JP3479509B2

JP3479509B2 - アルカリプロテアーゼ

Info

Publication number: JP3479509B2
Application number: JP2000515013A
Authority: JP
Inventors: 美喜雄高岩; 光美奥田; 勝久佐伯; 浩美久保田; 泰影山; 潤人見; 資通四方; 昌史野村
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1997-10-07
Filing date: 1998-10-07
Publication date: 2003-12-15
Anticipated expiration: 2018-10-07
Also published as: US20020064854A1; AU9457998A; US20040142837A1; AU732369B2; EP1029920B1; EP1029920A4; US6376227B1; US7297528B2; WO1999018218A1; KR20050099566A; DE69833031T2; CN1280621A; KR100832764B1; KR20010030974A; KR100601189B1; US6759228B2; DK1029920T3; ID24410A; DE69833031D1; CN1130462C

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は洗浄剤配合用酵素として有用なアルカリプロ
テアーゼ、それをコードする遺伝子、該アルカリプロテ
アーゼを産生する微生物及び該アルカリプロテアーゼを
含有する洗浄剤組成物に関する。

背景技術プロテアーゼは、衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄
剤、化粧料、浴用剤、食品改質剤、消化助剤あるいは消
炎剤といった医薬品等の多分野で利用されてきた。

その中でも最も大量に工業生産され市場規模が大きい
のは洗剤用プロテアーゼであり、例えばアルカラーゼ、
サビナーゼ（ノボ・ノルディスク社製）、マクサカル
（ジェネンコア社製）、ブラップ（ヘンケル社製）及び
プロテアーゼＫ（ＫＡＰ；花王社製）などが知られてい
る。

一方、現在もより性能の向上した洗剤用酵素の探索が
試みられており、熱及び界面活性剤に対する安定性の高
い酵素（特開平６−７０７６５号公報等）、ケラチンな
どの不溶性蛋白質に作用しかつ高い比活性を有する酵素
（特開平９−１２１８５５号公報等）、低温域での活性
に優れた酵素（特開平５−２１１８６８号公報、特開平
９−１２１８５６号公報等）及び酸化剤に対する安定性
を向上させる方法（欧州特許第０１３０７５６号公報）
等が開示されている。

ところで、衣料等の汚れは蛋白質だけでなく、脂質、
固体粒子など複数の成分が含まれていることがほとんど
であり、かかる実際の複合汚れに対して洗浄力の高い洗
浄剤が望まれている。これに対しては、通常複数種の酵
素、複数種の界面活性剤の配合がなされている。

しかしながら、複数種の酵素を配合したところで、そ
の配合した個々の酵素が複合汚れの条件下で安定で、か
つ充分な活性を維持していなければ、その作用は充分に
発揮されない。この点で従来の酵素は必ずしも十分では
なかった。

発明の開示本発明者は、高濃度の脂肪酸存在下でもカゼイン分解
活性を保持し、蛋白だけでなく皮脂等の汚れのある複合
汚れ条件下でも優れた洗浄性を有するアルカリプロテア
ーゼを見出した。

すなわち、本発明は、下記の理化学的性質を有するア
ルカリプロテアーゼを提供するものである。

（ｉ）作用pH範囲： pH４〜１３の広い範囲で作用し、pH６〜１２で最適pH
活性値の８０％以上を示す。

（ii）安定pH範囲：４０℃、３０分の処理条件でpH６〜１１の範囲で安定
である。

（iii）等電点：８．９〜９．１付近。

（iv）脂肪酸の影響：オレイン酸によってカゼイン分解活性の阻害を受けな
い。

また、本発明は、上記アルカリプロテアーゼをコード
する遺伝子を提供するものである。

また、本発明は、上記アルカリプロテアーゼを産生す
る微生物を提供するものである。

さらに本発明は、上記アルカリプロテアーゼを含有す
る洗浄剤組成物を提供するものである。

図面の簡単な説明図１は、アルカリプロテアーゼＫＰ４３のpHプロファ
イルを示す。図２は、アルカリプロテアーゼＫＰ４３の
pH安定性（４０℃、３０分）を示す。図３は、アルカリ
プロテアーゼＫＰ４３のpH安定性（１０℃、２４時間）
を示す。図４は、アルカリプロテアーゼＫＰ４３の温度
プロファイルを示す。図５は、アリカリプロテアーゼＫ
Ｐ４３の耐熱性を示す。図６は、ＫＰ４３プロテアーゼ
の酸化剤（５０mM過酸化水素）に対する安定性を示す。
図７は、ＫＰ９８６０プロテアーゼ及びその部分分解物
のＮ末端配列を示す。図８は、ＫＰ９８６０プロテアー
ゼのＮ末端配列からデザインしたプライマー配列を示
す。図９は、５７ｂｐＰＣＲ増幅断片とプライマーデザ
インを示す。

発明を実施するための最良の形態本発明のアルカリプロテアーゼは、前記（ｉ）〜（i
v）の理化学的性質を有するが、特に（iv）の性質は重
要である。すなわち、オレイン酸は皮脂の成分の一つで
あり、オレイン酸１０mM存在下でも、オレイン酸不存在
下の場合と同等のカゼイン分解活性を保持している。

本発明のアルカリプロテアーゼとしては、（ｖ）ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）にょる推定分子量が約４３，０００のものが好ま
しい。

さらに、上記（ｉ）〜（ｖ）の性質以外に下記（vi）
〜（ix）の性質を有するアルカリプロテアーゼが特に好
ましい。

（vi）作用温度及び最適温度：作用最適温度は６０℃〜７０℃であるが、２０℃以下
の低温でも作用する。

（vii）金属イオンの影響：Ｈｇ²⁺及びＣｕ²⁺イオンでは活性が阻害され、Ｃａ²⁺
イオンでは熱安定性が向上する。

（viii）阻害剤の影響：エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びｐ−クロロ
マーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）では活性は阻害され
ないが、ジイソプロピルフルオロ燐酸（ＤＦＰ）及びフ
ェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）では活
性は阻害される。

（ix）界面活性剤耐性：直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオ
キシエチレンアルキル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナ
トリウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム及びα
−スルホ脂肪酸エステルで活性は阻害されない。

本発明のアルカリプロテアーゼとしては、配列番号１
又は２に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の１若
しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列を有するものが好ましい。配列番号１と
２とは、配列番号２における３位リジンが配列番号１で
は欠失している点で異なるのみである。配列番号１及び
２におけるＸａａは、任意のアミノ酸を示すが、各位置
のＸａａの好ましいアミノ酸を配列番号２における位置
で下記の表に示す。

本発明アルカリプロテアーゼにおける前記欠失、置換
又は付加は、アルカリプロテアーゼ活性を失わない限り
特に制限されないが、配列番号１又は２で示されるアミ
ノ酸配列の好ましくは７０％以上、より好ましくは８０
％以上、さらに好ましくは９０％以上が保存されている
ものが好ましい。

本発明のアルカリプロテアーゼの具体例としては、配
列番号３、４又は５で示されるアミノ酸配列、又は該ア
ミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換
若しくは付加されたアミノ酸配列を有するアルカリプロ
テアーゼが挙げられる。

本発明のアルカリプロテアーゼは、例えばバチルス属
（Bacillus）に属するアルカリプロテアーゼ生産菌を培
養し、その培養物から採取することにより製することが
できる。ここで、本発明アルカリプロテアーゼ生産菌と
しては、バチルス属に属する野生株、及び前記のアミノ
酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子を有する形
質転換体が挙げられる。また、該野生株としては例えば
ＫＰ４３株、ＫＰ１７９０株及びＫＰ９８６０株が挙げ
られる。これらの菌体の菌学的性質を以下に示す。

以上の菌学的性質について「Bergey' s Manual of Sy
stematic Bacteriology」（Williams & Wilkins社、1984
年）の記載に準じ検討したところ、上記の３菌株はバチ
ルス属に属させることが妥当である。しかし、種につい
ては、既知のバチルス属の種の諸性質とは完全に一致し
ないことから新規な微生物である。そこで上記３菌株を
工業技術院生命工学技術研究所（あて名：〒305-0046日
本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）にバチルスエ
スピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−ＫＰ４３（FERM BP-65
32）、バチルスエスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｋ
Ｐ１７９０（FERM BP-6533）、バチルスエスピー（Ba
cillus sp.）ＫＳＭ−ＫＰ９８６０（FERM BP-6534）と
して寄託した（原寄託日：1996年９月18日）。

上記の菌株を用いて本発明アルカリプロテアーゼを生
産するには、菌株を資化性の炭素源、窒素源その他の必
須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培養すればよ
い。

かくして得られた培養液中からのアルカリプロテアー
ゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及び精製方法に
準じて行うことができる。例えば、培養液から遠心分離
又は濾過することで菌体を除き、培養上清液から常法の
精製手段により目的酵素を得る。このようにして得られ
る酵素液は、そのまま用いることもできるがさらに公知
の方法により精製、結晶化することもできる。

本発明アルカリプロテアーゼは、該アルカリプロテア
ーゼをコードする遺伝子を取得し、これを用いて組換え
ベクターを作製し、該組換えベクターを用いて宿主細胞
を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、培養物か
らアルカリプロテアーゼを採取することによっても得ら
れる。

本発明アルカリプロテアーゼ遺伝子は、例えば上記３
菌株からクローニングすることができる。該クローニン
グ手段としては、既知の手段、例えば（１）適当な制限
酵素による染色体ＤＮＡの全分解又は部分分解で得られ
たＤＮＡ断片を適当なベクターに組み込み、大腸菌や枯
草菌などに導入し発現させるショットガン法、（２）適
当なプライマーを合成してＰＣＲ法で目的とする遺伝子
をクローニングする方法等が挙げられる。

本発明アルカリプロテアーゼ遺伝子の塩基配列の一例
を配列番号３〜５に示す。該塩基配列は、配列番号３〜
５に限定されるものではなく、配列番号１若しくは２に
示されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は該ア
ミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失し、置
換若しくは付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列
であればよいが、配列番号３〜５で示される塩基配列、
又は該塩基配列の１若しくは２以上の塩基が欠失、置換
若しくは付加された塩基配列を有するものが好ましい。
ここで欠失、置換若しくは付加は、前記アミノ酸配列の
変異の範囲内であることが好ましい。

前記アルカリプロテアーゼ遺伝子を含む組換えベクタ
ーを作製するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現す
るのに適した任意のベクターにアルカリプロテアーゼ遺
伝子を組み込めばよい。かかるベクターとしては、大腸
菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＵ
Ｃ１９等が挙げられ、枯草菌を宿主とする場合、ｐＵＢ
１１０等が挙げられる。

かくして得られた組換えベクターを用いて宿主を形質
転換するには、常法、例えばプロトプラスト法、コンピ
テントセル法等により行われる。宿主としては、特に制
限されないが、微生物が好ましく、バチルス属細菌学の
グラム陽性菌；大腸菌（Escherichia coli）等のグラム
陰性菌；サッカロマイセス属酵母、アスペルギルス属カ
ビ等の真菌等が挙げられる。

得られた形質転換体を培養して本発明アルカリプロテ
アーゼを採取するには、例えば前記の野生株を用いた培
養、採取、精製の手段に準じればよい。

本発明のアルカリプロテアーゼは、前記の如く優れた
アルカリ耐性を有し、脂質の存在下でも優れたプロテア
ーゼ活性を有し、さらに酸化剤に対する耐性及び界面活
性剤耐性を有するので、各種洗浄剤組成物配合用酵素と
して有用である。

洗浄剤組成物中への上記アルカリプロテアーゼの配合
量は、アルカリプロテアーゼが活性を示す量であれば特
に制限されないが、洗浄剤組成物１kg当たり０．１〜５
０００Ｕ、特に１〜５００Ｕが好ましい。

また、本発明のアルカリプロテアーゼ含有洗浄剤組成
物には、公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該
公知の洗浄成分としては、ＷＯ９４／２６８８１の第５
頁、右上欄、第１４行〜右下欄、第２９行記載のものを
使用することができる。

界面活性剤は、洗浄剤組成物中０．５〜６０重量％
（以下単に％で示す）配合され、特に粉体状洗浄剤組成
物については１０〜４５％、液体洗浄剤組成物について
は２０〜５０％配合することが好ましい。また、本発明
洗浄剤組成物が漂白洗浄剤又は自動食器洗浄機用洗浄剤
である場合、界面活性剤は一般に１〜１０％、好ましく
は１〜５％配合される。

二価金属イオン捕捉剤は、０．０１〜５０％、好まし
くは５〜４０％配合される。

アルカリ剤及び無機塩は０．０１〜８０％、好ましく
は１〜４０％配合される。

再汚染防止剤は０．００１〜１０％、好ましくは１〜
５％配合される。

本発明のアルカリプロテアーゼ以外にセルラーゼ、ア
ミラーゼ、プロトペクチナーゼ、ペクチナーゼ、リパー
ゼ、ヘミセルラーゼ、β−グリコシダーゼ、グルコース
オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ等を使用す
ることができる。これらの酵素は０．００１〜５％、好
ましくは０．１〜３％配合される。

漂白剤（例えば過酸化水素、過炭酸塩等）は１〜１０
％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するとき漂白活
性化剤（アクチベーター）を０．０１〜１０％配合する
ことができる。

蛍光剤はビフェニル型蛍光剤（例えばチノパールＣＢ
Ｓ−Ｘ）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ型蛍光染）
等が挙げられる。蛍光剤は０．００１〜２％配合するの
が好ましい。

上記の洗浄剤組成物の形態は、例えば液体、粉末、顆
粒等とすることができる。また、この洗浄剤組成物は、
衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、排水管洗浄
剤、義歯洗浄剤、漂白剤等として使用することができ
る。

実施例実施例１（アルカリプロテアーゼ生産菌のスクリーニン
グ）土壌サンプル１ｇを生理食塩水（１０mL）に懸濁し、
８０℃で１０分間熱処理を行った後、以下に示した組成
を有するプロテアーゼ生産菌液体集積培地へ接種し、２
０℃で培養を行った。３回程度同培地で植え継ぎ集積を
行った後、以下に示した組成を有するプロテアーゼ生産
判定プレートに塗抹し、２０℃で５〜７日間培養した。
生育した集落の周囲にスキムミルクの分解によって生じ
た透明帯を指標としてプロテアーゼ生産菌を分離した。
その結果、アルカリプロテアーゼ生産菌としてバチルス
エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株、ＫＳＭ−ＫＰ１７９０
株及びＫＳＭ−ＫＰ９８６０株を得た。

実施例２得られたバチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株をポ
リペプトンＳ１％、酵母エキス０．０５％、リン酸１カ
リウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０２％、グルコ
ース（別滅菌）１％、炭酸ナトリウム（別滅菌）０．５
％、の組成の液体培地に接種し３０℃、２４時間培養し
た。この時の培養上清の酵素濃度は、約１．５Ｕ／Ｌで
あった。この培養液を４℃で遠心分離し得られた培養上
清に攪拌しながら粉砕した硫安を９０％飽和濃度になる
ように添加した。攪拌しながら４℃で一昼夜放置後遠心
分離により沈殿を回収し、得られた沈殿を５mMの塩化カ
ルシウムを含む１０mMトリス−塩酸緩衝液pH７．５に溶
解し、同緩衝液に対して透析した。続いてこの透析内液
を５mMの塩化カルウムを含む１０mMトリス−塩酸緩衝液
pH７．５で平衡化させたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＦＦ（ファルマシア社製）カラムを通過させ非吸着画分
を回収した。この回収液を２mM塩化カルシウムを含む５
０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液pH７．５に対して透析し、同緩
衝液で平衡化させたＳＰ−セファロースＦＦカラムを通
過させ非吸着画分よりやや遅れて溶出してくる活性画分
を回収した。活性回収率１５％のこのサンプルを用いて
ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行ったところ単一
バンドとして検出された。

実施例３得られたバチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ１７９０株
及びＫＳＭ−ＫＰ９８６０株を実施例２と同様の培地で
培養し、実施例２と同様に培養液を精製してアルカリプ
ロテアーゼを採取した。

実施例４実施例２及び３で得られたアルカリプロテアーゼの酵
素学的性質を検討した。その実験方法及び結果を以下に
示す。

Ｉ．実験材料及び実験方法（１）活性測定法（ａ）カゼイン法１％（ｗ／ｖ）カゼイン（ハマーステイン：メルク社
製）を含む５０mmol／Ｌ各種緩衝液１mLを４０℃で５分
間保温した後、０．１mLの酵素溶液を添加し、４０℃で
１０分間反応を行った。ＴＣＡ溶液（０．１１mol／Ｌ
トリクロロ酢酸：０．２２mol／Ｌ酢酸ナトリウム：
０．３３mol／Ｌ酢酸）２mLを添加して反応を停止し、
室温で１０分間放置した後、酸変性蛋白を濾過（Ｎｏ．
２濾紙：ホワットマン社製）した。そして、濾液０．５
mLにアルカリ性銅試薬（１％（ｗ／ｖ）酒石酸カリウム
・ナトリウム：１％（ｗ／ｖ）硫酸銅：２％（ｗ／ｖ）
炭酸ナトリウム、０．１mol／Ｌ水酸化ナトリウム＝
１：１：１００（ｖ／ｖ））を２．５mLを添加し、３０
℃、１０分間保温した後、希釈フェノール試薬（フェノ
ール試薬（関東化学社製）をイオン交換水で２倍希釈し
たもの）０．２５mLを加え、３０℃、３０分間保温した
後、６６０nmにおける吸光度を測定した。上記の酵素反
応系に反応停止液を混合した後、酵素溶液を加えた系を
ブランクとした。

なお、酵素１単位（Ｐ．Ｕ）は、上記の反応条件にお
いて１分間に１mmolのチロジンに相当する酸可溶性蛋白
分解物を遊離する酵素量とした。

（ｂ）合成基質法０．９mLの１００mmol／Ｌホウ酸緩衝液（pH１０．
０．２mmol／Ｌ塩化カルシウム含有）に５０mmol／Ｌ合
成基質溶液（サクシニル−アラニル−アラニル−フェニ
ル−ロイシン・パラニトロアニライドをジメチルスルホ
キサイドに溶解）０．０５mLを混合し、３０℃で５分間
保温した後、０．０５mLの酵素溶液を加え、３０℃、１
０分間反応を行った。５％（ｗ／ｖ）クエン酸溶液２mL
を添加して反応を停止させ、４２０nmにおける吸光度を
測定した。

なお、酵素１単位（Ｕ）は、上記の反応条件において
１分間に１μmolのｐ−ニトロアニリンを遊離させるの
に必要な酵素量とした。

（ｃ）アンソン・ヘモグロビン法アンソンの方法に従い(M. L. Anson, J. Gen. Physio
l. 22, 79(1938))、尿素を用いて牛血清ヘモグロビンを
変性させ、水酸化ナトリウムにてpH１０．５とした。こ
の基質溶液（ヘモグロビンとして２．２％）０．５mLに
酵素液０．１mL（１．０×１０^-5〜１．０×１０^-3Ａ．
Ｕ）を添加し２５℃にて１０分間反応を行い、４．９％
のトリクロル酢酸１．０mLを加え、反応を停止した。反
応終了後、遠心分離（３，０００rpm,１０分）を行い、
その上清液中に含まれる蛋白分解物をフォーリン・ロー
リー法(O. H. Lowryら、J. Biol. Chem., 193, 265(195
1))によって定量した。

なお、酵素１単位（Ａ．Ｕ）は、上記の反応条件にお
いて１分間に１mmoleのチロシンに相当する酸可溶性蛋
白分解物を遊離する酵素量とした。

（２）至適pH カゼイン１％（ｗ／ｖ）を含む５０mmol／Ｌのブリッ
トン・ロビンソン緩衝液１mLに酵素溶液（３．０×１０
^-5ｍＰ．Ｕ）０．１mLを加え、カゼイン法によって活性
測定を行った。

（３）pH安定性ブリットン・ロビンソン緩衝液（２０mmol／Ｌ、２mm
ol／Ｌ塩化カルシウム含有）中に酵素溶液を（８．０×
１０^-4ｍＰ．Ｕ．）混合し、４０℃、３０分間及び１０
℃、２４時間の処理を行った。この処理液を氷冷後、５
０mmol／Ｌホウ酸緩衝液で４０倍に希釈した後、カゼイ
ン法により残存活性を測定した。

（４）至適温度カゼイン１％（ｗ／ｖ）を含有する５０mmol／Ｌホウ
酸緩衝液（pH１０．０）１mL中に、酵素溶液２．０×１
０^-5ｍＰ．Ｕ．）０．１mLを添加し、１０〜８０℃まで
の各温度でカゼイン法により活性測定を行った。

なお、活性測定は５mmol／Ｌ塩化カルシウムの存在下
及び非存在下の両系において行った。

（５）耐熱性２０mmol／Ｌホウ酸緩衝液（pH１０．０）中、５mmol
／Ｌ塩化カルシウムの存在下及び非存在下の両系におい
て、酵素溶液（２．５×１０^-4ｍＰ．Ｕ．）を加え、各
温度で１０分間熱処理を行った。氷冷後、５０mmol／Ｌ
ホウ酸緩衝液（pH１０．０）で５倍希釈し、カゼイン法
により残存活性を測定を行った。

（６）金属イオンの影響１mmol／Ｌ各種金属塩を含む２０mmol／Ｌホウ酸緩衝
液（pH１０．０）中に酵素溶液（４．０×１０^-4ｍＰ．
Ｕ．）を添加し、３０℃、２０分間の処理を行った。そ
の後、５０mmol／Ｌホウ酸緩衝液（pH１０．０）で５倍
希釈し、カゼイン法により活性の測定を行った。

（７）阻害剤の影響１０mmol／Ｌリン酸緩衝液（pH７．０）に各種阻害剤
を所定濃度になるよう調製し、酵素溶液（１．０×^-3ｍ
Ｐ．Ｕ．）を添加し、３０℃、２０分間の処理を行っ
た。その後、イオン交換水で２０倍希釈し、カゼイン法
により残存活性の測定を行った。

（８）界面活性剤の影響１％の界面活性剤を溶解した１００mmol／Ｌホウ酸緩
衝液に、酵素溶液（７．０×１０^-4ｍＰ．Ｕ．）を添加
し、４０℃、４時間の処理を行った。その後、５０mmol
／Ｌホウ酸緩衝液（pH１０．０）で２０倍希釈し、カゼ
イン法により残存活性の測定を行った。

（９）酸化剤（過酸化水素）の影響過酸化水素及び塩化カルシウムを含むブリットン・ロ
ビンソン緩衝液（最終濃度：５０mmol／Ｌ過酸化水素、
２mmol／Ｌ塩化カルシウム、２０mmol／Ｌブリットン・
ロビンソン（pH８．０）２．７mLを３０℃、１５分間保
温した後、０．３mLの酵素溶液を添加した。経時的に、
予め準備しておいた５μＬのカタラーゼ（ベーリンガー
マンハイム社製：２０mg／mL）入り試験管に０．８mLサ
ンプリングし、酸化反応を停止させた。そして、各サン
プルを２mmol／Ｌ塩化カルシウムで適当に希釈した後、
合成基質法を用いて残存活性を測定した。

（１０）脂肪酸の影響１％（ｗ／ｖ）カゼインを含む５０mMリン酸緩衝液
（pH７）を基質溶液として、０〜１０mMのオレイン酸ナ
トリウム存在下で２０℃、１５分間反応を行い、カゼイ
ン法で活性測定を行った。

II. 実験結果（１）至適pH ３種類のプロテアーゼ（KP43, KP1790, KP9860）に及
ぼすpHの影響を検討した。至適pHにおける活性を１００
％とし、各pHでのＫＰ４３の相対活性を図１に示した。
その結果、いずれのプロテアーゼも、作用最適pHはpH６
〜１２にあり、非常に広いpH領域において高い蛋白分解
活性能範を有することが明らかになった。

（２）pH安定性処理前の酵素活性を１００％とし、４０℃で３０分間
及び１０℃で２４時間保存後の、各pHにおけるＫＰ４３
の残存活性を図２及び３に示した。その結果、４０℃、
３０分間の処理では、いずれもpH６〜１２の広範囲で安
定であり、カルシウムイオンの添加によってpH５におけ
る安定性も改善されることが明らかになった。一方、１
０℃、２４時間の処理では、いずれもpH５〜１２の広範
囲で安定であった。

（３）至適温度基質にカゼインを用いて、各々のプロテアーゼに及ぼ
す温度の影響を検討した。カルシウム無添加系における
最高活性を１００％とし、各温度におけるＫＰ４３の相
対活性を図４に示した。この結果から、カルシウムイオ
ン無添加系においては、３種類のプロテアーゼは至適温
度を６０℃に有することが判った。また、カルシウムイ
オン添加系によっていずれも至適温度は７０℃となり、
既存の洗剤用プロテアーゼと同様、カルシウムイオン添
加系による至適温度の高温側への移行が認められた。

（４）耐熱性３０〜６０℃までの各温度で（pH１０．０、５mmol／
Ｌ塩化カルシウム添加及び無添加系）、１０分間の熱処
理を行い、残存活性を測定した。未処理時の活性を１０
０％とし、各処理温度におけるＫＰ４３の残存活性を図
５に示す。その結果、いずれのプロテアーゼも塩化カル
シウム無添加系においては、６０℃まで安定であり、塩
化カルシウム（５mmol／Ｌ）の添加により温度安定性は
１０℃程高温側にシフトすることが明らかになった。市
販の洗剤用酵素と比較した場合、最も耐熱性に優れてい
るエスペラーゼに匹敵する耐熱性を保持するものと考え
られた。

（５）金属イオンの影響４種類のプロテアーゼについて、各種金属塩（１mmol
／Ｌ）で２０mmol／Ｌホウ酸緩衝液中（pH１０）、３０
℃、２０分間の処理を行い、残存活性を測定した。残存
活性は、金属塩無添加系で同様の処理を行った時の酵素
活性を１００％とする相対値で表わした（表３参照）。
その結果、いずれのプロテアーゼも塩化水銀及び硝酸銀
による阻害が認められたが、他の各種金属塩に対して
は、非常に安定であることが判った。

（６）各種阻害剤の影響一般的な酵素阻害剤が本発明プロテアーゼに対して与
える影響を検討した。１０mmol／Ｌリン酸緩衝液（pH
７．０）に各種阻害剤を所定濃度になるように添加し、
３０℃、２０分間の処理を行い、残存活性を測定した。
残存活性は、阻害剤無添加系で同様の処理を行った時の
酵素活性を１００％とする相対値で表わした（表４参
照）。この結果から明らかなように、３種類のプロテア
ーゼはいずれも、セリンプロテアーゼの阻害剤であるジ
イソプロピルフルオルリン酸（ＤＦＰ）、フェニルメタ
ンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）及びキモスタチ
ンで阻害されることから、活性中心にセリン残基を有す
るプロテアーゼであると考えられた。また、放線菌由来
でセリンプロテアーゼの阻害作用が報告されているアン
チパインやロイペプチンによる影響は認められなかっ
た。

（７）界面活性剤の影響各種プロテアーゼを０．１mol／Ｌトリス−塩酸緩衝
液（pH９．０）中、１％の各種界面活性剤で４０℃、４
時間の処理を行い、残存活性を測定した。残存活性は、
処理時間０分での酵素活性を１００％とする相対値で表
わした（表５参照）。その結果、３種類の酵素は、直鎖
アルキルベンゼンスルホン酸（ＬＡＳ）をはじめとする
界面活性剤に非常に安定であることから、界面活性剤を
含有する洗浄剤成分として有用であると考えられた。

（８）酸化剤の影響各種プロテアーゼを５０mmol／Ｌ過酸化水素を含むブ
リットン・ロビンソン緩衝液（pH８．０）中３０℃で処
理を行い、経時的に残存活性を測定した。図６に示すよ
うに、３種の酵素は市販洗剤用酵素のサビナーゼやＫＡ
Ｐを大きく上回る安定性を示し、蛋白工学的手法を用い
てサビナーゼに酸化剤耐性を付与したデュラザイム（ノ
ボ・ノルディスク社製）並の優れた安定性を示した。

（９）脂肪酸の影響結果を表６に示すように、本発明アルカリプロテアー
ゼは、皮脂の成分の一つであるオレイン酸１０mMの存在
下で活性を全く失わなかった。

実施例５（ＫＰ９８６０プロテアーゼ遺伝子のクローニ
ング）（１）ＫＳＭ−ＫＰ９８６０株ゲノムＤＮＡの調製法ＫＳＭ−ＫＰ９８６０株を液体培地（０．５％グルコ
ース、０．２％ポリペプトン−Ｓ、０．０５％酵母エキ
ス、０．１％ＫＨ₂ＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．２６％Ｎａ
Ｃｏ₃：pH９．０）５００mLで３０℃、２日間培養した
後、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体か
ら、Saito とMiura らの方法（Biochim.Biophyc. Acta
o, 72, 619(1963)）らの方法によりゲノムＤＮＡを調製
した。

（２）ＫＰ９８６０プロテアーゼの部分分解と分解産物
の回収１）熱失活によるＫＰ９８６０プロテアーゼの変性ＫＰ９８６０プロテアーゼ（５mg／mL）４５μＬＰＭＳＦ（１００mM）２０μＬＥＤＴＡ（２００mM）１０μＬＳＤＳ（０．０８mg／mL）２５μＬ上記の組成のプロテアーゼ溶液を沸騰水中で１０分間
加熱した。プロテアーゼ溶液を２mM 酢酸アンモニウム
で透析し、ＳＤＳ、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦを除いた後、凍
結乾燥した後、１００μＬの蒸留水に溶解し、変性蛋白
サンプルとした。

２）トリプシンによる部分分解変性蛋白サンプル１００μ
Ｌトリプシン（１μｇ／mL, Sigma）１００μＬ１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）５０μＬ蒸留水７５０μＬトリプシンを１）で得られた変性蛋白サンプルに対し
て、上記の組成で氷中で３時間作用させた。反応の停止
はＳＤＳ（０．０８mg／mL）、ＥＤＴＡ（２００mM）、
ＰＭＳＦ（１００mM）をそれぞれ３００μＬ、１００μ
Ｌ、２００μＬ加え、沸騰水中で３分間加熱することで
行った。

２mM 酢酸アンモニウムで透析し、ＳＤＳ、ＥＤＴ
Ａ、ＰＭＳＦを除いた後、凍結乾燥した後、１００μＬ
の蒸留水に溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルとし
た。

３）部分分解物の回収２）で得られたサンプルをレディゲル−Ｊ（Bio-Rad
社製）１２％で電気泳動し、ＱｕｉｃｋＣＢＢ染色液
（Bio-Rad 社製）で染色し蛋白バンドを検出した。蛋白
バンド部分を剃刀で切り出し、１．５mLチューブ内で破
砕後、５倍量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動バッファー（組成
はグリシン１４．４％（W/V）、Ｔｒｉｓは３．０３
％、ＳＤＳ（Bio-Rad 社製）１０％）を加え、室温で攪
拌し蛋白バンドを溶出させた。得られた溶出液を２mM
酢酸アンモニウムで透析、凍結乾燥して、プロテインシ
ーケンサー（Protein Sequencer 476A型：Applied Bios
ystem 社製）を用いた解析に供した。

得られた部分分解物のＮ末端配列を図７に示す。

（３）ＰＣＲ増幅すべきＤＮＡ領域のそれぞれの＋鎖、−鎖の５′
末端に相当する２０〜３０塩基数のプライマー（図８）
を合成し、鋳型ＤＮＡ１００ng、プライマー２０pmolを
用いてPwoDNA polymerase（Boehringer mannheim 社
製）を用いて１００μＬの反応系でＰＣＲ反応を行っ
た。また、インバースＰＣＲを行う場合はExpand^TMlong
template PCR system（Boehringer mannheim 社製）を
用いて５０μＬの反応系で行った。図８に示したプライ
マーである９８６０−Ｎ２と９８６０−２５ｋ−ＲＶを
用いたＰＣＲにより、５２７bpのＤＮＡ断片を取得し
た。

（４）ＰＣＲ産物のサブクローニングＰＣＲ産物をHigh pure PCR product purification k
it（Boehringer mannheim社製）を用いて精製した後、
ｐＵＣ１８のＳｍａＩサイトにLigation kit ver.２
（Takara社製）を用いて１６℃、一夜反応により挿入し
た。得られた組換えプラスミドとコンピテントセルE. c
oli ＪＭ１０９株（Takara社製）を混合し、４２℃、４
５秒間のヒートショックを与え、E. coli ＪＭ１０９株
を形質転換した。菌液にＬＢを加え、３７℃で１時間保
温した後に、ＩＰＴＧ（０．１mM、 Sigma）及びＸ−ｇ
ａｌ[０．００４％（ｗ／ｖ）、Sigma]、アンピシリン
(５０μｇ／mL、Sigma）を含有するＬＢプレートに塗布
した。３７℃で一夜培養し、生育したホワイトコロニー
を組換えプラスミドが導入された形質転換体として選抜
した。

（５）塩基配列の決定形質転換体をアンピシリン５０μｇ／mLを含有したＬ
Ｂで３７℃で一夜培養し、菌体を遠心分離により回収
後、High pure plasmid isolation kit を用いて（Boeh
ringer mannheim 社製）組換えプラスミドを得た。得ら
れた組換えプラスミド１μｇを鋳型として、プライマー
とＤＮＡ Sequencing kit （PERKIN ELMER社製）を用い
て２０μＬの反応系でＰＣＲ反応を行った。反応生成物
をQuick spin column（Boehringer mannheim社製）を用
いて精製した後に、遠心エバポレーターで乾燥させ、
ＤＮＡSequencer ３７７型（Applied Biosystem 社製）
を用いた解析に供した。

ＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片は、ＫＰ−９８６
０プロテアーゼのＮ末端配列に一致するアミノ酸配列を
有し、サブチリシン等のアルカリウロテアーゼとの活性
中心を構成する３つのアミノ酸（Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｓｅ
ｒ）の内、ＡｓｐとＨｉｓ周辺の共通配列と考えられる
配列が認められたことから、ＫＰ−９８６０プロテアー
ゼ遺伝子の一部分であると考えられた。

（６）サザンハイブリダイゼーションＫＰ９８６０染色体をEcoR I、Sac I、Kpn I、Hind
III、Xho I、Pst I、BgI IIを用いて処理し、得られた
５２７bp ＤＮＡをプローブにサザンハイブリダイゼー
ションを行い、相間性領域の検出を試みた。

その結果、Kpn Iを除く各々のレーンでハイブリダイ
ズするバンドが認められた。

（７）インバースＰＣＲ得られた５２７bpの配列から作製したプローブ１〜４
（図９）を用いてインバースＰＣＲを行った。ＫＰ−９
８６０染色体を制限酵素EcoRI, Hind III, PstI,BglII
による完全消化を行い、各々Ligation Kit ver.２（Tak
ara社製）処理をキットに従って行った。得られた反応
液をエタノール沈殿させ、インバースＰＣＲ用鋳型ＤＮ
Ａとした。EcoRI, HindIII, PstI, BglII制限酵素処理
インバースＰＣＲ用鋳型ＤＮＡ０．１μｇ、プライマー
１及び４各１０p molとExpand long template PCR Syst
emを用いて、ＰＣＲ反応（条件；（９４℃ １０秒、６
０℃３０秒、６８℃ ４分）１０サイクル、（９４℃
１０秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ４分＋２０×サイク
ル数）２０サイクル、６８℃ ７分、４℃ １分）を行
った。又、EcoRI制限酵素処理インバースＰＣＲ用鋳型
ＤＮＡ０．１μｇ、プライマー２及び３各１０p molとE
xpand long template PCR system を用いて、ＰＣＲ反
応（条件；同上）を行った。得られた増幅ＤＮＡ断片を
High Pure PCR Product Purification Kit を用いて精
製後、ＤＮＡ blunting Kit（Takara社製）を用いて末
端を平滑化した。得られたＤＮＡ断片と制限酵素Ｓｍａ
Ｉ処理したｐＵＣ１８とを混合し、キットに従ってLiga
tion Kit ver.2処理を行った。得られた、処理反応液を
用いて大腸菌ＪＭ１０９株をコンピテンスセル法を用い
て形質転換し、組換えプラスミドを取得した。得られた
組換えプラスミドに挿入されたＤＮＡ断片を上記に従っ
てシーケンスし、塩基配列の決定を行った。

（８）ＫＰ−９８６０プロテアーゼ遺伝子の全塩基配列
の解析シーケンスの結果、ＫＰ−９８６０プロテアーゼ遺伝
子には１９１７bp、６３９アミノ酸残基をコードするOp
en Reading Frame(ORF）が存在し、ＯＲＦ中には精製酵
素のＮ末端配列に一致する領域が存在した（NDVARHIVKA
DVAQSSYGLY)。Ｎ末端配列から、成熟型プロテアーゼは
１３０２bp、４３４アミノ酸残基と推定された（配列番
号３、分子量45310Da)。またＯＲＦの上流にはプロモー
ター領域（−３５領域：ttgtgt、−１０領域：tacgat）
及びリボソーム結合部位（ＳＤ配列：aggagt）と推定さ
れる配列が認められた。終止コドン（taa）の下流には
ターミネーターと推定される、−２６．２kcal／molの
自由エネルギーを有するインバーテッド・リピートが存
在した。

実施例５と同様にして、ＫＰ−４３プロテアーゼ及び
ＫＰ−１７９０プロテアーゼのそれぞれの遺伝子の全塩
基配列及びアミノ酸配列を解析した。その結果を配列番
号４及び５に示す。

実施例６洗浄試験：ＪＩＳＫ３３７１に準じ洗浄試験を行った。洗浄
系は、表７記載の配合組成から成る洗剤を７１．２mgＣ
ａＣｏ₃／Ｌ（４゜ＤＨ）の水にて使用濃度に溶解後、
各種のプロテアーゼをアンソン・ヘモグロビン法で４０
ｍＡＰＵ／Ｌとなるようにそれぞれ添加した（表８参
照）。

試験布は、ワイシャツの衿部分（３日間着用）とし、
一対比較ができるように８×８cm程に裁断後、酵素添
加、あるいは酵素無添加の洗浄系にてターゴトメーター
（上島製作所製）を使用し、１５℃、１００rpm で１０
分間洗浄を行った。濯ぎ、乾燥後、一対の衿布（１５
組）を見比べ汚れ落ちの程度を肉眼で判定した。判定方
法は、汚れがほぼ完全に落ちている場合を５点、汚れが
ほとんど落ちていない場合を１点とし、１５点の衿布の
合計評価点を求め、酵素無添加の洗浄系による評価点を
１００とした場合の比率を洗浄力指数として表した。こ
の結果を表８に示す。

ＬＡＳ：直鎖アルキル（C_12-14）ベンゼンスルホン酸
ナトリウム（液体洗剤は酸型で配合）ＡＳ：ドデシルアルコール硫酸エステルナトリウムＡＥ：ポリオキシエチレンラウリルエーテル（EO平均
付加モル数４）ＡＥＰ：ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンラ
ウリルエーテル（EO平均付加モル数８、PO平均付加モル
数３）ＡＥＳ：ポリオキシエチレンアルキル（C_10-12）エー
テル硫酸ナトリウム（EO平均付加モル数2.5）脂肪酸：ヤシ油由来脂肪酸ナトリウムゼオライト：４Ａ型ゼオライト、平均粒系３μｍ炭酸ナトリウム：デンス灰非晶質珪酸塩：ＪＩＳ２号珪酸ナトリウム結晶性珪酸塩：ＳＫＳ−６（ヘキストトクヤマ社製）
粉砕品、平均粒径１５μｍＡＡ−ＭＡ：ソカランＣＰ、アクリル酸−マレイン酸
共重合体（ＢＡＳＦ社製）ＰＥＧ：ポリエチレングリコール、平均分子量８，０
００表８より、活性が同じ条件であっても、本発明品を配
合した洗浄剤（洗剤Ａ）は、従来のプロテアーゼ配合洗
浄剤より選れた洗浄力を有することが分かる。本発明の
優た洗浄効果は、同様に、洗剤Ｂ及び洗剤Ｃでも得られ
る。

実施例７表９に示す組成の洗浄剤１００重量部に、実施例２又
は３で得られたBacillussp. KSM-KP43、KSM-KP1790又は
KSM-KP9860由来の本発明プロテアーゼ精製標品から特開
昭６２−２５７９９０号公報記載の方法に基づき調製し
た造粒物（６ＡＰＵ／ｇ）を１重量部配合して本発明の
洗浄剤組成物を調製した。なお、粒状洗浄剤の場合に
は、酵素、ＰＣ、ＡＣ−１、ＡＣ−２を除いた成分で粒
子化した洗剤生地に、酵素、ＰＣ、ＡＣ−１、ＡＣ−２
をそれぞれ粒子化したものをブレンドすることにより製
造した。各洗浄剤を７１．２mgＣａＣＯ₃／Ｌ（４゜Ｄ
Ｈ）の水にて使用濃度に溶解後、実施例６と同様にして
衿布を洗浄した。得られた洗浄剤は優れた洗浄力を有
し、衣料用洗浄剤として有用である。

ＬＳＡ−２：アルキルベンゼンスルホン酸（アルキル鎖
の炭素数10〜14）を４８％ＮａＯＨで中和したものＬＡＳ−３：アルキルベンゼンスルホン酸（アルキル鎖
の炭素数10〜14）を５０％ＫＯＨで中和したものＡＳ−２：ドパール25サルフェート（Ｃ₁₂〜Ｃ₁₅硫酸）
のナトリウム塩ＳＡＳ：Ｃ₁₃〜Ｃ₁₈アルカンスルホン酸ナトリウムＡＯＳ：アルファオレフィンスルホン酸ナトリウムＳＦＥ：パーム油由来、アルファスルホ脂肪酸メチルエ
ステルナトリウム脂肪酸塩：パルミチン酸ナトリウムＡＥＳ−２：ポリオキシエチレンアルキル（Ｃ₁₂〜
Ｃ₁₅）エーテル硫酸ナトリウム（EO平均付加モル数２）ＡＥ−３：Ｃ₁₂〜Ｃ₁₈アルコールにEOを平均３モル付加
したものＡＥ−４：Ｃ₁₂〜Ｃ₁₅アルコールにEOを平均７．２モル
付加したものＡＥ−５：Ｃ₁₂〜Ｃ₁₅２級アルコールにEOを平均７モル
付加したものＡＧ：アルキル（ヤシ油由来）グルコシド（平均重合度
１．５）吸油性担体：非晶質アルミノ珪酸ソーダ、吸油能２３５
mL/100g 結晶性珪酸塩：ＳＫＳ−６（δ−Ｎａ₂Ｓｉ₂Ｏ₅、結晶
性層状シリケート、平均粒子径２０μｍ）非晶質珪酸塩：ＪＩＳ１号珪酸ナトリウムＳＴＰＰ：トリポリリン酸ナトリウムＮＴＡ：ニトリロトリ酢酸ナトリウムＰＡＡ：ポリアクリル酸ナトリウム、平均分子量１２，
０００ＡＡ−ＭＡ：アクリル酸／マレイン酸共重合体ＣＭＣ：カルボキシメチルセルロースナトリウムＰＥＧ：ポリエチレングリコール、平均分子量６，００
０ＰＶＰ：ポリビニルピロリドン、平均分子量４０，００
０、Ｋ値＝２６〜３５蛍光染料：チノパールＣＢＳと、ホワイテックスＳＡを
重量比１：１で配合したもの（注意：液体洗剤の場合は
チノパールＣＢＳのみ配合）香料：特開平８−２３９７００号公報の実施例記載の香
料組成を使用酵素：リポラーゼ１００Ｔ、ターマミル６０Ｔ、及びＫ
ＡＣ５００（花王(株)製）を重量比率で１：１：１の
割合で配合したものＰＣ：過炭酸ソーダ、平均粒子径４００μｍ、メタホウ
酸ソーダにて被覆したものＡＣ−１：テトラアセチルエチレンジアミンＡＣ−２：ラウロイルオキシベンゼンスルホン酸ナトリ
ウム実施例８表１０に示す組成のうち、過炭酸ナトリウムと炭酸ナ
トリウム（デンス灰）を攪拌混合しながら、ポリアクリ
ル酸ナトリウム４０％水溶液及び直鎖アルキルベンゼン
スルホン酸ナトリウム又は非イオン性界面活性剤又はラ
ウロイルオキシベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加し
た。次いで実施例７で得られたBacillus sp. KSM-KP43
由来のアルカリプロテアーゼ造粒物を添加し、全体的に
均一になる程度に攪拌することにより、漂白剤を調製し
た。次いで、各漂白剤の０．５％水溶液中に衿布を２０
℃、３０分間浸漬後、洗剤Ａ（実施例６参照）にてター
ゴトメーターで１００ｒｐｍ、１０分、２０℃で洗浄し
た。得られた漂白剤は優れた漂白力を有し、衣料用漂白
剤として有用である。

実施例９表１１に示す組成の自動食器洗浄機用洗浄剤組成物を
実施例８と同様にして調製した。得られた自動食器洗浄
機用洗浄剤組成物について、下記条件で洗浄力試験を行
った。得られた洗浄剤は優れた洗浄力を有し、自動食器
洗浄機用洗浄剤として有用である。

（１）汚染皿の調製直径２５cmの磁器製の皿に一枚当たり２．５ｇの卵黄
を刷毛で均一に塗布し、１１５℃に暖めた乾燥機で６０
分乾燥させ、試験に供した。

（２）洗浄条件使用洗浄機；松下電器(株)製全自動食器洗い機（機種Ｎ
Ｐ−８１０）洗浄；標準コース洗浄用水；硬度６２．３mgＣａＣＯ₃／Ｌ（３．５゜Ｄ
Ｈ）の水洗剤濃度；０．２重量％（３）評価方法汚染皿５枚を洗浄機に入れ、上記の洗浄条件にて実施
例の洗浄剤組成物を用いて洗浄を行った。洗浄後の皿を
１％エリトロシン溶液を用いて蛋白染色し、残留する蛋
白汚れを肉眼判定した。

実施例１０表１２に示す各成分を用い、自動食器洗浄用洗浄剤組
成物を得た。これらの自動食器洗浄機用洗浄剤組成物を
用いて、実施例９と同様に洗浄力試験を行ったところ、
いずれも優れた洗浄効果が得られた。

実施例１１前記洗剤Ａ（実施例６参照）に下記表１３記載の配合
量にて各種酵素を添加し、実施例６と同様にしてワイシ
ャツの衿部分を洗浄した。

産業上の利用可能性本発明のアルカリプロテアーゼは、各種の界面活性剤
に極めて安定であり、脂肪酸耐性を有し、かつ酸化剤に
も高い安定性を有することから、漂白剤成分を含有する
食器洗浄機用洗剤及び衣料用洗浄剤用の酵素として有用
である。

配列表 SEQUENCE LISTING ＜110＞ KAO CORPORATION ＜120＞ Alkaline Protease ＜130＞ FP-KS-0498 ＜150＞ JP 09-274570 ＜151＞ 1997-10-07 ＜160＞ 5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 639 ＜212＞ PRT ＜213＞ Bacillus sp. ＜220＞＜221＞ misc＿feature ＜222＞ 23,29,32,46,47,53,70,74,89,102,105,128,13
0,131,132,133,146,148,160,165,172,183,187,188,189,
194,286,306,324,369,431,501,531,541,584,591,592,59
4,595,596,611,632 ＜223＞ Xaa=arbitraty amino acid ＜400＞＜210＞ 2 ＜211＞ 640 ＜212＞ PRT ＜213＞ Bacillus sp. ＜220＞＜221＞ misc＿feature ＜222＞ 3,24,30,33,47,48,54,71,75,90,103,106,129,
131,132,133,134,147,149,161,166,173,184,188,189,19
0,195,287,307,325,370,432,502,532,542,585,592,593,
595,596,597,612,633 ＜223＞ Xaa=arbitray amino acid ＜400＞＜210＞ 3 ＜211＞ 1920 ＜212＞ DNA ＜213＞ Bacillus sp. ＜400＞＜210＞ 4 ＜211＞ 1923 ＜212＞ DNA ＜213＞ Bacillus sp. ＜400＞＜210＞ 5 ＜211＞ 1923 ＜212＞ DNA ＜212＞ Bacillus sp. ＜400＞

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者佐伯勝久栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内 (72)発明者久保田浩美栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内 (72)発明者影山泰栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内 (72)発明者人見潤茨城県鹿島郡神栖町東深芝20 花王株式会社研究所内 (72)発明者四方資通和歌山県和歌山市湊1334 花王株式会社研究所内 (72)発明者野村昌史和歌山県和歌山市湊1334 花王株式会社研究所内 (56)参考文献特開平４−197182（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−280278（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の理化学的性質を有するアルカリプ
ロテアーゼ。（ｉ）作用pH範囲： pH４〜１３の広い範囲で作用し、pH６〜１２で最適pH活
性値の８０％以上を示す。（ii）安定pH範囲：４０℃、３０分の処理条件でpH６〜１１の範囲で安定で
ある。（iii）等電点：８．９〜９．１付近。（iv）脂肪酸の影響：オレイン酸によってカゼイン分解活性の阻害を受けな
い。（ｖ）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による推定
分子量が約４３０００である。
【請求項２】配列番号１又は２で示されるアミノ酸配
列、又は該アミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸
が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる
ものである請求項１記載のアルカリプロテアーゼ。
【請求項３】配列番号３、４又は５で示されるアミノ
酸配列からなるアルカリプロテアーゼ、又は該アミノ酸
配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しく
は付加されたアミノ酸配列からなり、下記の理化学的性
質を有するアルカリプロテアーゼ。（ｉ）作用pH範囲： pH４〜１３の広い範囲で作用し、pH６〜１２で最適pH活
性値の８０％以上を示す。（ii）安定pH範囲：４０℃、３０分の処理条件でpH６〜１１の範囲で安定で
ある。（iii）等電点：８．９〜９．１付近。（iv）脂肪酸の影響：オレイン酸によってカゼイン分解活性の阻害を受けな
い。
【請求項４】請求項２又は３記載のアルカリプロテア
ーゼをコードする遺伝子。
【請求項５】請求項４記載の遺伝子を含有する組換え
ベクターを含む形質転換体。
【請求項６】バチルスエスピー（Bacillus sp.）Ｋ
ＳＭ−ＫＰ４３（FERM BP-6532）株、バチルスエスピ
ー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−ＫＰ１７９０（FERM BP-65
33）株及びバチルスエスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ
−ＫＰ９８６０（FERM BP-6534）株から選ばれる微生
物。
【請求項７】請求項１〜３のいずれか１記載のアルカ
リプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物。