CN101981193A - 在细菌细胞中扩增基因座的方法 - Google Patents

Abstract

此公开的某些方面涉及扩增基因座的方法。在某些实施方案中，该方法可以包括：a)将细菌宿主细胞的群体与必需酶的抑制剂接触，其中所述细菌宿主细胞包含结构为A₁-P-M-A₂的基因座，其中A₁和A₂是同向重复，P包含多肽的编码序列，M包含所述必需酶的编码序列；和b)选择对所述抑制剂具有抗性的细胞；其中对所述抑制剂具有抗性的细胞具有多个拷贝的扩增单位。

Description

在细菌细胞中扩增基因座的方法

本申请要求2008年3月28日提交的美国临时申请61/040,456的优先权。

技术领域

本发明提供在不使用抗生素的情况下扩增基因座的方法。具体而言，本发明涉及在体内扩增编码目的多肽的DNA序列的方法、包含多个拷贝所述经扩增的DNA序列的细胞，和包含待用于所述方法的DNA构建体的载体。此外，本发明涉及通过培养如上文所述的细胞来产生目的多肽(例如酶)的方法。

背景技术

外源多肽的表达和重组产生是广泛使用的技术。众所周知，可以用编码外源目的多肽的核酸转化细胞来表达和产生大量所希望的多肽。在一些应用中，用该方法产生超过由起源生物自然产生的量的大量多肽。事实上，外源核酸序列的表达以及内源序列的过量表达已广泛用于现代生物技术中。

尽管有在分子生物学和蛋白质工程中的进步，但任然存在对提高多肽在宿主细胞中的表达水平的方法和组合物的需要。

发明概述

本文提供扩增基因座的方法。在某些实施方案中，该方法可以包括：a)将细菌宿主细胞群体与必需酶的抑制剂接触，其中所述细菌宿主细胞包含结构为A₁-P-M-A₂的基因座，其中A₁和A₂是同向重复，P包含目的多肽的编码序列，M包含所述必需酶的编码序列，和b)选择对该抑制剂具有抗性的细胞；其中对该抑制剂具有抗性的细胞具有多个拷贝的扩增单位。虽然考虑其他细菌细胞类型(例如链霉菌属物种(Streptomyces sp.))，但细菌宿主细胞可以是芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)细胞。在一些实施方案中，目的多肽是枯草蛋白酶，例如SEQ ID NO：8的枯草蛋白酶，或SEQID NO：12中所示的其成熟形式。在某些情况下，该方法避免使用抗生素标记和抗生素，提供基于抗生素的扩增系统之外的另一种选择。在某些实施方案中，必需酶具有细胞内源酶(例如野生型酶)的氨基酸序列。在具体实施方案中，用于该方法的细菌宿主细胞可以包含或不包含失活的编码该必需酶的内源基因，其中失活的基因可以处于与结构为A₁-P-M-A₂的基因座不同的基因座。在某些情况下，虽然可以使用其他酶/抑制剂组合，但必需酶可以是丙氨酸消旋酶(例如SEQ ID NO：11)，抑制剂可以是β-氯-D-丙氨酸或环丝氨酸。在一些实施方案中，扩增单位包含SEQ ID NO：7中所示的序列。

扩增单位提供由M区编码的必需酶的表达。在具体实施方案中，M可以包含必需酶的编码序列和有效连接至该编码序列的启动子，其中该启动子是必需酶的编码序列的天然启动子。在某些实施方案中，编码序列和启动子可以是宿主细胞内源的。扩增单位还提供由P区编码的目的蛋白质的表达。在具体实施方案中，P的编码序列可以有效连接至存在于相邻同向重复(A₁)中的内源或非内源启动子。在其他实施方案中，P的启动子可以不存在于相邻同向重复中。相反，该启动子存在于P区中。

在一些实施方案中，本发明提供包含含有结构为A₁-P-M-A₂的扩增单位的基因座的细菌宿主细胞，其中A₁和A₂是同向重复，P包含目的多肽的编码序列，也提供包含必需酶的编码序列的M。在这个实施方案中，扩增单位提供了必需酶的显著表达。虽然考虑其他细菌细胞类型(例如链霉菌属物种)，但细菌宿主细胞可以是芽孢杆菌属物种细胞。在一些实施方案中，目的多肽是枯草蛋白酶，例如SEQ ID NO：8的枯草蛋白酶，或SEQ IDNO：12中所示的其成熟形式。在某些情况下，该方法避免使用抗生素标记和抗生素，提供基于抗生素的扩增系统之外的另一种选择。在某些实施方案中，必需酶具有细胞内源酶(例如野生型酶)的氨基酸序列。在具体实施方案中，细菌宿主细胞可以包含或不包含失活的编码该必需酶的内源基因，其中失活的基因可以处于与结构为A₁-P-M-A₂的基因座不同的基因座。在某些情况下，虽然可以使用其他酶/抑制剂组合，但必需酶可以是谷氨酸消旋酶(例如SEQ ID NO：11)，抑制剂可以是β-氯-D-丙氨酸或环丝氨酸。在一些实施方案中，扩增单位包含SEQ ID NO：7中所示的序列。

在其他实施方案中，本发明的细菌宿主细胞包含多个拷贝含有结构为A₁-P-M-A₂的扩增单位的基因座，其中A₁和A₂是同向重复，P包含目的多肽的第一编码序列，M包含必需酶的第二编码序列。在一些实施方案中，扩增单位包含SEQ ID NO：7中所示的多核苷酸序列。在一些实施方案中，将第一编码序列有效连接至存在于同向重复A₁中的启动子。在具体实施方案中，细菌宿主细胞包含多个拷贝含有式(A₁-P-M)_n-A₂所描述的扩增单位的基因座，其中n为至少2，A₁和A₂是同向重复，P包含目的多肽的编码序列，M包含必需酶的编码序列，其中M的编码序列有效连接至内源或非内源启动子。在一个实施方案中，M的编码序列和启动子可以是宿主细胞内源的。在一些实施方案中，细菌宿主细胞包含多个拷贝含有SEQ IDNO：7的扩增单位(例如至少2个拷贝)的基因座。扩增单位提供目的多肽(例如枯草蛋白酶)和必需酶二者的表达。在一些实施方案中，所表达的目的多肽是SEQ ID NO：8中所示的枯草蛋白酶FNA，或SEQ ID NO：12中所示的其成熟形式，必需酶是SEQ ID NO：11中所示的丙氨酸消旋酶。在具体实施方案中，有效连接至P的编码序列的启动子可以是相邻同向重复(A₁)的部分。在另一个实施方案中，有效连接至P区编码序列的启动子存在于P区中而不是相邻同向重复中。

在另一个实施方案中，本发明包含细菌细胞培养物，其包含培养基和细菌宿主细胞群体，该细菌宿主细胞包含结构为A₁-P-M-A₂的扩增单位的至少1个、至少2个或更多个拷贝，其中A₁和A₂是同向重复，P包含用于目的蛋白质的第一编码序列，M包含用于必需酶的第二编码序列。如上文所述，扩增单位提供目的多肽(例如枯草蛋白酶)和必需酶二者的表达。在一些实施方案中，所表达的目的多肽是SEQ ID NO：8中所示的枯草蛋白酶FNA，或SEQ ID NO：12中所示的其成熟形式，必需酶是SEQ ID NO：11中所示的丙氨酸消旋酶。还在另一个实施方案中，可以在蛋白质产生方法中使用细菌细胞培养物，该方法包括在适合产生由编码序列编码的目的多肽的条件下维持受试细胞的培养物。在具体实施方案中，此方法还可以包括从培养基中回收目的多肽。

附图简述

图1图示说明本文所述实施方案的一些特征。

图2显示pBSFNAalr质粒(SEQ ID NO：2)的图谱。

图3显示qPCR校准曲线。

图4是显示来自多种宿主菌株的枯草蛋白酶FNA表达水平的图表。

定义

除非本文另作定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员的通常理解相同的意义。虽然可将类似或等同于本文所述方法和材料的任意方法和材料用于实施或测试本发明，但描述了优选的方法和材料。

本文提到的所有专利和出版物，包含在这类专利和出版物中公开的所有序列在此明确引入作为参考。

数值范围包含定义该范围的数值。除非另行说明，核酸按5′至3′的方向从左向右书写；氨基酸序列按氨基至羧基的方向从左向右书写。

本文给出的标题不是对本发明的多个方面或实施方案的限制。因此，以下术语通过参考说明书整体而得到更充分的定义。

除非另作定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员的通常理解相同的意义。Singleton等，DICTIONARYOF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，第二版，JohnWiley和Sons，New York(1994)和Hale & Markham，THE HARPERCOLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，N.Y.(1991)为技术人员提供了本文所用的许多术语的一般意义。但是，为了清楚和便于参考的缘故，下文定义了某些术语。

术语“重组体”指并非天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或多肽。重组分子可以包含以非天然存在的方式连接在一起的两条或更多条天然存在的序列。重组细胞包含重组多核苷酸或重组多肽。

术语“异源的”指正常情况下不彼此结合的元件。例如，若宿主细胞产生异源蛋白质，则正常情况下该蛋白质不在该宿主细胞中产生。同样，有效连接至异源编码序列的启动子是这样的启动子，其有效连接至编码序列，而在野生型宿主细胞中通常不有效连接至该编码序列。关于多核苷酸或蛋白质，术语“同源的”指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。

“信号序列”是存在于蛋白质N端部分的氨基酸序列，其促进成熟形式的蛋白质从细胞分泌。信号序列的定义是功能性定义。胞外蛋白质的成熟形式无信号序列，其在分泌过程中被切除。

术语“核酸”包含单链或双链的DNA、RNA及其化学修饰物。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用。

“载体”指设计用于将核酸引入一个或多个宿主细胞的多核苷酸。在某些实施方案中，载体可在不同宿主细胞中自主复制，其包含：克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体粒子、盒等。在其他实施方案中，载体可以整合入宿主细胞基因组。

“启动子”是起始下游核酸转录的调节序列。

术语“有效连接”指使元件在功能上相关的元件排列。例如，若启动子控制编码序列的转录，则启动子有效连接至该序列。

术语“选择标记”指能够在宿主中表达的蛋白质，其便于包含引入的核酸或载体的那些宿主的筛选。选择标记的实例包含但不限于抗微生物剂(例如潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势(如营养优势)的基因。

本文所用的术语“回收的”、“分离的”和“分开的”指从至少一种其天然结合的成分移出的蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。

如本文所用，提到细胞时使用的术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”指该细胞具有整合入其基因组或作为附加型质粒保持多代的非天然(例如异源的)核酸序列。

本文所用的术语“表达”指通过其来根据基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包含转录和翻译二者。

在将核酸序列插入细胞的背景中，术语“引入的”指“转染”、“转化”或“转导”，且包含对核酸序列整合入真核或原核细胞的指代，其中该核酸序列可以整合入细胞基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)、转变为自主复制子或瞬时表达(例如转染的mRNA)。

术语“杂交”指核酸链通过本领域已知的碱基配对与其互补链连接的过程。若核酸与参考序列核酸在中度到高度严格的杂交和漂洗条件下特异性地彼此杂交，则认为这两条序列“可选择性杂交”。中度和高度严格的杂交条件是已知的(见例如Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，第三版，Wiley & Sons 1995和Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第三版，2001冷泉港，纽约)。高度严格的条件的一个实例包含在约42℃下在50％甲酰胺、5X SSC、5X Denhardt’s溶液、0.5％SDS和100ug/ml变性载体DNA中杂交，然后在室温下在2X SSC和0.5％SDS中漂洗两次，在42℃下在0.1X SSC和0.5％SDS中漂洗另外两次。

“编码序列”是编码多肽的DNA片段。

如本文所用，“表达盒”指DNA构建体，其包含有效连接至适合的控制序列的蛋白质编码区，该控制序列能够影响蛋白质在适合的宿主细胞中的表达。此类控制序列可以包含引起转录的启动子、控制转录以产生mRNA的可选的操纵基因序列、编码适合的mRNA上的核糖体结合位点的序列、增强子，和控制转录和翻译终止的其他序列。

“宿主细胞的天然”多肽或多核苷酸具有与未被改变的宿主细胞中存在的多肽或多核苷酸相同的氨基酸或核苷酸序列。在某些情况下，细胞可包含重组核酸，该重组核酸包含该细胞的天然多核苷酸(例如编码序列)。在这些情况下，细胞在不同的基因座包含重组核酸，该重组核酸包含具有也存在于未被改变的宿主细胞版本(即不包含任意基因敲除的宿主细胞)中的核苷酸序列的多核苷酸。在某些情况下，细胞可包含编码细胞的天然多肽的重组核酸。在这些情况下，细胞包含编码多肽的核酸，该多肽具有与见于未被改变的宿主细胞版本(即不包含任意基因敲除的宿主细胞)中的多肽相同的氨基酸序列。术语“内源的”与术语“天然的”是同义词。

关于有效连接至其天然启动子的编码序列，“天然启动子”指野生型宿主细胞的启动子，其在该细胞中有效连接至该编码序列。

术语“同向重复”指在细胞中以相同取向存在并可以进行同源重组的至少两个序列元件。同向重复具有超过至少50个核苷酸(例如至少100、至少200或至少500或更多个核苷酸)的相同或几乎相同的核苷酸序列(例如至少98％或99％序列同一性)。

术语“抑制剂”指通过竞争性抑制或非竞争性抑制(例如变构抑制)可逆地抑制酶的化合物。

术语“必需酶”是细胞生长必需的酶。

若细胞中内源必需酶的基因是野生型(即未失活)，则术语“提供必需酶的显著表达的表达盒”指提供超过内源必需酶水平50％(例如至少70％、至少90％或至少100％，高达1000％)的必需酶表达水平的表达盒。

术语“丙氨酸消旋酶”指催化L-丙氨酸和D-丙氨酸互变的酶。丙氨酸消旋酶具有如EC 5.1.1.1所述的活性(根据IUBMB酶命名法)。编码丙氨酸消旋酶的基因可以表示为“alr”、“alrA”或“dal”基因。

术语的其他定义可以在整篇说明书中出现。

示例性实施方案的详述

如上文所述，提供扩增基因座的方法。在图1中说明本方法的几个一般特征。参照图1，在该方法中使用的细菌宿主细胞可以包含含有结构为A₁-P-M-A₂的扩增单位的基因座，其中A₁和A₂是同向重复，P包含目的多肽的编码序列，M包含细胞必需的酶的编码序列。式A₁-P-M-A₂旨在包含含有以相对于P和M的任一方向定位的同向重复的基因座。

扩增单位提供目的多肽和必需酶在细胞中的表达。在某些情况下，P区和M区可以分别独立地包含目的多肽和必需酶的表达盒(即有效连接至启动子的编码序列)。在一些实施方案中，扩增单位包含用于表达目的多肽的第一表达盒和用于表达必需酶的第二表达盒。在其他实施方案中，可以将P区的编码序列有效连接至存在于相邻同向重复中的启动子。在此实施方案中和如将在下文中更详细地讨论，同向重复和必需酶编码序列的组合核苷酸序列可以是细胞内源的，即其见于宿主细胞的基因组。在具体实施方案中，有效连接至M区编码序列的启动子可以是该编码序列内源的或非内源的。在具体实施方案中，可以由有效连接至P的编码序列的启动子驱动M区的编码序列。

如显而易见，P和M在本文所述任意核酸中的方向可以是相反方向(即A₁-M-P-A₂)。在此相反方向中和在一些实施方案中，可以将M区的编码序列有效连接至同向重复A₁中的启动子。备选地，可以将M区的编码序列有效连接至存在于M区中的启动子。

将这类细胞的群体与必需酶的抑制剂接触，选择对抑制剂具有抗性的细胞(即可以在抑制剂存在的情况下生长和分裂形成菌落的细胞)。如图1中所示，选择的细胞具有多个拷贝包含扩增单位的基因座，该基因座可以通过式(A₁-P-M)_n-A₂描述，其中A₁和A₂是同向重复，n是至少2。n可以是例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或至少10，例如在10-50或50-100的范围内或更多。相对于未选择的细胞，选择的细胞在必需酶的编码序列(例如在抑制剂的结合位点)中或在连接至该编码序列的启动子中无突变。然而，选择的细胞在扩增单位的拷贝数上有增加，这允许细胞在抑制剂存在的情况下生长。在某些情况下，可以对细胞群体进行几轮选择，每一轮选择使用浓度依次提高的抑制剂(例如抑制剂浓度依次加倍)。在一些实施方案中，A₁-P-M-A₂扩增单位包含SEQ ID NO：7中所示的多核苷酸序列：tccattttcttctgctatcaaaataacagactcgtgattttccaaacgagctttcaaaaaagcctctgccccttgcaaatcggatgcctgt ctataaaattcccgatattggttaaacagcggcgcaatggcggccgcatctgatgtctttgcttggcgaatgttcatcttatttcttcctc cctctcaataattttttcattctatcccttttctgtaaagtttatttttcagaatacttttatcatcatgctttgaaaaaatatcacgataatatcca ttgttctcacggaagcacacgcaggtcatttgaacgaattttttcgacaggaatttgccgggactcaggagcatttaacctaaaaaag catgacatttcagcataatgaacatttactcatgtctattttcgttcttttctgtatgaaaatagttatttcgagtctctacggaaatagcgag aggtgatatacctaaatagagataaaatcatctcaaaaaaatg

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其中重复单位A₁和A₂以下划线显示，编码目的蛋白质(即枯草蛋白酶FNA)的多核苷酸序列以黑体字母表示，编码必需酶(例如丙氨酸消旋酶)的多核苷酸序列以斜体显示。启动子序列以黑体大写字母显示。

由于通过该方法产生的宿主细胞包含第一表达盒的更多个拷贝，细胞可以产生比具有单拷贝A₁-P-M-A₂扩增单位的宿主细胞更多的由第一表达盒编码的目的多肽。在具体实施方案中，与具有单拷贝A₁-P-M-A₂扩增单位的其他相同宿主细胞相比，获得的宿主细胞可以产生多至少20％、至少40％、至少60％、至少80％、至少100％、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍、高达约100倍的蛋白质。

在本方法中使用的抑制剂的浓度可以随所用必需酶和抑制剂潜能而变化。在具体实施方案中，虽然考虑这些范围外的浓度，但抑制剂可以处于1μM-100mM范围内的浓度，例如在5μM-10mM、20μM-1mM的范围内。可以将抑制剂加入液体培养物，或抑制剂可以存在于细菌生长于其上的固体培养基(例如琼脂培养基)中。如上文所指出，可以对细胞群体进行几轮选择，每一轮选择使用浓度依次提高的抑制剂(例如抑制剂浓度依次加倍)。

在具体实施方案中，扩增单位不包含抗生素抗性标记，且可以在无抗生素的培养基中进行细胞选择。

下文更详细地描述了第一和第二表达盒及宿主细胞。

表送盒

如上文所指出，扩增单位提供目的多肽和必需酶的表达。因此，扩增单位一般包含至少两个表达盒：用于目的多肽表达的第一表达盒和用于必需酶基因表达的第二表达盒。每个表达盒包含处于有效连接中的启动子、编码序列和终止子。在某些情况下，扩增单位的P区可以包含第一表达盒，扩增单位的M区可以包含第二表达盒。在其他情况下和如上文所指出，邻近P区的同向重复可以包含有效连接至P区编码序列的启动子。在某些情况下，P区和邻近P区的正向重复的连续的核苷酸序列可以是宿主细胞内源的(即存在于宿主细胞基因组中)。在具体实施方案中，可以将M区的编码序列有效连接至P区的启动子。

本文讨论的每一表达盒可以包含处于有效连接中的以下元件：启动子、编码序列和终止子序列，其中该表达盒足以在宿主细胞中产生蛋白质。如下文将更详细地讨论，第一表达盒的编码序列可以编码重组蛋白质，例如治疗性蛋白质或所谓的“工业酶”。在具体实施方案中，该编码序列可以编码具有提供蛋白质从细胞分泌的信号序列的蛋白质。如上文所指出和如将在下文中更详细地讨论，第二表达盒提供必需酶的表达。

若使用启动子、终止子和信号序列，则它们的选择主要取决于所使用的宿主细胞。宿主细胞包含芽孢杆菌属物种宿主细胞、链霉菌属物种宿主细胞、大肠杆菌(E.coli)和其他细菌宿主细胞。如上文所指出，在示例性实施方案中，可以使用链霉菌属宿主细胞，在这种情况下，若使用信号序列，则其可以是celA信号序列。在某些情况下，celA信号序列可以是如Kluepfel等(Nature Biotechnol.199614：756-759)所述的由变铅青链霉菌(S.lividans)纤维素酶A基因CelA编码的信号序列。在使用芽孢杆菌属宿主细胞的其他示例性实施方案中，信号序列可以是能够指导融合蛋白质进入芽孢杆菌属宿主细胞的分泌途径的任意氨基酸序列。在某些情况下，可以使用的信号序列包含从野生型芽孢杆菌属细胞分泌的蛋白质的信号序列。这类信号序列包含由α-淀粉酶、蛋白酶(例如aprE或枯草蛋白酶E)或β-内酰胺酶基因编码的信号序列。示例性信号序列包含但不限于由α-淀粉酶基因、枯草蛋白酶基因、β-内酰胺酶基因、中性蛋白酶基因(例如nprT、nprS、nprM)或来自任意适合的芽孢杆菌属物种(包含但不限于嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens))的prsA基因编码的信号序列。在一个实施方案中，信号序列由枯草芽孢杆菌的aprE基因编码(如Appl.Microbiol.Biotechnol.200362：369-73中所述)。Simonen和Palva(MicrobiologicalReviews 1993 57：109-137)和其他参考文献描述了其他信号肽。

适合用于芽孢杆菌属和链霉菌属宿主细胞中的启动子和终止子是已知的，包含：apr(碱性蛋白酶)、npr(中性蛋白酶)、amy(α-淀粉酶)和β-内酰胺酶基因以及枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽淀粉酶(maltogenic amylase)基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子和终止子；WO 93/10249、WO 98/07846和WO99/43835中所述的启动子和终止子。可以用描述于例如Hopwood等(Genetic Manipulation of Streptomyces：A Laboratory Manual；冷泉港实验室，1985)；Hopwood等(Regulation of Gene Expression inAntibiotic-producing Streptomyces.在Booth，I.和Higgins，C.(编辑)Symposium of the Society for General Microbiology，Regulation of GeneExpression，剑桥大学出版社，1986，251-276页中)；Fornwald等(Proc.Natl.Acad.Sci.198784：2130-2134)；Pulido等(Gene.198756：277-82)；Dehottay等(Eur.J.Biochem.1987166：345-50)；Taguchi(Gene.198984：279-86)；Schmitt-John等(Appl.Microbiol.Biotechnol.199236：493-8)；Motamedi(Gene 1995160：25-31)和Binnie(Protein Expr.Purif.199711：271-8)中的启动子和终止子构建用于链霉菌属宿主细胞中的表达盒。在一个实施方案中，可以使用描述于WO 06/054997中的A4启动子，WO 06/054997在此引用作为参考。

在某些实施方案中，可以针对目的多肽在所用宿主细胞中的表达，对任一编码序列进行密码子优化。由于列出每一密码子在许多细胞中的使用的密码子选择表为本领域已知(见例如Nakamura等，Nucl.Acids Res.200028：292)或易于推导，给出待表达蛋白质的氨基酸序列后可以容易地设计这类核酸。

用于在链霉菌属和芽孢杆菌属宿主细胞中表达重组蛋白质的系统为本领域公知，不需比上文所述更详细地对其进行讨论。

第一表达盒

第一表达盒可以包含启动子和编码目的蛋白质的多核苷酸(即编码序列)，其中启动子和多核苷酸有效连接，以使分离的核酸引起多核苷酸的转录和目的蛋白质的产生。

所编码的目的蛋白质可以是所谓的“工业酶”、治疗性蛋白质、报道蛋白质、食品添加剂或食品等。

在一个实施方案中，目的蛋白质可以是例如酶，如糖酶，如液化和糖化α-淀粉酶、碱性α-淀粉酶、β-淀粉酶、纤维素酶；葡聚糖酶、α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、戊聚糖酶、木聚糖酶、转化酶、乳糖酶、柚苷酶(naringanase)、果胶酶或支链淀粉酶；蛋白酶，如酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、肽酶、粗制凝乳酶、凝乳酶(rennin)、凝乳酶(chymosin)、枯草蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶或胰蛋白酶；脂肪酶或酯酶，如甘油三酯酶、磷脂酶、pregastric esterase、磷酸酶、肌醇六磷酸酶、酰胺酶、亚胺酰基酶(iminoacylase)、谷氨酰胺酶、溶菌酶或青霉素酰基酶；异构酶，如葡萄糖异构酶；氧化还原酶，例如氨基酸氧化酶、过氧化氢酶、氯过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、羟类固醇脱氢酶或过氧化物酶；裂合酶，如乙酰乳酸脱羧酶、天冬氨酸β-脱羧酶、延胡索酸酶或组氨酸酶(histadase)；转移酶，如环糊精糖基转移酶；或连接酶。在具体实施方案中，蛋白质可以是例如氨肽酶、羧肽酶、几丁质酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、漆酶、甘露糖苷酶、齿斑葡聚糖酶、果胶分解酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶或转谷氨酰胺酶。

在具体实施方案中，由第一表达盒编码的目的蛋白质是清洁剂添加剂蛋白质，即a)从细胞分泌且b)将其加至衣物清洗剂的蛋白质(例如酶)。示例性清洁剂添加剂蛋白质包含蛋白酶，例如枯草蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶。枯草蛋白酶(即胞外碱性丝氨酸蛋白酶)尤其重要。枯草蛋白酶可以具有见于野生型基因组的氨基酸序列(即枯草蛋白酶可以是天然存在的枯草蛋白酶)，或可以是天然存在的枯草蛋白酶的变体，从而可以包含与由野生型基因组编码的枯草蛋白酶至少80％、至少90％、至少95％或至少98％一致的氨基酸序列。示例性枯草蛋白酶包含：FNA^TM(Genencor)、Purafect^TM(Genencor)、KAP^TM(Kao)、Everlase^TM(Novozymes)、Purafect OxP^TM(Genencor)、FN4^TM(Genencor)、BLAP S^TM(Henkel)、BLAP X^TM(Henkel)、

(Novozymes)、Kannase^TM(Novozymes)和Prosperase^TM(Genencor)。在其他实施方案中，枯草蛋白酶可以是枯草蛋白酶168、枯草蛋白酶BPN，、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶DY、枯草蛋白酶147或枯草蛋白酶309(见例如EP414279B、WO89/06279和Stahl等，J.Bacteriol.1984159：811-818)。在一些实施方案中，由第一表达盒编码的枯草蛋白酶是FNA：

枯草蛋白酶的前原区(pre-pro region)以斜体显示，成熟区以黑体字母显示

编码FNA的多核苷酸实例是：gtgagaagcaaaaaattgtggatcagtttgctgtttgctttagcgttaatctttacgatggcgttcggcagcacatcctctgcccaggcggcagggaaatcaaacggggaaaagaaatatattgtcgggtttaaacagacaatgagcacgatgagcgccgctaagagaaagatgtcatttctgaaaaaggcgggaaagtgcaaaagcaattcaaatatgtagacgcagcttcagctacattaaacgaaaaagctgtaaaagaattgaaaaaagacccgagcgtcgcttacgttgaagaagatcacgtagcacatgcgtacgcgcagtccgtgccttacggcgtatcacaaattaaagcccctgctctgcactctcaaggctacactggatcaaatgttaaagtagcggttatcgacagcggtatcgattcttctctcctgatttaaaggtagcaggcggagccagcatggttccttctgaaacaaatcctttccaagacaacaactctcacggaactcacgttgccggcacagttgcggctcttaataactcaatcggtgtattaggcgttgcgccaagcgcatcactttacgctgtaaaagttctcggtgctgacggttccggccaatacagctggatcattaacggaatcgagtgggcgatcgcaaacaatatggacgttattaacatgagcctcggcggaccttctggttctgctgctttaaaagcggcagttgataaagccgttgcatccggcgtcgtagtcgttgcggcagccggtaacgaaggcacttccggcagctcaagcacagtgggctaccctggtaaatacccttctgtcattgcagtaggcgctgttgacagcagcaaccaaagagcatctttctcaagcgtaggacctgagcttgatgtcatggcacctggcgtatctatccaaagcacgcttcctggaaacaaatacggcgcgttgaacggtacatcaatggcatctccgcacgttgccggagcggctgctttgattctttctaagcacccgaactggacaaacactcaagtccgcagcagtttagaaaacaccactacaaaacttggtgattctttctactatggaaaagggctgatcaacgtacaggcggcagctcagtaa(SEQ ID NO：9).

本文可以使用的示例性枯草蛋白酶和其他蛋白酶包含描述于WO99/20770、WO 99/20726、WO 99/20769、WO 89/06279、RE 34,606、美国专利号4,914,031、美国专利号4,980,288、美国专利号5,208,158、美国专利号5,310,675、美国专利号5,336,611、美国专利号5,399,283、美国专利号5,441,882、美国专利号5,482,849、美国专利号5,631,217、美国专利号5,665,587、美国专利号5,700,676、美国专利号5,741,694、美国专利号5,858,757、美国专利号5,880,080、美国专利号6,197,567和美国专利号6,218,165中的枯草蛋白酶和其他蛋白酶。枯草蛋白酶一般详细地综述在Siezen(Protein Sci.1997 6：501-523)中，清洁剂添加剂枯草蛋白酶综述于Bryan(Biochim.Biophys.Acta 2000 1543：203-222)；Maurer(CurrentOpinion in Biotechnology 2004 15：330-334)和Gupta(Appl MicrobiolBiotechnol.2002 59：15-32)中。某些目的枯草蛋白酶具有如EC 3.4.4.16(根据IUBMB酶命名法)所述的活性。

在其他实施方案中，目的蛋白质可以是治疗性蛋白质(即具有治疗性生物学活性的蛋白质)。适合的治疗性蛋白质的实例包含：促红细胞生成素、细胞因子，如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-o和粒细胞CSF、GM-CSF；凝血因子，如VIII因子、IX因子和人蛋白C、抗凝血酶III、凝血酶、可溶性IgE受体α-链、IgG、IgG片段、IgG融合蛋白质、IgM、IgA、白细胞介素、尿激酶、糜蛋白酶和尿素胰蛋白酶抑制剂、IGF结合蛋白质、表皮生长因子、生长激素释放因子、膜联蛋白V融合蛋白质、制管张素、血管内皮生长因子-2、骨髓祖细胞抑制因子-1、护骨蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、甲胎蛋白、DNA酶II、三环人纤维蛋白溶酶原(kringle 3 ofhuman plasminogen)、葡糖脑苷脂酶、TNF结合蛋白质1、促卵泡激素、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4-Ig、跨膜激活剂和钙调节剂和亲环蛋白配体、可溶性TNF受体Fc融合蛋白质、胰高血糖素样蛋白质1和IL-2受体激动剂。抗体蛋白质(例如可以人源化的单克隆抗体)尤其重要。

在另一个实施方案中，目的蛋白质可以是报道蛋白质。这类报道蛋白质可以是例如光学可检测的或生色的。在这个实施方案中，蛋白质可以是β-半乳糖苷酶(lacZ)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)、荧光素酶、碱性磷酸酶、胭脂碱合酶(NOS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、辣根过氧化物酶(HRP)或荧光蛋白质，例如绿色荧光蛋白(GFP)或其衍生物。

如上文所指出，编码序列可以编码融合蛋白质。在这些实施方案的一些中，融合蛋白质可以提供目的蛋白质从其在其中表达的宿主细胞的分泌，因此，融合蛋白质可以包含有效连接至目的蛋白质N端的信号序列，其中信号序列包含将蛋白质导向宿主细胞分泌途径的氨基酸序列，其导致蛋白质从宿主细胞分泌进入宿主细胞在其中生长的培养基。目的蛋白质分泌前从融合蛋白质切除信号序列。

第二表达盒

第二表达盒提供必需酶的表达，其中，如上文所指出，必需酶是细胞进行细胞生长所需的。在具体实施方案中，必需酶可以是条件性必需的，由此其仅在某些条件下为细胞生长所需(例如在缺乏使必需酶的任意丧失无效的外源化合物的情况下)。在某些情况下，通过加入外源化合物(其在某些情况下可以是酶的产物或另一碳源)，缺乏条件性必需酶活性的细胞(其可以通过失活编码该酶的基因或通过将细胞与该酶的抑制剂接触来产生)可以在培养物中生长。因此，在某些情况下，用于第二表达盒中的必需酶可以是当其从细胞中缺失时使细胞成为特定化合物的营养缺陷型或不能利用一种或多种特定碳源的酶。

这类必需酶/抑制剂组合的实例是已知的并包含例如：涉及氨基酸合成的酶和它们各自的抑制剂；涉及特定碳源利用的酶和它们各自的抑制剂。下文给出了这类酶/抑制剂组合的实例。编码涉及氨基酸合成的酶的基因的失活引起对该氨基酸的辅源营养。同样，编码涉及特定碳源利用的酶的基因的失活引起对另一碳源的辅源营养。酶不切割抑制剂。然而，抑制剂可逆和特异地竞争性或非竞争性抑制酶的催化活性。

在一个实施方案中，酶可以是S-腺苷-甲硫氨酸合成酶(由metE编码；GenBank检索号U52812；见Yocum等，Cloning and characterization of themetE gene encoding S-adenosylmethionine synthetase from Bacillus subtilis.J.Bacteriol.1996 178：4604)，其可以被环亮氨酸(Chiang等Molecularcharacterization of Plasmodium falciparum S-adenosylmethioninesynthetase.Biochem J.1999 344：571-6)以及甲硫氨酸类似物、嘌呤类似物、8-氮鸟嘌呤和咪唑硫嘌呤(Berger等Characterisation of methionineadenosyltransferase from Mycobacterium smegmatis and M.tuberculosisBMC Microbiol.2003；3：12)抑制。S-腺苷-甲硫氨酸合成酶基因的失活引起甲硫氨酸辅源营养。

在另一个实施方案中，酶可以是3-异丙基苹果酸脱氢酶，其催化3-羧基-2-羟基-4-甲基戊酸向3-羧基-4-甲基-2-氧戊酸的转变。该酶由leuB编码，leuB缺陷的菌株是亮氨酸营养缺陷型。3-异丙基苹果酸脱氢酶可以被例如O-isobutenyl oxalyl hydroxamate(Singh等，The High-resolution Structureof LeuB(Rv2995c)from Mycobacterium tuberculosis，Journal ofMolecular Biology 2005 346：1-11页)抑制。

在另一个实施方案中，酶可以是二氨基庚二酸脱羧酶，其催化内消旋-2，6-diaminoheptanedioate向L-赖氨酸的转变，由lysA编码。lysA缺陷的菌株将是赖氨酸营养缺陷型。二氨基庚二酸脱羧酶的抑制剂包含二氨基庚二酸的类似物，其包含但不限于羊毛硫氨酸亚砜、羊毛硫氨酸砜的内消旋和LL异构体、羊毛硫氨酸、包含N-羟二氨庚二酸4和N-氨基二氨庚二酸5的N修饰的类似物(见Kelland等J.Biol.Chem.1986 Analogs ofdiaminopimelic acid as inhibitors of meso-diaminopimelate decarboxylasefrom Bacillus sphaericus and wheat germ 261：13216-13223)。

在另一个实施方案中，酶可以是谷氨酰-tRNA还原酶，其催化5-氨基乙酰丙酸的合成，由hemA编码。hemA缺陷的菌株是5-氨基乙酰丙酸或氯化血红素的营养缺陷型。该酶可以被戊二霉素抑制(Schauer等Escherichia coli Glutamyl-tRNA Reductase J.Biol.Chem.2002 277：48657-48663)。

在另一个实施方案中，酶可以是D-丙氨酸消旋酶，其催化L-丙氨酸和D-丙氨酸的互变，由alr(也称为dal)编码。alr缺陷的菌株是D-丙氨酸(其为细胞壁生物合成所需)的营养缺陷型。D-丙氨酸消旋酶的抑制剂包含但不限于D-环丝氨酸、β-氯-D丙氨酸和邻氨基甲酰-D-丝氨酸(见例如Manning等，Inhibition of Bacterial Growth by β-chloro-D-alaninePNAS 1974 71：417-421)。在一些实施方案中，第二表达盒包含多核苷酸，例如：atgagcac

aaaacctttt tacagagata cgtgggcgga aattgacttg tccgcgataa aggaaaatgt cagcaatatg aaaaaacata

tcggtgaaca tgtccacttg atggcagttg tgaaagcaaa cgcctacggg catggtgatg cagaaacagc aaaggctgct

cttgacgcag gtgcttcatg cttggccgtg gccattttgg atgaagcgat ttcactgcgc aaaaagggat tgaaggcgcc

tatattggtg cttggcgcgg ttcccccgga gtatgtggca atcgctgctg agtatgacgt gaccttaaca ggttattctg

ttgaatggct tcaggaggca gcccgccaca cgaaaaaagg ttctcttcat tttcatctga aggtcgatac ggggatgaac

agacttggtg taaaaacaga ggaagaagtt cagaacgtga tggcaattct tgaccgcaac cctcgtttaa agtgcaaagg

ggtatttacc cattttgcga cagcggatga aaaagaaaga ggctatttct taatgcagtt tgagcgcttt aaagagctga

ttgctccgct gccgttaaag aatctaatgg tccactgcgc gaacagcgcc gctggactcc ggctgaaaaa aggctttttt

aatgcagtca gattcggcat cggcatgtat ggccttcgcc cgtctgctga catgtcggac gagataccgt ttcagctgcg

tccggcattt accctgcatt cgacactgtc acatgtcaaa ctgatcagaa aaggcgagag cgtcagctac ggagccgagt

acacagcgga aaaagacaca tggatcggga cggtgcctgt aggctatgcg gacggctggc tccgaaaatt

gaaagggacc gacatccttg tgaagggaaa acgcctgaaa attgccggcc gaatttgcat ggaccaattt atggtggagc

tggatcagga atatccgccg ggcacaaaag tcacattaat aggccggcag ggggatgaat atatttccat ggatgagatt

gcaggaaggc tcgaaaccat taactatgag gtggcctgta caataagttc ccgtgttccc cgtatgtttt tggaaaatgg

其编码D-丙氨酸消旋酶：

MSTKPFYRDTWAEIDLSAIKENVSNMKKHIGEHVHLMAVVKANAYGHGDAETAK

AALDAGASCLAVAILDEAISLRKKGLKAPILVLGAVPPEYVAIAAEYDVTLTGYSV

EWLQEAARHTKKGSLHFHLKVDTGMNRLGVKTEEEVQNVMAILDRNPRLKCKG

VFTHFATADEKERGYFLMQFERFKELIAPLPLKNLMVHCANSAAGLRLKKGFFNA

VRFGIGMYGLRPSADMSDEIPFQLRPAFTLHSTLSHVKLIRKGESVSYGAEYTAEK

DTWIGTVPVGYADGWLRKLKGTDILVKGKRLKIAGRICMDQFMVELDQEYPPGT

KVTLIGRQGDEYISMDEIAGRLETINYEVACTISSRVPRMFLENGSIMEVRNPLLQV

NISN(SEQ ID NO：11).

可以对其使用抑制剂的其他必需酶包含：例如木糖异构酶(xylA)、葡糖酸激酶(EC 2.7.1.12)、葡糖酸通透酶(gntK或gntP)、甘油激酶、甘油脱氢酶(例如glpP、glpF、glpK或glpD)、阿拉伯糖异构酶(araA)。

在具体实施方案中，第二表达盒提供必需酶的显著表达，由此若细胞中内源必需酶的基因是野生型的(即未失活)，则必需酶以内源必需酶水平的超过50％(例如至少约70％、至少约90％、高达至少约100％)的水平产生。

在某些实施方案中，由M区编码的必需酶可以是天然存在的，由此其具有野生型必需酶的氨基酸序列。在其他实施方案中，由M区编码的必需酶可以是天然存在的酶的变体，例如其可以具有与天然存在的必需酶至少约80％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同或至少约99％相同的氨基酸序列。

在具体实施方案中，必需酶可以具有天然存在的氨基酸序列，且在某些实施方案中，其可以是宿主细胞内源的，由此其具有任意失活突变前的宿主细胞基因组编码的氨基酸序列。

在具体实施方案中，表达盒的核苷酸序列(即启动子、编码序列和终止子)可以属于任意失活突变前的宿主细胞内源基因。这种基因可以位于与表达盒的基因座不同的基因座。

虽然不是实施本方法所需的，但是可以通过突变失活必需酶的内源基因(即存在于尚未包含A₁-P-M-A₂基因座的宿主细胞中的基因)。特异性失活细菌基因的方法(例如通过缺失、置换或插入)为本领域公知。

宿主细胞

本文使用的细菌宿主细胞可以是革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，并包含但不限于：芽孢杆菌属物种细菌，例如克劳氏芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细菌；链霉菌属物种细菌，例如变铅青链霉菌、(S.carbophilus)、淡蜡黄链霉菌(S.helvaticus)、锈赤链霉菌(S.rubiginosus)或鼠灰链霉菌(S.murinus)细菌；假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)细菌和大肠杆菌。在具体情况下，细菌宿主细胞可以是具有GRAS资格的(即FDA认定的公认为安全的)用来进行蛋白质产生的历史的菌株。

枯草芽孢杆菌宿主细胞包含但不限于描述于美国专利号5,264,366和4,760,025(RE 34,606)中的枯草芽孢杆菌宿主细胞，以及1A6(ATCC39085)、168(1A01)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753至PB1758、PB3360、JH642、1A243(ATCC 39,087)、ATCC 21332、ATCC 6051、MI113、DE100(ATCC 39,094)、GX4931、PBT 110和PEP 211菌株(见例如Hoch等，Genetics 197373：215-228；美国专利号4,450,235；美国专利号4,302,544；和EP 0134048)。例如Palva等和其他人也描述了枯草芽孢杆菌作为表达宿主的用途(见Palva等，Gene 1982 19：81-87；还见Fahnestock和Fischer，J.Bacteriol.1986 165：796-804；和Wang等，Gene1988 69：39-47)。

在具体实施方案中，可以改造芽孢杆菌属宿主细胞以最大化蛋白质表达，因此，芽孢杆菌属宿主细胞可以在以下基因的至少一个中包含失活改变：degU、degS、degR和degQ。见Msadek等(J.Bacteriol.1990 172：824-834)和Olmos等(Mol.Gen.Genet.1997 253：562-567)。一个菌株属于枯草芽孢杆菌物种且携带degU32(Hy)突变。在另一个实施方案中，芽孢杆菌属宿主细胞可以在scoC4(见Caldwell等，J.Bacteriol.2001 183：7329-7340)、spoIIE(见Arigoni等，Mol.Microbiol.1999 31：1407-1415)、oppA或opp操纵子中的其他基因(见Perego等，Mol.Microbiol.1991 5：173-185)中包含突变或缺失。

可以通过将重组核酸插入细菌宿主细胞的基因组来产生用于本方法中的细菌细胞。在具体实施方案中，可以使用类似于已建立的方法的方法，通过同源或非同源重组来产生该细胞，该已建立的方法如Jung等(J.Gen.Appl.Microbiol.1998 44 107-111)；Tangney等(FEMS Microbio.Lett.1995125：107-114)；Petit等(EMBO J.1992 11：1317-1326)；美国专利5,733,753和已公开的美国专利申请20070134760中的方法。

宿主细胞可以具有或不具有失活的编码必需酶的内源基因。

蛋白质产生方法

提供使用上述细胞的方法。在某些实施方案中，本方法包括：培养细胞群体以产生由第一表达盒编码的目的蛋白质。在某些实施方案中和如上文所讨论，目的蛋白质可以分泌进入培养基。本方法的具体实施方案包含从培养基回收目的蛋白质的步骤。

可以通过任意方便的方法从生长培养基回收目的蛋白质，例如通过沉淀、离心、亲和力、过滤或本领域已知的任意其他方法。例如，可以使用亲和层析(Tilbeurgh等，(1984)FEBS Lett.16：215)；离子交换层析方法(Goyal等，(1991)Biores.Technol.36：37；Fliess等，(1983)Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17：314；Bhikhabhai等，(1984)J.Appl.Biochem.6：336；和Ellouz等，(1987)Chromatography 396：307)，其包含使用具有高分辨力的材料的离子交换(Medve等，(1998)J.Chromatography A808：153)；疏水作用层析(Tomaz和Queiroz，(1999)J.Chromatography A865：123)；两相分配(Brumbauer等，(1999)Bioseparation 7：287)；乙醇沉淀；反相HPLC；二氧化硅或如DEAE的阳离子交换树脂上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。在具体实施方案中，清洁剂添加剂蛋白质可以在不从培养基的其他成分纯化的情况下使用。在某些实施方案中，可以简单地浓缩培养基的成分，例如，然后在不进一步从生长培养基的其他成分纯化蛋白质的情况下使用。

在一些实施方案中，可以在分批或连续发酵条件下培养细胞。经典的分批发酵法使用封闭系统，其中在发酵运行开始之前配制培养基，用所希望的一种或多种生物接种培养基，并在随后未向培养基加入任意成分的条件下发生发酵。在某些情况下，可以在分批方法的过程中改变生长培养基的pH和氧含量，而不改变碳源含量。分批系统的代谢产物和细胞生物量不断变化直至发酵终止时。在分批系统中，细胞通常从静止的延迟期行进至高生长对数期，并最终行进至其中生长速率降低或停止的稳定期，若不处理，稳定期中的细胞最终死亡。概括地说，对数期中的细胞产生最多的蛋白质。

“补料分批发酵”系统是标准分批系统的变异。在此系统中，只有当其在培养物中的浓度降至阈值以下时，才加入营养物(例如碳源、氮源、盐类、O₂或其他营养物)。补料分批系统在分解代谢物阻抑有抑制细胞代谢的倾向时和希望培养基中具有有限量的营养物时有用。根据可测量因素(如pH、溶解氧和废气(如CO₂)的分压)的变化来估计补料分批系统中实际营养物浓度的测量值。分批发酵和补料分批发酵是本领域常见和已知的。

连续发酵是开放系统，其中不断地往生物反应器加入确定的培养基，同时移出等量的条件培养基用于加工。连续发酵一般将培养物维持于恒定的高密度，其中细胞主要处于对数期生长中。

连续发酵允许影响细胞生长和/或终产物浓度的一个因素或任意数目的因素的调节。例如，在一个实施方案中，将如碳源或氮源的限制性营养物维持于固定比例，允许调节所有其他参数。在其他系统中，可以不断改变影响生长的许多因素，同时保持通过培养基浊度测量的细胞浓度恒定。连续系统力图维持稳态生长条件。因此，可以针对发酵中的细胞生长速率来平衡培养基排出引起的细胞损失。已知调节连续发酵法的营养物和生长因素的方法，以及用于最大化产物形成速率的技术。

实验

提供以下实施例的目的在于举例和进一步说明本发明的某些优选实施方案和方面，不解释为限制其范围。

材料和方法

用来操作DNA的实验技术是分子生物学领域内的标准技术(Sambrook等Molecular cloning：A Laboratory Manual)。用Qiagen试剂盒(Qiagen Inc.)制备质粒和纯化插入片段。限制性内切酶和其他酶购自Roche Applied Science(Indianapolis，IN)，并按厂商所推荐使用。按Ferrari E.和B.Miller所述(Bacillus expression：a Gram-Positive Model.InGene Expression Systems：Using Nature for the Art of Expression.1999.Academic Press，N.Y.)制备感受态枯草芽孢杆菌细胞。

按照厂商的说明用Herculase酶(Stratagene)进行PCR反应。反应包含200nM的每种引物、1单位的Herculase和200μM的每种dNTP。按以下循环使用来自Hybaid(Thermo)的PxE Thermal Cycler：94℃变性3分钟，然后30个循环的94℃变性30秒、55℃退火30秒和72℃延伸1分钟/1kbp待扩增序列。然后在来自Invitrogen的0.8％琼脂糖e-gel上分析PCR反应。

用Eppendorf Phase Lock Gel管(Eppendorf)及其实验流程制备基因组DNA。

D-丙氨酸、D-环丝氨酸和β-氯-D-丙氨酸获自Sigma。

枯草蛋白酶的测定

枯草蛋白酶的测定如之前所述(Estell，D.V.，Graycar，T.P.，Wells，J.A.(1985)J.Biol.Chem.260，6518-6521)在含1.6mM N-琥珀酰-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对硝基苯胺(p-nitroanilide)(VegaBiochemicals)的0.1M Tris缓冲液，pH 8.6中进行。该测定测量对硝基苯胺释放引起的在410nm处的吸光度的增加。在初始速度条件下进行测定。蛋白酶单位定义为25℃下在光程为1cm的比色杯中，使上述标准溶液在410nm处的吸光度每分钟增加1吸光度单位(AU)的蛋白酶的量。

细菌菌株

大肠杆菌(Escherichia coli)MM294：endA thiA hsdR17 supE44。

枯草芽孢杆菌菌株BG2190(alr-)and BG2189(alr-CmR)由Ferrari和Yang(1985)(Isolation of an alanine racemase gene from Bacillus subtilisand its use for plasmid maintenance in B.subtilis.Biotechnology，3，1003-1007[1985])描述。

枯草芽孢杆菌菌株BG3594：nprE aprE spoIIE degU32 oppA。

枯草芽孢杆菌菌株BG3594comK：这是如WO 02/14490中所述的包含xylR-PxylA-comK构建体的枯草芽孢杆菌BG3594，该构建体使此菌株可被制备为超级感受态(即细胞群体的超过1％是可以用染色体芽孢杆菌属DNA转化的)。

枯草芽孢杆菌菌株CP3490：此菌株是其中alr被敲减(与BG2190中相同的突变)的枯草芽孢杆菌菌株BG3594comK。

枯草芽孢杆菌菌株CP35491：此菌株是其中alr被敲除(与BG2190中相同的突变)的枯草芽孢杆菌菌株BG3594。

枯草芽孢杆菌菌株MDT01-138：此菌株是具有以下结构的可扩增盒的枯草芽孢杆菌菌株BG3594：aprE 5’-枯草蛋白酶FNA-氯霉素-aprE 5’。已将其扩增至Cm25。

枯草芽孢杆菌菌株CP4010：此菌株是具有以下结构的可扩增盒的枯草芽孢杆菌菌株BG3594 comK：aprE 5’-枯草蛋白酶FNA-alr-aprE 5’。已用β-氯-D-丙氨酸对其进行了扩增。

枯草芽孢杆菌菌株CP4020：此菌株是具有以下结构的可扩增盒的枯草芽孢杆菌菌株BG3594：aprE 5’-枯草蛋白酶FNA-alr-aprE 5’。已用β-氯-D-丙氨酸对其进行了扩增。

枯草芽孢杆菌菌株Hyper1：具有编码枯草蛋白酶FNA且包含氯霉素标记的扩增盒。

CP3591：此菌株是在oppA基因座中在aprE启动子之后具有1拷贝枯草蛋白酶FNA(即总计1拷贝枯草蛋白酶)的BG3594。

CP3592：此菌株是在ybdL和ybdM基因之间在aprE启动子之后具有额外的1拷贝枯草蛋白酶FNA(即总计2拷贝枯草蛋白酶)的CP3591。

CP3593：此菌株是在pps基因座中在aprE启动子之后具有额外的1拷贝枯草蛋白酶FNA(即总计3拷贝枯草蛋白酶)的CP3592。

CP3594：此菌株是在nprE基因座中在aprE启动子之后具有额外的1拷贝枯草蛋白酶FNA(即总计4拷贝枯草蛋白酶)的CP3593。

质粒

pDALsub1已描述于Ferrari等1985中。此质粒表达alr。(Ferrari和Yang，Biotechnology，3，1003-1007[1985])

pBSFNACm(Seq ID NO：1)：此质粒是pBluescript的衍生物(Alting-Mees，M.A.和Short，J.M.pBluescript II：gene mapping vectors.Nucleic Acids Res.17(22)，9494(1989))，其包含f1(IG)-噬菌体f1的整合区；rep(pMB1)-负责噬菌粒复制的pMB1复制子；bla(ApR)-编码赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶的基因；编码β-半乳糖苷酶N端片段的lacZ基因的5′端部分；包含aprE 5’区、编码枯草蛋白酶(FNA)的基因、具有其启动子的来自pC194的氯霉素抗性基因、aprE 5’区的重复的多肽表达盒。此质粒用于将表达盒整合入5’aprE区。

pBSFNAalr(Seq ID NO：2)：此质粒是上述pBSFNACm的衍生物。在此质粒中，具有其自身启动子的枯草芽孢杆菌alr基因替换氯霉素抗性基因。此质粒用于将表达盒整合入5’aprE区。

培养基

LB和LB琼脂如Ausubel，EM.等(编辑)“Current Protocols inMolecular Biology”.John Wiley和Sons，1995中所述。LBG 1％是补充10g/L葡萄糖的LB。LBSM是补充1.6％脱脂乳的LB琼脂。用来研究蛋白酶产生的FNII培养基描述于WO05052146A2中。在LB琼脂+100mg/L D-丙氨酸上繁殖Alr-菌株。

适合时，将氯霉素、氨苄青霉素、环丝氨酸或β-氯-D-丙氨酸加至平板或培养液。

定量PCR(aPCR)

在ABI Prism 7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems，Foster City，CA)上进行定量编码待产生的目的多肽(例如枯草蛋白酶)的基因拷贝数的qPCR。按厂商(Applied Biosystems，Foster City，CA)的说明使用

Gene Expression Master Mix试剂盒。

发酵

在37℃和250转/分下，于10ml管中将待测试菌株接种入5ml LBG％中。OD₆₀₀为～1时，在250ml的Erlenmeyer摇瓶中用2.5ml培养物接种25ml FNII培养基。在37℃和250转/分孵育摇瓶，并定期取出培养液样品以测量枯草蛋白酶活性。

实施例1

枯草芽孢杆菌BG3594和BG3594、pDALsub1对β-氯-D-丙氨酸(CDA) 的敏感性阈值的测定

在第一个阶段中，通过将LB中生长的菌株BG3594的稀释液涂布在包含不同浓度CDA的LB琼脂平板上，测定抑制枯草芽孢杆菌生长必需的β-氯-D-丙氨酸(CDA)的浓度。如表1中所示，虽然BG3594在20mg/L的浓度下仍然可以生长，但是在50mg/L的浓度下生长完全被抑制。在第二个阶段中，将pDalsub1转化入BG3594，以测定alr的过量表达是否可以回复在CDA抑制浓度上生长。如表1中所示，alr表达质粒的存在允许在所测试的所有CDA浓度上生长。此结果表明，只要发生扩增，包含染色体编码的表达盒“目的多肽-alr”的菌株可以在高于20mg/L的CDA浓度上生长。可以用其他丙氨酸消旋酶抑制剂(如环丝氨酸)代替CDA。

表1

BG3594和BG3594、pDALsub1对LB琼脂平板中浓度增加的β-氯-D-丙氨酸的抗性

＊+：生长；＊＊-：不生长

实施例2

包含染色体编码的表达盒“目的多肽-标记”的菌株(菌株BG4010(comK) 和BG4020)的构建

按如下从pBSFNACm(SEQ ID NO：1)构建质粒pBSFNAalr(SEQ IDNO：2)。用染色体DNA为模板，PCR扩增具有其自身启动子的枯草芽孢杆菌alr基因。所用引物是EcoRIDrdIalrF(具有DrdI位点；gaagaattcgactaggttgt cttttcgtta gacatcgttt ccctttagc；SEQ ID NO：3)和SmaI-alrR(具有SmaI位点；ggttcccggg ttaattgctt atatttacct gcaataaagg；SEQ ID NO：4)。用DrdI/SmaI消化PCR产物，并与经BsmI/StuI消化的pBSFNACm的较大的片段重新连接。将连接产物转化入大肠杆菌菌株MM294，并涂布在羧苄青霉素50ppm平板上。将来自此转化的4个菌落接种入5ml LB+羧苄青霉素50ppm进行质粒纯化。产生的构建体称为pBSFNAalr(SEQ IDNO：2)。

pBSFNACm(SEQ ID NO：1)

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc  60

attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga  120

gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc  180

caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc  240

ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag  300

cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa  360

agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac  420

cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg  480

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg  540

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg  600

taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca  660

ccgcggtggc ggccgctcta gaactagtgg atcccccggg ctgcaggaat tctccatttt  720

cttctgctat caaaataaca gactcgtgat tttccaaacg agctttcaaa aaagcctctg  780

ccccttgcaa atcggatgcc tgtctataaa attcccgata ttggttaaac agcggcgcaa  840

tggcggccgc atctgatgtc tttgcttggc gaatgttcat cttatttctt cctccctctc  900

aataattttt tcattctatc ccttttctgt aaagtttatt tttcagaata cttttatcat  960

catgctttga aaaaatatca cgataatatc cattgttctc acggaagcac acgcaggtca  1020

tttgaacgaa ttttttcgac aggaatttgc cgggactcag gagcatttaa cctaaaaaag  1080

catgacattt cagcataatg aacatttact catgtctatt ttcgttcttt tctgtatgaa  1140

aatagttatt tcgagtctct acggaaatag cgagagatga tatacctaaa tagagataaa  1200

atcatctcaa aaaaatgggt ctactaaaat attattccat ctattacaat aaattcacag  1260

aatagtcttt taagtaagtc tactctgaat ttttttaaaa ggagagggta aagagtgaga  1320

agcaaaaaat tgtggatcag tttgctgttt gctttagcgt taatctttac gatggcgttc  1380

ggcagcacat cctctgccca ggcggcaggg aaatcaaacg gggaaaagaa atatattgtc  1440

gggtttaaac agacaatgag cacgatgagc gccgctaaga agaaagatgt catttctgaa  1500

aaaggcggga aagtgcaaaa gcaattcaaa tatgtagacg cagcttcagc tacattaaac  1560

gaaaaagctg taaaagaatt gaaaaaagac ccgagcgtcg cttacgttga agaagatcac  1620

gtagcacatg cgtacgcgca gtccgtgcct tacggcgtat cacaaattaa agcccctgct  1680

ctgcactctc aaggctacac tggatcaaat gttaaagtag cggttatcga cagcggtatc  1740

gattcttctc atcctgattt aaaggtagca ggcggagcca gcatggttcc ttctgaaaca  1800

aatcctttcc aagacaacaa ctctcacgga actcacgttg ccggcacagt tgcggctctt  1860

aataactcaa tcggtgtatt aggcgttgcg ccaagcgcat cactttacgc tgtaaaagtt  1920

ctcggtgctg acggttccgg ccaatacagc tggatcatta acggaatcga gtgggcgatc  1980

gcaaacaata tggacgttat taacatgagc ctcggcggac cttctggttc tgctgcttta  2040

aaagcggcag ttgataaagc cgttgcatcc ggcgtcgtag tcgttgcggc agccggtaac 2100

gaaggcactt ccggcagctc aagcacagtg ggctaccctg gtaaataccc ttctgtcatt 2160

gcagtaggcg ctgttgacag cagcaaccaa agagcatctt tctcaagcgt aggacctgag 2220

cttgatgtca tggcacctgg cgtatctatc caaagcacgc ttcctggaaa caaatacggc 2280

gcgttgaacg gtacatcaat ggcatctccg cacgttgccg gagcggctgc tttgattctt 2340

tctaagcacc cgaactggac aaacactcaa gtccgcagca gtttagaaaa caccactaca 2400

aaacttggtg attctttcta ctatggaaaa gggctgatca acgtacaggc ggcagctcag 2460

taaaacataa aaaaccggcc ttggccccgc cggtttttta ttatttttct tcctccgcat 2520

gttcaatccg ctccataatc gacggatggc tccctctgaa aattttaacg agaaacggcg 2580

ggttgacccg gctcagtccc gtaacggcca agtcctgaaa cgtctcaatc gccgcttccc 2640

ggtttccggt cagctcaatg ccgtaacggt cggcggcgtt ttcctgatac cgggagacgg 2700

cattcgtaat cggatcctct agagtcgatt tttacaagaa ttagctttat ataatttctg 2760

tttttctaaa gttttatcag ctacaaaaga cagaaatgta ttgcaatctt caactaaatc 2820

catttgattc tctccaatat gacgtttaat aaatttctga aatacttgat ttctttgttt 2880

tttctcagta tacttttcca tgttataaca cataaaaaca acttagtttt cacaaactat 2940

gacaataaaa aaagttgctt tttccccttt ctatgtatgt tttttactag tcatttaaaa 3000

cgatacatta ataggtacga aaaagcaact ttttttgcgc ttaaaaccag tcataccaat 3060

aacttaaggg taactagcct cgccggcaat agttaccctt attatcaaga taagaaagaa 3120

aaggattttt cgctacgctc aaatccttta aaaaaacaca aaagaccaca ttttttaatg 3180

tggtctttat tcttcaacta aagcacccat tagttcaaca aacgaaaatt ggataaagtg 3240

ggatattttt aaaatatata tttatgttac agtaatattg acttttaaaa aaggattgat 3300

tctaatgaag aaagcagaca agtaagcctc ctaaattcac tttagataaa aatttaggag 3360

gcatatcaaa tgaactttaa taaaattgat ttagacaatt ggaagagaaa agagatattt 3420

aatcattatt tgaaccaaca aacgactttt agtataacca cagaaattga tattagtgtt 3480

ttataccgaa acataaaaca agaaggatat aaattttacc ctgcatttat tttcttagtg 3540

acaagggtga taaactcaaa tacagctttt agaactggtt acaatagcga cggagagtta 3600

ggttattggg ataagttaga gccactttat acaatttttg atggtgtatc taaaacattc 3660

tctggtattt ggactcctgt aaagaatgac ttcaaagagt tttatgattt atacctttct 3720

gatgtagaga aatataatgg ttcggggaaa ttgtttccca aaacacctat acctgaaaat 3780

gctttttctc tttctattat tccatggact tcatttactg ggtttaactt aaatatcaat 3840

aataatagta attaccttct acccattatt acagcaggaa aattcattaa taaaggtaat 3900

tcaatatatt taccgctatc tttacaggta catcattctg tttgtgatgg ttatcatgca 3960

ggattgttta tgaactctat tcaggaattg tcagataggc ctaatgactg gcttttataa 4020

tatgagataa tgccgactgt actttttaca gtcggttttc taatgtcact aacctgcccc 4080

gttagttgaa gaaggttttt atattacagc tccagatcca tatccttctt tttctgaacc 4140

gacttctcct ttttcgcttc tttattccaa ttgctttatt gacgttgagc ctcggaaccc 4200

ttaacaatcc caaaacttgt cgaatggtcg gcttaatagc tcacgctatg ccgacattcg 4260

tctgcaagtt tagttaaggg ttcttctcaa cgcacaataa attttctcgg cataaatgcg 4320

tggtctaatt tttattttta ataaccttga tagcaaaaaa tgccattcca atacaaaacc 4380

acatacctat aatcgaccgg aattaattct ccattttctt ctgctatcaa aataacagac 4440

tcgtgatttt ccaaacgagc tttcaaaaaa gcctctgccc cttgcaaatc ggatgcctgt 4500

ctataaaatt cccgatattg gttaaacagc ggcgcaatgg cggccgcatc tgatgtcttt 4560

gcttggcgaa tgttcatctt atttcttcct ccctctcaat aattttttca ttctatccct 4620

tttctgtaaa gtttattttt cagaatactt ttatcatcat gctttgaaaa aatatcacga 4680

taatatccat tgttctcacg gaagcacacg caggtcattt gaacgaattt tttcgacagg 4740

aatttgccgg gactcaggag catttaacct aaaaaagcat gacatttcag cataatgaac 4800

atttactcat gtctattttc gttcttttct gtatgaaaat agttatttcg agtctctacg 4860

gaaatagcga gagatgatat acctaaatag agataaaatc atctcaaaaa aatgggtcta 4920

ctaaaatatt attccatcta ttacaataaa ttcacagaat agtcttttaa gtaagtctac 4980

tctgaatttt tttatcaagc ttatcgatac cgtcgacctc gagggggggc ccggtaccca 5040

gcttttgttc cctttagtga gggttaattg cgcgcttggc gtaatcatgg tcatagctgt 5100

ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa 5160

agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac 5220

tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 5280

cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 5340

gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 5400

ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 5460

ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 5520

atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 5580

aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg  5640

gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta  5700

ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg  5760

ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac  5820

acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag  5880

gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat  5940

ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat  6000

ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc  6060

gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt  6120

ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct  6180

agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt  6240

ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc  6300

gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac  6360

catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat  6420

cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg  6480

cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata  6540

gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta  6600

tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt  6660

gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag  6720

tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa  6780

gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc  6840

gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt  6900

taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc  6960

tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta  7020

ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa  7080

taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca  7140

tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac  7200

aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccac(SEQ ID NO：1)           7239

pBSFNAalr(SEQ ID NO：2)

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc  60

attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga  120

gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc  180

caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc  240

ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag  300

cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa  360

agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac  420

cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg  480

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg  540

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg  600

taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca  660

ccgcggtggc ggccgctcta gaactagtgg atcccccggg ctgcaggaat tctccatttt  720

cttctgctat caaaataaca gactcgtgat tttccaaacg agctttcaaa aaagcctctg  780

ccccttgcaa atcggatgcc tgtctataaa attcccgata ttggttaaac agcggcgcaa  840

tggcggccgc atctgatgtc tttgcttggc gaatgttcat cttatttctt cctccctctc  900

aataattttt tcattctatc ccttttctgt aaagtttatt tttcagaata cttttatcat  960

catgctttga aaaaatatca cgataatatc cattgttctc acggaagcac acgcaggtca  1020

tttgaacgaa ttttttcgac aggaatttgc cgggactcag gagcatttaa cctaaaaaag  1080

catgacattt cagcataatg aacatttact catgtctatt ttcgttcttt tctgtatgaa  1140

aatagttatt tcgagtctct acggaaatag cgagagatga tatacctaaa tagagataaa  1200

atcatctcaa aaaaatgggt ctactaaaat attattccat ctattacaat aaattcacag  1260

aatagtcttt taagtaagtc tactctgaat ttttttaaaa ggagagggta aagagtgaga  1320

agcaaaaaat tgtggatcag tttgctgttt gctttagcgt taatctttac gatggcgttc  1380

ggcagcacat cctctgccca ggcggcaggg aaatcaaacg gggaaaagaa atatattgtc  1440

gggtttaaac agacaatgag cacgatgagc gccgctaaga agaaagatgt catttctgaa  1500

aaaggcggga aagtgcaaaa gcaattcaaa tatgtagacg cagcttcagc tacattaaac  1560

gaaaaagctg taaaagaatt gaaaaaagac ccgagcgtcg cttacgttga agaagatcac  1620

gtagcacatg cgtacgcgca gtccgtgcct tacggcgtat cacaaattaa agcccctgct  1680

ctgcactctc aaggctacac tggatcaaat gttaaagtag cggttatcga cagcggtatc  1740

gattcttctc atcctgattt aaaggtagca ggcggagcca gcatggttcc ttctgaaaca  1800

aatcctttcc aagacaacaa ctctcacgga actcacgttg ccggcacagt tgcggctctt  1860

aataactcaa tcggtgtatt aggcgttgcg ccaagcgcat cactttacgc tgtaaaagtt  1920

ctcggtgctg acggttccgg ccaatacagc tggatcatta acggaatcga gtgggcgatc  1980

gcaaacaata tggacgttat taacatgagc ctcggcggac cttctggttc tgctgcttta  2040

aaagcggcag ttgataaagc cgttgcatcc ggcgtcgtag tcgttgcggc agccggtaac  2100

gaaggcactt ccggcagctc aagcacagtg ggctaccctg gtaaataccc ttctgtcatt  2160

gcagtaggcg ctgttgacag cagcaaccaa agagcatctt tctcaagcgt aggacctgag  2220

cttgatgtca tggcacctgg cgtatctatc caaagcacgc ttcctggaaa caaatacggc  2280

gcgttgaacg gtacatcaat ggcatctccg cacgttgccg gagcggctgc tttgattctt  2340

tctaagcacc cgaactggac aaacactcaa gtccgcagca gtttagaaaa caccactaca  2400

aaacttggtg attctttcta ctatggaaaa gggctgatca acgtacaggc ggcagctcag  2460

taaaacataa aaaaccggcc ttggccccgc cggtttttta ttatttttct tcctccgcat  2520

gttcaatccg ctccataatc gacggatggc tccctctgaa aattttaacg agaaacggcg  2580

ggttgacccg gctcagtccc gtaacggcca agtcctgaaa cgtctcaatc gccgcttccc  2640

ggtttccggt cagctcaatg ccgtaacggt cggcggcgtt ttcctgatac cgggagactt  2700

ttcgttagac atcgtttccc tttagccttt aattttagta tgatatgtaa atgatattga  2760

ataaaagcta ggaagtgtcg taatgagcac aaaacctttt tacagagata cgtgggcgga  2820

aattgacttg tccgcgataa aggaaaatgt cagcaatatg aaaaaacata tcggtgaaca  2880

tgtccacttg atggcagttg tgaaagcaaa cgcctacggg catggtgatg cagaaacagc  2940

aaaggctgct cttgacgcag gtgcttcatg cttggccgtg gccattttgg atgaagcgat  3000

ttcactgcgc aaaaagggat tgaaggcgcc tatattggtg cttggcgcgg ttcccccgga  3060

gtatgtggca atcgctgctg agtatgacgt gaccttaaca ggttattctg ttgaatggct  3120

tcaggaggca gcccgccaca cgaaaaaagg ttctcttcat tttcatctga aggtcgatac  3180

ggggatgaac agacttggtg taaaaacaga ggaagaagtt cagaacgtga tggcaattct  3240

tgaccgcaac cctcgtttaa agtgcaaagg ggtatttacc cattttgcga cagcggatga  3300

aaaagaaaga ggctatttct taatgcagtt tgagcgcttt aaagagctga ttgctccgct  3360

gccgttaaag aatctaatgg tccactgcgc gaacagcgcc gctggactcc ggctgaaaaa  3420

aggctttttt aatgcagtca gattcggcat cggcatgtat ggccttcgcc cgtctgctga  3480

catgtcggac gagataccgt ttcagctgcg tccggcattt accctgcatt cgacactgtc  3540

acatgtcaaa ctgatcagaa aaggcgagag cgtcagctac ggagccgagt acacagcgga  3600

aaaagacaca tggatcggga cggtgcctgt aggctatgcg gacggctggc tccgaaaatt  3660

gaaagggacc gacatccttg tgaagggaaa acgcctgaaa attgccggcc gaatttgcat  3720

ggaccaattt atggtggagc tggatcagga atatccgccg ggcacaaaag tcacattaat  3780

aggccggcag ggggatgaat atatttccat ggatgagatt gcaggaaggc tcgaaaccat  3840

taactatgag gtggcctgta caataagttc ccgtgttccc cgtatgtttt tggaaaatgg  3900

gagtataatg gaagtaagaa atcctttatt gcaggtaaat ataagcaatt aacctaatga  3960

ctggctttta taatatgaga taatgccgac tgtacttttt acagtcggtt ttctaatgtc  4020

actaacctgc cccgttagtt gaagaaggtt tttatattac agctccagat ccatatcctt  4080

ctttttctga accgacttct cctttttcgc ttctttattc caattgcttt attgacgttg  4140

agcctcggaa cccttaacaa tcccaaaact tgtcgaatgg tcggcttaat agctcacgct  4200

atgccgacat tcgtctgcaa gtttagttaa gggttcttct caacgcacaa taaattttct  4260

cggcataaat gcgtggtcta atttttattt ttaataacct tgatagcaaa aaatgccatt  4320

ccaatacaaa accacatacc tataatcgac ctgcaggaat taattcctcc attttcttct  4380

gctatcaaaa taacagactc gtgattttcc aaacgagctt tcaaaaaagc ctctgcccct  4440

tgcaaatcgg atgcctgtct ataaaattcc cgatattggc ttaaacagcg gcgcaatggc  4500

ggccgcatct gatgtctttg cttggcgaat gttcatctta tttcttcctc cctctcaata  4560

attttttcat tctatccctt ttctgtaaag tttatttttc agaatacttt tatcatcatg  4620

ctttgaaaaa atatcacgat aatatccatt gttctcacgg aagcacacgc aggtcatttg  4680

aacgaatttt ttcgacagga atttgccggg actcaggagc atttaaccta aaaaagcatg  4740

acatttcagc ataatgaaca tttactcatg tctattttcg ttcttttctg tatgaaaata  4800

gttatttcga gtctctacgg aaatagcgag agatgatata cctaaataga gataaaatca  4860

tctcaaaaaa atgggtctac taaaatatta ttccatctat tacaataaat tcacagaata  4920

gtcttttaag taagtctact ctgaattttt ttatcaagct tatcgatacc gtcgacctcg  4980

agggggggcc cggtacccag cttttgttcc ctttagtgag ggttaattgc gcgcttggcg  5040

taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac  5100

atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca  5160

ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat  5220

taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc  5280

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca  5340

aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca  5400

aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg  5460

ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg  5520

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt  5580

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt  5640

tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc  5700

tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt  5760

gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt  5820

agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc  5880

tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa  5940

agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt  6000

tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct  6060

acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta  6120

tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa  6180

agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc  6240

tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact  6300

acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc  6360

tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt  6420

ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta  6480

agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg  6540

tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt  6600

acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc  6660

agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt  6720

actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc  6780

tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc  6840

gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa  6900

ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac  6960

tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa  7020

aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt  7080

tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa  7140

tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa  agtgccac   7198

(SEQ ID NO：2)

用NotI/ScaI(缓冲液H)消化pBSFNAalr，在凝胶上迁移时其产生4个片段。片段的大小如下：3660-2263-1105-174。凝胶纯化最大的片段(包含5’-FNA-alr-5’盒)并使其自连。用“快速连接”试剂盒(Roche)进行连接。获得的环状DNA片段进行滚环反应(Amersham试剂盒)，转化入CP3590或CP3591的感受态细胞并涂布在LA+1.6％脱脂乳的平板上，或转化入BG3594或BG3594comK的感受态细胞并涂布在LA+1.6％脱脂乳+50ppm CDA的平板上。具有正确构建体的菌株将在那些平板上生长并显示通过所表达的蛋白酶清除脱脂乳产生的孔环。

可以通过用上一段落中提到的菌株的染色体DNA转化并在CDA 50上选择，在任意菌株中传代盒。通过在量渐增的CDA(高达200ppm)上划线培养菌株来进行盒的扩增。当涂布在1.6％脱脂乳平板上时，经扩增的菌株具有较大的孔环，这显示在量渐增的CDA上传代菌株导致盒的扩增。

实施例3

使用qPCR的菌株BG4020中枯草蛋白酶基因拷贝数的测定

从菌株CP3591、CP3592、CP3593、BG4020、经扩增的BG4020和Hyper1提取染色体DNA。测量DNA浓度并将每一样本的样品稀释至相同浓度。然后将每一菌株的相同量的DNA用于具有退火至枯草蛋白酶基因的引物(FNA-R2；ccagtgtagc cttgagag；SEQ ID NO：5和FNA-F2；acaatgagca cgatgagc；SEQ ID NO：6)的qPCR反应中。

用分别具有该基因的1、2和3个拷贝的菌株CP3591、CP3592和CP3593来建立校准曲线(图3)。用该校准曲线来测定枯草蛋白酶在BG4020、经扩增的BG4020和MDT01-138中的拷贝数。

表2给出获自BG4020、经扩增的BG4020和Hyper1中的qPCR反应的计数。从图3中给出的校准曲线产生相应的枯草蛋白酶基因拷贝数。结果显示，用alr标记扩增(经扩增的BG4020)与用氯霉素标记扩增(Hyper1)同样有效；经扩增的BG4020和Hyper1菌株都被测定为包含相同的拷贝数(即4)。4020中的非整数拷贝数可以产生自并非均一地包含相同拷贝数的经扩增的基因的细胞群体；数值2.4表示平均值。

实施例4

从用包含Cm或alr的盒扩增的菌株产生目的多肽

在37℃和250转/分下，于10ml管中将待测试菌株接种入5ml LBG％中。OD₆₀₀为～1时，用2.5ml培养物接种25ml FNII培养基于250ml的Erlenmeyer摇瓶中。在37℃和250转/分孵育摇瓶，并定期取出培养液样品以测量枯草蛋白酶活性。以这种方式测试了4个菌株：BG3591(包含枯草蛋白酶基因的一个拷贝，不可扩增)、MDT01-138(用氯霉素扩增)、BG4020(其中已引入5’-枯草蛋白酶-alr-5’盒的菌株)、经扩增的BG4020(已重新划线培养在渐增浓度的CDA上的BG4020菌株)。MDT01-138是与Hyper1同源(isogenic)的菌株-其包含氯霉素标记基因。

那些菌株的每一种在摇瓶中产生的枯草蛋白酶的量显示于图4中。从此图可以看出，枯草蛋白酶基因的扩增(经扩增的BG4020)导致比单拷贝菌株(BG3591)或未扩增菌株(BG4020)更高的蛋白酶产生。此外，通过用alr标记扩增获得的菌株(经扩增的BG4020)比用氯霉素标记扩增的菌株(MDT01-138)产生更多的蛋白酶。

这些结果显示，alr基因可以有效地用作非抗生素、非外源标记，用来扩增编码目的多肽的表达盒和随后产生高水平的目的多肽。

Claims (17)

1.扩增基因座的方法，其包括：

(a)将包含结构为A₁-P-M-A₂的基因座的细菌宿主细胞的群体与必需酶的抑制剂接触，其中A₁和A₂是同向重复，P包含目的蛋白质的编码序列，M包含所述必需酶的编码序列；和

(b)选择对所述抑制剂具有抗性的细胞，其中对所述抑制剂具有抗性的细胞具有多个拷贝所述扩增单位。

2.权利要求1的方法，其中所述细菌宿主细胞是芽孢杆菌属物种细胞。

3.权利要求1或2的方法，其中所述必需酶是所述细胞内源的野生型酶。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述细菌宿主细胞还包含编码所述必需酶的失活的基因，其中所述失活的基因是所述细胞内源的且位于与所述结构为A₁-P-M-A₂的基因座不同的基因座。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中P包含表达盒。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中A₁包含有效连接至P的编码序列的启动子。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述必需酶的所述编码序列连接至所述编码序列内源的启动子。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述目的蛋白质是枯草蛋白酶。

9.权利要求1的方法，其中所述必需酶是D-丙氨酸消旋酶。

10.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述必需酶是D-丙氨酸消旋酶且所述抑制剂是β-氯-D-丙氨酸。

11.细菌宿主细胞，其包含含有结构为A₁-P-M-A₂的扩增单位的基因座，其中A₁和A₂是同向重复，P包含目的蛋白质的编码序列，M包含必需酶的编码序列。

12.细菌宿主细胞，其包含多个拷贝含有结构为A₁-P-M-A₂的扩增单位的基因座，其中A₁和A₂是同向重复，P包含用于目的蛋白质的第一编码序列，M包含用于必需酶的第二编码序列，其中所述第一编码序列有效连接至存在于同向重复A₁中的启动子。

13.权利要求11或12的细菌宿主细胞，其中所述目的蛋白质是枯草蛋白酶，且所述必需酶是丙氨酸消旋酶。

14.权利要求11-13中任一项的细菌宿主细胞，其中所述扩增单位具有SEQ ID NO：7中所示的序列。

15.细菌细胞培养物，其包含：

生长培养基；和

权利要求11-14中任一项的细菌细胞的群体。

16.包括在适合产生所述目的蛋白质的条件下维持权利要求15的细胞培养物的方法。

17.权利要求16的方法，其还包括从所述培养基回收所述目的蛋白质。

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