포함하는 디아미노피멜산의 유사체를 포함하나 이에 한정되지는 않는다 ([Kelland et al J. Biol. Chem. 1986 Analogs of diaminopimelic acid as inhibitors of meso - diaminopimelate decarboxylase from Bacillus sphaericus and wheat germ 261: 13216-13223] 참조).

또 다른 구현예에서, 효소는 5-아미노 레불린산의 합성을 촉매화하며 hemA 에 의해 인코딩되는, 글루타밀-tRNA 환원효소일 수 있다. hemA-결핍 균주는 5-아미노 레불린산 또는 헤민에 대해 영양요구성일 수 있다. 상기 효소는 글루타마이신에 의해 저해될 수 있다 [Schauer et al Escherichia coli Glutamyl-tRNA Reductase J. Biol. Chem. 2002 277: 48657-48663].

추가의 구현예에서, 효소는 L-알라닌 및 D-알라닌의 상호전환을 촉매화하며 alr (dal 로도 공지됨) 에 의해 인코딩되는 D-알라닌 라세미화효소일 수 있다. alr-결핍 균주는 세포벽 생합성에 필요한 D-알라닌에 대해 영양요구성이다. D-알라닌 라세미화효소의 저해제는 D-시클로세린, β-클로로-D-알라닌 및 O-카르바밀-D-세린을 포함하나 이제 한정되지는 않는다 (예를 들어, [Manning et al, Inhibition of bacterial Growth by β-chloro-D-alanine PNAS 1974 71:417-421] 참조). 일부 구현예에서, 제 2 발현 카세트는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어,

를 포함하며, 이는 하기 D-알라닌 라세미화효소를 인코딩한다:

저해제가 사용될 수 있는 기타 필수 효소는 예를 들어 하기를 포함한다: 자일로스 이소메라아제 (xylA), 글루코네이트 키나아제 (EC 2.7.1.12), 글루코네이트 퍼미아제 (gntK 또는 gntP), 글리세롤 키나아제, 글리세롤 데히드로게나아제, 예를 들어, glpP, glpF, glpK, 또는 glpD 또는 아라비노스 이소메라아제 (araA).

특정 구현예에서, 내재적 필수 효소에 대한 유전자가 세포 내에서 야생형 (즉, 불활성화되지 않음) 인 경우, 필수 효소가 내재적 필수 효소 수준의 50% 초과 (예를 들어, 약 70% 이상, 약 90% 이상 또는 약 100% 이상 내지 약 1000% 이상) 인 수준으로 제조된다는 점에서, 제 2 발현 카세트는 필수 효소의 현저한 발현을 가능하게 한다.

일부 구현예에서, M 구역에 의해 인코딩되는 필수 효소는 야생형 필수 효소의 아미노산 서열을 가지므로, 자연-발생적일 수 있다. 기타 구현예에서, M 구역에 의해 인코딩되는 필수 효소는 자연-발생 효소의 이형일 수 있다, 예를 들어, 자연 발생 필수 효소에 약 80% 이상 일치, 약 90% 이상 일치, 약 95% 이상 일치, 약 98% 이상 일치, 또는 약 99% 이상 일치하는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

특정 구현예에서, 필수 효소는 자연 발생 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 일부 구현예에서는, 임의의 불활성화 변이 전에, 숙주 세포의 유전체에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 가지므로 숙주 세포에 내재적일 수 있다.

특정 구현예에서, 발현 카세트 (즉, 프로모터, 코딩 서열 및 종료자) 의 뉴클레오타이드 서열은 임의의 불활성화 변이 전, 숙주 세포에 내재적인 유전자의 것일 수 있다. 상기 유전자는 발현 카세트의 로커스와 상이한 유전체 로커스에 있을 수 있다.

본 방법의 실행에 필요하지는 않지만, 필수 효소에 대한 내재적 유전자 (즉, A₁-P-M-A₂ 로커스를 아직 함유하지 않는 숙주 세포 내에 존재하는 유전자) 는 변이에 의해 불활성화될 수 있다. 박테리아 유전자를, 예를 들어, 결실, 치환 또는 삽입에 의해 특이적으로 불활성화시키는 방법이 당업계에 널리 공지되어 있다.

숙주 세포

본원에 사용되는 박테리아 세포는 그람 양성 또는 그람 음성일 수 있으며, 하기를 포함하나 그에 한정되지는 않는다: 바실러스 종 박테리아, 예를 들어, 바실 러스 클라우시이, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스, 바실러스 브레비스 (brevis), 바실러스 서쿨란스 (circulans), 바실러스 코애굴란스 (coagulans), 바실러스 라우터스 (lautus), 바실러스 렌터스 (lentus), 바실러스 리체니포르미스, 바실러스 메가 테리움 (megaterium), 바실러스 스테아로서모필러스, 바실러스 서브틸리스, 또는 바 실러스 투린지엔시스 (thuringiensis) 박테리아; 스트렙토마이시즈 종 박테리아, 예를 들어 S. 리비댄즈, S. 카르보필러스 (carbophilus), S. 헬바티커스 ( helvaticus), S. 루비지노서스 (rubiginosus) 또는 S. 뮤리너스 (murinus) 박테리아, 수도모나스 (Pseudomonas) 종 박테리아 및 E. 콜라이. 특정 경우, 박테리아 숙주 세포는 FDA 에 의해 GRAS, 즉, 일반적으로 안전한 것으로 인정되는 (Generally Recognized as Safe) 자격을 갖는, 단백질 제조를 위한 사용 이력을 갖는 균주의 세포일 수 있다.

B. 서브틸리스 숙주 세포는 미국 특허 제 5,264,366 호 및 제 4,760,025 호 (RE 34,606), 및 또한 1A6 (ATCC 39085), 168 (IA01), SB19, W23, Ts85, B637, PB1753 내지 PB1758, PB3360, JH642, 1A243 (ATCC 39,087), ATCC 21332, ATCC 6051, MI113, DE100 (ATCC 39,094), GX4931, PBT 110, 및 PEP 211 균주 (예를 들어, [Hoch et al, Genetics 1973 73:215-228] 참조); 미국 특허 제 4,450,235 호; 미국 특허 제 4,302,544 호; 및 제 EP 0134048 호) 에 기재된 것들을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 발현 숙주로서의 B. 서브틸리스의 사용은 또한, 예를 들어, Palva 등 및 기타 ([Palva et al, Gene 1982 19:81-87] 참조; [Fahnestock and Fischer, J. Bacteriol. 1986 165:796-804]; 및 [Wang et al, Gene 1988 69:39-47] 또한 참조) 에 의해 기술된다.

특정 구현예에서, 바실러스 숙주 세포는 단백질 발현을 최대화시키기 위해 엔지니어링될 수 있으며, 이러한 것으로서 하기 유전자의 하나 이상에서 불활성화 변화를 함유할 수 있다: degU, degS, degR 및 degQ. [Msadek et al. (J. Bacteriol. 1990 172:824-834)] 및 [Olmos et al, (Mol. Gen. Genet. 1997 253:562-567)] 참조. 하나의 균주는 바실러스 서브틸리스 종이며 degU32(Hy) 돌연변이를 지닌다. 또 다른 구현예에서, 바실러스 숙주 세포는 scoC4 ([Caldwell et al ., J. Bacteriol. 2001 183:7329-7340] 참조); spoIIE ([Arigoni et al ., Mol. Microbiol. 1999 31: 1407-1415] 참조); oppA 또는 opp 오페론 내의 또 다른 유전자 ([Perego et al ., Mol. Microbiol. 1991 5:173-185] 참조) 내의 돌연변이 또는 결손을 포함할 수 있다.

대상 방법에서 사용되는 박테리아 세포는 박테리아 숙주 세포의 유전체 내로 재조합 핵산을 삽입하여 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 예컨대 [Jung et al. (J. Gen. Appl. Microbiol. 1998 44 107-111)]; [Tangney et al . (FEMS Microbio. Lett. 1995 125: 107-114)]; [Petit et al . (EMBO J. 1992 11:1317-1326)]; 미국 특허 제 5,733,753 호 및 미국 특허 출원 제 20070134760 호의 것과 같은 공지된 방법과 유사한 방법을 사용하여 상동 또는 비상동 재조합에 의해 제조될 수 있다.

숙주 세포는 필수 효소를 인코딩하는 불활성화 내재적 유전자를 갖거나 갖지 않을 수 있다.

단백질 제조 방법

상술된 세포 사용 방법이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 대상 방법은 제 1 발현 카세트에 의해 인코딩되는 관심 단백질을 제조하는 세포의 개체군을 배양하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 및 상술된 바와 같이, 관심 단백질은 배양 배지로 분비될 수 있다. 상기 방법의 특정 구현예는 배양 배지로부터 관심 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.

관심 단백질은 임의의 편리한 방법, 예를 들어, 침전, 원심분리, 친화도, 여과 또는 당업계에 공지된 임의의 기타 방법에 의해 성장 배지로부터 회수될 수 있다. 예를 들어, 친화성 크로마토그래피 [Tilbeurgh et al., (1984) FEBS Lett. 16:215]; 고-분해능을 갖는 물질을 사용하는 이온-교환 크로마토그래피법 [Medve et al., (1998) J. Chromatography A 808: 153] 을 포함하는, 이온-교환 크로마토그래피법 ([Goyal et al., (1991) Biores. Technol. 36:37]; [Fliess et al., (1983) Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17:314]; [Bhikhabhai et al., (1984) J. Appl. Biochem. 6:336]; 및 [Ellouz et al., (1987) Chromatography 396:307]); 소수성 상호작용 크로마토그래피 [Tomaz and Queiroz, (1999) J. Chromatography A 865:123]; 2-상 분배 [Brumbauer, et al., (1999) Bioseparation 7:287]; 에탄올 침전; 역상 HPLC; DEAE 와 같은 양이온-교환 수지 상 또는 실리카 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱 (chromatofocusing); SDS-PAGE; 암모늄 술페이트 침전; 및 예를 들어, Sephadex G-75 를 사용하는 겔 여과가 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 세제-첨가제 단백질은 배양 배지의 기타 구성 성분로부터 정제하지 않고 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 배양 배지의 구성 성분은 예를 들어 간단히 농축된 후, 성장 배지의 기타 구성 성분으로부터 단백질의 추가적인 정제 없이 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 세포는 회분 또는 연속 발효 조건 하에서 배양될 수 있다. 전형적인 회분 발효법은, 배양 배지를 발효 작업의 개시 전에 제조하고, 배지에 바람직한 생물(들)을 접종하고, 배지에 임의의 구성 성분의 차후의 추가 없이 발효가 일어나는 폐쇄 시스템을 사용한다. 일부 경우, 성장 배지의 pH, 및 탄소원 함량이 아닌, 산소 함량이 회분법 중 변경될 수 있다. 회분 시스템의 대사물 및 세포 생물량은 발효가 정지되는 시간까지 계속 변화한다. 회분 시스템에서, 세포는 보통 정적 지체기를 거쳐 고-성장 대수증식기 및 최종적으로 성장률이 감소 또는 중단되는 정지기로 진행된다. 처리되지 않으면, 정지기 중의 세포는 결국 죽는다. 일반적으로 말하면, 대수증식기 중의 세포가 가장 많은 단백질을 제조한다.

표준 회분 시스템의 변형은 "유가 발효" 시스템이다. 상기 시스템에서, 영양소 (예를 들어, 탄소원, 질소원, 염, O₂ 또는 기타 영양소) 는 배양 중 그의 농도가 임계치 미만으로 하락했을 경우에만 첨가된다. 유가 시스템은 이화대사 억제가 세포의 대사를 저해시키는 경향이 있는 경우 및 배지 중 제한된 양의 영양소를 갖는 것이 바람직한 경우에 유용하다. 유가 시스템 내의 실제 영양소 농도의 측정은 측정가능한 요인 예컨대 pH, 용존 산소 및 CO₂ 와 같은 폐 기체의 분압의 변화에 근거하여 추정된다. 회분 및 유가 발효는 흔하며 당업계에 공지되어 있다.

연속 발효는 규정 배양 배지가 바이오리액터 (bioreactor) 에 연속적으로 가해지고 동일한 양의 조건 배지가 처리를 위해 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 연속 발효는 일반적으로 세포가 주로 대수증식기 성장 중에 있는, 일정한 고밀도로 배양물을 유지시킨다.

연속 발효는 세포 성장 및/또는 최종 산물 농도에 영향을 미치는 하나의 요인 또는 임의의 수의 요인의 조절을 감안한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 탄소원 또는 질소원과 같은 제한 영양소는 고정된 비율로 유지되고, 모든 기타 매개변수는 조절되도록 한다. 기타 시스템에서, 성장에 영향을 미치는 몇 가지 요인은 지속적으로 변경될 수 있음에 반하여, 배지 탁도로 측정되는 세포 농도는 일정하게 유지된다. 연속 시스템은 정상 상태 성장 조건을 유지하기 위해 노력한다. 따라서, 배지를 감함에 따른 세포 손실이 발효 중 세포 성장률에 대해 균형을 이루게 할 수 있다. 연속 발효 공정을 위한 영양소 및 성장 요인의 조절 방법뿐만 아니라, 산물 형성 속도 최대화를 위한 기법이 공지되어 있다.

실험

하기 실시예는 본 발명의 측면 및 특정 바람직한 구현예를 설명하고 추가로 예시하기 위해 제공되며, 그의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

재료 및 방법

DNA 를 조작하기 위해 사용된 실험 기법은 분자 생물학 분야에서의 표준 기법이었다 [Sambrook et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual]. Qiagen 키트 (kit) (Qiagen 사제) 를 사용하여 플라즈미드를 제조하고 삽입물을 정제하였다. 제한 엔도뉴클레아제 및 기타 효소는 Roche Applied Science 사 (Indianapolis, IN) 로부터 구입하였으며, 제조사가 추천하는 바와 같이 사용하였다. 적격 B. 서브틸리스 세포는 Ferrari E. 및 B. Miller [Bacillus expression: a Gram-Positive Model. In Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression. 1999. Academic Press, N. Y.] 에 의해 기술된 바와 같이 제조하였다.

PCR 반응은 Herculase 효소 (Stratagene 사제) 로, 제조사의 설명에 따라 수행하였다. 반응은 200 nM의 각 프라이머, 1 단위의 Herculase 및 200 μM 의 각 dNTP 를 함유하였다. Hybaid 로부터의 PxE Thermal Cycler (Thermo 사제) 를 하기 사이클로 사용하였다: 3 분간 94℃ 에서의 변성후, 30 초간 94 ℃ 에서의 변성 30 사이클, 30 초간 55℃ 에서의 어닐링 (annealing) 및 증폭될 1 kbp 당 1 분간 72℃ 에서의 신장. 이후, PCR 반응을 Invitrogen 사의 0.8% 아가로스 e-겔 상에서 분석하였다.

유전체 DNA 는 Eppendorf Phase Lock Gel 튜브 (Eppendorf 사제) 및 그의 프로토콜을 사용하여 준비하였다.

D-알라닌, D-시클로세린 및 β-클로로-D-알라닌은 Sigma 사로부터 수득하였다.

서브틸리신에 대한 검정

서브틸리신에 대한 검정은 1.6 mM N-숙시닐-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-니트로아닐리드 (Vega Biochemicals 사제) 를 함유하는 pH 8.6 의 0.1 M Tris 완충액 중 이전에 기술된 바 [Estell, D. V.,Graycar, T. P., Wells, J. A. (1985) J. Biol. Chem. 260, 6518-6521] 와 같이 수행하였다. 검정은 p-니트로아닐린의 방출에 기인한 410 nm/분에서의 흡광도의 증가를 측정한다. 검정은 초기 속도 조건 하에서 수행하였다. 프로테아제 단위는 1 cm 경로 길이를 갖는 큐벳 내에서 25 ℃ 하, 상술된 표준 용액의 410 nm 에서의 흡광도를 분당 1 흡광도 단위 (AU) 로 증가시키는 프로테아제 효소의 양으로 정의한다.

박테리아 균주

에셔리샤 (E scherichia ) 콜라이 MM294: endA thiA hsdR17 supE44

바실러스 서브틸리스 균주 BG2190 (alr-) 및 BG2189 (alr- CmR) 은 Ferrari 및 Yang (1985) [Isolation of an alanine racemase gene from Bacillus subtilis and its use for plasmid maintenance in B. subtilis . Biotechnology, 3, 1003-1007 (1985)] 에 의해 기술되었다.

B. 서브틸리스 균주 BG3594: nprE aprE spoIIE degU32 oppA

B. 서브틸리스 균주 BG3594comK: 이것은 이 균주가 과적격 (supercompetent) (즉, 세포 개체군의 1% 초과가 염섹체 바실러스 DNA 로 형질전환가능함) 이 되도록 하는, 제 WO 02/14490 호에 기술된 바와 같은 xylR-PxylA-comK 구축물을 함유하는 B. 서브틸리스 BG3594 이다.

B. 서브틸리스 균주 CP3490: 상기 균주는 alr 가 녹다운 (knocked down) 된 (BG2190 에서와 동일한 돌연변이) B. 서브틸리스 균주 BG3594comK 이다.

B. 서브틸리스 CP35491: 상기 균주는 alr 가 녹다운된 (BG2190 에서와 동일한 돌연변이) B. 서브틸리스 균주 BG3594 이다.

B. 서브틸리스 MDT01-138: 상기 균주는 하기 구조의 증폭가능한 카세트를 갖는 B. 서브틸리스 균주 BG3594 이다: aprE 5'-서브틸리신 FNA-클로람페니콜-aprE 5'. 이것은 Cm25 로 증폭하였다.

B. 서브틸리스 균주 CP4010: 상기 균주는 하기 구조의 증폭가능한 카세트를 갖는 B. 서브틸리스 균주 BG3594comK 이다: aprE 5'-서브틸리신 FNA-alr-aprE 5'. 이것은 β-클로로-D-알라닌을 사용하여 증폭하였다.

B. 서브틸리스 균주 CP4020: 상기 균주는 하기 구조의 증폭가능한 카세트를 갖는 B. 서브틸리스 균주 BG3594 이다: aprE 5'-서브틸리신 FNA-alr-aprE 5'. 이것은 β-클로로-D-알라닌을 사용하여 증폭하였다.

B. 서브틸리스 균주 Hyper1: 이것은 서브틸리신 FNA 를 인코딩하며 클로람페니콜 마커를 함유하는 증폭가능한 카세트를 갖는다.

CP3591: 상기 균주는 oppA 로커스 내 aprE 프로모터 후에 서브틸리신 FNA 의 하나의 복제본을 갖는 BG3594 이다 (즉, 총 1 개 복제본의 서브틸리신).

CP3592: 이것은 ybdL 및 ybdM 유전자 사이 aprE 프로모터 후에 서브틸리신 FNA 의 하나의 추가적인 복제본을 갖는 CP3591 이다 (즉, 총 2 개 복제본의 서브틸리신).

CP3593: 이것은 pps 로커스 내 aprE 프로모터 후에 서브틸리신 FNA 의 하나의 추가적인 복제본을 갖는 CP3592 이다 (즉, 총 3 개 복제본의 서브틸리신).

CP3594: 이것은 nprE 로커스 내 aprE 프로모터 후에 서브틸리신 FNA 의 하나의 추가적인 복제본을 갖는 CP3593 이다 (즉, 총 4 개 복제본의 서브틸리신).

플라스미드

pDALsub1 은 [Ferrari et al. 1985] 에 기재되어 있다. 상기 플라스미드는 alr 을 발현한다 [Ferrari and Yang, Biotechnology, 3, 1003-1007 (1985)].

pBSFNACm (Seq ID NO:1): 상기 플라스미드는 f1 (IG) - 파지 f1 의 유전자간 구역; rep (pMB1) - 파지미드의 복제의 원인이 되는 pMB1 레플리콘; bla (ApR) - 암피실린에 대한 내성을 부여하는 베타-락타마아제를 코딩하는 유전자; lacZ - 베타-갈락토시다아제의 N-말단 단편을 인코딩하는 lacZ 유전자의 5'-말단 부분; aprE 5' 구역을 포함하는 폴리펩타이드 발현 카세트, 서브틸리신 (FNA) 을 코딩하는 유전자, 그의 프로모터를 갖는 pC194 로부터의 클로람페니콜 내성 유전자, aprE 5' 구역의 반복 서열을 함유하는, pBluescript 유도체 [Alting-Mees,M.A. and ShortJ.M. pBluescript II: gene mapping vectors. Nucleic Acids Res. 17 (22), 9494 (1989)] 이다. 상기 플라스미드를 사용하여 5' aprE 구역에 발현 카세트를 혼입시킨다.

pBSFNAalr (Seq ID NO:2): 상기 플라스미드는 상술된 pBSFNACm 의 유도체이다. 상기 플라스미드에서, B. 서브틸리스 alr 유전자와 그 자체의 프로모터는 클로람페니콜-내성 유전자를 대체한다. 상기 플라스미드를 사용하여 5' aprE 구역에 발현 카세트를 혼입시킨다.

배지

[Ausubel, F.M. et al. (eds) "Current Protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995] 에 기술된 바와 같은 LB 및 LB 아가. LBG 1% 는 10 g/L 글루코스를 보충한 LB 이다. LBSM 은 1.6% 탈지유를 보충한 LB 아가이다. 프로테아제 제조를 연구하기 위해 사용된 FNII 배지는 제 WO05052146A2 호에 기재된다. Alr- 균주는 LB 아가 + 100 mg/L D-알라닌 상에서 증식된다.

적절한 경우, 클로람페니콜, 암피실린, 시클로세린 또는 β-클로로-D-알라닌을 플레이트 또는 액체 배지에 첨가하였다.

정량 PCR ( qPCR )

제조될 관심 폴리펩타이드 (예를 들어, 서브틸리신) 를 인코딩하는 유전자의 복제수를 정량화하기 위한 qPCR 은 ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems 사제, Foster City, CA) 상에서 수행하였다. TaqMan® Gene Expression Master Mix 키트는 제조사 (Applied Biosystems 사, Foster City, CA) 에 의해 지시된 바와 같이 사용하였다.

발효

시험될 균주는 37℃ 및 250 rpm 하, 10 mL 튜브 내에서 LBG 1% 5 mL 중 성장시켰다. ~1 의 OD₆₀₀ 에서, 2.5 mL 의 배양액을 사용하여 250 mL 삼각 진탕 플라스크 내의 FNII 배지 25 mL 을 접종하였다. 진탕 플라스크는 37℃ 및 250 rpm 에서 인큐베이션하고, 액체배지 시료를 정기적으로 취하여 서브틸리신 활성을 측정하였다.

실시예 1

β- 클로로 -D-알라닌 ( CDA ) 에 대한 바실러스 서브틸리스 BG3594 및 BG3594 , pDALsub1 의 감수성 임계치의 측정

제 1 상에서, B. 서브틸리스의 성장을 저해하는데 필요한 β-클로로-D-알라닌 (CDA) 의 농도는 각각 다른 농도의 CDA 를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 LB-성장 균주 BG3594 의 희석액을 플레이팅 (plating) 하여 측정하였다. 표 1 에 기재된 바와 같이, BG3594 가 20 mg/L 의 농도에서 여전히 성장할 수 있는 한편, 50 mg/L 의 농도에서는 성장이 완전히 저해되었다. 제 2 상에서, alr 의 과발현이 저해 농도의 CDA 상에서 성장을 회복시킬 수 있는지 확인하기 위해 pDalsub1 을 BG3594 내로 형질전환시켰다. 표 1 에 기재된 바와 같이, alr-발현 플라스미드의 존재는 시험된 모든 CDA 농도에서 성장을 허용한다. 상기 결과는 염색체-인코딩된 발현 카세트 "관심 폴리펩타이드-alr" 를 함유하는 균주가 오로지 증폭이 발생할 경우에만 20 mg/L 초과의 CDA 농도에서 성장할 수 있음을 나타낸다. 기타 알라닌 라세미화효소 저해제, 예컨대 시클로세린을 CDA 대신 사용할 수 있다.

LB 아가 플레이트 내 증가하는 농도의 β- 클로로 -D-알라닌에 대한 BG3594 및 BG3594, pDALsub1 의 내성

CDA mg/L	0	20	50	100
BG3594	+*	+	-**	-
BG3594, pDALsub1	+	+	+	+

*+: 성장; **-: 성장 없음

실시예 2

염색체-인코딩된 발현 카세트 "관심 폴리펩타이드 - 마커" 를 함유하는 균주 (균주 BG4010 ( comK ) 및 BG4020 ) 의 구축

플라스미드 pBSFNAalr (SEQ ID NO:2) 를 pBSFNACm (SEQ ID NO:1) 으로부터 하기와 같이 구축하였다. 그 자체의 프로모터를 갖는 B. 서브틸리스 alr 유전자는 염색체 DNA 를 주형으로 사용하여 PCR-증폭하였다. 사용된 프라이머는 EcoRIDrdIalrF (DrdI 부위를 가짐; gaagaattcg actaggttgt cttttcgtta gacatcgttt ccctttage; SEQ ID NO:3) 및 SmaI-alrR (SmaI 부위를 가짐; ggttcccggg ttaattgctt atatttacct gcaataaagg; SEQ ID NO:4) 이었다. PCR 산물은 DrdI/SmaI 로 소화시키고 BsmI/StuI-소화된 pBSFNACm 의 더 큰 단편으로 재결찰 (religated) 하였다. 결찰물은 E. 콜라이 균주 MM294 에 형질전환시켰으며, 카르베니실린 50 ppm 상에 플레이팅하였다. 상기 형질전환으로부터의 4 개 집락은 플라스미드 정제를 위해 5 mL LB + 카르베니실린 50 ppm 에 접종하였다. 결과의 구축물은 pBSFNAalr (SEQ ID NO:2) 로 칭하였다.

pBSFNAalr 을 NotI/ScaI (완충액 H) 로 소화시켜, 겔 상에 영동 시 4 개의 단편을 수득하였다. 단편의 크기는 하기와 같았다: 3660-2263-1105-174. 카세트 5'-FNA-alr-5' 를 함유하는 가장 큰 조각을 겔 정제하고 그 자체 상에서 결찰시켰다. 결찰은 "급속 결찰" 키트 (Roche 사제) 로 수행하였다. 수득된 원형 조각의 DNA 는 회전환 반응 (Amersham 사제 키트) 시키고, CP3590 또는 CP3591 중 어느 하나의 적격 세포 내로 형질전환시키고, LA + 1.6% 탈지유 상에 플레이팅, BG3594 또는 BG3594comK 중 어느 하나 및 LA + 1.6% 탈지유 + 50 ppm CDA 상에 플레이팅하였다. 적합한 구축물을 갖는 균주는 상기 플레이트 상에서 성장하며 발현된 프로테아제에 의한 탈지유 제거에 기인한 원형 테두리를 나타낼 것이다.

카세트는 상기 문단에 언급된 균주의 염색체 DNA 로 형질전환 및 CDA50 상의 선별에 의해 임의의 균주에 허용될 수 있다. 카세트의 증폭은 증가하는 양의 CDA (200 ppm 이하) 상에 균주를 스트리킹 (streaking) 하여 수행하였다. 증폭된 균주는 1.6% 탈지유 상에 플레이팅하였을 경우 더 큰 원형 테두리를 가져, 증가하는 양의 CDA 에 균주를 통과시키는 것이 카세트의 증폭을 초래함을 나타냈다.

실시예 3

qPCR 을 사용한, BG4020 균주 내 서브틸리신 유전자의 복제수의 측정

염색체 DNA 는 CP3591, CP3592, CP3593, BG4020, BG4020 증폭 및 Hyper1 균주로부터 추출하였다. DNA 농도를 측정하고 시료는 각 시료에 대해 동일한 농도로 희석하였다. 이후, 서브틸리신 유전자 (FNA-R2; ccagtgtagc cttgagag; SEQ ID NO:5 및 FNA-F2; acaatgagca cgatgagc; SEQ ID NO:6) 에 어닐링하는 프라이머와 함께 각각의 균주에 대한 동일한 양의 DNA 를 qPCR 반응에서 사용하였다.

각각 1, 2 및 3 개의 유전자 복제본을 갖는 CP3591, CP3592 및 CP3593 균주를 사용하여 교정 곡선 (도 3) 을 수득하였다. 상기 교정 곡선을 사용하여 BG4020, BG4020 증폭 및 MDT01-138 내의 서브틸리신 복제수를 확인하였다.

표 2 는 BG4020, BG4020-증폭 및 Hyper1 균주 내에서 qPCR 반응으로부터 수득된 수를 제공한다. 상응하는 서브틸리신 유전자 복제수는 도 3 에 제공된 교정 곡선으로부터 수득하였다. 결과는 alr 마커로의 증폭 (BG4020-증폭) 이 클로람페니콜 마커로의 증폭 (Hyper1) 만큼 효율적임을 나타낸다; BG4020-증폭 및 Hyper1 균주 모두 동일한 복제수 (즉, 4 개) 를 함유하는 것으로 확인되었다. 4020 내의 정수가 아닌 복제수는 증폭된 유전자의 동일한 복제수를 동질적으로 함유하지 않는 세포의 개체군으로부터 초래될 수 있으며; 2.4 의 수치는 평균을 나타낸다.

균주	수	복제수
BG4020	19.473	2.4
BG4020 증폭	17.499	4.2
Hyper 1	17.665	4.1

실시예 4

Cm 또는 alr -함유 카세트로 증폭된 균주로부터의 관심 폴리펩타이드의 제조

시험될 균주는 37℃ 및 250 rpm 하, 10 mL 튜브 내에서 LBG 1% 5 mL 중 성장시켰다. ~1 의 OD₆₀₀ 에서, 2.5 mL 의 배양액을 사용하여 250 mL 삼각 진탕 플라스크 내의 FNII 배지 25 mL 을 접종하였다. 진탕 플라스크는 37℃ 및 250 rpm 에서 인큐베이션하고, 액체배지 시료를 정기적으로 취하여 서브틸리신 활성을 측정하였다. 4 개의 균주를 하기 방식으로 시험하였다: BG3591 (증폭불가능한, 서브틸리신 유전자 복제본 1 개를 함유함), MDT01-138 (클로람페니콜을 사용하여 증폭함), BG4020 (카세트 5'-서브틸리신-alr-5' 가 도입된 균주), BG4020-증폭 (증가하는 CDA 농도상에 다시 스트리킹된 BG4020 균주). MDT01-138 은 Hyper1 에 유사유전자형인 균주이다 - 상기는 클로람페니콜 마커 유전자를 함유한다.

각각의 상기 균주에 의해 진탕 플라스크 내에서 제조된 서브틸리신 프로테아제의 양은 도 4 에 나타낸다. 이 도표로부터, 서브틸리신 유전자의 증폭 (BG4020-증폭) 은 단일-복제본 균주 (BG3591) 또는 비-증폭 균주 (BG4020) 보다 더 많은 프로테아제 제조를 초래한다. 추가로, alr 마커를 사용한 증폭에 의해 수득된 균주 (BG4020-증폭) 는 클로람페니콜 마커를 사용하여 증폭된 균주 (MDT01-138) 보다 더 많은 프로테아제를 제조하였다.

상기 결과는 alr 유전자가, 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 발현 카세트를 증폭하고, 그에 따라 높은 수준의 관심 폴리펩타이드를 제조하기 위한 비(非)-항생제, 비-외래적 마커로서 효율적으로 사용될 수 있음을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> Danisco US Inc., Genencor Division Ferrari, Eugenio Peres, Caroline <120> Method for Amplifying Locus in Bacterial Cell <130> 31147WO <140> PCT/US09/38511 <141> 2009-03-27 <150> US 61/040,456 <151> 2008-03-28 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic pBSFNACm plasmid <400> 1 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540 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cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 5880 tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 5940 agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 6000 tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 6060 acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 6120 tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 6180 agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 6240 tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 6300 acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 6360 tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 6420 ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 6480 agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 6540 tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 6600 acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 6660 agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 6720 actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 6780 tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 6840 gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 6900 ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 6960 tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 7020 aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 7080 tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 7140 tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccac 7198 <210> 3 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 3 gaagaattcg actaggttgt cttttcgtta gacatcgttt ccctttagc 49 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic primer <400> 4 ggttcccggg ttaattgctt atatttacct gcaataaagg 40 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 5 ccagtgtagc cttgagag 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 6 acaatgagca cgatgagc 18 <210> 7 <211> 4241 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic amplification unit <400> 7 tccattttct tctgctatca aaataacaga ctcgtgattt tccaaacgag ctttcaaaaa 60 agcctctgcc ccttgcaaat cggatgcctg tctataaaat tcccgatatt ggttaaacag 120 cggcgcaatg gcggccgcat ctgatgtctt tgcttggcga atgttcatct tatttcttcc 180 tccctctcaa taattttttc attctatccc ttttctgtaa agtttatttt tcagaatact 240 tttatcatca tgctttgaaa aaatatcacg ataatatcca ttgttctcac ggaagcacac 300 gcaggtcatt tgaacgaatt ttttcgacag gaatttgccg ggactcagga gcatttaacc 360 taaaaaagca tgacatttca gcataatgaa catttactca tgtctatttt cgttcttttc 420 tgtatgaaaa tagttatttc gagtctctac ggaaatagcg agagatgata tacctaaata 480 gagataaaat catctcaaaa aaatgggtct actaaaatat tattccattt attacaataa 540 attcacagaa tagtctttta agtaagtcta ctctgaattt ttttaaaagg agagggtaaa 600 gagtgagaag caaaaaattg tggatcagtt tgctgtttgc tttagcgtta atctttacga 660 tggcgttcgg cagcacatcc tctgcccagg cggcagggaa atcaaacggg gaaaagaaat 720 atattgtcgg gtttaaacag acaatgagca cgatgagcgc cgctaagaag aaagatgtca 780 tttctgaaaa aggcgggaaa gtgcaaaagc aattcaaata tgtagacgca gcttcagcta 840 cattaaacga aaaagctgta aaagaattga aaaaagaccc gagcgtcgct tacgttgaag 900 aagatcacgt agcacatgcg tacgcgcagt ccgtgcctta cggcgtatca caaattaaag 960 cccctgctct gcactctcaa ggctacactg gatcaaatgt taaagtagcg gttatcgaca 1020 gcggtatcga ttcttctcat cctgatttaa aggtagcagg cggagccagc atggttcctt 1080 ctgaaacaaa tcctttccaa gacaacaact ctcacggaac tcacgttgcc ggcacagttg 1140 cggctcttaa taactcaatc ggtgtattag gcgttgcgcc aagcgcatca ctttacgctg 1200 taaaagttct cggtgctgac ggttccggcc aatacagctg gatcattaac ggaatcgagt 1260 gggcgatcgc aaacaatatg gacgttatta acatgagcct cggcggacct tctggttctg 1320 ctgctttaaa agcggcagtt gataaagccg ttgcatccgg cgtcgtagtc gttgcggcag 1380 ccggtaacga aggcacttcc ggcagctcaa gcacagtggg ctaccctggt aaataccctt 1440 ctgtcattgc agtaggcgct gttgacagca gcaaccaaag agcatctttc tcaagcgtag 1500 gacctgagct tgatgtcatg gcacctggcg tatctatcca aagcacgctt cctggaaaca 1560 aatacggcgc gttgaacggt acatcaatgg catctccgca cgttgccgga gcggctgctt 1620 tgattctttc taagcacccg aactggacaa acactcaagt ccgcagcagt ttagaaaaca 1680 ccactacaaa acttggtgat tctttctact atggaaaagg gctgatcaac gtacaggcgg 1740 cagctcagta aaacataaaa aaccggcctt ggccccgccg gttttttatt atttttcttc 1800 ctccgcatgt tcaatccgct ccataatcga cggatggctc cctctgaaaa ttttaacgag 1860 aaacggcggg ttgacccggc tcagtcccgt aacggccaag tcctgaaacg tctcaatcgc 1920 cgcttcccgg tttccggtca gctcaatgcc gtaacggtcg gcggcgtttt cctgataccg 1980 ggagactttt cgttagacat cgtttccctt tagcctttaa ttttagtatg atatgtaaat 2040 gatattgaat aaaagctagg aagtgtcgta atgagcacaa aaccttttta cagagatacg 2100 tgggcggaaa ttgacttgtc cgcgataaag gaaaatgtca gcaatatgaa aaaacatatc 2160 ggtgaacatg tccacttgat ggcagttgtg aaagcaaacg cctacgggca tggtgatgca 2220 gaaacagcaa aggctgctct tgacgcaggt gcttcatgct tggccgtggc cattttggat 2280 gaagcgattt cactgcgcaa aaagggattg aaggcgccta tattggtgct tggcgcggtt 2340 cccccggagt atgtggcaat cgctgctgag tatgacgtga ccttaacagg ttattctgtt 2400 gaatggcttc aggaggcagc ccgccacacg aaaaaaggtt ctcttcattt tcatctgaag 2460 gtcgatacgg ggatgaacag acttggtgta aaaacagagg aagaagttca gaacgtgatg 2520 gcaattcttg accgcaaccc tcgtttaaag tgcaaagggg tatttaccca ttttgcgaca 2580 gcggatgaaa aagaaagagg ctatttctta atgcagtttg agcgctttaa agagctgatt 2640 gctccgctgc cgttaaagaa tctaatggtc cactgcgcga acagcgccgc tggactccgg 2700 ctgaaaaaag gcttttttaa tgcagtcaga ttcggcatcg gcatgtatgg ccttcgcccg 2760 tctgctgaca tgtcggacga gataccgttt cagctgcgtc cggcatttac cctgcattcg 2820 acactgtcac atgtcaaact gatcagaaaa ggcgagagcg tcagctacgg agccgagtac 2880 acagcggaaa aagacacatg gatcgggacg gtgcctgtag gctatgcgga cggctggctc 2940 cgaaaattga aagggaccga catccttgtg aagggaaaac gcctgaaaat tgccggccga 3000 atttgcatgg accaatttat ggtggagctg gatcaggaat atccgccggg cacaaaagtc 3060 acattaatag gccggcaggg ggatgaatat atttccatgg atgagattgc aggaaggctc 3120 gaaaccatta actatgaggt ggcctgtaca ataagttccc gtgttccccg tatgtttttg 3180 gaaaatggga gtataatgga agtaagaaat cctttattgc aggtaaatat aagcaattaa 3240 cctaatgact ggcttttata atatgagata atgccgactg tactttttac agtcggtttt 3300 ctaatgtcac taacctgccc cgttagttga agaaggtttt tatattacag ctccagatcc 3360 atatccttct ttttctgaac cgacttctcc tttttcgctt ctttattcca attgctttat 3420 tgacgttgag cctcggaacc cttaacaatc ccaaaacttg tcgaatggtc ggcttaatag 3480 ctcacgctat gccgacattc gtctgcaagt ttagttaagg gttcttctca acgcacaata 3540 aattttctcg gcataaatgc gtggtctaat ttttattttt aataaccttg atagcaaaaa 3600 atgccattcc aatacaaaac cacataccta taatcgacct gcaggaatta attcctccat 3660 tttcttctgc tatcaaaata acagactcgt gattttccaa acgagctttc aaaaaagcct 3720 ctgccccttg caaatcggat gcctgtctat aaaattcccg atattggctt aaacagcggc 3780 gcaatggcgg ccgcatctga tgtctttgct tggcgaatgt tcatcttatt tcttcctccc 3840 tctcaataat tttttcattc tatccctttt ctgtaaagtt tatttttcag aatactttta 3900 tcatcatgct ttgaaaaaat atcacgataa tatccattgt tctcacggaa gcacacgcag 3960 gtcatttgaa cgaatttttt cgacaggaat ttgccgggac tcaggagcat ttaacctaaa 4020 aaagcatgac atttcagcat aatgaacatt tactcatgtc tattttcgtt cttttctgta 4080 tgaaaatagt tatttcgagt ctctacggaa atagcgagag atgatatacc taaatagaga 4140 taaaatcatc tcaaaaaaat gggtctacta aaatattatt ccatttatta caataaattc 4200 acagaatagt cttttaagta agtctactct gaattttttt a 4241 <210> 8 <211> 382 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic variant <400> 8 Val Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Ile Phe Thr Met Ala Phe Gly Ser Thr Ser Ser Ala Gln Ala Ala Gly 20 25 30 Lys Ser Asn Gly Glu Lys Lys Tyr Ile Val Gly Phe Lys Gln Thr Met 35 40 45 Ser Thr Met Ser Ala Ala Lys Lys Lys Asp Val Ile Ser Glu Lys Gly 50 55 60 Gly Lys Val Gln Lys Gln Phe Lys Tyr Val Asp Ala Ala Ser Ala Thr 65 70 75 80 Leu Asn Glu Lys Ala Val Lys Glu Leu Lys Lys Asp Pro Ser Val Ala 85 90 95 Tyr Val Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Tyr Ala Gln Ser Val Pro 100 105 110 Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gln Gly Tyr 115 120 125 Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile Asp Ser 130 135 140 Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala Ser Met Val Pro Ser 145 150 155 160 Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His Gly Thr His Val Ala 165 170 175 Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala 180 185 190 Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser 195 200 205 Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ala Asn 210 215 220 Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser Ala 225 230 235 240 Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala Ser Gly Val Val Val 245 250 255 Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly Ser Ser Ser Thr Val 260 265 270 Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp 275 280 285 Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Pro Glu Leu Asp 290 295 300 Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr Leu Pro Gly Asn Lys 305 310 315 320 Tyr Gly Ala Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly 325 330 335 Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Trp Thr Asn Thr Gln 340 345 350 Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys Leu Gly Asp Ser Phe 355 360 365 Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala Ala Ala Gln 370 375 380 <210> 9 <211> 1147 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 9 gtgagaagca aaaaattgtg gatcagtttg ctgtttgctt tagcgttaat ctttacgatg 60 gcgttcggca gcacatcctc tgcccaggcg gcagggaaat caaacgggga aaagaaatat 120 attgtcgggt ttaaacagac aatgagcacg atgagcgccg ctaagagaaa gatgtcattt 180 ctgaaaaagg cgggaaagtg caaaagcaat tcaaatatgt agacgcagct tcagctacat 240 taaacgaaaa agctgtaaaa gaattgaaaa aagacccgag cgtcgcttac gttgaagaag 300 atcacgtagc acatgcgtac gcgcagtccg tgccttacgg cgtatcacaa attaaagccc 360 ctgctctgca ctctcaaggc tacactggat caaatgttaa agtagcggtt atcgacagcg 420 gtatcgattc ttctctcctg atttaaaggt agcaggcgga gccagcatgg ttccttctga 480 aacaaatcct ttccaagaca acaactctca cggaactcac gttgccggca cagttgcggc 540 tcttaataac tcaatcggtg tattaggcgt tgcgccaagc gcatcacttt acgctgtaaa 600 agttctcggt gctgacggtt ccggccaata cagctggatc attaacggaa tcgagtgggc 660 gatcgcaaac aatatggacg ttattaacat gagcctcggc ggaccttctg gttctgctgc 720 tttaaaagcg gcagttgata aagccgttgc atccggcgtc gtagtcgttg cggcagccgg 780 taacgaaggc acttccggca gctcaagcac agtgggctac cctggtaaat acccttctgt 840 cattgcagta ggcgctgttg acagcagcaa ccaaagagca tctttctcaa gcgtaggacc 900 tgagcttgat gtcatggcac ctggcgtatc tatccaaagc acgcttcctg gaaacaaata 960 cggcgcgttg aacggtacat caatggcatc tccgcacgtt gccggagcgg ctgctttgat 1020 tctttctaag cacccgaact ggacaaacac tcaagtccgc agcagtttag aaaacaccac 1080 tacaaaactt ggtgattctt tctactatgg aaaagggctg atcaacgtac aggcggcagc 1140 tcagtaa 1147 <210> 10 <211> 1170 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 10 atgagcacaa aaccttttta cagagatacg tgggcggaaa ttgacttgtc cgcgataaag 60 gaaaatgtca gcaatatgaa aaaacatatc ggtgaacatg tccacttgat ggcagttgtg 120 aaagcaaacg cctacgggca tggtgatgca gaaacagcaa aggctgctct tgacgcaggt 180 gcttcatgct tggccgtggc cattttggat gaagcgattt cactgcgcaa aaagggattg 240 aaggcgccta tattggtgct tggcgcggtt cccccggagt atgtggcaat cgctgctgag 300 tatgacgtga ccttaacagg ttattctgtt gaatggcttc aggaggcagc ccgccacacg 360 aaaaaaggtt ctcttcattt tcatctgaag gtcgatacgg ggatgaacag acttggtgta 420 aaaacagagg aagaagttca gaacgtgatg gcaattcttg accgcaaccc tcgtttaaag 480 tgcaaagggg tatttaccca ttttgcgaca gcggatgaaa aagaaagagg ctatttctta 540 atgcagtttg agcgctttaa agagctgatt gctccgctgc cgttaaagaa tctaatggtc 600 cactgcgcga acagcgccgc tggactccgg ctgaaaaaag gcttttttaa tgcagtcaga 660 ttcggcatcg gcatgtatgg ccttcgcccg tctgctgaca tgtcggacga gataccgttt 720 cagctgcgtc cggcatttac cctgcattcg acactgtcac atgtcaaact gatcagaaaa 780 ggcgagagcg tcagctacgg agccgagtac acagcggaaa aagacacatg gatcgggacg 840 gtgcctgtag gctatgcgga cggctggctc cgaaaattga aagggaccga catccttgtg 900 aagggaaaac gcctgaaaat tgccggccga atttgcatgg accaatttat ggtggagctg 960 gatcaggaat atccgccggg cacaaaagtc acattaatag gccggcaggg ggatgaatat 1020 atttccatgg atgagattgc aggaaggctc gaaaccatta actatgaggt ggcctgtaca 1080 ataagttccc gtgttccccg tatgtttttg gaaaatggga gtataatgga agtaagaaat 1140 cctttattgc aggtaaatat aagcaattaa 1170 <210> 11 <211> 389 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 11 Met Ser Thr Lys Pro Phe Tyr Arg Asp Thr Trp Ala Glu Ile Asp Leu 1 5 10 15 Ser Ala Ile Lys Glu Asn Val Ser Asn Met Lys Lys His Ile Gly Glu 20 25 30 His Val His Leu Met Ala Val Val Lys Ala Asn Ala Tyr Gly His Gly 35 40 45 Asp Ala Glu Thr Ala Lys Ala Ala Leu Asp Ala Gly Ala Ser Cys Leu 50 55 60 Ala Val Ala Ile Leu Asp Glu Ala Ile Ser Leu Arg Lys Lys Gly Leu 65 70 75 80 Lys Ala Pro Ile Leu Val Leu Gly Ala Val Pro Pro Glu Tyr Val Ala 85 90 95 Ile Ala Ala Glu Tyr Asp Val Thr Leu Thr Gly Tyr Ser Val Glu Trp 100 105 110 Leu Gln Glu Ala Ala Arg His Thr Lys Lys Gly Ser Leu His Phe His 115 120 125 Leu Lys Val Asp Thr Gly Met Asn Arg Leu Gly Val Lys Thr Glu Glu 130 135 140 Glu Val Gln Asn Val Met Ala Ile Leu Asp Arg Asn Pro Arg Leu Lys 145 150 155 160 Cys Lys Gly Val Phe Thr His Phe Ala Thr Ala Asp Glu Lys Glu Arg 165 170 175 Gly Tyr Phe Leu Met Gln Phe Glu Arg Phe Lys Glu Leu Ile Ala Pro 180 185 190 Leu Pro Leu Lys Asn Leu Met Val His Cys Ala Asn Ser Ala Ala Gly 195 200 205 Leu Arg Leu Lys Lys Gly Phe Phe Asn Ala Val Arg Phe Gly Ile Gly 210 215 220 Met Tyr Gly Leu Arg Pro Ser Ala Asp Met Ser Asp Glu Ile Pro Phe 225 230 235 240 Gln Leu Arg Pro Ala Phe Thr Leu His Ser Thr Leu Ser His Val Lys 245 250 255 Leu Ile Arg Lys Gly Glu Ser Val Ser Tyr Gly Ala Glu Tyr Thr Ala 260 265 270 Glu Lys Asp Thr Trp Ile Gly Thr Val Pro Val Gly Tyr Ala Asp Gly 275 280 285 Trp Leu Arg Lys Leu Lys Gly Thr Asp Ile Leu Val Lys Gly Lys Arg 290 295 300 Leu Lys Ile Ala Gly Arg Ile Cys Met Asp Gln Phe Met Val Glu Leu 305 310 315 320 Asp Gln Glu Tyr Pro Pro Gly Thr Lys Val Thr Leu Ile Gly Arg Gln 325 330 335 Gly Asp Glu Tyr Ile Ser Met Asp Glu Ile Ala Gly Arg Leu Glu Thr 340 345 350 Ile Asn Tyr Glu Val Ala Cys Thr Ile Ser Ser Arg Val Pro Arg Met 355 360 365 Phe Leu Glu Asn Gly Ser Ile Met Glu Val Arg Asn Pro Leu Leu Gln 370 375 380 Val Asn Ile Ser Asn 385 <210> 12 <211> 275 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 12 Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu 1 5 10 15 His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp 20 25 30 Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala 130 135 140 Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly 145 150 155 160 Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala 165 170 175 Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr 195 200 205 Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn 225 230 235 240 Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys 245 250 255 Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala 260 265 270 Ala Ala Gln 275 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic reagent <400> 13 Ala Ala Pro Phe 1

Claims (17)

1. 하기 단계를 포함하는 유전체 로커스 (locus) 의 증폭 방법:
   (a) 하기 구조:
   A₁-P-M-A₂
   [식 중, A₁ 및 A₂ 는 동향 반복서열이며, P 는 관심 단백질에 대한 코딩 (coding) 서열을 포함하며, M 은 필수 효소에 대한 코딩 서열을 포함함] 의 유전체 로커스를 포함하는 박테리아 숙주 세포의 개체군을 상기 필수 효소의 저해제와 접촉시키는 단계; 및
   (b) 상기 저해제에 내성인 세포가 상기 증폭 단위의 다중 복제본을 갖는, 상기 저해제에 내성인 세포를 선별하는 단계.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 박테리아 숙주 세포가 바실러스 (Bacillus) 종 세포인 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 필수 효소가 상기 세포에 내재적인 야생형 효소인 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 숙주 세포가 상기 필수 효소를 인코딩하는 불활성화 유전자를 추가로 포함하며, 상기 불활성화 유전자는 상기 세포에 내재적이며 A₁-P-M-A₂ 구조의 상기 유전체 로커스와 상이한 유전체 로커스에 있는 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, P 가 발현 카세트를 포함하는 방법.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, A₁ 이 P 의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 방법.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 필수 효소에 대한 상기 코딩 서열이 상기 코딩 서열에 내재적인 프로모터에 연결된 방법.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 단백질이 서브틸리신 (subtilisin) 인 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 필수 효소가 D-알라닌 라세미화효소인 방법.
10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 필수 효소가 D-알라닌 라세미화효소이며, 상기 저해제가 β-클로로-D-알라닌인 방법.
11. 하기 구조:
    A₁-P-M-A₂
    [식 중, A₁ 및 A₂ 는 동향 반복서열이며, P 는 관심 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하며, M 은 필수 효소의 코딩 서열을 포함함] 의 증폭 단위를 포함하는 유전체 로커스를 포함하는 박테리아 숙주 세포.
12. 하기 구조:
    A₁-P-M-A₂
    [식 중, A₁ 및 A₂ 는 동향 반복서열이며, P 는 관심 단백질에 대한 제 1 코딩 서열을 포함하며, M 은 필수 효소에 대한 제 2 코딩 서열을 포함하며, 상기 제 1 코딩 서열은 동향 반복서열 A₁ 내에 존재하는 프로모터에 작동가능하게 연결됨] 의 증폭 단위의 다중 복제본을 포함하는 유전체 로커스를 포함하는 박테리아 숙주 세포.
13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 상기 관심 단백질이 서브틸리신이며, 상기 필수 효소가 알라닌 라세미화효소인 박테리아 숙주 세포.
14. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭 단위가 SEQ ID NO:7 에 기재된 서열을 갖는 박테리아 숙주 세포.
15. 제 11 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 박테리아 세포의 개체군 및 성장 배지를 포함하는 박테리아 세포 배양물.
16. 제 15 항의 세포 배양물을 상기 관심 단백질을 제조하기에 적절한 조건 하에서 유지시키는 것을 포함하는 방법.
17. 제 16 항에 있어서, 상기 배양 배지로부터 상기 관심 단백질을 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.

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