KR20150115023A

KR20150115023A - 광범위한 온도에 걸쳐 활성인 프로테아제 변이형

Info

Publication number: KR20150115023A
Application number: KR1020157026840A
Authority: KR
Inventors: 피테르 아우구스티누스; 프리츠 구데게부르; 아이루카랜 제이 파울로스; 데르 란 요하네스 코넬리스 반
Original assignee: 다니스코 유에스 인크.
Priority date: 2006-07-18
Filing date: 2007-07-09
Publication date: 2015-10-13
Also published as: US20080090747A1; US20190078070A1; US20110059517A1; WO2008010925A2; NZ573467A; CN101511998A; MX2009000537A; US20140302590A1; WO2008010925A3; CA2658396C; BRPI0714329B1; RU2009105503A; JP2009543577A; JP2016052308A; US20130323816A1; CA2658396A1; CN104232365A; RU2509152C2; BRPI0714329A2; AU2007275864A1

Abstract

본 발명은 식기세정 적용에 특히 적합한 프로테아제 조성물을 제공한다.

Description

광범위한 온도에 걸쳐 활성인 프로테아제 변이형 {PROTEASE VARIANTS ACTIVE OVER A BROAD TEMPERATURE RANGE}

본 출원은 계류 중인 미국 가출원 특허 일련 번호 60/831,732 에 대한 우선권을 주장한다.

전형적으로, 통상의 가정용 및 산업용 식기세정 조성물은, 식기류의 세정 및 살균을 위해 고 알칼리성 세정세제 및 염소 표백제의 조합에 의존한다. 이러한 시스템은 일반적으로 표백이 가능한 얼룩에서는 잘 작용한다. 그러나, 이들은 가정, 병원, 음식점, 연회업 등에서의 식기류에 종종 존재하는 단백질-함유 오물의 제거에 있어 불충분할 수 있다. 또한, 고도의 알칼리성 및 염소-함유 조성물은 소비자 및 환경에 대해서 친화적인 것으로 고려되지 않는다.

단백질성 오물의 제거에 효과적인 식기세정 조성물을 제조하기 위해 다양한 시도가 이루어졌다. 이러한 조성물에는 전형적으로 알칼리 조건 (예를 들어, pH 9.5 이상) 하에서 활성인 프로테아제가 포함된다. 그러나, 이러한 조성물은 식기세정 세제용으로 소비자에게 통상적으로 선호되는 액체 또는 젤 형태로 제형화하기가 어렵다는 현저한 단점이 있다. 또한, 알칼리성 식기세정 조성물은 종종 자극적인 것으로 생각된다.

저 pH (예를 들어, pH 9.5 미만) 의 식기세정 조성물을 제조하려는 시도가 종종 행해졌다. 이러한 조성물은 좀더 안전하고, 더욱 환경 친화적이고, 젤 및 액체 제형으로 제형화될 수 있다. 그러나, 저 pH 의 현행 식기세정 조성물은 고농도의 효소 (예를 들어, 프로테아제) 를 식기세정 조성물로 제형화하는 경우에도, 단백질성 오물 제거가 매우 불충분하다는 것으로 밝혀졌다.

그러므로, 식기류로부터 단백질성 오물을 제거하는데 매우 효과적인 식기세정 조성물에 대한 당업계의 요구가 남아있다. 또한, 더욱 환경 및 소비자에 대해 친화적이고, 사용이 용이하고 비용 효율적인 형태인 식기세정 조성물에 대한 요구가 남아있다.

본 발명은 식기류 세제에 적용하기 위해 향상된 특성을 나타내는 돌연변이체 프로테아제를 제공한다. 일부 바람직한 구현예에서, 돌연변이체 프로테아제는 하기 아미노산 서열을 갖는 PB92 세린 프로테아제의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는다: H₂N-

또다른 추가의 구현예에서, 돌연변이체 프로테아제는 SEQ ID NO:2 와 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는다. 본원의 각각의 바람직한 구현예에서, 돌연변이체 프로테아제는 야생형 PB92 프로테아제와 비교해 향상된 세정력 및/또는 향상된 안정성을 제공한다.

일부 바람직한 구현예에서, 본 발명은 출발 프로테아제와 비교해 향상된 식기세정력을 갖는 변이형 프로테아제를 제공한다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 효소에는 본원에서 표 1 에 언급된 바와 같은 치환을 갖는, 049, 045, 046, 047/048, 050, 051/052, 053, 054, 055/056, 057, 058, 059 및 060 으로 지정된 것들이 포함된다. 부가적인 구현예에서, 본 발명은 부가적인 돌연변이 (예를 들어, 치환, 삽입 및/또는 결실) 를 갖는 이러한 효소를 제공한다.

일부 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열을 갖는, 049 로 지칭되는 효소를 제공한다:

또한 본 발명은 본원에 제공된 돌연변이체 프로테아제 중 하나 이상을 함유하는 단백질 가수분해 효소 생성물을 포함하는, 신규 효소 식기세정 세제를 제공한다.

부가적인 구현예에서, 본 발명은 변형 서브틸리신이 SEQ ID NO:2 에 언급된 서열 중에서 하나 이상의 치환을 포함하며, 각각의 위치는 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열의 아미노산 서열의 위치에 상응하고, 치환은 다음의 위치: G118, S128, P129, S130, 및 S166 으로부터 선택되는, 변형 서브틸리신을 포함하는 식기세정 조성물을 제공한다.

일부 구현예에서, 변형 서브틸리신은 다음의 위치: G118, S128, P129, 및 S130 에서 형성된 치환을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 변형 서브틸리신은 돌연변이 G118V 및 하나 이상의 부가적인 돌연변이를 포함한다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 부가적인 돌연변이는 S128F, S128L, S128N, S128R, S128V, P129E, P129L, P129M, P129N, P129L, P129Q, P129S, S130A, S130K, S130P, S130T, S130V, 및 S166D 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또다른 추가적인 바람직한 구현예에서, 변형 서브틸리신은 다음의 위치: S128, P129, 및 S130 에서 형성된 치환을 포함한다. 또다른 추가적인 바람직한 구현예에서, 치환은 S128C, S128R, P129Q, P129R, S130D, 및 S130G 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 상기 변형 서브틸리신의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:3 에 언급된다.

또한 본 발명은 변형 서브틸리신이 SEQ ID NO:2 에 언급된 서열 중에서 치환을 포함하며, 각각의 위치는 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열의 아미노산 서열의 위치에 상응하고, 치환은 S130T 인, 변형 서브틸리신을 포함하는 식기세정 조성물을 포함하는 구현예를 제공한다.

또한 본 발명은 변형 서브틸리신이 SEQ ID NO:2 에 언급된 서열 중에서 2 개 이상의 치환을 포함하며, 각각의 위치는 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열의 아미노산 서열의 위치에 상응하고, 치환은 다음의 위치: G118, S128, P129, S130, 및 S166 으로부터 선택되는, 변형 서브틸리신을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 핵산은 다음의 위치: G118, S128, P129, 및 S130 에서 형성된 치환을 포함하는 변형 서브틸리신을 코딩한다. 일부 바람직한 구현예에서, 핵산은 돌연변이 G118V 및 하나 이상의 부가적인 돌연변이를 포함하는 변형 서브틸리신을 코딩한다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 핵산은 S128F, S128L, S128N, S128R, S128V, P129E, P129L, P129M, P129N, P129L, P129Q, P129S, S130A, S130K, S130P, S130T, S130V, 및 S166D 로 이루어진 군으로부터 선택되는 부가적인 돌연변이를 추가로 포함한다. 또다른 추가적인 바람직한 구현예에서, 핵산은 다음의 위치 S128, P129, 및 S130 에서 형성된 치환을 포함하는 변형 서브틸리신을 코딩한다. 또다른 추가적인 바람직한 구현예에서, 핵산은 S128C, S128R, P129Q, P129R, S130D, 및 S130G 로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환을 포함한다.

일부 특히 바람직한 구현예에서, 변형 서브틸리신의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:3 에 언급된다. 일부 부가적인 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:3 에 언급된 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.

또다른 부가적인 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 상기 언급된 바와 같은 단리된 핵산 중 하나 이상을 포함하는 벡터를 제공한다. 또다른 추가의 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 벡터 중 하나 이상을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형 서브틸리신 및 세정이 필요한 식기류를 제공하는 단계; 및 식기류의 세정에 효과적인 조건 하에서 식기류를 하나 이상의 변형 서브틸리신과 접촉시키는 단계를 포함하는, 식기세정 방법을 제공한다.

도 1A 는 PB92 프로테아제 유전자를 함유하는 돌연변이 벡터의 구축을 보여준다.
도 1B 는 본 발명의 일부 구현예에서 사용되는 돌연변이 절차를 보여주는 도식을 나타낸다.
도 1C 는 돌연변이체 PB92 프로테아제 유전자를 함유하는 발현 벡터의 구축을 보여준다.
도 2 는 PB92 프로테아제 유전자의 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 1) 및 코딩되는 예비-단백질, 전-단백질 및 성숙 단백질의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:2) 을 제공한다.

본 발명은 식기세정에 적용하기 위해 하나 이상의 돌연변이체 프로테아제를 포함하는 방법 및 조성물을 제공한다.

다르게 언급되지 않는다면, 본 발명의 실시에는 모두 당업계 내에 있는 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 조작, 단백질 및 DNA 서열분석, 재조합 DNA 분야, 및 산업적 효소 용도 및 개발에 흔히 사용되는 통상적인 기술이 포함된다. 본원의 상기 및 하기 모두에 언급된 모든 특허, 특허 출원, 논문 및 문헌은 참조로서 본원에 명백히 인용된다.

게다가, 본원에 제시된 표제는 전체적으로 명세서를 참조할 수 있는 본 발명의 다양한 양상 또는 구현예를 제한하지 않는다. 따라서, 바로 이하에 정의되는 용어는 전체적으로 명세서를 참조로 하여 더욱 완전히 정의된다. 그럼에도 불구하고, 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 여러 용어에 대한 정의가 하기에 제공된다.

본원에서 다르게 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, [Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley and Sons, NY (1994); 및 Hale and Markham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)] 에서는 당업자에게 본 발명에서 사용되는 많은 용어의 일반적인 사전적 의미를 제공한다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시에 사용되나, 바람직한 방법 및 물질이 본원에 기재되어 있다. 따라서, 바로 이하에 정의되는 용어는 전체적으로 명세서를 참조로 하여 더욱 완전히 정의된다. 또한, 본원에 사용되는 바와 같은 단수형 용어에는 문맥상 명백하게 지시되지 않는 한 복수형 참조도 포함된다. 다르게 지시되지 않는다면, 핵산은 왼쪽에서 오른쪽으로 5' 에서 3' 방향으로 적고; 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 아미노에서 카르복시 방향으로 각각 적는다. 이들은 당업자에 의해 사용되는 문맥에 따라 매우 달라질 수 있으므로 본 발명이 기재되는 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 제한되는 것이 아닌 것으로 이해된다.

본 명세서에 제시된 모든 최대 수치 한계에는, 보다 적은 수치 한계가 본원에 명백하게 적혀있으면 모든 보다 적은 수치 한계가 포함되는 것으로 의도된다. 본 명세서에 제시된 모든 최소 수치 한계에는, 보다 큰 수치 한계가 본원에 명백하게 적혀있으면 모든 보다 큰 수치 한계가 포함될 것이다. 본 명세서에 제시된 모든 수치 범위에는, 보다 좁은 수치 범위가 모두 본원에 명백하게 적혀있으면 보다 넓은 수치 범위 내의 모든 보다 좁은 수치 범위가 포함될 것이다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "상용성" 은 본원에서 제공되는 프로테아제(들) 이 정상적인 사용 상황 동안 필요한 만큼 효과적이지 않은 정도로, 세정 조성물 물질이 프로테아제 효소(들) 의 효소 활성을 감소시키지 않는 것을 의미한다. 구체적인 세정 조성물 물질이 이하 상세히 열거된다.

본원에 사용된 바와 같은, "효소 유효량" 은 특정 적용에 필요한 효소 활성을 달성하는데 필요한 효소의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자에 의해 쉽게 확인되며 많은 인자, 예컨대 사용되는 특정 효소 변이형, 세정 적용, 세정 조성물의 특정 조성, 및 액체 또는 건조 (예를 들어, 과립형) 조성물이 필요한지의 여부 등에 근거한다.

본원에 사용된 바와 같은, "돌연변이체 단백질 가수분해 효소" 와 관련하여 사용된 "향상된 특성을 가짐" 은 상응하는 야생형 프로테아제와 비교해, 보유된 성능에 비해 향상된 성능 및/또는 향상된 안정성을 갖는 단백질 가수분해 효소를 말한다.

일부 특히 바람직한 구현예에서, 향상된 특성은 향상된 식기세정력 및 향상된 안정성 뿐 아니라, 향상된 식기세정력과 향상된 안정성의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본원에 사용된 바와 같은, 구 "세제 안정성" 은 세제 조성물의 안정성을 말한다. 일부 구현예에서, 안정성은 세제의 사용 동안 평가되는 반면, 다른 구현예에서, 상기 용어는 저장 동안의 세제 조성물의 안정성을 말한다.

용어 "향상된 안정성" 은 저장 동안 조성물에서의 돌연변이체 프로테아제(들) 의 보다 양호한 안정성 및/또는 서드 (sud) 에서의 보다 양호한 안정성을 나타내는데 사용된다. 바람직한 구현예에서, 돌연변이체 프로테아제(들) 은 저장 동안 식기 관리 세제에서의 향상된 안정성 및/또는 서드 (sud) 에서의 향상된 안정성을 나타내고, 여기에는 상응하는 야생형 효소에 비교한 산화제, 격리제, 자가분해, 계면활성제 및 고 알칼리성에 대한 안정성이 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은, 구 "단백질 가수분해에 대한 안정성" 은 단백질 가수분해를 견디는 단백질 (예를 들어, 효소) 의 능력을 말한다. 상기 용어가 단백질의 안정성을 평가하기 위한 임의의 특정 프로테아제의 사용에 제한되는 것으로 의도되는 것은 아니다.

본원에 사용된 바와 같은, "산화 안정성" 은 산화 조건 하에서 작용하는 단백질의 능력을 말한다. 특히, 상기 용어는 다양한 농도의 H₂O₂, 과산 및 다른 산화제의 존재하에서 작용하는 단백질의 능력을 말한다. 다양한 산화 조건 하에서의 안정성은 당업자에게 공지된 표준 절차 및/또는 본원에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다. 산화 안정성의 실질적인 변화는 산화 화합물의 부재하에 존재하는 효소 활성과 비교하여, 효소 활성의 반감기의 약 5% 이상의 증가 또는 감소 (대부분의 구현예에서, 이것은 바람직하게는 증가한다) 에 의해 증명된다.

본원에 사용된 바와 같은, "pH 안정성" 은 특정 pH 에서 작용하는 단백질의 능력을 말한다. 일반적으로, 대부분의 효소는 그들이 작용할 한정된 pH 가 있다. 중간 범위의 pH (즉, pH 7 근처) 에서 작용하는 효소 외에도, 매우 높거나 매우 낮은 pH 조건하에서 작용할 수 있는 효소가 있다. 다양한 pH 에서의 안정성은 당업자에게 공지된 표준 절차 및/또는 본원에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다. pH 안정성의 실질적인 변화는 효소의 최적 pH 에서의 효소 활성과 비교하여, 효소 활성의 반감기의 약 5% 이상의 증가 또는 감소 (대부분의 구현예에서, 이것은 바람직하게는 증가한다) 에 의해 증명된다. 그러나, 본 발명이 임의의 pH 안정성 수준 또는 pH 범위에 제한되는 것으로 의도되는 것은 아니다.

본원에 사용된 바와 같은, "열 안정성" 은 특정 온도에서 작용하는 단백질의 능력을 말한다. 일반적으로, 대부분의 효소는 그들이 작용할 한정된 온도 범위가 있다. 중간 범위의 온도 (예를 들어, 실온) 에서 작용하는 효소 외에도, 매우 높거나 매우 낮은 온도에서 작용할 수 있는 효소가 있다. 열 안정성은 공지된 절차 또는 본원에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다. 열 안정성의 실질적인 변화는 제시된 온도에 노출된 경우 돌연변이체의 효소 활성의 반감기의 약 5% 이상의 증가 또는 감소 (대부분의 구현예에서, 이것은 바람직하게는 증가한다) 에 의해 증명된다. 그러나, 본 발명이 임의의 온도 안정성 수준 또는 온도 범위에 제한되는 것으로 의도되는 것은 아니다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약품 안정성" 은 그 활성에 악영향을 끼칠 수 있는 약품에 대한 단백질 (예를 들어, 효소) 의 안정성을 말한다. 일부 구현예에서, 이러한 약품에는 과산화수소, 과산, 음이온성 세제, 양이온성 세제, 비이온성 세제, 킬레이트제, 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나, 본 발명이 임의의 특정 약품 안정성 수준 또는 약품 안정성의 범위에 제한되는 것으로 의도되는 것은 아니다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "정제된" 및 "단리된" 은 샘플로부터의 오염물질의 제거를 말한다. 예를 들어, 관심의 효소는 오염 단백질 및 관심의 효소가 아닌 용액 또는 제제 내의 다른 화합물의 제거에 의해 정제된다. 일부 구현예에서, 관심의 재조합 효소는 박테리아 또는 진균 숙주 세포에서 발현되고, 이러한 관심의 재조합 효소는 다른 숙주 세포 구성물의 제거에 의해 정제된다; 그러므로 샘플 중에서 관심 폴리펩티드의 재조합 효소의 % 가 증가한다.

본원에 사용된 바와 같은, "관심의 단백질" 은 분석, 확인 및/또는 변형되는 단백질 (예를 들어, 효소 또는 "관심의 효소") 을 말한다. 자연 발생적, 뿐 아니라 재조합 (예를 들어, 돌연변이체) 단백질이 본 발명에서 사용된다.

본원에 사용된 바와 같은, "단백질" 은 아미노산으로 구성되고 당업자에 의해 단백질로 인지된 임의의 조성물을 말한다. 용어 "단백질," "펩티드" 및 폴리펩티드는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 펩티드가 단백질의 일부인 경우, 당업자는 문맥에서의 용어의 사용을 이해한다.

본원에 사용된 바와 같은, 기능적으로 및/또는 구조적으로 유사한 단백질은 "관련 단백질" 인 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 이러한 단백질은 개체 분류 간의 차이를 포함하는 상이한 속 및/또는 종 유래의 것이다 (예를 들어, 박테리아 단백질 및 진균 단백질). 부가적인 구현예에서, 관련 단백질은 동일 종으로부터 제공된다. 게다가, 본 발명이 임의의 특정 근원(들) 로부터의 관련 단백질에 제한되는 것으로 의도되는 것은 아니다. 또한, 용어 "관련 단백질" 은 3 차 구조적 상동 및 1 차 서열 상동 (예를 들어, 본 발명의 효소) 을 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 용어는 면역학적으로 교차 반응하는 단백질을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "유도체" 는 한쪽 또는 양쪽 C- 및 N-말단(들) 에 대한 하나 이상의 아미노산의 첨가 (즉, 삽입), 아미노산 서열 중의 하나 또는 다수의 상이한 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 치환, 및/또는 단백질의 한쪽 또는 양쪽 말단 또는 아미노산 서열 중의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 결실, 및/또는 아미노산 서열 중의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 삽입에 의해 단백질로부터 유도된 단백질을 말한다. 단백질 유도체의 제조는 바람직하게는 선천적 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 변형하고, DNA 서열을 적합한 숙주 내로 형질전환시키고, 변형된 DNA 서열을 발현시켜 유도체 단백질을 형성하여 달성된다.

관련 (및 유도체) 단백질은 "변이형 단백질" 을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 변이형 단백질은 소수의 아미노산 잔기가 모 단백질과 서로 상이하다. 상이한 아미노산 잔기의 수는 하나 이상의, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 개 이상의 아미노산 잔기일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 변이형 간의 상이한 아미노산의 수는 1 내지 10 개이다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 관련 단백질 및 특히 변이형 단백질은 적어도 약 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 일치성을 포함한다. 부가적으로, 본원에 사용되는 바와 같은 관련 단백질 또는 변이형 단백질은, 현저한 영역의 수가 또다른 관련 단백질 또는 모 단백질과 상이한 단백질을 말한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 변이형 단백질은 모 단백질과 상이한 1, 2, 3, 4, 5, 또는 10 개의 상응하는 현저한 영역을 갖는다.

부위-포화 돌연변이화, 스캐닝 돌연변이화, 삽입형 돌연변이화, 랜덤 돌연변이화, 위치-지정 돌연변이화, 및 지정-진화 뿐 아니라, 다양한 기타 재조합 접근법을 이에 제한되지 않게 포함하는 여러 방법이, 본 발명의 프로테아제 효소의 변이형의 발생에 적합한 것으로 당업계에 알려져 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "발현 벡터" 는 적합한 숙주에서 DNA 의 발현에 영향을 줄 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 구축물을 말한다. 이러한 조절 서열에는 전사에 영향을 주는 프로모터, 이러한 전사를 조절하는 임의의 조작 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 번역의 종결을 조절하는 서열이 포함된다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 단순히 잠재적인 게놈 삽입체일 수 있다. 일단 적합한 숙주 내로 형질전환되면, 벡터는 복제되고 숙주 게놈과 독립적으로 기능할 수 있고, 또는 일부 예에서는 게놈 그 자체 내로 통합될 수 있다. 본 명세서에서, "플라스미드," "발현 플라스미드," 및 "벡터" 는, 플라스미드가 현재 가장 통상적으로 사용되는 벡터의 형태이므로 종종 상호교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 수행하고, 당업계에 공지된, 또는 당업계에 공지되게 되는 이러한 다른 형태의 발현 벡터가 포함되는 것으로 의도된다.

일부 바람직한 구현예에서, 프로테아제 유전자는 적합한 발현 플라스미드 내로 라이게이션된다. 그 다음 클로닝된 프로테아제 유전자는 프로테아제 유전자를 발현하기 위해 숙주 세포를 형질전환 또는 트랜스펙션시키는데 사용된다. 상기 플라스미드는 플라스미드 복제에 필요한 잘 공지된 요소를 포함하므로 숙주에서 복제될 수 있고, 또는 상기 플라스미드는 숙주 염색체 내로 통합되도록 고안될 수 있다. 필요 요소가 효과적인 유전자 발현을 위해 제공된다 (예를 들어, 관심의 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터). 일부 구현예에서, 이러한 필요 요소는 인지되는 경우 (즉, 숙주에 의해 전사되는 경우) 유전자 자체의 상동 프로모터로서, 및 외생이거나 프로테아제 유전자의 내생 종결자 영역에 의해 공급되는 전사 종결자에 의해 공급된다. 일부 구현예에서, 항생제-함유 배지에서의 성장에 의한 플라스미드-감염 숙주 세포의 지속적 배양 유지를 가능하게 하는 항생제 내성 유전자와 같은 선별 유전자가 또한 포함된다.

다른 방법이 사용될 수 있지만, 하기 카세트 돌연변이화 방법이 본 발명의 프로테아제 변이형의 구축을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다.

먼저, 본원에 기재되는 바와 같이, 프로테아제를 코딩하는 자연 발생적 유전자를 수득하고 전체적으로 또는 부분적으로 서열분석한다. 그 다음, 코딩된 프로테아제에서 하나 이상의 아미노산의 돌연변이 (결실, 삽입 또는 치환) 의 제조를 원하는 지점에 대해 서열을 스캐닝한다. 상기 지점의 측면 서열을, 짧은 절편의 유전자 발현 시 다양한 돌연변이체를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 집합 (pool) 으로 대체하기 위한 제한 부위의 존재에 대해 평가한다. 이러한 제한 부위는 유전자 절편의 대체를 용이하게 하도록 바람직하게는 단백질 유전자 내의 독특한 부위이다. 그러나, 프로테아제 유전자 내에 전체적으로 중복되지 않는 임의의 편리한 제한 부위가 사용될 수 있으며, 단, 제한 소화에 의해 발생되는 유전자 단편은 적합한 서열에 재집합될 수 있다. 제한 부위가 선택 지점으로부터 편리한 거리 내의 위치 (10 내지 15 개의 뉴클레오티드) 에 존재하지 않는 경우, 이러한 부위는 최종 구축물에서 해독 프레임 또는 코딩되는 아미노산을 변화시키지 않는 방식으로 유전자 중의 뉴클레오티드를 치환하여 발생된다. 원하는 서열에 부합하도록 서열을 변화시키기 위한 유전자의 돌연변이는, 일반적으로 공지된 방법에 따라 M13 프라이머 확장에 의해 수행된다. 적합한 측면 영역을 위치시키고 2 개의 편리한 제한 부위 서열에 도달하는데 필요한 변경을 평가하려는 과제는 유전학 암호의 중복성, 유전자의 제한 효소 지도 및 다수의 상이한 제한 효소에 의해 정규적으로 수행된다. 편리한 측면 제한 부위가 이용가능한 경우, 상기 방법은 오직, 해당 부위를 함유하지 않은 측면 영역과 관련하여 사용되는 것이 필요하다.

일단 자연 발생적 DNA 및/또는 합성 DNA 가 클로닝되면, 돌연변이되는 위치의 측면 제한 부위가 동족 제한 효소로 소화되고 대다수의 말단-상보적 올리고뉴클레오티드 카세트가 유전자 내에 라이게이션된다. 동일한 제한 부위를 갖도록 모든 올리고뉴클레오티드가 합성될 수 있기 때문에 돌연변이화는 상기 방법으로 단순화되며, 제한 부위를 제작하기 위해 합성 연결자는 필요하지 않다.

본원에 사용된 바와 같은, "상응하는" 은 단백질 또는 펩티드 중의 열거된 위치에서의 잔기, 또는 단백질 또는 펩티드 중의 열거된 잔기와 유사, 상동, 또는 등가인 잔기를 말한다.

본원에 사용된 바와 같은, "상응하는 영역" 은 일반적으로 관련 단백질 또는 모 단백질과 유사한 위치를 말한다.

용어 "코딩하는 핵산 분자" "코딩하는 핵산 서열" "코딩하는 DNA 서열" 및 "코딩하는 DNA" 는 데옥시리보핵산 가닥을 따른 데옥시리보뉴클레오티드의 순서 또는 서열을 말한다. 이러한 데옥시리보뉴클레오티드의 순서는 폴리펩티드 (단백질) 사슬을 따른 아미노산의 순서를 결정한다. 그러므로 DNA 서열은 아미노산 서열을 코딩한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "유사 서열" 은 관심의 단백질 (즉, 전형적으로 관심의 본래 단백질) 과 유사한 기능, 3 차 구조, 및/또는 보존 잔기를 제공하는 단백질 내의 서열을 말한다. 예를 들어, 알파 헬릭스 또는 베타 쉬트 구조를 함유하는 에피토프 영역에서, 유사 서열 중의 대체 아미노산은 바람직하게는 동일한 특이적 구조를 유지한다. 또한 상기 용어는 뉴클레오티드 서열 뿐 아니라, 아미노산 서열을 말한다. 일부 구현예에서, 유사 서열은 대체 아미노산이 유사한 또는 향상된 기능을 보이는 변이형 효소를 야기하는 식으로 발생된다. 일부 바람직한 구현예에서, 관심의 단백질 중의 아미노산의 3 차 구조 및/또는 보존 잔기는 관심의 분절 또는 단편에 또는 그 주변에 위치한다. 그러므로, 관심의 분절 또는 단편이 예를 들어, 알파 헬릭스 또는 베타 쉬트 구조를 함유하는 경우, 대체 아미노산은 바람직하게는 특정 구조를 유지한다.

본원에 사용된 바와 같은, "상동 단백질" 은 관심의 단백질 (예를 들어, 또다른 근원으로부터의 프로테아제) 와 유사한 작용 및/또는 구조를 갖는 단백질 (예를 들어, 프로테아제) 을 말한다. 상동이 반드시 진화적으로 관련될 필요는 없다. 그러므로, 상기 용어는 상이한 종으로부터 수득된 동일 또는 유사한 효소(들) (즉, 구조 및 기능 면에서) 를 포함하는 것으로 의도된다. 일부 바람직한 구현예에서, 변화 붕괴를 감소시킬 상동으로부터의 유사 분절을 가진 관심의 단백질 중의 분절 또는 단편에 대한 대체물로서, 관심의 단백질과 유사한 4 차, 3 차 및/또는 1 차 구조를 갖는 상동을 확인하는 것이 바람직하다. 일부 구현예에서, 상동 단백질은 관심의 단백질과 유사한 면역 반응(들) 을 유도하였다.

본원에 사용된 바와 같은, "상동 유전자" 는 상이한 종으로부터의 적어도 한 쌍의 유전자를 말하고, 상기 유전자는 서로 상응하고, 서로 동일 또는 매우 유사하다. 상기 용어는 종분화 (즉, 신규 종의 발생) 에 의해 분리된 유전자 (예를 들어, 오르소로그 (orthologous) 유전자) 뿐 아니라, 유전적 복제 (예를 들어, 파라로그 (paralogous) 유전자) 에 의해 분리된 유전자를 포함한다. 이러한 유전자는 "상동 단백질" 을 코딩한다.

본원에 사용된 바와 같은, "오르소로그" 및 "오르소로그 유전자" 는 종분화에 의해 통상의 조상 유전자 (즉, 상동 유전자) 로부터 진화한 상이한 종에서의 유전자를 말한다. 전형적으로, 오르소로그는 진화 과정 동안 동일한 기능을 보유한다. 오르소로그의 확인은 새롭게 서열분석된 게놈에서 유전자 기능의 신뢰성있는 예측에 사용된다.

본원에 사용된 바와 같은, "파라로그" 및 "파라로그 유전자" 는 게놈 내의 복제에 의해 관련된 유전자를 말한다. 오르소로그가 진화 과정 동안 동일한 기능을 보유하는 반면, 파라로그는 새로운 기능을 진화시킨다 (일부 기능은 종종 본래 기능과 관련되기는 함). 파라로그 유전자의 예에는 트립신, 키모트립신, 엘라스타아제 및 트롬빈을 코딩하는 유전자가 포함되나 이에 제한되지 않으며, 이것은 모두 세린 프로테아제이고 동일한 종 내에 함께 발생한다.

본원에 사용된 바와 같은, "야생형" 및 "선천적" 단백질은 자연에서 발견된 단백질이다. 용어 "야생형 서열" 및 "야생형 유전자" 는 숙주 세포에서 선천적인 또는 자연 발생적인 서열을 말하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 야생형 서열은 단백질 조작 계획의 시작점인 관심의 서열을 말한다. 자연 발생적 단백질을 코딩하는 유전자는 당업자에게 공지된 일반적 방법에 따라 수득될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 관심의 단백질의 영역을 코딩하는 추정 서열을 갖는 표지된 탐침을 합성하고, 단백질을 발현하는 유기체로부터 게놈 라이브러리를 작성하고, 탐침에 관심의 유전자를 혼성화하기 위한 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다. 그다음 양성으로 혼성화된 클론을 지도화하고 서열분석한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합 DNA 분자" 는 분자 생물학 기술에 의해 함께 연결된 DNA 의 분절로 이루어진 DNA 분자를 말한다.

용어 "재조합 올리고뉴클레오티드" 는 폴리뉴클레오티드 서열의 제한 효소 소화에 의해 발생된 2 개 이상의 올리고뉴클레오티드 서열의 라이게이션, 올리고뉴클레오티드의 합성 (예를 들어, 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드의 합성) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 분자 생물학 조작을 사용하여 생성된 올리고뉴클레오티드를 말한다.

서열간의 상동성 정도는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 결정될 수 있다 (예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI) 의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA 와 같은 프로그램; 및 Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984] 참조).

예를 들어, PILEUP 는 서열 상동성 수준을 결정하기 위한 유용한 프로그램이다. PILEUP 는 진행적, 쌍 방식 정렬을 사용하여 관련 서열 그룹으로부터 다중 서열 정렬을 작성한다. 이것은 또한 정렬을 작성하는데 사용된 클러스터 관계를 보여주는 계도를 플롯화할 수 있다. PILEUP 는 Feng and Doolittle, (Feng and Doolittle, J. Mol. Evol., 35:351-360 [1987]) 의 진행적 정렬 방법의 단순화를 사용한다. 상기 방법은 Higgins and Sharp (Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153 [1989]) 에 기재된 것과 유사하다. 유용한 PILEUP 파라미터는 디폴트 갭 웨이트 3.00, 디폴트 갭 길이 웨이트 0.10, 및 웨이트 말단 갭을 포함한다. 또다른 유용한 알고리즘의 예는, Altschul et al., (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, [1990]; 및 Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993]) 에 의해 기재되는 BLAST 알고리즘이다. 하나의 특히 유용한 BLAST 프로그램은 WU-BLAST-2 프로그램이다 (Altschul et al., Meth. Enzymol.., 266:460-480 [1996] 참조). 파라미터 "W," "T," 및 "X" 는 정렬의 민감성 및 속도를 측정한다. BLAST 프로그램은 디폴트 단어길이 (W) 11, BLOSUM62 점수화 매트릭스 (Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1989] 참조) 정렬 (B) 50, 기대치 (E) 10, M'5, N'-4, 및 양쪽 가닥 비교를 사용한다.

본원에 사용된 바와 같은, "백분율 (%) 핵산 서열 일치성" 은 서열의 뉴클레오티드 잔기와 일치하는 후보 서열 중의 뉴클레오티드 잔기의 백분율로 정의된다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "혼성화" 는 당업계에 공지된 바와 같이, 핵산 가닥이 염기 쌍을 통한 상보적 가닥과 연결되는 방법을 말한다.

본원에 사용된 바와 같은, 구 "혼성화 조건" 은 혼성화 반응이 수행되는 조건을 말한다. 이러한 조건은 혼성화가 측정되는 조건의 "엄격함" 정도에 의해 전형적으로 분류된다. 엄격함 정도는 예를 들어, 핵산 결합 복합체 또는 탐침의 용융 온도 (Tm) 에 근거할 수 있다. 예를 들어, "최대 엄격함" 은 전형적으로 약 Tm － 5℃ (탐침의 Tm 의 5° 미만) 에서; "고 엄격함" 은 Tm 의 약 5-10°미만에서; "중간 엄격함" 은 탐침의 Tm 의 약 10-20° 미만에서; "저 엄격함" 은 Tm 의 약 20-25° 미만에서 일어난다. 대안적으로는, 또는 게다가, 혼성화 조건은 혼성화의 염 또는 이온 강도 조건 및/또는 1 회 이상의 엄격한 세정에 기반할 수 있다. 예를 들어, 6xSSC = 매우 낮은 엄격함; 3xSSC = 낮은 ~ 중간 엄격함; 1xSSC = 중간 엄격함; 및 0.5xSSC = 고 엄격함. 기능적으로, 최대 엄격함 조건은 혼성화 탐침과 엄밀한 일치성 또는 거의-엄밀한 일치성을 갖는 핵산 서열을 확인하기 위해 사용될 수 있고; 고 엄격함 조건은 탐침과 약 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 핵산 서열을 확인하기 위해 사용된다.

고 선별성이 필요한 적용에서는, 전형적으로는 비교적 엄격한 조건을 사용하여 혼성물을 형성하는 것이 바람직하다 (예를 들어, 비교적 저염 및/또는 고온 조건이 사용됨).

2 개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드와 관련하여 구 "실질적으로 유사한" 및 "실질적으로 일치하는" 은 전형적으로, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 참조 (즉, 야생형) 서열과 비교하여 약 50% 이상 일치성, 더욱 바람직하게는 약 60% 이상 일치성, 더욱 더 바람직하게는 약 75% 이상 일치성, 더욱 바람직하게는 약 80% 이상 일치성, 더욱 더 바람직하게는 약 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 95%, 가장 바람직하게는 약 97% 일치성, 종종 약 98% 및 약 99% 정도의 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 것을 의미한다. 서열 일치성은 표준 파라미터를 사용하는 BLAST, ALIGN, 및 CLUSTAL 과 같은 공지된 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다 (예를 들어, Altschul, et al, J. Mol. Biol. 215:403-410 [1990]; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1989]; Karin et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:5873 [1993]; 및 Higgins et al, Gene 73:237 - 244 [1988] 참조). BLAST 분석 수행을 위한 소프트웨어는 미국 생명공학 정보 국립센터 [National Center for Biotechnology Information] 를 통해 공개적으로 이용가능하다. 또한, 데이터베이스는 FASTA (Pearson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448 [1988]) 를 사용하여 조사될 수 있다. 2 개의 폴리펩티드가 실질적으로 일치한다는 하나의 지표는, 첫번째 폴리펩티드가 두번째 폴리펩티드와 면역학적으로 교차-반응성이라는 것이다. 전형적으로는, 보존적 아미노산 치환이 상이한 폴리펩티드는 면역학적으로 교차-반응성이다. 그러므로, 폴리펩티드는 예를 들어, 2 개의 펩티드가 보존적 치환만 상이한 경우에는 두번째 폴리펩티드와 실질적으로 일치한다. 2 개의 핵산 서열이 실질적으로 일치하는 또다른 지표는 2 개 분자가 엄격한 조건 하에서 (예를 들어, 중간 ~ 고 엄격함의 범위 내) 서로 혼성화되는 것이다.

본원에 사용된 바와 같은, "등가 잔기" 는 특정 아미노산 잔기를 공유하는 단백질을 말한다. 예를 들어, 등가 잔기는 x-선 결정학에 의해 측정된 3 차 구조를 가진 단백질 (예를 들어, 프로테아제) 에 대한 3 차 구조의 수준에서의 상동성을 측정하여 확인될 수 있다. 등가 잔기는 추정 등가 잔기를 갖는 단백질 및 관심의 단백질의 특정 아미노산 잔기의 2 개 이상의 주쇄 원자의 원자 좌표가 정렬 후 0.13 nm 이내, 바람직하게는 0.1 nm 인 잔기로 정의된다. 분석되는 단백질의 비-수소 단백질 원자의 원자 좌표의 최대 중복을 제공하기 위해 최적의 모델이 판단 및 배치된 후 정렬이 달성된다. 바람직한 모델은 결정학 및 단백질 특성화/분석의 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 측정된, 이용가능한 최고 해상도에서의 실험 회절 데이터에 대한 최저 R 인자를 제공하는 결정학 모델이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "조절 요소" 는 핵산 서열 발현의 일부 양상을 조절하는 유전적 요소를 말한다. 예를 들어, 프로모터는 작동가능하게 연결된 코딩 영역의 전사 개시를 용이하게 하는 조절 요소이다. 부가적인 조절 요소에는 스플라이싱 신호, 폴리아데닐화 신호 및 종결 신호가 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은, "숙주 세포" 는 일반적으로 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 제작된 벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션되는 원핵 또는 진핵 숙주이다. 형질전환된 숙주 세포는 단백질 변이형을 코딩하는 벡터를 복제하거나 원하는 단백질 변이형을 발현할 수 있다. 단백질 변이형의 예비- 또는 예비전(prepro)-형을 코딩하는 벡터의 경우, 이러한 변이형은 발현될 때, 숙주 세포로부터 숙주 세포 배지 내로 분비된다.

핵산 서열의 세포 내로의 삽입에 관련하여 용어 "도입된" 은 형질전환, 형질도입 또는 트랜스펙션을 의미한다. 형질전환 수단에는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법, 예컨대 당업계에 공지된 것과 같은 원형질체 형질전환, 염화칼슘 침전, 전기천공, 노출 DNA 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다 (참조, Chang and Cohen, Mol. Gen. Genet, 168:111 - 115 [1979]; Smith et al., Appl. Env. Microbiol., 51:634 [1986]; 및 리뷰 논문 Ferrari et al., in Harwood, Bacillus. Plenum Publishing Corporation, pp. 57-72 [1989]).

용어 "프로모터/인핸서 (enhancer)" 는 프로모터 및 인핸서 기능을 모두 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA 의 분절을 나타낸다. 인핸서/프로모터는 "내생" 또는 "외생" 또는 "이종" 일 수 있다. 내생 인핸서/프로모터는 게놈 내에 제시된 유전자와 자연적으로 연결된 것이다. 외생 (이종) 인핸서/프로모터는 유전적 조작 (즉, 분자 생물학 기술) 에 의해 유전자에 병렬로 위치된 것이다.

발현 벡터 상에 "스플라이싱 신호" 가 존재하면 종종 재조합 전사물의 발현 수준이 더 높아진다. 스플라이싱 신호는 1 차 RNA 전사물로부터 인트론 제거를 매개하고, 스플라이스 제공체 및 수용체 부위로 이루어진다 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York [1989], pp. 16.7-16.8).

용어 "안정한 트랜스펙션" 또는 "안정하게 트랜스팩션된" 은 트랜스펙션된 세포의 게놈 내로의 외래 DNA 의 도입 및 통합을 말한다. 용어 "안정한 트랜스펙션체" 는 트랜스펙션된 세포의 게놈 DNA 내로 안정하게 통합된 외래 또는 외생 DNA 를 갖는 세포를 말한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "선별가능 마커" 또는 "선별가능 유전자 생성물" 은 선별가능 마커가 발현되는 세포에 대해 항생제 또는 약물에 대한 내성을 부여하는 효소 활성을 코딩하는 유전자의 사용을 말한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "증폭" 및 "유전자 증폭" 은, 증폭된 유전자가 게놈에 처음에 존재하던 것 보다 높은 카피 수로 존재하게 되는 식으로 특정 DNA 서열이 과잉 복제되는 과정을 말한다. 일부 구현예에서, 약물 (예를 들어, 억제가능 효소의 억제자) 의 존재하에서의 성장에 의한 세포의 선별은, 약물의 존재하의 생장에 필요한 유전자 생성물을 코딩하는 내생 유전자의 증폭 또는 상기 유전자 생성물을 코딩하는 외생 (즉, 투입됨) 서열의 증폭, 또는 모두를 초래한다. 약물 (예를 들어, 억제가능 효소의 억제자) 의 존재하에서의 생장에 의한 세포의 선별은, 약물의 존재하의 생장에 필요한 유전자 생성물을 코딩하는 내생 유전자의 증폭 또는 상기 유전자 생성물을 코딩하는 외생 (즉, 투입됨) 서열의 증폭, 또는 모두를 초래할 수 있다.

"증폭" 은 주형 특이성과 관련된 핵산 복제의 특별한 경우이다. 이것은 비-특이적 주형 복제 (즉, 주형-의존적이나 특이적 주형에는 의존하지 않는 복제) 와는 대조적인 것이다. 여기서 주형 특이성은 복제 충성도 (즉, 적합한 폴리뉴클레오티드 서열의 합성) 및 뉴클레오티드 (리보- 또는 데옥시리보-) 특이성과는 구별된다. 주형 특이성은 종종 "표적" 특이성과 관련되어 기재된다. 표적 서열은 다른 핵산으로부터 색출되는 점에서 "표적" 이다. 증폭 기술은 이러한 색출을 위해 일차적으로 고안되었다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "공동-증폭 (co-amplification)" 은 단일 세포 내로의 다른 유전자 서열과 함께 증폭가능 마커 (즉, 발현 벡터 내에 함유된 것들과 같은 하나 이상의 비-선별적 유전자를 포함함) 의 도입 및 적합한 선택 압력의 적용을 말하며, 세포는 증폭가능 마커 및 기타, 비-선별적 유전자 서열 모두를 증폭시킨다. 증폭가능 마커는 다른 유전자 서열에 물리적으로 연결될 수 있거나 대안적으로는 하나는 증폭가능 마커를 함유하고 다른 하나는 비-선별적 마커를 함유하는 2 개의 분리된 DNA 조각이 동일 세포 내에 도입될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "증폭가능 마커," "증폭가능 유전자" 및 "증폭 벡터" 는 적합한 생장 조건하에서 유전자의 증폭을 가능하게하는 유전자를 코딩하는 마커, 유전자 또는 벡터를 말한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "증폭가능 핵산" 은 임의의 증폭 방법에 의해 증폭될 수 있는 핵산을 말한다. "증폭가능 핵산" 은 통상 "샘플 주형" 을 포함할 것으로 생각된다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "샘플 주형" 은 "표적" (하기 정의됨) 의 존재를 분석하는 샘플로부터 기원하는 핵산을 말한다. 대조적으로, "배경 주형" 은 샘플에 존재할 수 있거나 존재할 수 없는 샘플 주형 이외의 핵산에 관해 사용된다. 배경 주형은 대부분 종종 부주의에 의한 것이다. 이것은 잔류 결과일 수 있거나, 샘플로부터 정제해서 제거되어야 할 핵산 오염물의 존재로 인한 것일 수 있다. 예를 들어, 검출되는 것 이외의 유기체로부터의 핵산은 시험 샘플 중의 배경으로 존재할 수 있다.

"주형 특이성" 은 대부분 효소 선택에 의한 증폭 기술로 달성된다. 증폭 효소는 사용되는 조건 하에서 핵산의 불균질 혼합물 중의 오직 특이적 서열의 핵산만을 조작할 효소이다. 예를 들어, Qβ 레플리카아제의 경우, MDV-1 RNA 가 레플리카아제에 대한 특이적 주형이다 (예를 들어, Kacian et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:3038 [1972] 참조). 다른 핵산은 상기 증폭 효소에 의해 복제되지 않는다. 유사하게, T7 RNA 폴리머라아제의 경우, 상기 증폭 효소는 그 자신의 프로모터에 대해 엄격한 특이성을 갖는다 (Chamberlin et al, Nature 228:227 [1970] 참조). T4 DNA 리가아제의 경우, 상기 효소는 라이게이션 접합점에서 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 기질과 주형 사이의 미스매치가 있는 2 개의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 라이게이션시키지 않을 것이다 (Wu and Wallace, Genomics 4:560 [1989] 참조). 마지막으로, Taq 및 Pfu 폴리머라아제는 고온에서 작용하는 그들의 능력에 비추어, 결합된 서열에 대해 높은 특이성을 나타내는 것으로 발견되므로, 프라이머에 의해 정의되며; 고온은 표적 서열과의 프라이머 혼성화를 선호하고 비-표적 서열과의 혼성화를 선호하지 않는 열역학적 상태를 야기한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "프라이머" 는 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 확장 생성물의 합성이 유도되는 조건하에 놓인 경우 (즉, 뉴클레오티드 및 DNA 폴리머라아제와 같은 유도제의 존재 하에서 및 적합한 온도 및 pH 에서) 합성 개시점으로 작용할 수 있는, 합성적으로 생성되거나 정제된 제한 소화물과 같이 자연 발생되는지의 여부에 관계없는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 프라이머는 증폭시 최대 효율을 위해 바람직하게는 단일 가닥이지만, 대안적으로는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥인 경우, 프라이머는 먼저 가닥을 분리시키기 위해 처리된 후, 확장 생성물을 제조하는데 사용된다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 프라이머는 유도제의 존재하에서 확장 생성물의 합성을 시작하기에 충분히 길어야만 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머의 근원 및 방법의 용도를 포함하는 많은 인자에 따라 다르다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "탐침" 은 또다른 관심의 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는, 합성적으로, 재조합적으로 또는 PCR 증폭에 의해 생성되거나 정제된 제한 소화물과 같이 자연 발생되는지의 여부에 관계없는 올리고뉴클레오티드 (즉, 일련의 뉴클레오티드) 를 말한다. 탐침은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 탐침은 특정 유전자 서열의 검출, 확인 및 단리에 유용하다. 본 발명에서 사용되는 임의의 탐침은 효소 (예를 들어, ELISA 뿐 아니라, 효소-기반 면역화학적 어세이), 형광, 방사능 및 발광 시스템을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 검출 시스템으로 검출가능하도록, 임의의 "리포터 분자" 로 표지될 것이 계획된다. 본 발명이 임의의 특정 검출 시스템 또는 표지에 제한되는 것으로 의도되지는 않는다.

본원에 사용된 바와 같은, 증폭 방법 (예를 들어, 폴리머라아제 연쇄 반응) 과 관련하여 사용되는 경우 용어 "표적" 은, 폴리머라아제 연쇄 반응에 사용되는 프라이머에 의해 결합된 핵산의 영역을 말한다. 그러므로, "표적" 은 다른 핵산 서열로부터 색출된다. "분절" 은 표적 서열 내의 핵산의 영역으로서 정의된다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "폴리머라아제 연쇄 반응" ("PCR") 은 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제 4,683,195 호, 제 4,683,202 호 및 제 4,965,188 호의 방법을 말하고, 여기에는 클로닝 또는 정제 없이 게놈 DNA 의 혼합물 중의 표적 서열의 분절의 농도를 증가시키기 위한 방법이 포함된다. 상기 표적 서열의 증폭 방법은 과량의 2 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 원하는 표적 서열을 함유하는 DNA 혼합물에 도입한 후, DNA 폴리머라아제의 존재 하의 정확한 순서의 열 사이클을 수행하는 것으로 이루어진다. 2 개의 프라이머는 이중 가닥 표적 서열의 각 가닥에 상보적이다. 증폭을 효과적으로 하기 위해, 혼합물을 변성시킨 다음 프라이머를 표적 분자 내의 그의 상보성 서열로 어닐링 (annealing) 시킨다. 어닐링 후, 프라이머는 신규한 쌍의 상보성 가닥을 형성하도록 폴리머라아제로 확장된다. 원하는 표적 서열의 고농도의 증폭된 분절을 수득하기 위해, 변성, 프라이머 어닐링 및 폴리머라아제 확장 단계가 수 회 반복될 수 있다 (즉, 변성, 어닐링 및 확장이 하나의 "사이클" 을 구성하며; 수 많은 "사이클" 이 있을 수 있다). 원하는 표적 서열의 증폭된 분절의 길이는 서로에 대한 프라이머의 상대 위치에 의해 결정되므로, 이러한 길이는 조절가능한 파라미터이다. 방법의 반복 양상에 비추어, 상기 방법을 "폴리머라아제 연쇄 반응" (이하 "PCR") 으로 부른다. 표적 서열의 원하는 증폭된 분절이 혼합물 중의 주된 서열이 되기 때문에 (농도에 있어서), 이들을 "PCR 증폭됨" 이라고 부른다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "증폭 시약" 은 프라이머, 핵산 주형 및 증폭 효소를 제외하고 증폭에 필요한 시약 (데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 완충액 등) 을 말한다. 전형적으로는, 다른 반응 성분과 함께 증폭 시약을 반응 용기 (시험관, 마이크로웰 등) 에 넣고 포함시킨다.

PCR 로, 게놈 DNA 중의 특이적 표적 서열의 단일 카피를 여러 상이한 방법론 (예를 들어, 표지된 탐침으로의 혼성화; 비오티닐화 프라이머의 혼입 후 아비딘-효소 컨쥬게이트 검출; 증폭된 분절 내로 32P-표지된 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트, 예컨대 dCTP 또는 dATP 의 혼입) 에 의해 검출가능한 수준으로 증폭시키는 것이 가능하다. 게놈 DNA 외에도, 임의의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 적합한 세트의 프라이머 분자로 증폭될 수 있다. 특히, PCR 과정 그 자체에 의해 제작된 증폭된 분절 그 자체는 수반되는 PCR 증폭에 대한 효과적인 주형이다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "PCR 생성물," "PCR 단편," 및 "증폭 생성물" 은 변성, 어닐링 및 확장의 PCR 단계의 2 회 이상의 사이클이 완료된 후 화합물의 수득된 혼합물을 말한다. 이러한 용어는 하나 이상의 표적 서열의 하나 이상의 분절의 증폭이 있는 경우를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소" 는 특정 뉴클레오티드 서열에서 또는 그 근처에서 이중 가닥 DNA 를 각각 절단하는 박테리아 효소를 말한다.

본원에 사용된 바와 같은, "표면 특성" 은 정전기 전하 뿐 아니라, 단백질의 표면에 의해 나타내지는 소수성 및/또는 친수성과 같은 특성과 관련되어 사용된다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "세제 조성물" 및 "세제 제형" 은 오염된 물품의 세정용 세정 매질에 사용하기 위한 것으로 의도되는 혼합물과 관련되어 사용된다. 바람직한 구현예에서, 상기 용어는 식기, 수저 등을 세정하는데 사용되는 세제 (예를 들어, "식기세정 세제") 와 관련되어 사용된다. 본 발명은 임의의 특정 세제 제형 또는 조성물에 제한되는 것으로 의도되는 것은 아니다. 게다가, 본 발명의 하나 이상의 프로테아제를 함유하는 세제 외에도, 상기 용어는 계면활성제, 트랜스페라아제(들), 가수분해 효소, 옥시도 리덕타아제, 세척강화제, 표백제, 표백 활성제, 청색화제 및 형광 염료, 고결 억제제, 차폐제, 효소 활성제, 항산화제, 및 가용화제를 함유하는 세제를 포함하는 것으로 의도된다.

본원에 사용된 바와 같은, "식기세정 조성물" 은 과립 및 액체 형태를 포함하나 이에 제한되지 않는 모든 형태의, 수저를 포함하는 식기류의 세정용 조성물을 말한다. 본 발명이 임의의 특정 유형 또는 식기류 조성물에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 게다가, 본 발명은 도자기, 플라스틱, 금속, 본차이나, 유리, 아크릴 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 물질로 된 식기류 (예를 들어, 접시, 컵, 유리그릇, 사발 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 식기) 및 수저 (예를 들어, 스푼, 나이프, 포크, 서빙 기구 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 기구) 의 세정에 사용된다. 본원에서 용어 "식기류" 는 식기 및 수저 모두와 관련되어 사용된다.

본원에 사용된 바와 같은, 돌연변이체 프로테아제의 "세정력" 은 조성물에 돌연변이체 프로테아제가 첨가되지 않은 세제에 비해 부가적인 세정력을 부여하는, 식기세정에 대한 돌연변이체 프로테아제 효소의 기여를 말한다. 세정력은 관련 세정 조건 하에서 비교된다.

본원에서 용어 "관련 세정 조건" 은 식기 세제 시장 세분화 중에서 가정용으로 실제로 사용되는 조건, 특히 세정 온도, 시간, 세정 기계, 서드 (sud) 농도, 세제의 유형 및 물 경도를 지칭하는 것으로 사용된다.

용어 "향상된 세정력" 은 관련 세정 조건 하에서 식기류 및/또는 수저로부터의 오염물 제거에 있어 보다 양호한 최종 결과가 수득되거나, 상응하는 야생형 효소와 동일한 최종 결과를 수득하기 위해 중량 기반으로 보다 적은 돌연변이체 프로테아제를 필요로 하는 것을 나타내기 위해 사용된다.

용어 "유보된 세정력" 은 중량 기반으로 돌연변이체 프로테아제 효소의 세정력이 관련 세정 조건 하에서 상응하는 야생형 프로테아제에 비해 적어도 80% 인 것을 나타내기 위해 사용된다.

프로테아제의 세정력은 편리하게는 적합한 시험 조건 하에서 특정의 대표적인 오염을 제거하는 능력에 의해 측정된다. 이러한 시험 시스템에서, 다른 관련 인자, 예컨대 세제 조성물, 서드 (sud) 농도, 물 경도, 세정 기계, 시간, pH, 및/또는 온도는, 특정 시장 세분화 중에서 가정용에 전형적인 조건과 유사한 방식으로 조절될 수 있다. 본원에 기재된 실험실용 시험 시스템은 DNA 돌연변이화를 통해 변형된 단백질 가수분해 효소에 사용되는 경우 가정용에 대표적이다. 그러므로, 본원에서 제공된 방법은 다량의 상이한 효소 및 특정 유형의 세제 적용에 특히 적합한 효소의 선택의 시험을 용이하게 한다. 이러한 방법으로 특정 용도 조건을 위한 "맞춤 제작" 효소가 쉽게 선택된다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "소독" 은 표면으로부터의 오염물의 제거 뿐 아니라, 물품의 표면 상의 미생물의 억제 및 살균을 말한다. 본 발명이 임의의 특정 표면, 물품 또는 제거되는 오염물(들) 또는 미생물에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.

일부 박테리아 세린 프로테아제는 "서브틸리신" 으로 언급된다. 서브틸리신은 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens) ("서브틸리신 BPN'"), 및 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis) ("서브틸리신 칼스버그 (Carlsberg)") 의 세린 프로테아제를 포함한다 (예를 들어, Markland and Smith, in Boyer (ed.), Enzymes, The (Boyer, ed.) vol. 3, pp.561-608, Academic Press, New York, [1971] 참조). 친알칼리성 바실러스 균주와 같은 바실러스 균주는 다른 프로테아제를 생성한다. 후자의 분류의 예에는 MAXACAL® 프로테아제 (또한 본원에서 "PB92 프로테아제" 로 언급됨, Bacillus nov. spec. PB92 로부터 단리됨), 및 SAVINASE® 프로테아제와 같은 세린 프로테아제가 포함된다. 부가적인 프로테아제에는 PROPERASE® 프로테아제가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

PB92 프로테아제의 아미노산 (SEQ ID NO:2) 및 DNA 서열 (SEQ ID NO:1) 은 도 2 에 제시된다. 성숙 프로테아제는 269 개의 아미노산으로 이루어지고, 분자량이 약 27,000 달톤이고, 고 알칼리 범위에서의 등전위점을 갖는다. 단백질 기질 상의 PB92 프로테아제의 활성은 알칼리 델프트 유닛 (Alkaline Delft Units: ADU) 으로 표현된다. ADU 의 활성은 영국 특허 제 1,353,317 호에 기재된 방법에 따르나, pH 를 8.5 에서 10.0 으로 변경하여 측정하였다. 정제된 PB92 프로테아제는 mg 당 21,000 ADU 의 활성을 갖는다. 카세인에 대해 측정된 전환수 (^kcat) 는 90 초^-1몰^-1 이다.

서브틸리신 칼스버그 (Carlsberg) (Delange and Smith, J. Biol. Chem., 243:2184 [1968] 참조) 의 정제된 제제의 특정 활성은, 10,000 ADU/mg 에 달하고, 서브틸리신 BPN' (Matsubara et al, J. Biol. Chem., 240:1125 [1965]) 의 정제된 제제의 특정 활성은 7,000 ADU/mg 에 달한다. 특정 활성 및 전환수 _(kcat) 와 같은 상기 언급된 파라미터를 제외하고는, PB92 프로테아제는 세제 중 제형화된 칼스버그 서브틸리신, 서브틸리신 BPN' 및 기타 프로테아제와 같은 프로테아제 (예를 들어, MAXATASE® 및 ALCALASE®) 와, 선천적 단백질의 젤 전기영동에 의해 가시화될 수 있는 높은 양성 전하를 갖는다는 점에서 구별된다.

PB92 프로테아제는 알칼리 pH 값에서 오염물 제거에 활성이므로, 이것은 계면활성제, 세척강화제 및 산화제와 같은 세제 성분과 함께, 세제 첨가제로서 통상 사용된다. 후자의 작용제는 대부분 분말 형태로 사용된다. PB92 프로테아제는 상기 언급된 서브틸리신과 같은 다른 프로테아제와 비교해 높은 오염물 제거 효율을 갖는다. 이것은 동일한 세정력을 달성하는데 보다 적은 PB92 프로테아제가 필요하다는 것을 의미한다. 산화에 대한 감수성은 세제에서의 적용에 사용하기 위한 PB92 프로테아제 및 다른 모든 공지된 세린 프로테아제의 중요한 결점이다 (예를 들어, Stauffer et al., J. Biol. Chem., 244:5333-5338 [1969]; 및 Estell et al., J. Biol. Chem., 263:6518-6521 [1985] 참조). 퍼보레이트-테트라히드레이트 및 TAED 를 함유하는 활성제 시스템에 의해 발생된 H₂O₂ 또는 과산에 의한 PB92 프로테아제의 산화는, 비-산화된 PB92 프로테아제와 비교하여 각각 50% 및 10% 의 특이적 활성 (ADU/mg) 을 가진 효소를 생성시킨다.

본 발명은 자연 생성된 박테리아 세린 프로테아제로부터 유래된 돌연변이체 단백질 가수분해 효소의 생성, 스크리닝 및 선별을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 이러한 돌연변이체는 예를 들어, 친알칼리성 바실러스 균주의 야생형 유전자로부터 유래된 유전자에 의해 코딩되는 것들이다. 가장 바람직한 구현예에서, 균주는 PB92 이다.

그러나, 친알칼리성 바실러스 세린 프로테아제 SAVINASE® 로부터 유래된 돌연변이체가 적합하다. 또한 본 발명은 친알칼리성 바실러스 균주 PB92 로부터의 세린 프로테아제 이외의 프로테아제로부터 유래되는 변형된 프로테아제의 선별에 사용된다. 예를 들어, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 및 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis) 의 세린 프로테아제를 코딩하는 유전자가 알려져 있고, 돌연변이화를 위한 표적으로 사용될 수 있다. 그러나, 임의의 적합한 돌연변이화 방법이 본 발명에 사용되므로, 본 발명이 올리고뉴클레오티드-지원 위치-지정 돌연변이화, 또는 영역-지정 랜덤 돌연변이화를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 특정 방법에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.

일부 바람직한 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 돌연변이체 단백질 가수분해 효소의 선별 방법 (생성 및 스크리닝 포함) 은 하기 단계를 포함한다: 관심의 단백질 가수분해 효소 또는 그의 단편을 코딩하는 클로닝된 유전자를 돌연변이화시키는 단계; 수득된 돌연변이체 프로테아제 유전자를 단리하는 단계; 상기 돌연변이체 프로테아제 유전자를, 발현 및 생성에 적합한 숙주 균주 내에, 바람직하게는 적합한 벡터 상에 도입하는 단계; 생성된 돌연변이체 프로테아제를 회수하는 단계; 및 세제에서의 적용에 향상된 특성을 갖는 돌연변이체 프로테아제를 확인하는 단계.

돌연변이체 프로테아제의 생성에 적합한 숙주 균주에는 프로테아제의 발현이 달성될 수 있는 형질전환가능한 유기체가 포함된다. 구체적으로는 실질적으로 동일한 특성을 갖는, 프로테아제가 유도되는 것과 동일한 종 또는 속의 숙주 균주가 적합하며, 예컨대 바실러스 균주, 바람직하게는 친알칼리성 바실러스 균주, 가장 바람직하게는 바실러스 nov. spec. PB92 또는 그의 돌연변이체가 적합하다. 또한, 이러한 바람직한 균주에는 B. 서브틸리스 (B. subtilis), B. 리체니포르미스 (B. licheniformis) 및 B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens) 균주가 있다. 기타 적합하고 바람직한 숙주 균주에는 돌연변이체 유전자로의 형질전환 전에 세포외부 단백질 가수분해 효소를 실질적으로 생성할 수 없는 균주가 포함된다. 특히 관심있는 것은 프로테아제 결핍 바실러스 숙주 균주, 예컨대 바실러스 nov. spec. PB92 의 프로테아제 결핍 유도체이다. 프로테아제의 발현은 선택된 숙주 유기체에서 기능하는 발현 신호를 사용하여 수득된다. 발현 신호에는 프로테아제 유전자의 전사 및 번역 조절 DNA 서열이 포함된다. 적합한 벡터는 선택된 숙주 균주에서 충분히 고 카피수로 복제될 수 있거나, 염색체 통합에 의해 숙주 균주에서 프로테아제 유전자의 안정적인 유지를 가능하게 한다.

본 발명에 따른 돌연변이체 단백질 가수분해 효소는 적합한 발효 조건 하에서, 원하는 돌연변이체 단백질 가수분해 유전자를 함유하는 형질전환된 숙주 균주를 배양하고, 생성된 효소를 회수하여 제조된다.

바람직하게는, 발현되는 프로테아제는 배양 배지 내로 분비되어 회수를 용이하게 하거나, 그람 음성 박테리아 숙주 균주의 경우에는 원형질막주위 공간 내로 분비된다. 분비를 위해, 적합한 아미노 말단 신호 서열이 사용되며, 바람직하게는 신호 서열은 선택된 숙주 균주에서 기능하는 경우 본래의 유전자에 의해 코딩된다.

일부 구현예에서, 자연 발생적 또는 자연 돌연변이화 세제 프로테아제의 특성은 효소에 다양한 돌연변이를 도입하여 향상된다. 일부 구현예에서 결실 및 삽입도 사용되지만, 대부분, 돌연변이는 보존 또는 비보존 치환된다.

보존 치환을 위해 하기 표가 사용된다:

지방족

중성

무극성 (G, A, P, L, I, V)

극성 (C, M, S, T, N, Q)

하전성

음이온성 (D, E)

양이온성 (K, R)

방향족

(F, H, W, Y)

여기서 임의의 아미노산은 동일한 분류의, 특히 동일한 줄에 있는 임의의 다른 아미노산로 치환될 수 있다. 또한, 극성 아미노산 N, Q 는 하전성 아미노산을 치환하거나 이에 의해 치환될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서는, 프로테아제의 증가된 음이온성 특성을 야기하는 치환, 특히 활성 부위에 직접적으로 관련되지 않은 부위에서의 치환에 특히 관심이 있다.

돌연변이에 대해 특히 관심있는 영역은, 억제제 분자 Eglin C 가 활성 부위에 결합하는 경우 Eglin C 와 4 Å 거리 내에 있는 아미노산이다.

하기 넘버링은 PB92 프로테아제에 근거한 것이나, 실질적으로 상동 구조를 갖는, 특히 약 70% 초과의 상동성을 갖는, 더욱 특히 약 90% 초과의 상동성을 갖는 기타 세린 프로테아제와 관련하여 고려된다. 특히 관심있는 위치에는 32, 33, 48-54, 58-62, 94-107, 116, 123-133, 150, 152-156, 158-161, 164, 169, 175-186, 197, 198, 203-216 (PB92 넘버링) 이 포함되며, 대부분의 이러한 위치는 단백질성 기질과 직접 상호작용이 가능하기 때문이다. 일반적으로, 위치 32, 62, 153 및 215 에서 아미노산은 치환되지 않는데, 이러한 부위에서의 돌연변이가 세정력을 감소시키는 경향이 있기 때문이다. 일부 가장 특히 바람직한 구현예에서, 돌연변이가 위치 116, 126, 127, 및 128 (PB92 넘버링) 에서 형성된다. 대안적인 구현예에서, 부가적인 돌연변이는 위치 160 에서 형성된다.

추가의 구현예에서, 특히 관심있는 치환의 위치에는 60, 94, 97-102, 105, 116, 123-128, 150, 152, 160, 183, 203, 211, 212, 213, 214 및 216 (PB92 넘버링) 이 포함된다. 일부 위치에서, 치환은 불안정한 아미노산 (예를 들어, 메티오닌) 을 산화적으로 더욱 안정한 아미노산 (예를 들어, 트레오닌) 으로, 해당 부위에서 아미노산의 일반적인 형상 및 부피는 유지하면서 변화시킨다. 일부 다른 구현예에서, 중성 아미노산을 대부분의 임의의 다른 아미노산으로 대체하는 것, 특히 수산화 아미노산 S 및/또는 T 가, 극성 또는 무극성 아미노산, 또는 심지어 방향족 아미노산으로 대체된 치환에서 향상된 결과가 수득된다.

일부 가장 특히 바람직한 구현예에서, 치환에는 하기가 포함된다 (PB92 넘버링):

G116 I, V, L

S126 임의의 아미노산 P127 임의의 아미노산 S128 임의의 아미노산

S160 음이온성 또는 중성 지방족 또는 R

A166 하전성, 특히 음이온성

M169 중성 지방족, 바람직하게는 무극성

N212 음이온성

M216 지방족 극성, 특히 S, T, N, Q

놀랍게도, 많은 돌연변이가 통상의 기질과의 프로테아제의 보다 낮은 특이적 활성을 초래하는 반면, 세정력은 자연적 효소에 필적할만 하거나 또는 향상되었고, 많은 경우 저장 안정성이 향상되었다. 또한, 선천적 PB92 프로테아제와 비교하여 일부 PB92 돌연변이체 프로테아제의 세정력은 약 120 내지 약 180% 인 것으로 발견되었다. 그러므로, 본 발명은 선천적 프로테아제와 비교하여 훨씬 향상된 성능을 가진 변이형 프로테아제를 제공한다.

일부 구현예에서, 세제 조성물 중의 프로테아제의 안정성을 증가시키기 위해 여러 돌연변이가 조합된다. 동일한 프로테아제의 세정에 긍정적으로 영향을 주는 여러 돌연변이는 가능하게는 훨씬 더 향상된 프로테아제의 생성을 가능하게 하는 단일 돌연변이체 프로테아제 유전자 (예를 들어, S126M, P127A, S128G, S160D 및 G116V, S126N, P127S, S128A, S160D; PB92 넘버링) 와 조합될 수 있다. 부가적인 프로테아제 돌연변이체는 예를 들어, G116V 및 S16OD 의 양호한 세정력 특성과 기타 돌연변이의 안정성 특성 (PB92 넘버링) 을 조합하어 제공된다.

또한 유용한 돌연변이체는 본원에 기재된 임의의 돌연변이 또는 돌연변이 세트를 조합하여 제공된다. 부가적인 구현예에서, 본원에서 특히 제공되는 유용한 돌연변이는 다른 부위에서 돌연변이와 조합된다. 일부 구현예에서, 이러한 조합은 효소의 특성에서의 실질적인 변화를 초래하나, 다른 구현예에서는, 변화는 덜 실질적이다.

또한 본 발명은 세제 조성물(들) 및/또는 세정 과정(들) 에서의 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 돌연변이체 단백질 가수분해 효소의 용도를 포함한다. 마지막으로, 프로테아제 폴리펩티드 사슬 중의 아미노산의 결실 또는 삽입에 의해, PB92 프로테아제에 상동인 프로테아제에서 돌연변이화에 의해 인공적으로 또는 자연 발생적으로 생성되는 것에서, 아미노산의 넘버링은 바뀔 수 있다는 것이 명확할 것이다. 그러나, PB92 프로테아제의 아미노산 위치에 상동인 위치가 청구의 범위 범주 내에 있을 것이라고 이해된다.

실험

하기 실시예는 본 발명의 특정의 바람직한 구현예 및 양상을 증명하고 추가로 예증하기 위해 제공되며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않는다.

이하 실험 기재에서, 하기 약어는 다음과 같이 적용된다: ℃ (섭씨 온도); rpm (분 당 회전수); H₂O (물); HCl (염산); aa (아미노산); bp (염기 쌍); kb (킬로염기 쌍); kD (킬로달톤); gm (그램); μg 및 ug (마이크로그램); mg (밀리그램); ng (나노그램); μl 및 ul (마이크로리터); ml (밀리리터); mm (밀리미터); nm (나노미터); μm 및 nm (마이크로미터); M (몰); mM (밀리몰); μM 및 uM (마이크로몰); U (유닛); V (볼트); MW (분자량); sec (초); min (분); hr (시간); MgCl₂ (염화마그네슘); NaCl (염화나트륨); OD_28O (280 nm 에서의 흡광도); OD_6OO (600 nm 에서의 흡광도); PAGE (폴리아크릴아미드 젤 전기영동); EtOH (에탄올); PBS (인산염 완충 식염수 [150 mM NaCl, 10 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.2]); SDS (나트륨 도데실 술페이트); Tris (트리스(히드록시메틸)아미노메탄); TAED (N,N,N'N'-테트라아세틸에틸렌디아민); w/v (중량 대 부피); v/v (부피 대 부피); MS (질량 분석); TIGR (The Institute for Genomic Research, Rockville, MD); AATCC (American Association of Textile and Coloring Chemists); SR (오염물 또는 얼룩 제거); WFK (wfk Testgewebe GmbH, Bruggen-Bracht, Germany); Amersham (Amersham Life Science, Inc. Arlington Heights, IL); ICN (ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA); Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL); Amicon (Amicon, Inc., Beverly, MA); ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA); Amersham (Amersham Biosciences, Inc., Piscataway, NJ); Becton Dickinson (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ); BioRad (BioRad, Richmond, CA); Clontech (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA); Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI); GIBCO BRL 또는 Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD); Novagen (Novagen, Inc., Madison, WI); Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA); Invitrogen (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); Finnzymes (Finnzymes Oy, Espoo, Finland); Macherey-Nagel (Macherey-Nagel, Easton, PA); Merieux (Institut Merieux, Codex, FR); Kelco (CP Kelco, Atlanta, GA); Genaissance (Genaissance Pharmaceuticals, Inc., New Haven, CT); DNA 2.0 (DNA 2.0, Menlo Park, CA); MIDI (MIDI Labs, Newark, DE) InvivoGen (InvivoGen, San Diego, CA); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); Sorvall (Sorvall Instruments, a subsidiary of DuPont Co., Biotechnology Systems, Wilmington, DE); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); Roche (Hoffmann La Roche, Inc., Nutley, NJ); Agilent (Agilent Technologies, Palo Alto, CA); Minolta (Konica Minolta, Ramsey, NJ); Zeiss (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY); Henkel (Henkel, GmbH, Duesseldorf, Germany); Cognis (Cognis Corp, USA, Cincinnati, OH); Finnzymes (Finnzymes Oy, Espoo, Finland); Reckitt Benckiser, Berks, United Kingdom); BASF (BASF Corp., Florham Park, NJ); IKW (Industrieverband Koerperflege und Waschmittel, Frankfurt, Germany); 및 WFK (Testgewebe GmbH, Brueggen-Bracht, Germany).

일부 식기세정 실험에 사용된 3.00 mmol Ca+Mg (16.8 °d) 를 함유하는 합성수를 다음과 같이 제조하였다. 먼저, 3 개의 저장 용액을 제조하였다. 용액 1 은 800 mmol/l NaHCO₃ (67.2 g/l) 이었고; 용액 2 는 154.2 mmol /l MgSO₄ * 7 H₂O (38.0 g/l) 이었고; 용액 3 은 446.1 mmol /l CaCl₂ * 2 H₂O (65.6 g/l) 이었다. 상기 용액을 제조한 후, 저장 용액 1, 2 및 3, 각각 50 ml 을 7 L 탈염수가 채워진 용기에 넣은 후, 상기 용기를 추가적 탈염수로 10 L 까지 채웠다. 사용전에, 합성수의 pH 값을 HCl 또는 NaOH 로 7.5 로 조정하였다.

하기 표 (표 1) 에는 본 발명의 개발 동안 제조 및 시험된 돌연변이체가 제공된다. 본 표에서는, 편의를 위해 BPN' 및 PB92 넘버링이 모두 제시된다.

표 1 에서, 모든 균주는 실시예에 기재된 방법을 사용하여 생성 및 특성화되었다. 별표 (*) 로 표시된 균주는 EP 0 571 049 B1 (실시예 1A-C 참조) 에 기재된 바와 같이 생성되었다. 모든 다른 변이형은 실시예 1D 에 기재된 바와 같이 생성되었다.

[실시예]

PB92 프로테아제 돌연변이체의 구축

본 실시예에는, 본원에 제공된 PB92 돌연변이체의 일부를 구축하는데 사용된 방법이 기재되어 있다. 돌연변이화 작업이 시작되는 기본 구조물은, "pM58" 로 불리며 EP 0283075 및 EP 571049 에 기재되어 있다. 전략은 하기 세가지 부분으로 이루어진다:

A. 돌연변이화 벡터 13M1 의 구축

B. 돌연변이 절차

C. pM58Eco 의 구축 및 벡터 내로의 돌연변이화된 DNA 조각의 서브클로닝

부가적으로, 부분 D ("PB92 변이형의 생성") 에는 본 발명에 유용한 것으로 발견된 다양한 PB92 변이형의 구축에 대한 기재가 포함된다.

A. 돌연변이화 벡터 M13M1 의 구축

기본 구조물 pM58 을 제한 효소 HpaI 및 BalI 으로 소화하였다. PB92 프로테아제 유전자를 함유하는 1400 bp 단편을 당업계에 공지된 바와 같은 저 용융 아가로오스에서 정제하였다. 벡터 M13MP11 (Messing et al., Nucl. Acids Res., 9:303-321 [1981] 참조) 을 SmaI 으로 소화시켰다. 관심의 1400 bp DNA 조각을 상기 벡터 내로 라이게이션하고, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 E. 콜라이 JM101 내로 트랜스펙션하였다 (Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110-2114 [1972] 참조).

E. 콜라이 JM101 에서 파지 증식 후, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 ssDNA 를 단리하고 (Heidecker et al., Gene 10:69-73 [1980] 참조), 삽입물 및 그 순응을 Sanger DNA 서열분석을 사용하여 체크하였다 (Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:6463 [1977] 참조). 돌연변이화에 적합한 벡터를 수득하고 "M13M1" 이라고 명명했다. 상기 기재된 방법은 도 1A 에서 도식적으로 묘사된다.

B. 돌연변이 절차

M13M1 벡터의 ssDNA 및 M13mp19 의 dsDNA 를 사용하여 M13M1 에서 돌연변이화를 수행하였고 (Messing et al.. Nucl. Acids Res., 9:303-321 [1988]), M13mp19 벡터를 제한 효소 EcoRI 및 HindIII 로 소화시킨 후, 저 용융 아가로오스 상에 대형 조각의 정제를 수행하였다.

돌연변이체 선별을 위해 E. 콜라이 WK30-3 보다는 E. 콜라이 JM105 를 사용하는 변형을 통해, 당업계에 공지된 바와 같이 돌연변이화를 수행하였다 (Kramer et al., Nucl. Acids Res., 12:9441-9456 [1984] 참조) .

특이적 돌연변이를 생성하는데 사용되는 올리고뉴클레오티드의 길이는 22 개의 뉴클레오티드였다. 특이적 DNA 서열에서 동시에 여러 돌연변이를 생성하는데 사용되는 영역 특이적 돌연변이화를, 돌연변이되는 아미노산(들) 에 상응하는 부위에서 랜덤으로 혼입된 모든 4 개의 뉴클레오티드를 가진 40 개의 뉴클레오티드 길이를 가진 올리고뉴클레오티드 제작물을 사용하여 수행하였다.

돌연변이화 후, 잠재적인 돌연변이체를 Sanger 디데옥시법 (Sanger, supra 참조) 을 사용하는 서열 분석에 의해 관련 돌연변이를 확인하였다. 전체 단일 가닥 갭 (도 1B 참조) 을 서열분석하여 2 차 돌연변이가 없음을 확인하였다. 본 과정은 도 1B 에 도식적으로 제시되어 있다.

기재된 절차는 프로테아제 유전자의 3' 부분 (아미노산 154-269) 에서 돌연변이를 갖는 DNA 조각을 생성하는데 유용하였다.

그러나, 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법이 사용될 것이므로, 본 발명이 이러한 특정 방법에 제한되는 것으로 의도되는 것은 아니다. 게다가, 당업자는 바실러스 벡터 중의 프로테아제 유전자의 5' 부분에서 돌연변이를 갖는 DNA 조각을 생성하기 위해, 도 1A 에 예증된 방법과 유사한 방법에서 대안적인 제한 효소 및 변형된 PB92 프로테아제 유전자를 구조물에 사용할 수 있다는 것을 인지한다.

C. pM58Eco 의 구축 및 벡터 내로의 돌연변이를 함유하는 DNA 조각의 서브클 로닝

pM58Eco 를 구축하기 위해, 당업게에 공지된 바와 같이 희석된 조건 하에서 pM58 을 제한 효소 EcoRI 으로 소화하고, T4 리가아제로 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물로, 당업계에 공지된 방법 (Spizizen et al., J. Bacteriol., 81:741-746 [1961] 참조) 을 사용하여 B. 서브틸리스 1-A40 (Bacillus Genetic Stock Centre, Ohio) 을 형질전환시켰다.

형질전환 혼합물로부터의 세포를 당업계에 공지된 바와 같이 20 g/ml 네오마이신을 함유하는 최소 플레이트에 플레이팅하였다 (EP 0283075 의 실시예 1 참조).

형질전환체의 플라스미드 DNA 를 당업계에 공지된 방법을 사용하여 단리하였고 (Birnboim and Doly, Nucl. Acids Res., 7:1513-1523 [1979] 참조), 제한 효소 분석을 사용하여 특징화하였다. 그러므로, 상기 방식으로, pM58Eco 를 단리하였다 (도 1c 참조).

돌연변이체 효소를 생성하기 위해, 상기 부분 B 에 기재된 바와 같이 발생되는 원하는 돌연변이를 포함하는 M13M1 의 DNA 조각을 pM58Eco 내에 서브클로닝하였다. 그 다음, M13M1 (상기 기재됨) 의 이중 가닥 DNA (dsDNA) 를 EcoRI 으로 소화하고, pM58Eco 의 EcoRI 부위 내로 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물을 사용하여 당업계에 공지된 방법을 사용하여 (Spizizen et al., supra 참조) B. 서브틸리스 DB104 (Doi, J. Bacteriol., 160:442-444 [1984] 참조) 를 형질전환시켰다.

형질전환 혼합물로부터의 세포를 당업계에 공지된 바와 같이 20 g/ml 네오마이신 및 0.4% 카세인을 함유하는 최소 플레이트 상에 플레이팅하였다 (EP 0283075 참조). 프로테아제-생성 형질전환체의 DNA 를 당업계에 공지된 방법을 사용하여 단리하였고 (Birnboim and Doly, supra 참조), 제한 효소 분석을 사용하여 특징화하였다s.

D. PB982 변이형의 생성

053 ~ 060 로 지정된 PB92 변이형을 당업계에 공지된 바와 같이 기재된 융합 PCR 에 의해 제작하였다 (예를 들어, 본원에 전체가 참조로서 인용된 미국 특허 출원 일련 번호 10/541,737 참조). 하기 표는 본원에 기재된 바와 같은 융합 PCR 에 사용되는 프라이머의 서열을 제공한다.

Phusion™ 폴리머라아제 (Finnzymes) 를 이러한 PCR 반응에 사용하였다. 상기 실험에서, 2 μl 의 10 mM 정방향 및 역방향 프라이머, 1 μl 10 mM dNTP's, 5μl 10x HF Phusion 완충액, 1.5 μl DMSO 및 1 μl 주형을 50μl 의 부피에 첨가하였다. 다음과 같은 프로그램을 사용하였다: 95℃ 에서 3 분 변성, 65℃ 에서 1 분 동안 어닐링, 72℃ 에서 1 분 15 초 동안 신장, 30 사이클 후, 72℃ 에서 7 분. 완료 후, 반응 생성물을 실온에 저장하였다.

"047/048" 로 지정된 돌연변이체를 주형으로 사용하여 돌연변이체 053 ~ 058 을 발달시켰다. BglII-Fw 프라이머를 118V-Rv 와 조합하고, BglII-Rv 프라이머를 128-130-Fw 프라이머와 조합시켜 두번째 단편을 제작하였다. 057 의 경우, BglII-Fw / S166D-Rv 및 BglII-Rv / S166D-Fw 를 조합하였다.

또한, 돌연변이체 "051/052" 를 주형으로 사용하여 돌연변이체 059 및 060 을 형성하였다. 프라이머 126-up-Rv 를 BglII-Fw 와 조합하는 반면, BglII-Rv 를 128-130Fw 프라이머와 조합하였다.

예상된 크기의 조각을 Macherey-Nagel 의 PCR 정제 컬럼을 사용하여 아가로오스 젤로부터 정제하였다. 올바른 조각을 Phusion™ 폴리머라아제 및 하기 프로그램을 사용하여 BglII 프라이머로 융합 및 증폭시켰다: 95℃ 에서 3 분의 변성 시간, 65℃ 에서 1 분 동안 어닐링, 및 72℃ 에서 2 분 동안 신장, 25 사이클 후, 72℃ 에서 7 분. 완료 후, 반응 생성물을 실온에 저장하였다.

조각을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 BglII 로 소화하고, 아가로오스 젤로부터 정제하고, 부피 40μl 중에 1 μl T4 DNA 리가아제, 8μl 5x T4 라이게이션 완충액으로 14℃ 에서 밤새 라이게이션하였다.

프로테아제 양성 형질전환체를 수득하기 위해 B. 서브틸리스 BG3594 comK 고도의 형질전환가능 균주를 사용하였다. 상기 기재된 바와 같이 수득된 발현 벡터를 10 μl 의 라이게이션 생성물로 형질전환시켰다. 수용능 바실러스 서브틸리스 세포, BG3594comK 를 실시예 1 에 기재된 발현 플라스미드로 형질전환시켰다. 악실로오스 (axylose) 유도가능 프로모터 (예를 들어, Hahn et al., Mol. Microbiol., 21:763-775 [1996] 참조) 의 조절 하에서 comK 유전자의 유도에 의해 박테리아를 수용능으로 만들었다. 프로테아제 양성 클론을 선별하고, 단리하고, 서열분석하고, 실시예 2 에 기재되는 바와 같이 B. 클라우시 (B. clausii) PBT125 로 형질전환시켰다.

B. 클라우시에서 발현된 돌연변이체

본 실시예에서는, 실시예 1 에 기재된 발현 벡터를 사용하여 형질전환된 B. 클라우시 PBT125 에서 발현된 돌연변이체 프로테아제를 발달시키는데 사용된 방법이 제공된다. 상기 균주는 종래의 균주 향상 방법을 사용하여 균주 PB92 로부터 수득된 후, 무포자 및 향상된 프로테아제 생성을 위해 스크리닝을 하여 생성된 PBT110 의 프로테아제 음성 유도체이다.

PB92 프로테아제-음성 유도체: PBT125 의 형질전환 과정

당업계에 공지된 Chang and Cohen 의 폴리에틸렌 글리콜-유도 원형질체 형질전환법 (예를 들어, Chang and Cohen, Mol. Gen. Genet., 168:1 11-115 [1979]) 을, 하기 변경을 하여 사용하여, 실시예 1 에 기재된 발현 벡터로 B. 클라우시 PBT125 를 형질전환시켰다. 먼저, 0.5 M 수크로오스, 0.02 M MgCl₂, 및 0.02 M 트리스-말레에이트 완충액 (pH 8.0) 을 함유하는 알칼리 지속 배지에서 원형질체를 준비하고, 여기에 ml 당 0.4 mg 의 리소자임을 첨가하였다. 그 다음, 원형질체를 5 ml 의 알칼리 지속 배지에서 펠렛화 및 현탁하고, 여기에 3.5% (wt/vol) Bacto-Penassay (Difco) 브로쓰 및 0.04% 알부민 (Merieux) 을 첨가하였다. 형질전환된 원형질체를 8.0 g 의 GELRITE® 겔람 Gum (Kelco), 0.3 g 의 CaCl₂ · 2H₂O, 4.06 g 의 MgCl₂ . H₂O, 5.0 g 의 N-트리스(히드록시메틸)메틸-2-아미노에탄술폰산 완충액 (Sigma), 5.0 g 의 카사미노산, 5 g 의 효모 추출물, 750 ml 의 H₂O 에 용해된 1.5 ml 의 4 M NaOH 를 함유하는 변형 DM3 (5) 플레이트 상에 재생시키고, 250 ml 의 2 M 수크로오스 및 10 ml 의 50% (wt/vol) 글루코오스, 1 ml 의 알부민 (Merieux), 10 mg 의 티아민, 5 mg 의 비오틴, 및 50 mg 의 네오마이신으로 멸균시킨 후 혼합하였다. 대략 70℃ 에서 플레이트를 부었다. 수용능 B. 클라우시 세포의 형질전환을 당업계에 공지된 바와 같이 수행하였다 (예를 들어, Tanaka, "Construction of Bacillus subtilis Plasmid and Molecular Cloning in Bacillus subtilis," In D. Schlesinger (ed.), Microbiology, American Society for Microbiology, Washington, D.C., pp.15-18, [1982] 참조).

발효 조건 및 프로테아제 생성

*B. 클라우시 PBT125 를 6 또는 3 리터 발효기에서, 리터 당 22 g (건조 물질 기준) 의 효모, 리터 당 5 g 의 K₂HPO₄ · 3H₂O, 리터 당 0.05 g 의 MgSO₄ · 7H₂O, 리터 당 0.05 g 의 CaCl₂, 리터 당 0.005 g 의 FeSO₄ · 7H₂O, 및 리터 당 0.05 g 의 MnSO₄ · 4H₂O 를 함유하는 배지 중에서 발효시켰다. 배지 성분을 90% 의 최종 부피에 용해하고, 120℃ 의 온도에서 1 시간 동안 pH 7.0 에서 살균시켰다. 100 ml 의 TSB 내에 B. 클라우시 PBT125 로 접종; 살균 후, 4 ml 의 1 M 나트륨 카르보네이트 용액을 경사 튜브로부터 첨가하여 접종 배양물을 수득하였다. 접종 배양물을 교반 장치 상에서 24 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 배지를 100 부피의 배지 당 1 부피의 접종 배양물로 37℃ 및 pH 8.0 에서 접종하였다. 주 발효는 pH, 온도, 및 발포 조절을 위한 장치 및 용해된 산소 농도 및 산소 섭취율의 지속적인 측정을 위한 장치가 장착된 교반되는 발효기 중의 37℃ 에서 수행되었다. 접종 17 시간 후에, 1 시간 동안 12O℃ 에서 살균된 30% 글루코오스 용액을 배지 리터 당 30 g 의 글루코오스의 최종 농도로 첨가하였다.

브로쓰를 11,800 xg 에서 30 분 동안 회전시켰다. 상청액을 Buchner 깔대기 중의 Whatman 유리섬유 필터 및 0.8 um 필터를 통해 여과한 후, 셀룰로오스 패드를 사용하여 여과하였다. 수득된 물질을 사용할 때까지 4℃ 에서 보관하였다. 그 다음, 물질을 10 kDa 의 필터 컷-오프 (cut-off) 로, Pall UF-필터 유닛을 사용하여 농축시켰다. 수득된 UF-농축물을 프로필렌 글리콜 및 나트륨 포르메이트를 첨가하여 제형화하였다. 포름산을 사용하여 pH 를 6.0 으로 조정하였다.

정제된 프로테아제의 순도를 측정하기 위한 분석 기술

본 실시예에서는, 정제된 프로테아제의 순도를 측정하기 위해 사용되는 방법이 기재된다. 프로테아제는 단일 밴드 또는 피크가 전기영동 및 고성능 젤 전기영동 (HPLC), 각각에 의해 발견되는 경우 순수한 것으로 고려되었다.

나트륨 도데실 술페이트 (SDS) 의 존재 하에 폴리아크릴아미드 젤-전기영동 (PAGE) 을 당업계에 공지된 바와 같이 수행하였다 (Laemmli, Nature, 227:680-685 [1970] 참조). 그러나, 100℃ 에서 SDS 에 의한 단백질 샘플의 변성 전, 자가분해를 방지하기 위해 프로테아제 활성의 비활성화가 필요하였다. 이것은 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF) 로의 인큐베이션 (1 mM, 30 분, 실온) 또는 트리클로로아세트산으로의 침전 (TCA, 8%, 30 분, 빙상) 에 의해 달성되었다. 선천적 PAGE 는 pH 7.45 (5% 폴리아크릴아미드 겔 (아크릴아미드:비스아크릴아미드의 비율 20:1) 중의 20 mM 히스티딘 (His) 및 50 mM 3-[N-모르폴리노]프로판술폰산 (MOPS) 으로 이루어진 젤 완충액) 에서 수행하였다. 단백질 샘플을 슬랩 (slab) 젤의 상부에 로딩하고, 캐소드 쪽으로 전기영동시켰다. 동일한 5 His/MOPS 완충액을 전기영동 (탱크) 완충액으로 사용하였다 (그러나 pH 6.3). 전기영동 후 (350 V 에서 1 내지 2 시간), 젤을 8% 아세트산에 적셔 젤 상에 단백질을 고정하고, 이어서 코마시 브릴리언트 블루 (Coomassie Brilliant Blue) R250 으로 염색하고 당업계에 공지된 바와 같이 탈색하였다.

양이온 교환 컬럼 (MonoS; Pharmacia) 및 젤 여과 컬럼 (TSK 2000; SW-LKB) 을 사용하여 HPLC 에 의한 순도 확인을 하였다. 양이온 교환 컬럼을 10 mM 나트륨 포스페이트 완충액 pH 5.5 에서 수행하였다. 결합된 프로테아제의 용리를 10 ~ 300 mM 나트륨 포스페이트의 선형 구배, pH 5.5 를 사용하여 수득하였다. 젤 여과 컬럼을 0.25 M 나트륨 아세테이트 pH 5.5 에서 수행하였다.

프로테아제 농도의 측정

본 실시예에서는, 프로테아제 농도를 측정하기 위해 사용된 방법이 기재된다. 일부 실험에서, 계산된 소멸 계수 (_M) 을 사용하여 280 nm 에서 소멸 측정을 수행하였고, 하기 기재되는 바와 같이 정제된 프로테아제 용액 중의 단백질 농도를 측정하기 위해 활성 부위 적정을 사용하였다. 부가적인 실험에서, 본원에 전체가 참조로서 인용된 미국 특허 출원 일련 번호 11/011,666 에 언급된 방법을 사용하였다.

280 nm 에서의 소멸 계수를 효소 분자 당 트립토판 (_M =5,600 M^-1.cm^-1) 및 티로신 (_M = 1,330 M^-1.cm^-1) 의 수로부터 계산하였다. PB92 프로테아제에 있어서, _M 은 280 nm =9.7 (M_r = 26,729 Da) 에서 측정된 ^E1 1%cm 에 등가인 26,100 M^-1.cm^-1 (3 Trp, 7 Tyr 잔기) 였고, 이것이 사용되었다. 변형된 수의 Trp 잔기 및 Tyr 잔기를 가진 돌연변이체의 경우, 이를 적절히 변경할 수 있었다.

활성 효소 분자의 수의 측정을 활성 부위 적정으로 확인하였다. N-트랜스신나모일이미다졸 (Bender et al., J. Am. Chem. Soc, 88:5890-5931 [1966] 참조) 로의 널리 사용되는 방법이 PB92 프로테아제에 대해 만족스럽게 작용하지 않는것으로 입중되었으므로, PMSF 를 사용하는 방법이 대신 개발되었다.

본 방법에서, 추정된 효소 농도 (280 nm 흡수로부터) 의 프로테아제 용액을 0.25, 0.50, 0.75, 1.00 및 1.25 당량의 PMSF 와 각각 혼합시키고, 10 mM 나트륨 포스페이트 pH 6.5 중에서 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 효소 농도는 50 M 이상이었다.

기질로서 숙시닐-L-알라닐-L-알라닐-L-프롤릴-L-페닐알라닐-파라-니트로아닐라이드 (sAAPFpNA) 를 사용하여 잔류 활성을 분광 광도계로 측정하였다. PMSF 의 순도 (그러므로 농도) 를 NMR-분광학에 의해 측정하고, 저장 용액을 이소프로파놀중에서 제조하였다. 활성 부위 적정으로부터의 결과는 HPLC 로의 순도 체크로부터의 결과와 일치하는 것으로 밝혀졌다.

야생형 및 돌연변이체 프로테아제의 동역학적 파라미터의 측정

본 실시예에서는, 야생형 및 돌연변이체 프로테아제의 동역학적 파라미터의 측정에 사용되는 방법을 기재하였다.

단백질 기질 (카세인) 에 대한 활성을 영국 특허 명세서 1,353,317 에 기재된 바와 같이 pH 10.0 에서 측정하였다 (ADU = Alkaline Delft Units 로 표현됨).

기질로서 카세인으로의 전환수를 pH-stat 에서 측정하였다. pH-stat 의 반응 챔버 (Radiometer, Copenhagen) 에는 10 ml 0.1 M KCl 이 50 mg 카세인 (Hammerstein, Merck) 과 함께 함유되었다. PB92 프로테아제에 의한 카세인의 가수분해시 방출되는 양자는, pH 10.0 으로 유지되면서 10 mM NaOH 로 적정되었다 (40℃ 및 질소 기체 흐름 하에서).

합성 펩티드에 대한 활성을 sAAPFpNA 를 사용하여 측정하였다. 형성된 (황색) 파라니트론아닐라이드 (pNA) 를 자동온도조절된 6 위치 세포 교환기가 장착된 UVIKON 860 (KONTRON) 분광 광도계로 당업계에 공지된 방법을 사용하여 (Delmar et al., Anal. Biochem., 94:316-320 [1979] 참조) 410 nm: M = 8,480 M^-1. cm^-1 에서 분광 광도계로 측정하였다. 동역학적 파라미터 kcat 및 Km 을 다양한 기질 농도에서 (PB92 프로테아제에 있어서는 0.1 내지 6.0 mM) 초기 속도 측정으로부터 수득하였고, 데이터를 다변수 할선 반복법을 사용하여 비선형 회기에 의해 쌍곡선 함수로 핏팅시켰다. 그 다음 특이성 상수 _kcat/Km 을 계산하였다. 25℃ 에서, 0.1M TRIS-HCl + 0.1M NaCl pH 8.6 를 함유하는 최종 부피 1 ml 에서 측정을 수행하였다. 염화나트륨이 필요한데, 이것이 없으면 PB92 프로테아제가 기질 억제에 의해 야기될 수 있는 비선형 Lineweaver-Burk 곡선을 나타내기 때문이다. 먼저 기질을 DMSO 에 농도 200 mM 로 희석하고, 이어서 0.1 M TRIS-HCl pH 8.6 로 희석하여, 20 mM 의 저장 용액을 산출하였다 (315 nm; M = 14,000 M^-1.cm^-1 에서 분광 광도계로 측정됨). 다양한 농도의 DMSO (0.05 ~ 3.0 % v/v) 에 대해 교정하지 않았다.

세정력 시험

본 실시예에서는, 시판 식기 세제를 사용하는 식기세정 적용에서의 PB92 프로테아제 돌연변이체 및 시판 PROPERASE® 세린 프로테아제의 세정력을 측정하기 위해 사용되는 방법이 기재된다.

본 실시예에서는, PB92 변이형 (049: G116V, S126L, P127Q, S128A; 및 046: G116V, S126I, P127Q, S128A, S160D; PB92 넘버링) 을 다양한 조건 하에서 시험하였다. 식기 세제의 조성은 하기 제시된다. 이러한 세제는 WFK 로부터 시판되고 하기 제시되는 명칭으로 언급된다. 각각의 오염물 유형 (다짐육, 달걀 노른자, 및 달걀 노른자와 우유) 에 대한 프로토콜은 하기에 제시된다. 개별 오염물 유형을 시험 접시에 적용하기 전에, 접시를 전체적으로 세정해야만 한다. 이것은 이전 시험으로부터 특정 지속성 오염 잔류물이 접시에 여전히 존재할 수 있기 때문에 특히 필요하다. 또한 새로운 접시를 시험에서 첫번째로 사용하기 전 3 회의 철저한 세정에 적용하였다.

*스테인레스 스틸 상의 달걀 노른자

이러한 실험에 사용된 스테인레스 스틸 박판 (10 x 15 cm; 한 면에 브러쉬질을 함) 를 고-알칼리성 시판 세제 (예를 들어, ECOLAB® 세제; Henkel) 로 실험실 식기세척기에서 95℃ 에서 전체적으로 세정하여, 깨끗하고 기름기가 없는 박판을 제공하였다. 이들 박판을 첫번째 사용하기 전에 잘 닦았다 (deburred). 박판을 열 캐비넷, 80℃ 에서 30 분 동안 건조시킨 후, 달걀 노른자로 오염시켰다. 브러쉬질을 할 표면은 오염 전에 건드리지 않았다. 또한, 표면 상에 물 자국 또는 보푸라기가 허용되지 않았다. 오염 전 냉각된 박판을 칙량하였다.

달걀 노른자는 대략 10 내지 11 개의 달걀의 노른자 (200 g 의 달걀 노른자) 를 흰자로부터 분리하여 준비하였다. 노른자를 유리 비이커에서 포크로 교반하여 노른자 현탁을 균질화한다. 그 다음 노른자를 걸러내어 (대략 0.5 mm 메쉬) 거친 입자 및 임의의 달걀 껍질 조각을 제거한다.

납작한 브러쉬 (2.5") 를 사용하여 1.0 ± 0.1 g 달걀 노른자 현탁액을 각각의 스테인레스 스틸 박판의 브러쉬질한 면 상의 140 cm² 의 면적에 가능한한 균일하게 적용하고, 대략 1 cm 너비의 미오염된 테투리를 남겨둔다 (필요한 경우 접착 테이프를 사용하였다). 오염된 박판을 수평으로 하여 (박판 모서리에 덩어리가 형성되는 것을 방지하기 위함), 실온에서 4 시간 동안 (최대 24 시간) 건조시켰다.

변성을 위해, 박판을 끓는, 탈염수 (필요한 경우 홀딩 장치를 사용함) 에 30 초 동안 담궜다. 그 다음, 박판을 80℃ 에서 30 분 동안 다시 건조시켰다. 건조 및 냉각 후, 박판을 칙량하였다. 칙량 후, 박판을 24 시간 이상 (20℃, 40 ~ 60% 상대 습도) 방치한 후, 이들을 세정 시험에 적용하였다. 시험 조건을 충족시키기 위해, 500 ± 100 mg/140 cm² (변성 후 달걀 노른자) 의 박판만을 시험에 사용하였다. 세정 시험을 수행한 후, 박판을 열 캐비넷, 80℃ 에서 30 분 동안 건조시키고, 냉각 후 칙량하였다. % 세정력을 (세정에 의해 방출된 달걀 노른자 mg x 100) ÷ (적용된 변성 달걀 노른자 mg) 으로 측정하였다.

자기 그릇 상의 다짐육

본 실험을 위해, 디저트 접시 (Arzberg, 백색, 도자기) (EN 50242, 폼 1495, No. 0219, 직경 19 cm) 를 사용하였다. 총 225 g 돼지 및 소 살코기 (반 반) 를 눈에 보이는 지방을 제거한 후 잘 다지고 냉동하였다. 혼합물을 다짐기에 2 회 통과시켰다. 35℃ 초과의 온도는 피했다. 그 다음, 225 g 의 다짐육을 75 g 의 달걀 (흰자 및 노른자가 함께 혼합됨) 과 혼합하였다. 그 다음 제조물을 사용 전 -18℃ 에서 3 개월 이하로 냉동시켰다. 돼지고기를 이용할 수 없다면, 소고기를 사용하였고, 이들은 상호반대도 가능하다.

다짐육 및 달걀 혼합물 (300 g) 을 실온에 두고, 80 ml 합성수와 혼합하였다. 그 다음 혼합물을 부엌용 핸드 블랜더를 사용하여 2 분 동안 균질화시켰다. 그 다음, 포크를 사용하여 3 g 의 다짐육/달걀/물 혼합물을 각 백색의 자기 접시에 펼쳐바르고, 테두리를 따라 대략 2 cm 너비의 미오염 가장자리를 남겨두었다. 적용된 양은 11.8 ± 0.5 mg/cm² 이었다. 플레이트를 예열된 열 캐비넷, 120℃ 에서 2 시간 동안 건조하였다. 접시를 냉각하자 마자 사용하였다. 각 접시 사이에 종이 타올을 쌓았다.

세정 후, 더 나은 다짐육 잔류물의 확인을 위해 플레이트에 닌히드린 용액 (1% 에탄올) 을 분사하였다. 색 반응을 촉진하기 위해, 플레이트를 열 캐비넷, 80℃ 에서 10 분 동안 가열하였다. IKW 사진 카탈로그 (IKW) 를 참조로 다짐육 잔류물의 색 반응을 시각적으로 관찰하여 세정력 평가를 수행하였다.

스테인레스 스틸 상의 달걀/우유 오염물

이러한 실험에 사용된 스테인레스 스틸 박판 (10 x 15 cm; 한 면에 브러쉬질을 함) 를 고-알칼리성 시판 세제로 실험실 식기세척기에서 95℃ 에서 전체적으로 세정하여, 기름기를 제거하고 박판을 깨끗이하였다. 이들 박판을 셀룰로오스 천으로 닦아 건조하였다. 브러쉬질을 할 표면은 오염 전에 건드리지 않았다. 또한, 표면 상에 물 자국 또는 보푸라기가 허용되지 않았다. 오염 전 박판을 열 캐비넷, 80℃ 에서 30 분 동안 두었다. 냉각된 박판을 오염 전 칙량하였다.

전체 생 달걀의 달걀 노른자 및 흰자 (3 내지 4 개 달걀; 160 g/달걀) 를 그릇에 담고 달걀 거품기로 반죽하였다. 그 다음, 50 ml 반-탈지 UHT (1.5% 지방, 초-고온, 균질화됨) 우유를 혼합물에 첨가하였다. 우유 및 달걀을 거품을 발생시키지 않고 혼합하였다. 납작한 브러쉬를 사용하여 스테인레스 스틸 박판의 브러쉬질한 면 상에 1.0 ± 0.1 g 의 달걀/우유 혼합물을, 분포를 체크하는 저울을 사용하여 균일하게 배치하였다. 박판의 짧은 면을 둘러 대략 1.0 cm 의 테두리를 남겨놓았다. 오염된 박판을 수평으로 하여 (박판 모서리에 덩어리가 형성되는 것을 방지하기 위함), 실온에서 4 시간 동안 (최대 24 시간) 건조시켰다.

그 다음 박판을 끓는, 탈염수 (필요한 경우 홀딩 장치를 사용함) 에 30 초 동안 담궜다. 그 다음, 박판을 80℃ 에서 30 분 동안 다시 건조시켰다. 건조 및 냉각 후, 박판을 칙량하였다. 칙량 후, 박판을 24 시간 이상 (20℃, 40 ~ 60% 상대 습도) 방치한 후, 이들을 세정 시험에 적용하였다. 시험 조건을 충족시키기 위해, 190 ± 10 mg 달걀 노른자의 박판만을 시험에 사용하였다.

세정 시험을 수행한 후, 박판을 열 캐비넷, 80℃ 에서 30 분 동안 건조시키고, 냉각 후 칙량하였다. % 세정력을 (세정에 의해 방출된 달걀/우유 mg x 100) ÷ (적용된 달걀/우유 mg) 으로 측정하였다.

세정 장비 및 조건

세정 시험을 상기 기재된 바와 같은 오염된 식기 및 스테인레스 스틸 박판이 준비된 자동 식기세척기 (Miele: G690SC) 에서 수행하였다. 하기 결과 표에 제시되는 바와 같은 정의된 양의 세제를 사용하였다. 시험된 온도는 45℃, 55℃ 및 65℃ 였다. 물 경도는 9° 또는 21° GH (German hardness) (374 ppm Ca) 였다.

상기 제시된 바와 같이, 세정 후 다짐육으로 오염된 접시는, "0" 은 완전히 더러운 접시를 지칭하고, "10" 은 깨끗한 접시를 지칭하는 0 내지 10 의 사진 등급화 스케일을 사용하여 시각적으로 평가하였다. 이들 값은 효소-함유 세제의 오염물 또는 얼룩 제거 (SR) 능력에 상응한다.

세정된 스테인레스 스틸 접시를 달걀 노른자 및/또는 달걀 노른자 우유 (세정 후 잔류 오염의 양을 측정하기 위해 중량 측정하여 분석하였음) 로 오염시켰다. PB92 돌연변이체 프로테아제 및 PROPERASE® 프로테아제 및 기타 돌연변이체를 세정 당 0 내지 20.57 mg/활성 단백질 수준에서 시험하였다.

상기 실험에 사용된 세제는 하기에 기재된다. 이러한 세제는 상기 실험에서 시험된 효소의 분석을 가능하게 하기 위해 효소가 존재하지 않는 근원으로부터 수득된다.

하기 표에서, 다양한 실험 결과가 제시된다. 이들 각 실험에서, 세정 당 20.57 mg 활성 단백질이 사용되었다. 이러한 결과에서, 지표는 100 이었다. 그러므로, PROPERASE® 효소에 대한 수행 결과는 "100" 의 값으로 할당하였고, 돌연변이체에 대한 결과를 상기 값과 비교하였다. 예를 들어, PROPERASE® 가 45% SR (지표로는 100) 의 결과를 갖는 경우, 돌연변이체는 52% SR5 의 결과를 가지고, 돌연변이체에 대한 결과는 52/45 x 100 = 116 (지표로는) 일 것이다.

본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공개는 본 발명이 속하는 당업자의 수준의 지표이다. 모든 특허 및 공개는 각각의 개별 공개가 참조로서 인용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 동등한 범위로 본원에 참조로서 인용된다.

본 발명의 바람직한 구현예를 기재함에 있어, 당업자에게는 기재된 구현예에 다양한 변형이 이뤄질 수 있고, 이러한 변형이 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 의도되는 것으로 여겨질 것이다.

당업자는 본 발명이 목적을 수행하고, 언급된 것 뿐 아니라 그 안에 내재된 목표 및 장점을 획득하기 위해 잘 적용될 것임을 쉽게 인지할 것이다. 본원에 기재된 조성물 및 방법이 대표적인 바람직한 구현예이고, 예시이고, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되는 것은 아니다.

본원에 적합하게 예증적으로 기재되는 본 발명은 본원에 구체적으로 기재되지 않는 임의의 요소, 제한이 없이도 실시될 수 있다. 사용되는 용어 및 표현은 제한이 아닌 기재와 관련되어 사용된 것이고, 제시되고 기재된 특징의 임의의 등가물 또는 그의 일부를 배제하는 이러한 용어 및 표현을 사용하려는 의도가 있는 것은 아니며, 그러나 다양한 변경이 본 발명의 청구의 범위 내에서 가능하다는 것이 인지된다. 그러므로, 본 발명이 바람직한 구현예 및 임의의 특징에 의해 구체적으로 기재된 경우라도, 본원에 기재된 개념의 변경 및 변형이 당업자에 의해 재분류될 수 있고, 이러한 변경 및 변형이 청구의 범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려되는 것으로 이해되어야만 한다.

본 발명은 본원에 널리, 그리고 일반적으로 기재되어 있다. 속명 기재에 있어서 각각의 보다 좁은 종명 및 아속명 그룹화는 또한 본 발명의 일부를 구성한다. 여기에는 삭제된 대상이 본원에 구체적으로 언급된지의 여부와 관계없이, 속명으로부터 임의의 대상을 제외하지 않는 단서 또는 부정적인 제한이 있는 본 발명의 속명 기재가 포함된다.

<110> Danisco US, Inc., Genencor Division Augustinus, Pieter Goedegebuur, Frits Poulose, Ayrookaran J. Van Der Laan Cornelis, Johannes <120> PROTEASE VARIANTS ACTIVE OVER A BROAD TEMPERATURE RANGE <130> GC-914-PCT <140> PCT/US2007/015642 <141> 2007-07-09 <150> US 60/831,732 <151> 2006-07-18 <160> 15 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 1143 <212> DNA <213> Bacillus nov. Sp. PB92 <400> 1 atgaagaaac cgttggggaa aattgtcgca agcaccgcac tactcatttc tgttgctttt 60 agttcatcga tcgcatcggc tgctgaagaa gcaaaagaaa aatatttaat tggctttaat 120 gagcaggaag ctgtcagtga gtttgtagaa caagtagagg caaatgacga ggtcgccatt 180 ctctctgagg aagaggaagt cgaaattgaa ttgcttcatg aatttgaaac gattcctgtt 240 ttatccgttg agttaagccc agaagatgtg gacgcgcttg aactcgatcc agcgatttct 300 tatattgaag aggatgcaga agtaacgaca atggcgcaat cagtgccatg gggaattagc 360 cgtgtgcaag ccccagctgc ccataaccgt ggattgacag gttctggtgt aaaagttgct 420 gtcctcgata caggtatttc cactcatcca gacttaaata ttcgtggtgg cgctagcttt 480 gtaccagggg aaccatccac tcaagatggg aatgggcatg gcacgcatgt ggctgggacg 540 attgctgctt taaacaattc gattggcgtt cttggcgtag caccgaacgc ggaactatac 600 gctgttaaag tattaggggc gagcggttca ggttcggtca gctcgattgc ccaaggattg 660 gaatgggcag ggaacaatgg catgcacgtt gctaatttga gtttaggaag cccttcgcca 720 agtgccacac ttgagcaagc tgttaatagc gcgacttcta gaggcgttct tgttgtagcg 780 gcatctggga attcaggtgc aggctcaatc agctatccgg cccgttatgc gaacgcaatg 840 gcagtcggag ctactgacca aaacaacaac cgcgccagct tttcacagta tggcgcaggg 900 cttgacattg tcgcaccagg tgtaaacgtg cagagcacat acccaggttc aacgtatgcc 960 agcttaaacg gtacatcgat ggctactcct catgttgcag gtgcagcagc ccttgttaaa 1020 caaaagaacc catcttggtc caatgtacaa atccgcaatc atctaaagaa tacggcaacg 1080 agcttgggaa gcacgaactt gtatggaagc ggacttgtca atgcagaagc ggcaacacgc 1140 taa 1143 <210> 2 <211> 380 <212> PRT <213> Bacillus nov. 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Claims

변형 서브틸리신이 SEQ ID NO:2 에 언급된 서열 중에서 하나 이상의 치환을 포함하며, 각각의 위치는 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열의 아미노산 서열의 위치에 상응하고, 치환은 다음의 위치: G118, S128, P129, S130, 및 S166 으로부터 선택되는, 변형 서브틸리신을 포함하는 식기세정 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 변형 서브틸리신이 다음의 위치: G118, S128, P129 및 S130 에서 형성된 치환을 포함하는 식기세정 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 변형 서브틸리신이 돌연변이 G118V 및 하나 이상의 부가적인 돌연변이를 포함하는 식기세정 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 부가적인 돌연변이가 S128F, S128L, S128N, S128R, S128V, P129E, P129L, P129M, P129N, P129L, P129Q, P129S, S130A, S130K, S130P, S130T, S130V, 및 S166D 로 이루어진 군으로부터 선택되는 식기세정 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 변형 서브틸리신이 다음의 위치: S128, P129 및 S130 에서 형성된 치환을 포함하는 식기세정 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 치환이 S128C, S128R, P129Q, P129R, S130D, 및 S130G 로 이루어진 군으로부터 선택되는 식기세정 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 변형 서브틸리신의 아미노산 서열이 SEQ ID NO:3 에 언급되는 식기세정 조성물.
변형 서브틸리신이 SEQ ID NO:2 에 언급된 서열 중에서 치환을 포함하며, 각각의 위치는 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열의 아미노산 서열의 위치에 상응하고, 치환은 S130T 인, 변형 서브틸리신을 포함하는 식기세정 조성물.
제 1 항에 언급된 바와 같은 변형 서브틸리신을 코딩하는 단리된 핵산.
제 9 항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
제 10 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제 1 항에 언급된 바와 같은 하나 이상의 변형 서브틸리신 및 세정이 필요한 식기류를 제공하는 단계; 및 상기 식기류의 세정에 효과적인 조건 하에서 상기 식기류를 상기 변형 서브틸리신과 접촉시키는 단계를 포함하는, 식기세정 방법.