CN101511998A

CN101511998A - 在宽温度范围内具有活性的蛋白酶变体

Info

Publication number: CN101511998A
Application number: CNA2007800269622A
Authority: CN
Inventors: P·奥古斯丁; F·齐德戈伯; A·J·保罗斯; J·C·范德莱
Original assignee: Danisco USA Inc
Current assignee: Danisco USA Inc; Danisco US Inc
Priority date: 2006-07-18
Filing date: 2007-07-09
Publication date: 2009-08-19
Also published as: NZ573467A; US20130323816A1; US20190338267A1; EP2059591A2; US20110059517A1; AU2007275864A1; AU2007275864B2; MX2009000537A; US20140302590A1; CN104232365A; BRPI0714329A2; DK2059591T3; BRPI0714329B1; EP2059591B1; JP2009543577A; US20080090747A1; RU2009105503A; US20190078070A1; RU2509152C2; WO2008010925A2

Abstract

本发明提供特别适用于餐具洗涤应用的蛋白酶组合物。

Description

在宽温度范围内具有活性的蛋白酶变体

本申请要求在审美国临时专利申请序列号60/831,732的优先权。

发明领域

【01】本发明提供特别适用于餐具洗涤应用的蛋白酶组合物。

背景技术

【02】通常地，传统家庭和工业餐具洗涤组合物依赖于高碱度洗涤剂洗涤和氯漂白的结合用以清洁和消毒餐具。这类系统通常对可漂白污点作用良好。但是，它们在去除含蛋白的污垢时作用不足，含蛋白的污垢经常出现在家庭、医院、自助餐厅、公共饮食业等的餐具中。另外，很高碱性并包含氯的组合物被认为对消费者和环境都不友好。

【03】已进行各种尝试以产生有效去除蛋白质类污垢的餐具洗涤组合物。这些组合物通常包括在碱性条件下(例如，pH至少9.5)具有活性的蛋白酶。但是，这样的组合物具有明显的缺点，因为它们很难配制成液体或凝胶形式，这是消费者通常优选的餐具洗涤用洗涤剂形式。另外，碱性餐具洗涤组合物经常被认为是刺激物。

【04】已进行一些尝试以产生低pH值(例如，pH小于9.5)餐具洗涤组合物。这些组合物更安全，对环境更加友好，并且能够配制成凝胶和液体形式。但是，已经证明：现有的低pH的餐具洗涤组合物对去除蛋白质类污垢非常低效，即使是在餐具洗涤组合物里配制高浓度的酶(例如，蛋白酶)时也是如此。

【05】因此，在本领域对从餐具上高效去除蛋白质类污垢的餐具洗涤组合物仍存在需要。另外，对于对环境和消费者更加友好并且处于易于使用和成本有效的形式的餐具洗涤组合物仍存在需要。

发明内容

【06】本发明提供突变型蛋白酶，其在餐具洗涤剂应用中显示出改进的性质。在某些优选的实施方式中，所述突变型蛋白酶具有与PB92丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列至少70％的同源性，PB92丝氨酸蛋白酶具有如下氨、基酸序列：H₂N-AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR-COOH(SEQ ID NO：2)。在另外进一步实施方式中，所述突变型蛋白酶具有与SEQ ID NO：2至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同源性。在此处每个优选的实施方式中，与野生型PB92蛋白酶相比，所述突变型蛋白酶提供了改进的洗涤性能和/或改进的稳定性。

【07】在某些优选的实施方式中，与起始蛋白酶相比，本发明提供具有改进的餐具洗涤性能的变体蛋白酶。在某些特别优选的实施方式中，所述酶包括那些称为049、045、046、047/048、050、051/052、053、054、055/056、057、058、059和060的酶，其具有如在本文表1中所列举的取代。在另外的实施方式中，本发明提供的这些酶具有另外的突变(例如，取代、插入和/或缺失)。

【08】在某些特别优选的实施方式中，本发明提供的酶被称为049，其具有如下的氨基酸序列：AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSG SVSSIAQGLE WAGNNVMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQI RNHLKNTATS LGSTNLYGSG LVNAEAATR(SEQ ID NO：3)

【09】本发明还提供新型的酶餐具洗涤用洗涤剂，包括蛋白水解酶产物，其包含至少一种于此提供的突变型蛋白酶。

【10】在另外的实施方式中，本发明提供的餐具洗涤组合物包括修饰的枯草杆菌蛋白酶，其中所述枯草杆菌蛋白酶包括至少一种在以SEQ IDNO：2表达的序列中的取代，其中每个位置与枯草杆菌蛋白酶BPN′的氨基酸序列的氨基酸序列位置相对应，并且其中所述取代选自下述位置：G118、S128、P129、S130和S166。

【011】在某些实施方式中，所述修饰的枯草杆菌蛋白酶包括在下述位置进行的取代：G118、S128、P129和S130。在某些优选的实施方式中，所述修饰的枯草杆菌蛋白酶包括突变G118V和至少一个另外的突变。在某些特别优选的实施方式中，所述另外的突变选自S128F、S128L、S128N、S128R、S128V、P129E、P129L、P129M、P129N、P129L、P129Q、P129S、S130A、S130K、S130P、S130T、S130V和S166D。在仍进一步优选的实施方式中，所述修饰的枯草杆菌蛋白酶包括在下述位置进行的取代：S128、P129和S130。还在另外的优选实施方式中，所述取代选自S128C、S128R、P129Q、P129R、S130D和S130G。在某些特别优选的实施方式中，所述修饰的枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列以SEQ ID NO：3表达。

【012】本发明还提供包括餐具洗涤组合物的实施方式，所述餐具洗涤组合物包括修饰的枯草杆菌蛋白酶，其中所述枯草杆菌蛋白酶包括在以SEQ ID NO：2表达的序列中的取代，其中每个位置与枯草杆菌蛋白酶BPN′的氨基酸序列的氨基酸序列位置相对应，并且其中所述取代是S130T。

【013】本发明还提供编码修饰的枯草杆菌蛋白酶的分离核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶包括至少两个在以SEQ ID NO：2表达的序列中的取代，其中每个位置与枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列的氨基酸序列位置相对应，并且其中所述取代选自下述位置：G118、S128、P129、S130和S166。在某些实施方式中，所述核酸编码修饰的枯草杆菌蛋白酶，该修饰的枯草杆菌蛋白酶包括在下述位置进行的取代：G118、S128、P129和S130。在某些优选的实施方式中，所述核酸编码包含突变G118V和至少一个另外的突变的修饰的枯草杆菌蛋白酶。在某些特别优选的实施方式中，所述核酸进一步包括选自下述的另外的突变：S128F、S128L、S128N、S128R、S128V、P129E、P129L、P129M、P129N、P129L、P129Q、P129S、S130A、S130K、S130P、S130T、S130V和S166D。在仍进一步优选的实施方式中，所述核酸编码包括在下述位置进行取代的修饰的枯草杆菌蛋白酶：S128、P129和S130。还在附加的优选实施方式中，所述核酸包括选自下述的取代：S128C、S128R、P129Q、P129R、S130D和S130G。

【014】在某些特别优选的实施方式中，所述修饰的枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列以SEQ ID NO：3表达。在某些附加的实施方式中，本发明提供编码以SEQ ID NO：3表达的氨基酸序列的分离核酸。

【015】还在另外的实施方式中，本发明提供包括至少一种如上所述的分离核酸的载体。在进一步的实施方式中，本发明提供包括如上所述分离核酸中至少一种的载体。在仍进一步的实施方式中，本发明提供包括如上所述载体中至少一种的宿主细胞。

【016】本发明还提供餐具洗涤方法，其包括下述步骤：提供至少一种如上所述的修饰的枯草杆菌蛋白酶和需要清洁的餐具；并且在对所述餐具提供有效清洁的条件下，使所述餐具接触所述至少一种修饰的枯草杆菌蛋白酶。

附图说明

【017】图1A显示含有PB92蛋白酶基因的突变载体的构建。

【018】图1B提供显示在本发明某些实施方式中使用的突变步骤的示意图。

【019】图1C显示含有突变型PB92蛋白酶基因的表达载体的构建。

【020】图2提供PB92蛋白酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和编码的前蛋白、原蛋白和成熟蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

发明详述

【021】本发明提供用于餐具洗涤应用的方法和组合物，所述组合物包括至少一种突变型蛋白酶。

【022】除非另有说明，本发明的实践涉及分子生物学、微生物学、蛋白质纯化、蛋白质工程、蛋白质和DNA测序、重组DNA领域和工业酶应用和开发中常用的传统技术，所有这些都在本领域的技术范围内。于此提到的所有专利、专利申请、文章和出版物，无论上述和下述，因此都通过参考明确引入本文。

【023】此外，此处提供的标题没有对本发明各个方面或实施方式进行限制，其可以通过参考作为整体的说明书而被拥有。因此，紧随下面所定义的术语通过参考作为整体的说明书而被更加充分地定义。尽管如此，为了便于理解本发明，大量术语的定义被提供如下。

【024】除非此处另有定义，于此使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。例如，Singleton和Sainsbury，Dictonary of Microbiology and Molecular Biology(微生物学与分子生物学字典)，第二版，John Wiley and Sons，NY(1994)；以及Hale和Markham，The Harper Collins Dictionary of Biology，Harper Perennial，NY(1991)提供给本领域普通技术人员有关本发明中所用的很多术语的普通字典。虽然类似或等同于本文所述那些的任何方法和材料在本发明实践中均可发现用途，但是优选的方法和材料描述于此。因此，下文紧接着定义的术语通过参考作为整体的说明书而被更充分地描述。并且，如本文所用，单数术语“一”、“一个”或“其”(“a”，“an”和“the”)包括复数引用，除非上下文另有明确说明。除非另有说明，分别地，核酸的书写是按5′到3′的方向从左向右；氨基酸序列的书写是按氨基到羧基方向从左向右。应当理解，本发明不限于所描述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以变化，这取决于它们被本领域普通技术人员使用时的环境。

【025】期望的是，贯穿本说明书所给出的每个最大数值限定包括每个较低的数值限定，就如同此类较低数值限定被明确写入本文一样。贯穿本说明书所给出的每个最小数值限定将包括每个较高的数值限定，就如同此类较高数值限定被明确写入本文一样。贯穿本说明书所给出的每个数值范围将包括落入此类较宽数值范围的每个较窄数值范围，就如同此类较窄数值范围全部被明确写入本文一样。

【026】如本文所使用，术语“相容的”是指清洁组合物材料不会降低此处提供的蛋白酶(多种蛋白酶)的酶活性，降低的程度使得蛋白酶(多种蛋白酶)在正常使用情况下不像所期望的一样有效。具体清洁组合物材料可在下文中详细示例。

【027】如本文所使用，“酶的有效量”是指达到具体应用中达到所需酶活性必需的酶数量。这类有效量是本领域普通技术人员容易确定的，并且其基于许多因素，如使用的具体酶变体、清洁应用、清洁组合物的具体组成和是否需要液体或干燥(例如颗粒)组合物等。

【028】如本文所使用，与“突变型蛋白水解酶”结合使用的“具有改进的性质”是指相对于相应的野生型蛋白酶，具有改进的性能和/或伴随保持的性能具有改进的稳定性的蛋白水解酶。在某些特别优选的实施方式中，所述改进的性质选自改进的餐具洗涤性能和改进的稳定性，以及改进的餐具洗涤性能和改进的稳定性的结合。

【029】如本文所使用，短语“洗涤剂稳定性”是指洗涤剂组合物的稳定性。在某些实施方式中，稳定性在洗涤剂使用过程中评估；而在其他实施方式中，该术语是指在储存过程中洗涤剂组合物的稳定性。

【030】术语“改进的稳定性”是用来表示在储存过程中组合物中的突变型蛋白酶(多种蛋白酶)具有更好的稳定性和/或在泡沫(sud)中更好的稳定性。在优选的实施方式中，所述突变型蛋白酶(多种蛋白酶)显示出在储存过程中在餐具护理洗涤剂中改进的稳定性和/或在泡沫中改进的稳定性，相对于相应的野生型酶，所述稳定性包括对氧化剂、螯合剂、自我分解、表面活性剂和高碱度的稳定性。

【031】如本文所使用，短语“对蛋白水解的稳定性”是指蛋白质(例如，酶)耐受蛋白水解的能力。不意图将术语限制于使用任何特定的蛋白酶来评估蛋白质的稳定性。

【032】如本文所使用，“氧化稳定性”是指蛋白质在氧化条件下发挥功能的能力。具体而言，所述术语是指在不同浓度的H₂O₂、过酸和其他氧化剂存在下蛋白质发挥功能的能力。不同氧化条件下的稳定性可以用本领域技术人员已知的标准方法和/或通过本文描述的方法来测量。氧化稳定性的实质变化通过与没有氧化化合物存在时的酶活性相比较，酶活性半衰期增加或减少至少约5％或更大(在大多数实施方式中，优选地是增加)得以证明。

【033】如本文所使用，“pH稳定性”是指蛋白质在特定pH值发挥功能的能力。一般来说，大多数酶具有它们将发挥功能的有限pH范围。除了在中间范围pH发挥功能的酶(即约pH7)，还有在很高或很低pH条件下能够发挥作用的酶。在各种pH的稳定性可用本领域技术人员已知的标准方法和/或通过本文描述的方法来测量。pH稳定性的实质变化通过与酶最适pH下的酶活性相比，酶活性半衰期增加或减少至少约5％或更大(在大多数实施方式中，优选地是增加)得以证明。但是，不意图将本发明限制于任何pH稳定性水平，也不限制于pH范围。

【034】如本文所使用，“热稳定性”是指蛋白质在特定温度发挥功能的能力。一般来说，大多数酶都具有它们将发挥功能的有限温度范围。除了在中间范围温度(例如室温)发挥作用的酶，还有能够在很高或很低的温度下作用的酶。热稳定性可通过已知方法和/或通过本文描述的方法测量。温度稳定性的实质变化通过当暴露于给定温度时，突变体催化活性半衰期增加或减少至少约5％或更大(在大多数实施方式中，优选地是增加)得以证明。但是，不意图将本发明限制于任何温度稳定性水平，也不限制于温度范围。

【035】如本文所使用，“化学稳定性”是指蛋白质(例如酶)对可不利影响其活性的化学物质的稳定性。在某些实施方式中，此类化学物质包括但不限于过氧化氢、过酸、阴离子洗涤剂、阳离子洗涤剂、非离子型洗涤剂、螯合剂等。但是，不意图将本发明限制于任何特定的化学稳定性水平，也不限制于化学稳定性的范围。

【036】如本文所使用，术语“纯化的”和“分离的”是指从样本中去除污染物。例如，感兴趣的酶通过去除溶液或制备物中不是感兴趣酶的污染蛋白质和其他化合物来纯化。在某些实施方式中，感兴趣的重组酶在细菌或真菌宿主细胞中表达，并且这些感兴趣的重组酶通过去除其他宿主细胞成分来纯化；从而增加样本中感兴趣多肽重组酶的百分比。

【037】如本文所使用，“感兴趣蛋白”是指正在分析、鉴定和/或修饰的蛋白质(如酶或“感兴趣的酶”)。自然发生的以及重组(例如突变体)的蛋白质可在本发明中发现用途。

【038】如本文所使用，“蛋白质”是指任何由氨基酸组成并被本领域普通技术人员公认为蛋白质的组分。术语“蛋白质”、“肽”和多肽于此互换地使用。其中肽是蛋白质的一部分，本领域普通技术人员可理解术语在上下文中的使用。

【039】如本文所使用，功能上和/或结构上相似的蛋白质被认为是“相关蛋白质”。在某些实施方式中，这些蛋白质来源自不同属和/或种，包括各纲生物之间的区别(例如，细菌蛋白和真菌蛋白)。在某些实施方式中，这些蛋白质来源自不同属和/或种，包括各纲生物之间的区别(例如，细菌酶和真菌酶)。在另外的实施方式中，相关蛋白质由相同种提供。实际上，不意图将本发明限制于任何具体来源(多种来源)的相关蛋白质。另外，术语“相关蛋白质”包括三级结构的同系物和一级序列同系物(例如，本发明的酶)。在进一步的实施方式中，所述术语包括是免疫交叉反应的蛋白质。【040】如本文所使用，术语“衍生物”是指蛋白质，其通过加成(即插入)一个或多个氨基酸至C-末端和N-末端的一端或两端，在氨基酸序列的一个或多个不同位点处取代一个或多个氨基酸，和/或在蛋白质的一个或两个末端或在氨基酸序列的一个或多个位点处缺失一个或多个氨基酸，和/或在氨基酸序列的一个或多个位点处插入一个或多个氨基酸，衍生自蛋白质。优选地，蛋白质衍生物的制备是通过修饰编码天然蛋白的DNA序列，转化此DNA序列至适合的宿主中并表达所修饰的DNA序列以形成衍生蛋白质而完成的。

【041】相关的(和衍生的)蛋白质包括“变体蛋白质”。在某些优选的实施方式中，变体蛋白质与母体蛋白质以及相互间有小量的氨基酸残基不同。不同氨基酸残基的数量可以是一个或多个，优选地是1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多氨基酸残基。在某些优选的实施方式中，变体之间不同氨基酸的数量在1到10之间。在某些特别优选的实施方式中，相关蛋白质以及特别是变体蛋白质包括至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的氨基酸序列同源性。另外，如本文所使用的相关蛋白质或变体蛋白质是指在显著区域数量上不同于另一相关蛋白质或母体蛋白质的蛋白质。例如，在某些实施方式中，变体蛋白质具有1、2、3、4、5或10个不同于母体蛋白质的相应的显著区域。

【042】适合于产生本发明蛋白酶的变体的几种方法是本领域已知的，其包括但不限于位点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、随机诱变、位点定向诱变和定向进化，以及各种其他重组的方法。

【043】如本文所使用，“表达载体”是指包含DNA序列的DNA构建物，该DNA序列与能够实现该DNA在合适宿主中表达的适当控制序列可操作地连接。这类控制序列包括实施转录的启动子、控制此类转录的任选的操纵子序列、编码适合的mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体粒子或简单地潜在基因组插入片段。一旦转化至适合的宿主中，载体可独立于宿主基因组复制和行使功能，或者在某些情况下，可以自己整合至基因组中。在本说明书中，“质粒”、“表达质粒”和“载体”经常被互换地使用，原因在于质粒是目前最常用的载体形式。但是，本发明意图包括表达载体的此类其他形式，其发挥等同的功能并且是本领域已知的或开始被本领域知晓。

【044】在某些优选的实施方式中，所述蛋白酶基因被连接至适当的表达质粒。克隆的蛋白酶基因随后用于转化或转染宿主细胞以表达蛋白酶基因。这种质粒可在宿主中以正义复制，即它包含众所周知的对质粒复制必要的元件或所述质粒可被设计成整合至宿主染色体中。必要元件被提供用于高效基因表达(例如，启动子可操作地被连接至感兴趣的基因)。在某些实施方式中，这些必要元件被提供作为基因自身的同源启动子——如果它被识别的话，(即被宿主转录)，和转录终止子，其是外源的或通过蛋白酶基因的内源终止子区域供应的。在某些实施方式中，还包括选择基因，例如抗抗生素基因，其通过在包含抗微生物的培养基中生长，能够实现质粒-被感染宿主细胞的持续培养保持。

【045】虽然可以使用其他方法，但下述盒式诱变方法可用于促进本发明蛋白酶变体的构建。

【046】首先，如本文所述，获得编码蛋白酶的自然发生的基因并进行整体或部分测序。然后，在所编码的蛋白酶中，对期望进行一个或多个氨基酸的突变(缺失、插入或取代)的点进行序列扫描。评价该点侧翼的序列中的限制位点的存在，其用于用寡核苷酸文库置换基因的短片段——当该寡核苷酸文库表达时将编码各种突变体。此类限制位点优选地是在所述蛋白质基因内的单一位点，以便促进所述基因片段的置换。但是，可以使用任何在蛋白酶基因内不过度丰富的方便的限制位点，条件是通过限制酶切消化产生的基因片段可在适当的序列中重组装。如果限制位点不存在于所选点的方便距离内(从10至15个核苷酸)的位置处，此类位点可通过在基因中取代核苷酸来产生——以阅读框和所编码的氨基酸在最终构建中都没有改变的方式进行。为了符合期望的序列而改变其序列的基因突变通过M13引物延伸来完成，与通常已知的方法一致。定位于适合的侧翼区并评估所需要变化以到达两个方便的限制位点序列的任务通过遗传密码的冗余、基因限制酶图谱和不同限制酶的较大数量常规进行。注意如果方便的侧翼限制位点是可利用的，上述方法需要仅与不包含位点的侧翼区结合使用。

【047】一旦克隆自然发生的DNA和/或合成DNA，在被突变位置侧翼的限制位点使用关联限制酶消化，并且多数末端-互补的寡核苷酸盒被连接至基因中。诱变通过这种方法而被简化，因为所有寡核苷酸均可合成以便具有相同的限制位点，并且不含产生限制位点所必需的合成接头。

【048】如本文所使用，“相应”是指在蛋白质或肽的列举位置处的残基，或指相似的、同源的或等同于蛋白质或肽中的列举残基的残基。

【049】如本文所使用，“相应区”通常是指沿相关蛋白质或母体蛋白质的相似的位置。

【050】术语“核酸分子编码”、“核酸序列编码”、“DNA序列编码”和“DNA编码”是指沿脱氧核酸链的脱氧核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核苷酸的顺序决定了沿多肽(蛋白质)链的氨基酸的顺序。因此，DNA序列编码氨基酸序列。

【051】如本文所使用，术语“相似序列”是指蛋白质中的序列，其提供与感兴趣蛋白质(即通常是感兴趣的原始蛋白质)相似的功能、三级结构和/或保守残基。例如，在含有α螺旋或β折叠结构的表位区，在相似序列中的置换氨基酸优选地保持同样的特定结构。该术语也指核苷酸序列以及氨基酸序列。在某些实施方式中，相似序列被开发，使得置换氨基酸产生显示类似或改进功能的变体酶。在某些优选的实施方式中，所述感兴趣蛋白质中的三级结构和/或保守氨基酸残基位于或接近感兴趣的节段或片段。因此，在感兴趣的节段或片段含有例如α-螺旋或β-折叠结构之处，置换氨基酸优选地保持这一特定的结构。

【052】如本文所使用，“同源蛋白质”是指具有与感兴趣蛋白质(例如，另一来源的蛋白酶)类似的作用和/或结构的蛋白质(例如，蛋白酶)。不意图同系物一定在进化上相关。因此，意图该术语包括从不同种得到的相同或相似酶(多种酶)(即在结构和功能方面)。在某些优选的实施方式中，期望的是识别同源物，其具有类似于感兴趣蛋白质的四级、三级和/或一级结构，因为使用来自同源物的相似片段置换感兴趣蛋白质中的节段或片段将会减少变化的破坏性。在某些实施方式中，同源蛋白质已经诱导与感兴趣蛋白类似的免疫反应(多种免疫反应)。

【053】如本文所使用，“同源基因”是指来自不同种的至少一对基因，所述基因互相对应并且是彼此相同或十分相似。该术语包括通过物种形成(即新物种的开发)而分离的基因(例如，直向同源基因)，以及通过遗传复制而被分离的基因(例如，平行进化同源基因)。这些基因编码“同源蛋白质”。

【054】如本文所使用，“直向同源物”和“直向同源基因”是指通过物种形成从共同祖先基因(即同源基因)进化的不同种的基因。通常地，直向同源物在进化过程中保留相同功能。直向同源物的识别在可靠预测新测序基因组中的基因功能方面发现用途。

【055】如本文所使用，“种内同源基因”和“平行进化同源基因”是指在基因组中通过复制而相关的基因。虽然直向同源物在进化过程中保留相同的功能，但是种内同源基因进化出新的功能，尽管有些功能经常与原始功能相关。平行进化同源基因的实例包括但不限于编码胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶和凝血酶的基因，这些都是丝氨酸蛋白酶并且在同一种内一起出现。

【056】如本文所使用，“野生型”和“天然的”蛋白质是指在自然界中发现的那些。术语“野生型序列”和“野生型基因”于此被互换使用，是指在宿主细胞中天然的或自然发生的序列。在某些实施方式中，野生型序列是指感兴趣序列，其是蛋白质工程项目的出发点。编码自然发生蛋白质的基因可以按照本领域普通技术人员已知的一般方法得到。所述方法通常包括合成具有编码感兴趣蛋白质区域的推定序列的标记探针，从表达蛋白质的生物体制备基因组文库并通过与探针杂交筛选文库中感兴趣的基因。然后阳性杂交克隆被作图和测序。

【057】术语“重组DNA分子”于此使用是指DNA分子，其由通过分子生物技术连接在一起的DNA节段构成。

【058】术语“重组寡核苷酸”是指使用分子生物操作产生的寡核苷酸，包括但不限于通过多核苷酸序列的限制酶消化产生的两个或多个寡核苷酸序列的连接，寡核苷酸的合成(例如，引物或寡核苷酸的合成)等等。

【059】序列之间的同源性程度可用本领域已知的任何适合方法测定(见例如，Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，2：482[1981]；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48：443[1970]；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444[1988]；在Wisconsin遗传学软件包(Genetics ComputerGroup，Madison，WI)中的程序，例如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；和Devereux等，Nucl.Acid.Res.，12：387-395[1984])。

【060】例如，PILEUP是测定序列同源性水平的有用程序。PILEUP使用进行性的配对比对从一组相关序列中产生多重序列排比。它也可绘制树以显示用于产生比对的成簇关系。PILEUP使用Feng和Doolittle(Feng和Doolittle，J.MoI.Evol.，35：351-360[1987])所述的进行性比对方法的简化。所述方法类似于Higgins和Sharp(Higgins和Sharp，CABIOS5：151-153[1989])所述的方法。有用的PILEUP参数包括3.00的默认间距加权，0.10的默认间距长度加权和加权末端间距。有用算法的另一个实施例是BLAST算法，由Altschul等(Altschul等，J.Mol.Biol.，215：403-410，[1990]；和Karlin等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787[1993])描述。一个特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(见Altschul等，Meth.Enzymol.，266：460-480[1996])。参数“W”、“T”和“X”决定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用下述作为默认值：字长(wordlength，W)为11，BLOSUM62得分矩阵(见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915[1989])比对(alignments，B)为50，期望值(expectation，E)为10，M’5，N’-4和双链比较。

【061】如本文所使用，“核酸序列同源性百分比(％)”被定义为在候选序列中与序列核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分数。

【062】如本文所使用，术语“杂交”是指核酸链与互补链通过碱基配对结合的方法，如本领域已知。

【063】如本文所使用，短语“杂交条件”是指进行杂交反应的条件。这些条件通常通过测量杂交的条件的“严格”程度来分类。例如，严格程度可基于核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)。例如，“最大严格性”通常发生在约Tm-5℃(在探针的Tm以下5℃)；“高严格性”在Tm以下约5-10℃；“中度严格性”在探针的Tm以下约10-20℃；和“低严格性”在Tm以下约20-25℃。可选地或另外，杂交条件可基于杂交和/或一个或多个严格洗涤的盐或离子强度条件。例如，6×SSC＝极低严格性；3×SSC＝低至中度严格性；1×SSC＝中度严格性；和0.5×SSC＝高严格性。功能上，最大严格条件可被用于鉴定与所述杂交探针具有严格同源性或近严格同源性的核酸序列；而高严格条件用于鉴定与所述探针具有约80％或更高序列同源性的核酸序列。

【064】对于需要高度选择性的应用，通常期望使用相对严格的条件以形成杂种(例如，使用相对低的盐和/或高温条件)。

【065】短语“基本相似”和“基本相同”在至少两种核酸或多肽的上下文中，通常地是指多核苷酸或多肽包括如此序列，该序列与参考(即野生型)序列比较，具有至少约50％的同源性，更优选地至少约60％的同源性，仍更优选地至少约75％的同源性，更优选地至少约80％的同源性，还更优选地至少约90％，仍更优选地约95％，最优选地约97％的同源性，有时多达约98％和约99％的序列同源性。序列同源性可以使用已知程序例如BLAST、ALIGN和CLUSTAL使用标准参数来测定。(见例如，Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410[1990]；Henikoff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915[1989]；Karin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873[1993]；和Higgins等，Gene73：237-244[1988])。用于进行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心(the National Center for BiotechnologyInformation)是公众可利用的。此外，可使用FASTA(Pearson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444-2448[1988])搜索数据库。两种多肽基本相同的一种指标是第一种多肽与第二种多肽免疫交叉反应。通常地，通过保守氨基酸取代而不同的多肽是免疫交叉反应的。因此，例如，一种多肽与第二种多肽基本相同，其中两种肽的区别仅在于保守取代。两种核酸序列基本相同的另一指标在于两个分子在严格条件下(例如，在中至高严格范围内)互相杂交。

【066】如本文所使用，“等同残基”是指共有特定氨基酸残基的蛋白质。例如，对于已用X-射线晶体学测定三级结构蛋白质(例如，蛋白酶)，等同残基可通过测定三级结构水平下的同源性来鉴定。等同残基被定义为这样的残基：具有推定等同残基的蛋白质和感兴趣的蛋白质在比对后，它们的特定氨基酸残基的两个或多个主链原子的原子坐标在0.13nm内并且优选在0.1nm内。最佳模型已被定向和定位以给出所分析蛋白质的非氢蛋白质原子的原子坐标的最大重叠后，可得到比对。优选的模型是晶体学模型，其在可用的最高分辨率下给出实验衍射数据的最低R因子，这是使用晶体学和蛋白质表征/分析领域普通技术人员已知的方法测定的。

【067】术语“调控元件”于此使用是指控制核酸序列表达某些方面的遗传元件。例如，启动子是促进可操作连接的编码区转录起始的调控元件。另外的调控元件包括剪接信号、多腺苷酸化信号和终止信号。

【068】如本文所使用，“宿主细胞”通常是原核或真核宿主，其用使用本领域已知的重组DNA技术构建的载体转化或转染。转化的宿主细胞能够复制编码蛋白质变体的载体或表达期望的蛋白质变体。在编码前或前原形式的蛋白质变体的载体的情况下，此类变体当被表达时，通常从宿主细胞分泌至宿主细胞培养基中。

【069】术语“引入”在将核酸序列插入细胞中的上下文中，是指转化、转导或转染。转化方法包括但不限于本领域已知的任何适合方法，例如原生质体转化、氯化钙沉淀、电转化、裸DNA等等，如本领域已知。(见，Chang和Cohen，Mol.Gen.Genet.，168：111-115[1979]；Smith等，Appl.Env.Microbiol.，51：634[1986]；和Ferrari等的Harwood，Bacillus，Plenum Publishing Corporation，pp.57-72[1989]中的综述文章)。

【070】术语“启动子/增强子”表示包含能够提供启动子和增强子功能的序列的DNA片段。所述增强子/启动子可以是“内源”或“外源”或“异种”的。内源增强子/启动子是在基因组中与特定基因自然连接的增强子/启动子。外源(异种)增强子/启动子是通过遗传操作(即分子生物技术)并列于基因放置的增强子/启动子。

【071】在表达载体上“剪接信号”的存在通常引起重组转录体的较高水平表达。剪接信号调节内含子从一级RNA转录体的去除并由剪接供体和受体位点组成(Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York[1989]，pp.16.7-16.8)。

【072】术语“稳定转染”或“稳定地被转染”是指外源DNA引入和整合至被转染细胞的基因组中。术语“稳定转染体”是指已经将外来或外源DNA稳定地整合进转染细胞基因组DNA中的细胞。

【073】术语“可选择标记”或“可选择基因产物”于此使用是指编码酶活性的基因的用途，所述酶活性赋予可选择标记在其中表达的细胞抗抗生素或抗药物性。

【074】如本文所使用，术语“扩增”和“基因扩增”是指特定DNA序列被不成比例地复制以致于所扩增的基因变成以比最初存在于在基因组中更高的拷贝数存在。在某些实施方式中，存在药物时通过生长进行的细胞选择(例如，可抑制酶的抑制剂)导致编码在药物存在情况下生长所需的基因产物的内源基因的扩增，或编码这种基因产物的外源(即输入)序列的扩增，或两者均有。存在药物时通过生长进行的细胞选择(例如，可抑制酶的抑制剂)可导致编码在药物存在情况下生长所需的基因产物的内源基因的扩增，或编码这种基因产物的外源(即输入)序列的扩增，或两者均有。

【075】“扩增”是涉及模板特异性的核酸复制的特殊情况。其与非特异性模板复制(即，复制是模板依赖型的，但不依赖于特定模板)相反。模板特异性此处区别于复制保真度(即，适当的多核苷酸序列的合成)和核苷酸(核糖-或脱氧核糖-)特异性。模板特异性经常以“靶”特异性进行描述。在靶序列被寻求从其他核酸中挑选出来的意义上，该靶序列是“靶”。扩增技术被设计为主要用于这种挑选。

【076】如本文所使用，术语“共扩增”是指将可扩增标记与其他基因序列一起导入单个细胞中(即，包含一个或多个非选择性基因，例如包含在表达载体内的那些)并施加适当的选择压力以使细胞扩增可扩增标记和其他非选择性基因序列。所述可扩增标记可以被物理连接至其他基因序列，或可选地，两个分离的DNA片段——其中一个含有可扩增标记，另一个含有非选择性标记——可被引入同一细胞。

【077】如本文所使用，术语“可扩增标记”、“可扩增基因”和“扩增载体”是指标记、基因或载体，其编码的基因在适当的生长条件下允许扩增该基因。

【078】如本文所使用，术语“可扩增核酸”是指可以用任何扩增方法扩增的核酸。“可扩增核酸”通常将包括“样本模板”被考虑在内。

【079】如本文所使用，术语“样本模板”是指源于样本的核酸，其用于分析“靶”的存在(下面定义)。相反，“背景模板”用于指不是样本模板的核酸，其可以存在或可以不存在于样本中。背景模板通常不被注意。它可以是样本遗留的结果，或者可能是由于试图从样本中纯化去除的核酸污染物的存在而引起。例如，来自生物体而不是被检测的那些的核酸可在测试样本中作为背景存在。

【080】“模板特异性”在大多数扩增技术中通过酶的选择来获得。扩增酶是指在使用它们的条件下仅处理核酸异源混合物中特定核酸序列的酶。例如，在Qβ复制酶的情况下，MDV-1RNA是复制酶的特异性模板(见例如，Kacian等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：3038[1972])。其他核酸不能被这种扩增酶复制。相似地，在T7RNA聚合酶的情况下，这种扩增酶对其自身的启动子具有严格的特异性(见Chamberlin等，Nature228：227[1970])。在T4DNA连接酶的情况下，所述酶不会连接两个寡核苷酸或多核苷酸，其中在连接的接头处寡核苷酸或多核苷酸底物和模板之间存在错配(见，Wu和Wallace，Genomics 4：560[1989])。最终，Tag和Pfu聚合酶，由于它们在高温发挥功能的能力，被发现对所结合的序列显示出高特异性，并因此被引物限定；高温导致有利于引物与靶序列杂交而不与非靶序列杂交的热力学条件。

【081】如本文所使用，术语“引物”是指寡核苷酸，不论是作为纯化的限制酶切消化天然发生或合成产生地，当置于互补于核酸链的引物延伸产物的合成被诱导的条件下时(即，在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶存在下，和在适合的温度和pH下)，其能够作为合成的起始点。引物优选地是单链以实现最大的扩增效率，但是可以可选地是双链。如果是双链，引物在用于制备延伸产物之前，首先被处理以分离其链。优选地，所述引物是寡脱氧核苷酸。所述引物必须足够长以在诱导剂存在情况下引发延伸产物的合成。引物的准确长度依赖于多种因素，包括温度、引物来源和使用方法。

【082】如本文所使用，术语“探针”是指寡核苷酸(即，核苷酸序列)，不论作为纯化的限制酶切消化天然的发生或者是合成地、重组地或通过PCR扩增产生的，其能够与另一个感兴趣的寡核苷酸杂交。探针可以是单链或双链的。探针用于检测、鉴定和分离特定基因序列。预期的是本发明使用的任何探针都将用任何“报告分子”标记以便在任何检测系统中是可检测的，所述检测系统包括但不限于酶(例如，ELISA以及基于酶的组织化学分析)、荧光、放射性和发光系统。不意图将本发明限制于任何特定的检测系统或标记。

【083】如本文所使用，术语“靶”在关于扩增方法使用时(例如，聚合酶链反应)，是指与引物结合用于聚合酶链反应的核酸区域。因此，“靶”试图从其他核酸序列中挑选出来。“片段”被定义为在靶序列内的核酸区域。

【084】如本文所使用，术语“聚合酶链反应”(polymerase chainreaction，PCR)是指美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188——此处通过引用引入——的方法，其包括用于增加基因组DNA混合物中靶序列的片段浓度而无需克隆或纯化的方法。这种用于扩增靶序列的方法包括引入过量很多的两种寡核苷酸引物至包含期望靶序列的DNA混合物，随后在DNA聚合酶存在下进行准确顺序的热循环。所述两种引物与它们双链靶序列的各自链互补。为实现扩增，混合物被变性，并且引物随后被退火至其靶分子内的互补序列。在退火后，所述引物用聚合酶延伸，以形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可被重复多次(即，变性、退火和延伸组成一个“循环”；可以有许多“循环”)，以得到期望靶序列的高浓度扩增片段。期望的靶序列扩增片段的长度由引物相对于彼此的相对位置决定，因此，该长度是可控参数。基于所述方法的重复方面，该方法被称为“聚合酶链反应”(下文中“PCR”)。因为靶序列的期望扩增片段在混合物中成为主要的序列(根据浓度)，因此它们被称为是“PCR扩增的”。

【085】如本文所使用，术语“扩增试剂”是指除引物、核酸模板和扩增酶外扩增所需的那些试剂(脱氧核苷酸三磷酸、缓冲液等)。通常地，扩增试剂与其他反应成分一起被放置并包含在反应容器中(测试管、微孔等)。

【086】利用PCR，通过几种不同方法可能将基因组DNA特定靶序列的单拷贝扩增至可检测水平(例如，与标记探针杂交；引入生物素化引物，随后是抗生物素蛋白-酶偶联检测；引入³²P-标记的脱氧核苷酸三磷酸例如dCTP或dATP至所扩增的片段中)。除了基因组DNA，任何寡核苷酸或多核苷酸序列也可用适当的引物分子组扩增。特别地，通过PCR方法本身产生的扩增片段自身就是随后PCR扩增的有效模板。

【087】如本文所使用，术语“PCR产物”、“PCR片段”和“扩增产物”是指包括变性、退火和延伸的PCR步骤的两个或更多循环完成后所得到的化合物的混合物。这些术语包括一个或多个靶序列的一个或多个片段已被扩增的情况。

【088】如本文所使用，术语“限制内切酶”和“限制酶”是指细菌酶，其中每种在特定核苷酸序列处或其附近切割双链DNA。

【089】如本文所使用，“表面性质”被用于指静电荷以及诸如由蛋白质表面显示的疏水性和/或亲水性等性质。

【090】如本文所使用，“洗涤剂组合物”和“洗涤剂配方”用于指意图用在清洁污染物体的洗涤介质中的混合物。在优选的实施方式中，该术语用于指用于清洁盘碟、刀具等的洗涤剂(例如“餐具洗涤用洗涤剂”)。不意图将本发明限制于任何特定的洗涤剂配方或组合物。事实上，意图除了含有至少一种本发明蛋白酶的洗涤剂之外，该术语还包括含下述物质的洗涤剂：表面活性剂、转移酶(多种转移酶)、水解酶、氧化还原酶、增效助剂、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂和荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶活化剂、抗氧化剂和增溶剂。

【091】如本文所使用，“餐具洗涤组合物”是指用于清洁包括刀具在内的餐具的所有形式的组合物，包括但不限于颗粒和液体形式。不意图将本发明限制于任何特定类型或餐具组合物。事实上，本发明在清洁任何材料的餐具(例如盘碟，包括但不限于碟子、酒杯、玻璃杯、碗等)和刀具(例如厨房用具，包括但不限于汤匙、刀、叉、服务用具等)中发现用途，所述材料包括但不限于陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃、丙烯酸树脂等。术语“餐具”于此被用于指盘碟和刀具。

【092】如本文所使用，突变型蛋白酶的“洗涤性能”是指突变型蛋白酶对餐具洗涤的作用，其对没有将突变型蛋白酶添加至组合物中的洗涤剂提供额外清洁性能。洗涤性能在相关洗涤条件下进行比较。

【093】术语“相关洗涤条件”此处用于表示在洗涤剂市场部分在家庭中实际应用的条件，特别是洗涤温度、时间、洗涤机械、泡沫浓度(sudconcentration)、洗涤剂类型和水的硬度。

【094】术语“改进的洗涤性能”用于表示在相关洗涤条件下在去除餐具和/或刀具污迹方面获得更好的最终效果，或者相对于相应的野生型酶获得同样的最终结果，需要基于重量基础较少的突变型蛋白酶。

【095】术语“保持的洗涤性能”用于表示突变型蛋白酶的洗涤性能，在相关洗涤条件下基于重量基础至少为相对于相应的野生型酶的80％。

【096】蛋白酶的洗涤性能是通过它们在适当测试条件下去除某些代表性污迹的能力来方便地测量。在这些测试系统中，其它相关因素，如洗涤剂组合物、泡沫浓度、水的硬度、洗涤机械、时间、pH和/或温度，可以以模仿某一市场部分典型家庭应用条件的方式来控制。当用于通过DNA诱变修饰的蛋白水解酶上时，描述于此的实验室应用测试系统是代表性的家庭应用。因此，于此提供的方法促进对大量不同酶的测试和对特别地适合于特定类型的洗涤剂应用的那些酶的选择。以这种方式，用于特定应用条件的“定制的”(tailor made)酶是容易选择的。

【097】如本文所使用，术语“消毒”是指从表面去除污染物，以及抑制或杀死物品表面上的微生物。不意图将本发明限制于任何特定的表面、物品或被去除的污染物(多种污染物)或微生物。

【098】某些细菌丝氨酸蛋白酶被称为“枯草杆菌蛋白酶”。枯草杆菌蛋白酶包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)(“枯草杆菌蛋白酶BPN”)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)(“枯草杆菌蛋白酶Carlsberg＂)的丝氨酸蛋白酶(见例如，Markland和Smith，在Boyer(ed.)，Enzymes，The(Boyer，ed.)vol.3，pp.561-608，Academic Press，New York，[1971])。杆菌菌株例如嗜碱杆菌菌株产生其他蛋白酶。近来种类的实例包括诸如MAXACAL蛋白酶(于此也被称为“PB92蛋白酶”，分离自杆菌nov.spec.PB92)和SAVINASE

蛋白酶的丝氨酸蛋白酶。另外的蛋白酶包括但不限于PROPERASE

蛋白酶。

【099】PB92蛋白酶的氨基酸(SEQ ID NO：2)和DNA序列(SEQ IDNO：1)显示于图2中。成熟蛋白酶由269个氨基酸组成，分子量为约27,000道尔顿，等电点在高碱范围内。PB92蛋白酶对蛋白质底物的活性用碱性德尔夫特单位表达(Alkaline Delft Units，ADU)。ADU活性根据英国专利说明书号1,353,317中描述方法测定，除pH从8.5改变至10.0之外。纯化PB92蛋白酶具有的活性为21,000ADU/mg。在酪蛋白上测量的转换数(^kcat(催化常数))为90sec^-1mol^-1。

【0100】枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的纯化制备物的比活性(见，Delange和Smith，J.Biol.Chem.，243：2184[1968])等于10,000ADU/mg；枯草杆菌蛋白酶BPN′(Matsubara等，J.Biol.Chem.，240：1125[1965])的为7,000ADU/mg。除了上述参数如比活性和转换数(^kcat)，PB92蛋白酶本身区别于像Carlsberg枯草杆菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶BPN′和在洗涤剂中配制的其他蛋白酶(例如MAXATASE

和ALCALASE

)之类的蛋白酶，PB92蛋白酶带有高正电荷，其可通过天然蛋白质的凝胶电泳显现。

【0101】由于PB92蛋白酶在碱性pH值下在污迹去除方面具有活性，因此其通常用于洗涤剂添加剂，与洗涤剂成分如表面活性剂、增效助剂和氧化剂一起使用。后面的试剂大多数以粉末形式使用。与其他蛋白酶如前述的枯草杆菌蛋白酶相比，PB92蛋白酶具有高的污迹去除效率。这意味着获得相同的洗涤性能只需较少的PB92蛋白酶。对氧化敏感是PB92蛋白酶和所有用于洗涤剂应用的其他已知丝氨酸蛋白酶的重要缺点(见例如，Stauffer等，J.Biol.Chem.，244：5333-5338[1969]；和Estell等，J.Biol.Chem.，263：6518-6521[1985])。由于含有过硼酸盐-四水合物和TAED的活化剂系统产生的H₂O₂或过酸引起的PB92蛋白酶的氧化，产生相比非氧化PB92蛋白酶，基于ADU/mg比活性分别为50％和10％的酶。

【0102】本发明提供用于生产、筛选和选择衍生自天然产生的细菌丝氨酸蛋白酶的突变型蛋白水解酶的方法和组合物。此类突变体例如是通过源自嗜碱杆菌菌株野生型基因的基因编码的那些。在大多数优选的实施方式中，所述菌株是PB92。

【0103】但是，源自嗜碱杆菌丝氨酸蛋白酶SAVINASE

的突变体是适合的。本发明还在选择源自蛋白酶而不是来自嗜碱杆菌菌株PB92的丝氨酸蛋白酶的修饰的蛋白酶方面发现用途。例如，编码枯草芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的丝氨酸蛋白酶的基因是已知的并且可被用作诱变的靶标。但是，不意图将本发明限制于任何特定方法，因为任何适合的诱变方法在本发明中发现用途，其包括但不限于寡核苷酸-辅助的位点定向诱变，或区域定向的随机诱变。

【0104】在某些优选的实施方式中，本发明提供的用于选择突变型蛋白水解酶的方法——包括生产和筛选，包括如下步骤：诱变编码感兴趣蛋白水解酶或其片段的克隆基因；分离所得到的突变型蛋白酶基因或多个基因；引入优选在适合的载体上的突变型蛋白酶基因或多个基因至适合的宿主菌株中用于表达和生产；回收所产生的突变型蛋白酶；和鉴定那些具有改进的性质用于洗涤剂应用的突变型蛋白酶。

【0105】用于产生突变型蛋白酶的适合宿主菌株包括可转化的微生物，在该微生物中可实现蛋白酶的表达。具体而言，衍生蛋白酶的相同种或属的所有宿主菌株是适合的，例如杆菌菌株，优选嗜碱杆菌菌株和最优选杆菌nov.spec.PB92或其突变体，它们具有基本相同的性质。此外，枯草芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌株在优选的菌株内。其他适合的和优选的宿主菌株包括那些在用突变体基因转化之前基本不能够产生细胞外蛋白水解酶的菌株。特别感兴趣的是蛋白酶缺陷型杆菌宿主菌株，例如杆菌nov.spec.PB92的蛋白酶缺陷型衍生物。蛋白酶的表达通过使用在被选择的宿主生物体内起作用的表达信号来实现。表达信号包括调控蛋白酶基因转录和翻译的DNA序列。在选择的宿主菌株中适当的载体能够以充分高的拷贝数复制，或通过染色体整合能够实现蛋白酶基因在宿主菌株中的稳定保持。

【0106】根据本发明的突变型蛋白水解酶通过在适当的发酵条件下培养包含期望突变型蛋白水解基因或多个基因的转化宿主菌株，以及回收所生产的酶而制备。

【0107】优选地，被表达的蛋白酶被分泌至培养基中，这促进它们的回收，或在革兰氏阴性细菌情况下，宿主菌株进入外周胞质空间。对于分泌，使用适合的氨基末端信号序列，优选地，如果在选择的宿主菌株中是可操作的(functional)，所述信号序列由原始基因编码。

【0108】在某些实施方式中，自然发生或天然突变的洗涤剂蛋白酶的性质通过在酶中引入多种突变来增强。很大程度上，所述突变是保守或非保守置换，虽然缺失和插入在某些实施方式中也得到应用。

【0109】关于保守置换，如下表得到应用：

脂肪族

中性

非极性(G、A、P、L、I、V)

极性(C、M、S、T、N、Q)

带电的

带负电(D、E)

带正电(K、R)

芳香族

(F、H、W、Y)

其中任何氨基酸可用同一种类的任何其他氨基酸取代，特别是在同一行上的。另外，极性氨基酸N、Q可取代或被取代为带电的氨基酸。用于本发明的目的，特别是在不直接涉及活性位点的位点处，导致蛋白酶带负电特征增加的置换是特别感兴趣的。

【0110】特别感兴趣的突变区域是当Eglin C与活性位点结合时，那些距离抑制剂分子Eglin C在4距离内的氨基酸。

【0111】下列编号基于PB92蛋白酶，但考虑因素与其他具有基本同源结构的丝氨酸蛋白酶有关，特别是那些具有大于约70％的同源性，更特别地是，具有大于约90％的同源性的丝氨酸蛋白酶。特定感兴趣的位置包括32、33、48-5458-62、94-107、116、123-133、150、152-156、158-161、164、169、175-186、197、198、203-216(PB92编号)，因为这些位置的大部分是可用于与蛋白质类底物直接相互作用。通常地，在位置32、62、153和215的氨基酸不被取代，因为在这些位点的突变趋向于降低洗涤性能。在某些最特别优选的实施方式中，突变在位置116、126、127和128(PB92编号)上进行。在可选的实施方式中，另外的突变在位置160上进行。

【0112】在进一步实施方式中，特别感兴趣的置换位置包括60、94、97-102、105、116、123-128、150、152、160、183、203、211、212、213、214和216(PB92编号)。在某些位置，所述置换将不稳定的氨基酸(例如甲硫氨酸)改变成氧化更稳定的氨基酸(例如苏氨酸)，同时保持在其位点处氨基酸的一般构象和体积。在某些其他实施方式中，用几乎任何其他氨基酸置换天然氨基酸，获得改进的结果，特别是在其中羟基化氨基酸S和/或T被置换成极性或非极性氨基酸或甚至芳香族氨基酸的取代中。

【0113】在某些最特别优选的实施方式中，取代包括(PB92编号)：

G116 I、V、L

S126 任何氨基酸P127任何氨基酸S128任何氨基酸

S160 带负电或中性脂肪族或R

A166 带电的，特别是带负电

M169 中性脂肪族，优选非极性

N212 带负电

M216 脂肪族极性，特别是S、T、N、Q

【0114】令人惊讶的是，尽管许多突变导致蛋白酶对普通底物的较低比活性，但是相对于天然酶，洗涤性能是相当的或增强的，并在许多情况下，储存稳定性得以改进。另外，某些PB92突变型蛋白酶的洗涤性能，与天然的PB92蛋白酶相比，发现为约120％至约180％。因此，本发明提供与天然的蛋白酶相比，具有许多改进性能的变体蛋白酶。

【0115】在某些实施方式中，几种突变组合以增加洗涤剂组合物中蛋白酶的稳定性。正面影响相同蛋白酶洗涤的几种突变可以被组合成能够产生可能更进一步改进的蛋白酶的单一突变型蛋白酶基因(例如，S126M、P127A、S128G、S160D和G116V、S126N、P127S、S128A、S160D；PB92编号)。通过将例如G116V和S160D的优良洗涤性能与其他突变(PB92编号)的稳定性性质结合，提供另外的蛋白酶突变体。

【0116】可用的突变体还通过组合于此描述的任何突变或突变组来提供。在另外的实施方式中，于此具体提供的有用的突变与在其他位点的突变组合。在某些实施方式中，这些组合导致酶性质的基本改变，而在其他实施方式中，改变较不重要。

【0117】本发明还包括如本文定义的一种或多种突变型蛋白水解酶在洗涤剂组合物(多个组合物)和/或洗涤过程(多个洗涤过程)中的用途。最后，应明确，通过氨基酸在蛋白酶多肽链中的缺失或插入——或者通过诱变人工建立或在与PB92蛋白酶同源的蛋白酶中自然发生，氨基酸编号可以改变。但是，应当理解，与PB92蛋白酶的氨基酸位置同源的位置应落入权利要求的范围内。

实验

【0118】提供下述实施例，用以显示并进一步说明本发明某些优选的实施方式和方面，并且其不被解释为限制其范围。

【0119】在下述实验公开中，应用下述缩写：℃(摄氏度)；rpm(每分钟转数)；H₂O(水)；HCl(盐酸)；aa(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；gm(克)；μg和ug(微克)；mg(毫克)；ng(纳克)；μl和ul(微升)；ml(毫升)；mm(毫米)；nm(纳米)；μm和um(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM和uM(微摩尔)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟)；hr(s)(小时)；MgCl₂(氯化镁)；NaCl(氯化钠)；OD₂₈₀(280nm处的光密度)；OD₆₀₀(600nm处的光密度)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；EtOH(乙醇)；PBS(磷酸缓冲盐溶液[150mM NaCl、10mM磷酸钠缓冲液，pH值7.2])；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)；TAED(N，N，N′N′-四乙酰乙二胺)；w/v(重量体积比)；v/v(体积体积比)；MS(质谱分析)；TIGR(基因组研究所，Rockville，MD)；AATCC(美国纺织和染色化学家协会)；SR(污垢或污迹去除)；WFK(wfkT estgewebe GmbH，Bruggen-Bracht，德国)；Amersham(Amersham Life Science，Inc.ArlingtonHeights，IL)；ICN(ICN Pharmaceuticals，Inc.，Costa Mesa，CA)；Pierce(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)；Amicon(Amicon Inc.，Beverly，MA)；ATCC(美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)；Amersham(AmershamBioscience，Inc.，Piscataway，NJ)；Becton Dickinson(Becton DickinsonLabware，Lincoln Park，NJ)；BioRad(BioRad，Richmond，CA)；Clontech(CLONTECH Laboratories，Palo Alto，CA)；Difco(Difco Laboratories，Detroit，MI)；GIBCO BRL或Gibco BRL(Life Technologies，Gaithersburg，MD)；Novagen(Novagen，Inc.，Madison，WI)；Qiagen(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)；Invitrogen(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)；Finnzymes(Finnzymes Oy，Espoo，芬兰)；Macherey-Nagel(Macherey-Nagel，Easton，PA)；Merieux(Instirut Merieux，Codex，FR)；Kelco(CP Kelco，Atlanta，GA)；Genaissance(Genaissance Pharmaceuticals，Inc.，New Haven，CT)；DNA2.0(DNA2.0，Menlo Park，CA)；MIDI(MIDI Labs，Newark，DE)；InvivoGen(InvivoGen，San Diego，CA)Sigma(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)；Sorvall(Sorvall Instruments，DuPont Co.，Biotechnology Systems子公司，Wilmington，DE)；Stratagene(Stratagene Cloning System，La Jolla，CA)；Roche(Hoffmann La Roche，Inc.，Nutley，NJ)；Agilent(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)；Minolta(Konica Minolta，Ramsey，NJ)；Zeiss(Carl Zeiss，Inc.，Thornwood，NY)；Henkel(Henkel，GmbH，Dusseldorf，德国)；Cognis(Cognis Corp，USA，Cincinnati，OH)；Finnzymes(Finnzymes Oy，Espoo，芬兰)；Reckitt Benckiser，Berks，英国)；BASF(BASF Corp.，Florham Park，NJ)；IKW(Industrieverband und Waschmittel，Frankfurt，德国)；和WFK(Testgewebe GmbH，Brüggen-Bracht，德国)。

【0120】一些餐具洗涤实验中所用的含有3.00mmol Ca+Mg(16.8d)的合成水如下制备。首先，制备三种储液。溶液1是800mmol/l NaHCO₃(67.2g/l)；溶液2是154.2mmol/l MgSO₄*7H₂O(38.0g/l)；和溶液3是446.1mmol/l CaCl₂*2H₂O(65.6g/l)。制备溶液后，将储液1、2和3每种50ml置于含有7L脱矿质水的容器中，并随后用另外的脱矿质水填充容器至10L。使用前，用HCl或NaOH将合成水的pH值调整至7.5。

【0121】下面的表(表1)提供在本发明开发过程中产生和测试的突变体。在此表中，为方便起见，同时提供BPN′和PB92编号。

【0122】在表1中，所有菌株使用实施例所述方法生产并表征。用星号(*)表明的菌株如EP 0 571 049 B1(见，实施例1A-C)所述制备。所有其他变体如实施例1D所述制备。

【0122】在表1中，所有菌株使用实施例所述方法生产并表征。用星号(*)表明的菌株如EP 0 571 049 B1(见，实施例1A-C)所述制备。其他所有变体如实施例1D所述制备。

实施例1

PB92蛋白酶突变体的构建

【0123】在该实施例中，描述了用于构建本文提供的一些PB92突变体的方法。诱变工作起始的基本构建物被称为“pM58”，其在EP 0283075和EP 571049中描述。所遵循的策略包括三个阶段：

A.诱变载体13M1的构建

B.突变步骤

C.pM58Eco构建和突变DNA片段在载体中的亚克隆

【0124】另外，部分D(“PB92变体的生产”)包括对发现可用于本发明的各种PB92变体构建的描述。

A.诱变载体M13M1的构建

【0125】基本构建物pM58用限制酶HpaI和BalI消化。含PB92蛋白酶基因的1400bp片段在低熔点琼脂糖上纯化，这在本领域是已知的。载体M13MP11(见Messing等，Nucl.Acids Res.，9：303-321[1981])用SmaI消化。感兴趣的1400bp DNA片段被连接至该载体中并转染至大肠杆菌(E.coli)JM101中，使用本领域已知方法(见Cohen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：2110-2114[1972])。

【0126】在大肠杆菌JM101中噬菌体增殖后，使用本领域已知方法(见Heidecker等，Gene 10：69-73[1980])分离ssDNA，并且插入片段及其定向使用Sanger DNA测序来检查(见Sanger，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：6463[1977])。适于诱变的载体获得并命名为“M13M1”。上述步骤被示意性描绘于图1A中。

B.突变步骤

【0127】使用M13M1载体的ssDNA和M13mp19的dsDNA(Messing等，Nucl.Acids Res.，9：303-321[1988])在M13M1上进行诱变，M13mp19载体用限制酶EcoRI和HindIII消化，随后在低熔点琼脂糖上纯化大片段。

【0128】如本领域已知进行诱变(见，Kramer等，Nucl.AcidsRes.，12：9441-9456[1984])，其中的修饰在于使用大肠杆菌JM105而不是大肠杆菌WK30-3来选择突变体。

【0129】用于产生特定突变的寡核苷酸长度是22个核苷酸。此时用于在特定DNA序列中产生几个突变的区域特定突变，使用长度为40个核苷酸的寡核苷酸制备物进行，其所有四个核苷酸被随机引入对应于被突变的氨基酸的位点(多个位点)上。

【0130】诱变后，利用Sanger双脱氧方法(见上述Sanger)通过序列分析检查潜在突变体的相关突变。全部单链缺口(见图1B)被测序以确定不存在二级突变。步骤示意性显示在图1B中。

【0131】所述步骤用于产生在蛋白酶基因的3′部分(氨基酸154-269)具有突变的DNA片段。

【0132】但是，不意图将本发明限制于这些特定方法，因为本领域已知的任何适合方法都将得到应用。实际上，本领域普通技术人员认识到为了在杆菌载体中产生在蛋白酶基因的5′部分具有突变的DNA片段，可选的限制酶和修饰的PB92蛋白酶基因在类似于图1A所示方法的构建方法中得到应用。

C.pM58Eco的构建和在载体中包含突变的DNA片段的亚克隆

【0133】为构建pM58Eco，在稀释条件下，pM58用限制酶EcoRI消化并用T4连接酶连接，如本领域已知的。使用本领域已知方法(见，Spizizen等，J.Bacterid.，81：741-746[1961])，将连接混合物用于转化枯草杆菌1-A40(Bacillus Genetic Stock Centre，Ohio)。

【0134】来自转化混合物的细胞被植板在含20g/ml新霉素的最小平板上，如本领域已知(见EP 0283075实施例1)。

【0135】转化体的质粒DNA使用本领域已知方法分离(见Birnboim和Doly，Nucl.Acids Res.，7：1513-1523[1979])并使用限制酶分析表征。因此，以这种方式，分离pM58Eco(见图1C)。

【0136】为产生突变型酶，如上面B部分所述产生的包含期望突变的M13M1的DNA片段被亚克隆至pM58Eco中。随后，M13M1(如上所述)的双链DNA(double-stranded DNA，dsDNA)用EcoRI消化并连接至pM58Eco的EcoRI位点。使用本领域已知方法(见上述Spizizen等)，连接混合物被用于转化枯草杆菌DB104(见，Doi，J.Bacteriol.，160：442-444[1984])。

【0137】来自转化混合物的细胞被植板在含20g/ml新霉素和0.4％酪蛋白的最小平板上，如已知本领域(见EP 0283075)。产生蛋白酶的转化体的DNA如本领域已知(见上述Birnboim和Doly)进行分离并用限制酶分析来表征。

D.PB982变体的产生

【0138】标定为从053到060的PB92变体通过融合PCR制备，如本领域已知所述(见例如美国专利申请序列号10/541,737，通过参考以其全部引入)。下表提供如本文所述的用于融合PCR的引物序列。

【0139】Phusion^TM聚合酶(Finnzymes)用于这些PCR反应。在这些实验中，2μl 10mM正向和反向引物、1μl 10mM dNTP’s、5μl 10×HFPhusion缓冲液、1.5μl DMSO和1μl模板加至50μl的体积中。使用如下程序：在95℃变性3分钟、在65℃退火1分钟和在72℃延伸1分15秒，进行30个循环，随后在72℃7分钟。完成后，反应产物储存于室温下。

【0140】标定为“047/048”的突变体被用作模板以开发突变体053至058。BglII-Fw引物与118V-Rv组合，并且第二段片段通过使BglII-Rv引物与128-130-Fw引物组合来制备。在057的情况下，BglII-Fw/S166D-Rv和BglII-Rv/S166D-Fw组合。

【0141】另外，突变体“051/052”被用作模板以产生突变体059和060。引物126-up-Rv与BglII-Fw组合，而BglII-Rv与128-130Fw引物组合。

【0142】预期大小的片段利用来自Macherey-Nagel的PCR纯化柱从琼脂糖凝胶上纯化。正确片段使用Phusion^TM聚合酶与BglII引物融合并扩增，并使用如下程序：在95℃变性时间为3分钟、在65℃退火1分钟和在72℃延伸2分钟，进行25个循环，随后在72℃7分钟。完成后，反应产物储存于室温下。

【0143】片段用BglII消化，从琼脂糖凝胶上纯化，并在14℃下与40μl体积中的1μl T4 DNA连接酶、8μl 5×T4连接缓冲液连接过夜，使用本领域已知方法。

【0144】枯草杆菌BG3594comK高度可转化的菌株用于获得蛋白酶阳性转化体。如上所述获得的表达载体用10μl的连接产物转化。感受态枯草杆菌细胞，BG3594comK，用实施例1所述的表达质粒转化。通过在木糖诱导启动子的控制下诱导comK基因使细菌成为感受态(见例如，Hahn等，Mol.Microbiol.，21：763-775[1996])。蛋白酶阳性克隆被选择、分离、测序并转化成如实施例2所述的克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)PBT125。

实施例2

在克劳氏芽孢杆菌表达的突变体

【0145】在该实施例中，提供方法，用于开发在使用实施例1所述的表达转化的克劳氏芽孢杆菌PBT125中表达的突变型蛋白酶。这种菌株是PBT110的蛋白酶阴性衍生物，其使用经典菌株改进方法，随后筛选不产芽孢性(asporogenity)和改进的蛋白酶产生，而从菌株PB92获得。

PB92蛋白酶阴性衍生物——PBT125——的转化步骤

【0146】本领域已知的Chang和Cohen(见例如，Chang和Cohen，MoI.Gen.Genet.，168：111-115[1979])的聚乙二醇诱导的原生质体转化方法，伴随如下修饰，被用于转化带有实施例1所述表达载体的克劳氏芽孢杆菌PBT125。首先，原生质体在碱保持培养基(alkaline holding medium)中制备，该碱保持培养基含有0.5M蔗糖、0.02M MgCl₂和0.02M Tris-马来酸缓冲液(pH值8.0)，向其中加入每毫升0.4mg的溶菌酶。然后，原生质体被沉淀并悬浮于5ml碱保持培养基中，向其中加入3.5％(wt/vol)Bacto-Penassay(Difco)液体培养基和0.04％白蛋白(Merieux)。转化的原生质体在修饰的DM3(5)平板上重新产生，该修饰的DM3(5)平板包含溶于750ml H₂O中的8.0g

结冷胶(Kelco)、0.3g CaCl₂·2H₂O、4.06g MgCl₂·H₂O、5.0g N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液(Sigma)、5.0g酪蛋白氨基酸、5g酵母提取物、1.5ml4M NaOH，并在灭菌后与250ml 2M蔗糖和10ml 50％(wt/vol)葡萄糖、1ml白蛋白(Merieux)、10mg硫胺素、5mg生物素和50mg新霉素混合。平板在大约70℃倾倒。如本领域已知进行感受态克劳氏芽孢杆菌细胞的转化(见例如，Tanaka，＂Construction of Bacillus subtilis Plasmid and Molecular Cloning in Bacillussubtilis，＂于D.Schlesinger(ed.)，Microbiology.American Society forMicrobiology，Washington，D.C.，pp.15-18，[1982]))。

发酵条件和蛋白酶产生

【0147】克劳氏芽孢杆菌PBT125在6或3升发酵罐中于培养基中发酵，所述培养基含有每升22克酵母(基于干物质)、每升5g K₂HPO₄·3H₂O、每升0.05g MgSO₄·7H₂O、每升0.05g CaCl₂、每升0.005g FeSO₄·7H₂O和每升0.05g MnSO₄·4H₂O。培养基成分溶解在90％的终体积中并在pH7.0、120℃的温度下灭菌1小时。接种培养物通过用克劳氏芽孢杆菌PBT125接种至100ml TSB中获得；灭菌后，4ml 1M碳酸钠溶液从斜管中加入。接种培养物在振荡设备上于37℃培养24小时。在37℃、pH8.0下，培养基用每100体积培养基1体积的接种培养物接种。主要发酵在37℃于搅拌发酵罐中进行，该搅拌发酵罐配备控制pH、温度和发泡的设备以及用于连续测量溶解氧浓度和氧摄取率的设备。接种后17小时，在120℃消毒1小时的30％葡萄糖溶液被增加至终浓度为每升培养基30g葡萄糖。

【0148】培养液以11,800×g旋转30分钟。上清液通过在Buchner漏斗中的Whatman玻璃纤维滤器和0.8um滤器过滤，随后利用纤维素垫过滤。所得物质储存在4℃直至使用。下一步，所述物质用Pall UF过滤装置浓缩，其中滤器截留物为10kDa。所产生的UF浓缩物通过添加丙二醇和甲酸钠来配制。甲酸用于将pH调为6.0。

实施例3

测定纯化蛋白酶纯度的分析技术

【0149】在这项实施例中，用于测定纯化蛋白酶纯度的方法被描述。当分别通过电泳和高效凝胶电泳法(high performance gel electrophoresis，HPLC)发现单条带或单峰时，蛋白酶被认为是纯的。

【0150】聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel-electrophoresis，PAGE)在十二烷基硫酸钠(SDS)存在下进行，如本领域已知(见Laemmli，Nature，227：680-685[1970])。但是，蛋白质样本在100℃通过SDS变性之前，蛋白酶活性的失活是必需的，以防止自体降解。这是通过与苯甲基磺酰氟(PMSF)(1mM，30分钟，室温)温育或用三氯乙酸(TCA，8％，30分钟，冰上)沉淀来完成。天然PAGE在pH7.45下进行(凝胶缓冲液由在5％聚丙烯酰胺凝胶中(丙烯酰胺：双丙烯酰胺的比率为20:1)中20mM组氨酸(His)和50mM 3-[N-吗啉基]丙磺酸(MOPS)组成)。蛋白质样本被加样于板凝胶的上部，并且向阴极电泳。相同的5His/MOPS缓冲液被用于电泳(槽)缓冲液，但在pH6.3下进行。电泳后(在350V1-2h)，将凝胶浸泡在8％乙酸中以固定凝胶中的蛋白质，并随后考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)R250染色并脱色，如本领域已知。

【0151】通过HPLC的纯度检查使用阳离子交换柱(MonoS；Pharmacia)和凝胶过滤柱(TSK 2000；SW-LKB)。前者在10mM磷酸钠缓冲液pH5.5下运行。结合蛋白酶的洗脱使用10-300mM磷酸钠线性梯度，pH5.5获得。凝胶过滤柱在0.25M醋酸钠pH5.5运行。

实施例4

蛋白酶浓度的测定

【0152】在这项实施例中，用于测定蛋白酶浓度的方法被描述。在一些实验中，使用计算的消光系数(_M)进行280nm处的消光测量，并且活化位点滴定用于测定在纯化蛋白酶溶液中的蛋白质浓度，如下文所述。在另外的实验中，使用在美国专利申请序列号11/011,666——因此引入其全部作为参考——中提出的方法。

【0153】在280nm的消光系数从每个酶分子的色氨酸数量(_M＝5,600M^-1.cm^-1)和酪氨酸数量(_M＝1,330M^-1.cm^-1)计算。对于PB92蛋白酶，_M是26,100M^-1.cm^-1(3个Trp，7个Tyr残基)被使用，等同于^E11^％cm，在280nm测定＝9.7(M_r＝26,729Da)。在具有改变数目的色氨酸残基和酪氨酸残基的突变型的情况下，相应地进行校正。

【0154】活化酶分子数目的估计用活化位点滴定获得。由于广泛使用的方法用N-反肉桂酰基咪唑(见Bender等，J.Am.Chem.Soc，88：5890-5931[1966])证明不能令人满意地用于PB92蛋白酶，所以使用PMSF的方法代替被发展。

【0155】在这种方法中，具有估计的酶浓度(来自280nm的吸收)的蛋白酶溶液分别与0.25、0.50、0.75、1.00和1.25当量的PMSF混合，并使其在室温下于10mM磷酸钠pH6.5中反应一小时。酶浓度必须至少是50M。

【0156】残余活性使用琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯丙酰-对硝基苯胺(sAAPFpNA)作为底物进行分光光度测定。PMSF的纯度(因而是浓度)用NMR-光谱测定，并且储备溶液在异丙醇中制造。活性位点滴定的结果被发现与用HPLC的纯度检测的结果一致。

实施例5

野生型和突变型蛋白酶动力学参数的测定

【0157】在这项实施例中，用于测定野生型和突变型蛋白酶动力学参数的方法被描述。

【0158】对蛋白质底物(酪蛋白)活性的测定在pH10.0下测量，如英国专利说明书1,353,317所述(以ADU′s＝碱性德尔夫特单位(AlkalineDelft Units)表示)。

【0159】以酪蛋白为底物的转换数在恒pH下测量。恒pH的反应室(Radiometer，Copenhagen)含有具有50mg酪蛋白(Hammerstein，Merck)的10ml 0.1M KCl。通过PB92蛋白酶酪蛋白水解时释放的质子用10mMNaOH滴定，同时pH保持在10.0(在40℃和氮气流下)。

【0160】使用sAAPFpNA测量合成肽活性。形成的对硝基苯胺(黄色)(pNA)使用本领域已知方法在410nm：M＝8,480M^-1.cm^-1进行分光光度测量(见，Delmar等，Anal.Biochem.，94：316-320[1979])，使用UVIKON 860(KONTRON)分光光度计，其配备有恒温器控制的6位置池转换器(cell changer)。动力学参数kcat和Km是从在各种底物浓度(对PB92蛋白酶而言，0.1-6.0mM)下测量初始速率和通过非线性回归使用多元割线迭代方法拟合数据与双曲函数而获得。然后计算特异性常数kcat/km。测量在25℃在包含0.1M TRIS-HCl+0.1M NaCl pH8.6的1ml终体积中进行。氯化钠是必要的，因为缺少它时，PB92蛋白酶显示非线性Lineweaver-Burk绘图，其可能由于底物抑制而引起。底物最初溶解在DMSO中以达到浓度为200mM，随后用0.1M TRIS-HCl pH8.6稀释以给出20mM的储备溶液浓度(在315nm分光光度测定；M＝14,000M^-1.cm^-1)。对不同浓度的DMSO没有进行校正(0.05-3.0％V/V)。

实施例6

洗涤性能测试

【0161】在这项实施例中，描述了方法，其用于使用商业可得的餐具洗涤剂测定在餐具洗涤应用中PB92蛋白酶突变体和商业可得的PROPERASE

丝氨酸蛋白酶的洗涤性能。

【0162】在这项实施例中，PB92变体(049：G116V、S126I、P127Q、S128A；和046：G116V、S126I、P127Q、S128A、S160D；PB92编号)在各种条件下被测试。所述餐具洗涤剂的组成提供如下。这些洗涤剂是从WFK商业可得的，并且由以下提供的名称指代。每种污迹类型的方案(碎肉、蛋黄和带牛奶的蛋黄)提供如下。在个别污垢类型可用于测试餐具之前，所述餐具必须彻底清洗。这是特别必要的，因为某些持久污迹的残余仍有可能存在于来自以前测试的餐具上。在第一次用于测试前，新的餐具也进行三次彻底冲洗。

不锈钢上的蛋黄污迹

【0163】用于这些实验的不锈钢板(10×15cm；在一侧上刷涂)在95℃在实验室餐具洗涤机中用高碱度商业洗涤剂(例如，ECOLAB

洗涤剂；Henkel)彻底清洗，以提供清洁且无油脂的钢板。这些板在其首次使用前被清理毛刺。在用蛋黄污染之前，板在80℃在热橱柜中干燥30分钟。被刷的表面在染污之前不被触及。并且，不允许表面上有水污点或绒毛。冷却的板在染污前称重。

【0164】通过将约10-11个鸡蛋(200g蛋黄)的蛋黄与蛋白分离制备蛋黄。蛋黄在玻璃烧杯中用叉子搅拌，以均匀蛋黄悬浮液。所述蛋黄然后被过滤(约0.5mm网孔)以去除粗颗粒和任何蛋壳碎片。

【0165】平刷(2.5＂)被用于尽可能均匀地将1.0±0.1g蛋黄悬浮液施用于每个不锈钢板刷涂侧的140cm²面积上，留下约1cm宽的未污染边缘(如果需要，使用胶带)。染污的板被水平干燥(以防止在钢板边缘上形成滴)，在室温进行4小时(最大24小时)。

【0166】对于变性而言，钢板在沸腾脱矿质水中浸泡30秒(如果必要的话使用支撑装置)。然后，钢板在80℃再次干燥30分钟。干燥和冷却后，称重钢板。称重后，在提交它们进行洗涤测试之前，钢板被留置至少24小时(20℃，40-60％相对湿度)。为了满足测试要求，仅具有500±100mg/140cm²(变性后的蛋黄)的板被用于测试。在洗涤测试进行之后，板在热橱柜中在80℃干燥30分钟，冷却后再次称重。清洁性能的百分数通过(蛋黄洗涤释放的蛋黄mg×100)除以(应用的变性蛋白mg)来测定。

在瓷盘上的肉末

【0167】对于这些实验，使用甜点盘(Arzberg，白色，釉面瓷器)，其符合EN50242、形状1495、0219号、直径19厘米。在去除可见脂肪后，总共225g瘦猪肉和牛肉(各一半)被切碎和冷却后。混合物两次通过绞肉机运转。避免35℃以上的温度。然后，225g的碎肉与75g鸡蛋(蛋白和蛋黄混合在一起)混合。然后，制备物在使用前在-18℃冷冻达3个月。如果猪肉不可得到，可使用牛肉，因为这些是可以互换的。

【0168】使肉末和鸡蛋混合物(300g)达到室温并与80ml合成水混合。然后用厨房手工搅拌器搅拌2分钟使混合物均匀。然后，用叉子将3g肉末/鸡蛋/水混合物涂在在每个白瓷盘上，在边缘周围留下约2cm宽的未染污边缘。应用的量是11.8±0.5mg/cm²。盘子在预热的热橱柜中于120℃干燥2小时。一旦盘子冷却，它们可备用。堆放盘子，每个盘子之间具有纸巾。

【0169】洗涤后，盘子被喷涂茚三酮溶液(1％乙醇)以便更好地鉴定肉末残余。为了促进颜色反应，盘子在热橱柜中于80℃加热10分钟。参考IKW照相目录(IKW)，通过视觉检查肉末残余的颜色反应来评价洗涤性能。

在不锈钢上的鸡蛋/牛奶污迹

【0170】用于这些实验的不锈钢板(10×15cm；在一侧刷涂)在95℃在实验室餐具洗涤机中用高碱度商业洗涤剂彻底清洗，以去除油脂并清洁板。这些板用纤维素布抛光干燥。被刷的表面在染污之前不被触及。并且，不允许表面上有水污迹或绒毛。在污染之前，板放置在80℃的热橱柜中30分钟。冷却的板在染污前称重。

【0171】整个生蛋的蛋黄和蛋白(3-4鸡蛋；160g/鸡蛋)被放置在碗中并用搅蛋器击打。然后，50ml低脂的UHT(1.5％脂肪，超高温，均质化)的牛奶被加至混合物。牛奶和鸡蛋不产生泡沫地混合。使用平刷以便将1.0±0.1g鸡蛋/牛奶混合物均匀分布在不锈钢板被刷涂侧上，利用秤来检查分布。在板短侧周围留下大约1.0cm的边缘。染污的板被水平干燥(以防止在板边缘上形成滴)，在室温进行4小时(最大24小时)。

【0172】板随后在沸腾的脱矿质水中浸泡30秒(如果必要的话使用支撑装置)。然后，板在80℃再次干燥30分钟。干燥和冷却后，称重钢板。称重后，在提交它们进行洗涤测试之前，钢板被留置至少24小时(20℃，40-60％的相对湿度)。为了满足测试要求，仅使用具有190±10mg蛋黄的钢板。

【0173】在进行洗涤测试之后，钢板在热橱柜中于80℃干燥30分钟，冷却后再次称重。清洁性能的百分数通过(洗涤释放的蛋/牛奶mg×100)除以(应用的蛋/牛奶mg)来测定。

洗涤设备和条件

【0174】洗涤测试在自动餐具洗涤机中进行(Miele：G690SC)，配备污染的盘碟和不锈钢钢板，如上所述。使用确定数量的洗涤剂，如在下面的结果表格中所示。测试的温度是45℃、55℃和65℃。水的硬度是9°或21°G(德国硬度，German hardness)(大约374ppm)。

【0175】如上所述，洗涤后，对用肉末污染的盘子进行视觉评估，使用从0到10的照片等级量表，其中“0”表示十分脏的盘子，“10”表示干净的盘子。这些值对应于含酶洗涤剂的污迹或污垢去除(SR)能力。

【0176】按重量分析用蛋黄和/或蛋黄牛奶污染的洗涤不锈钢钢板，以测定洗涤后残余污迹的量。PB92突变型蛋白酶和PROPERASE

蛋白酶和其他突变体在每次洗涤0与20.57mg/活性蛋白质之间的水平下进行测试。

【0177】用于这些实验的洗涤剂如下所述。这些洗涤剂从不存在酶的来源获得，以允许分析在这些实验中测试的酶。

【0178】在下表中，提供各种实验的结果。在这些实验的每个实验中，每次洗涤使用20.57mg活性蛋白质。在这些结果中，指标(index)是100。因此，

酶的性能结果被指定为值“100”，并将突变体的结果与该值比较。例如，如果

的结果是45％SR(100为指标)，并且突变体的结果是52％SR，则突变体的结果应是52/45×100＝116(作为指标)。

【0179】本说明书提到的所有专利和出版物表示本发明所属领域普通技术人员的水平。所有专利和出版物通过参考引入本文，其程度如同每个单独出版物被具体且单独地表明通过参考引入。

【0180】已经描述了本发明的优选实施方式，对本领域普通技术人员显然地是，可以对公开的实施方式进行各种修改，而且此类修改意图在本发明的范围内。

【0181】本领域普通技术人员容易理解，本发明非常适于实现目标并获得所提到的以及本文固有的那些目的和优势。于此所述的组合物和方法代表优选的实施方式，是示例性的，并且不意图作为对本发明范围的限定。实施方式以及此类修改意图在本发明的范围内。

【0181】本领域普通技术人员容易理解，本发明非常适于实现目标并获得所提到的以及本文固有的那些目的和优势。于此所述的组合物和方法代表优选的实施方式，是示例性的，并且不意图作为对本发明范围的限定。对本领域普通技术人员非常明显的是，可对此处公开的发明进行变化的替换和修改，而不偏离本发明的范围和精神。

【0182】于此适当地说明性描述的本发明可以在缺乏任何要素或多个要素、限制或多个限制的情况下被实践，其没有具体公开于此。已使用的术语和表达被用作描述性而不是限制性术语，并且不意图在使用这些术语和表达时排斥所显示和描述的特征的任何等价物或它们的部分，而应当认识到，在要求保护的本发明范围内的各种修改是可能的。因此，应该理解，虽然本发明已通过优选的实施方式和任选特征被具体公开，但是本领域普通技术人员可以采取于此公开的概念的修改和变化，而且这类修改和变化被认为在如通过所附权利要求书限定的本发明范围之内。

【0183】本发明已经在此处进行广泛且概括性的描述。每个落入该概述公开内容内的较窄种类和亚属分组也构成本发明的组成部分。这包括具有附带条件或者从该概述中去除任何主题的否定限定的本发明的概述描述，不论所去除的物质是否于此被具体陈述。

Claims

1.餐具洗涤组合物，其包括修饰的枯草杆菌蛋白酶，其中所述枯草杆菌蛋白酶包括至少一种在以SEQ ID NO：2表达的序列中的取代，其中每个位置与枯草杆菌蛋白酶BPN′的氨基酸序列的氨基酸序列的位置相对应，并且其中所述取代选自下述位置：G118、S128、P129、S130和S166。

2.根据权利要求1所述的餐具洗涤组合物，其中所述修饰的枯草杆菌蛋白酶包括在下述位置进行的取代：G118、S128、P129和S130。

3.根据权利要求1所述的餐具洗涤组合物，其中所述修饰的枯草杆菌蛋白酶包括突变G118和至少一个另外的突变。

4.根据权利要求3所述的餐具洗涤组合物，其中所述另外的突变选自：S128F、S128L、S128N、S128R、S128V、P129E、P129L、P129M、P129N、P129L、P129Q、P129S、S130A、S130K、S130P、S130T、S130V和S166D。

5.根据权利要求1所述的餐具洗涤组合物，其中所述修饰的枯草杆菌蛋白酶包括在下述位置进行的取代：S128、P129和S130。

6.根据权利要求5所述的餐具洗涤组合物，其中所述取代选自：S128C、S128R、P129Q、P129R、S130D和S130G。

7.根据权利要求1所述的餐具洗涤组合物，其中所述修饰的枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列以SEQ ID NO：3表达。

8.餐具洗涤组合物，其包括修饰的枯草杆菌蛋白酶，其中所述枯草杆菌蛋白酶包括在以SEQ ID NO：2表达的序列中的取代，其中每个位置与枯草杆菌蛋白酶BPN′的氨基酸序列的氨基酸序列的位置相对应，并且其中所述取代为S130T。

9.分离核酸，其编码如权利要求1所述的修饰枯草杆菌蛋白酶。

10.载体，其包括权利要求9所述的分离核酸。

11.宿主细胞，其包括权利要求10所述的载体。

12.餐具洗涤方法，其包括下述步骤：提供如权利要求1中所述的至少一种的修饰的枯草杆菌蛋白酶和需要清洁的餐具；以及在对所述餐具提供有效清洁的条件下，使所述餐具与所述修饰的枯草杆菌蛋白酶接触。