KR910004363B1

KR910004363B1 - 미생물 세포벽 용해 효소와 그의 생산 미생물

Info

Publication number: KR910004363B1
Application number: KR1019890004661A
Authority: KR
Inventors: 유주현; 정명호; 권익부; 이윤수; 김돈기
Original assignee: 유주현
Priority date: 1989-04-08
Filing date: 1989-04-08
Publication date: 1991-06-26
Also published as: DK88090A; JPH0367579A; KR900017052A; DK88090D0

Abstract

내용 없음.

Description

미생물 세포벽 용해 효소와 그의 생산 미생물

제 1 도는 본 균주의 효소를 기질 균체가 도말된 플레이트(plate)에 스포팅(spotting)하여 용균 여부를 나타낸 사진이다.

제 2 도는 미생물 세포벽에 본 균주의 효소를 작용시켜 얻어진 반응 생성물을 분석한 도면이다.

제 3 도는 미생물 세포벽에 용해 효소를 생산하는 미생물의 전자 현미경 사진 도해이다.

제 4 도는 본 균주의 배양시간에 따른 세포벽 용해효소 생산을 나타낸 도면이다.

제 5 도는 정제된 효소 단백질의 에스 디에스 폴리아크릴 아마이드 젤 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) 사진이다.

본 발명은 미생물의 세포벽에 작용하여 미생물을 용해시키는 미생물 세포벽 용해 효소(lytic enzyme)와 그 생산 미생물에 관한 것이다.

미생물 세포벽의 주요한 성분인 펩티도글리칸(peptidoglycan)은 엔 아세틸 글루코사민(N-acetyl glucosamine)과 엔 아세틸 뮤라믹 에시드(N-acetyl muramic acid)로 된 펩타이드(peptide)가 뮤라믹 에시드(muramic acid)의 젖산(lactic acid) 잔기와 펩타이드 결합(peptide bond)을 하고 그 펩타이드 사슬사이에 펩타이드 가교(peptide bridge)가 형성되어 매우 강한 결합을 하고 펩타이드 사슬과 펩타이드 가교의 아미노산 배열은 균종에 따라 약간 다르다. 이러한 세포벽의 펩티도글리칸을 분해하는 미생물 세포벽 용해 효소는 3가지 부류로 나눌 수 있는데 펩티도글리칸의 폴리삭카라이드 사슬(polysaccaride chain)을 절단하는 글리코시다제(glycosidase)와 폴리사카라이드와 펩타이드 결합을 분해하는 아세틸 뮤라밀 엘알라닌 아미다제(acetyl-muramyl-L-alanine amidase), 그리고 폴리펩타이드(polypetide)사슬 자체를 절단하는 엔도 펩티다제(endo-peptidase)등이 있다.

이 효소에 대한 연구는 지금까지 주로 라이소자임(lysozyme)에 내성이 있는 스타필코코스(Stapylococcus)속 미생물을 용해시키는 효소와 곰팡이나 효모를 용해시키는 효소 등에 대해 진행되어 왔다.

스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 미생물 중에서 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus), 스트렙토마이세스 알부스(Streptomyces albus), 스트렙토마이세스 에리쓰라에우스(Streptomyces erythraeus), 스트렙토마이세스 루더제네시스(Streptomyces rutergenesis), 스트렙토마이세스 오리엔탈리스(Streptomyces orientalis)등과 스타필로코코스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 아크로모박터 루나터스(Achromobacter lunatus), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 믹소코코스 잔투스(Myxococcus xantus), 슈도모나스 에우로지노사(Pesudomonas aeuroginosa), 클로라피스 속(Chlorapis sp.) 등이 이 효소를 생산하는 것으로 알려져 있다.

미생물 세포벽 용해 효소는 미생물 세포벽의 구조를 밝히는데 많이 이용되며 미생물의 오염으로부터 식품을 보호하는 식품 보호제로 치즈(cheese), 소세지(sausages), 감자 샐러드 세이크(potatosalad sake)등에 첨가하여 사용될 뿐만 아니라 세포내 물질을 분리하고 연구하는데 사용되고 있다.

본 발명자들은 지금까지 알려진 미생물 세포벽 용해 효소와는 물리, 화학적인 면에서 다른 새로운 미생물 세포벽 용해 효소를 생산하는 호알칼리성 미생물을 토양으로부터 분리하여 바실러스속(Bacillus sp.)미생물로 동정하고 균주의 성질 및 효소적 특성을 검토한 결과 기존의 생산균주와 다른 특성을 갖고 있음을 발견하고, 이러한 발견을 기초로 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 미생물 세포벽에 작용하여 미생물을 용해시키는 미생물 세포벽 용해 효소 및 이 효소를 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.

[효소 활성을 갖는 균주의 분리]

본 발명의 미생물 균주는 토양으로 부터 알칼리조건(pH 10.2)에서 생육하는 미생물중 미생물 세포벽 용해활성이 있는 균주를 선택하기 위해서 기질균체인 호알칼리성 바실러스 속 미생물이 도말된 평판 배지에 분리한 미생물의 배양 상징액을 스포팅하여 스포팅한 부위에 투명환(clear zone)이 생기는 균주를 세포벽 용해활성이 있는 균주로 선정하였는데 그 결과를 사진 제 1 도에 나타내었다. 또한 세포벽 용해 효소의 확인방법으로 호알칼리 바실러스 속과 바실러스 메가테리움 미생물 세포벽에 본 효소를 45℃에서 80분간 반응시키면서 20분마다 샘플링(sampling)하여 660nm에서 흡광도와 반응 생성물 중 유리 아미노기(free aminogroup) 및 환원력(reducing power)등을 측정하였는데 결과는 제 2 도와 같았다.

본 효소는 반응시간이 경과함에 따라 660nm에서 세포벽의 흡광도가 감소하며 유리 아미노기가 증가하는 반면 환원력은 거의 변화를 보이지 않아 본 효소는 미생물 세포벽 주요 구성 성분인 펩티도글리칸의 펩타이드 결합을 절단하는 엔도 펩티다제(endo-pep-tidase)로 추정되는 미생물 세포벽 용해 효소였다.

[미생물의 균주 동정]

본 발명의 균주는 그람(gram) 염색 양성이었으며 제 3 도 사진에 나타난 바와 같이 형태는 간균(0.4μm×1.7μm이며 호기성과 운동성을 가지며 카탈라제(catalase) 양성과 포자를 형성하는 특징으로부터 바실러스 속 미생물로 동정하였다. 그 밖에 여러 가지 배양 및 생리적 특성을 실험 검토한 결과는 표 1과 같다.

[표 1]

1. 형태의 특성

2. 배양상 특징

- ; 생육하지 못함 ＋ ; 생육한다 ＋＋ ; 잘 생육한다

3. 생화학적 특징

이러한 균주의 미생물학적 특성을 미생물 세포벽 용해 효소 균주로 알려진 스트렙토마이세스, 스테필로코커스, 아크로모나스, 믹소코커스, 슈도모나스 등의 미생물의 특성과 비교해 본 바, 본 발명의 균주는 이미 알려진 미생물 세포벽 용해 효소 생산 균주와는 다른 특성을 가지며, pH가 7.5∼11.5에서 생육하는 호알칼리성 바실러스 속임을 알 수 있다.

따라서, 본 발명자들은 균주를 신규의 균주로 단정하고, 바실러스 속(Bacillus sp.) KFCC 10671라고 명명하였다.

이 균주는 한국 종균협회에 1989년 3월 24일자로 KFCC 10671의 수탁번호로 기탁되어 있다.

상기의 균주 바실러스 속(Bacillus sp.) KFCC 10671을 배양하기 위한 탄소원으로 전분, 포도당, 설탕, 당밀, 갈락토오스, 프락토오스, 아라비노오스, 라피노오스, 말토오스 등이 사용될 수 있으며, 질소원으로는 요소, 질산염, 암모늄염, 단백질, 아미노산 등이 사용될 수 있다. 그 밖에도 인산염, 탄산염, 황산염 등가 같은 무기염이 사용될 수 있다. 배지의 pH는 7.5∼11.5가 바람직하며, 배양온도는 20∼40℃이다.

본 발명의 균주를 가용성전분2%, 효모추출액 0.5%, 폴리펩톤 0.5%, 인산칼륨(K₂HPO₄) 0.1%, 황산마그네슘(MgSO₄7H₂O)0.02%, 탄산나트륨(Na₂CO₃) 1%를 증류수에 용해시킨 pH 10.2의 배지에서 30℃의 호기적 조건하에 배양할 때 최대의 효소생산을 얻을 수 있다.

본 발명의 바실러스 sp. KFCC 10671가 생산한 세포벽 용해 효소는 하기 실시예 3 및 4에서 나타낸 바와 같이 효소의 분자량이 27,000달톤 정도의 단일 서브유니트를 갖는 효소로서 최적반응 pH는 pH 10 부근인 내알칼리성 미생물 세포벽 용해 효소이다. 이 효소는 슈도모나스속 까지도 미생물 세포벽을 용해시키는 작용이 있어 기존 미생물 세포벽 용해 효소와 물리화학적 성질이 다른 신규의 효소이다. 이 효소를 생산하는 미생물이 호알칼리성 바실러스 sp. 이고, 균주의 성질과 효소의 조건이 기존의 미생물 용해 효소 생산균과는 다른 특성을 갖는 것으로 보아도 본 발명의 효소는 신규성이 있는 것이다.

본 발명의 균주 및 이 균주에 의해 생산된 미생물 세포벽 용해 효소에 대하여 하기의 실시예를 참고로 더욱 상세히 설명한다.

[실시예 1]

본 발명의 균주를 전분, 당류등과 같은 탄소원, 요소, 질산염, 암모늄염, 단백질, 아미노산과 같은 질소원, 비타민, 핵산, 효모 추출액, 펩톤, 말트추출물과 같은 영양원 및 인산염, 탄산염, 황산염 등과 같은 무기염으로 구성된 배지에서 배양함으로써 신규한 미생물 세포벽 용해 효소를 얻을 수 있다.

예를들면, 가용성전분 2%, 효모추출액 0.5%, 플리펩톤 0.5%, 인산칼륨(K₂HPO₄) 0.1%, 황산마그네슘(MgSO₄7H₂O) 0.02%, 탄산나트륨(Na₂CO₃) 1%를 증류수에 용해한 배지(pH 10.2)에서 본 발명의 균주를 30℃로 호기적 조건하에 30시간 동안 진탕 배양한다. 이때 배양액으로부터 1.20×10³U/ml의 효소를 수득할 수 있다.

또한 가용성전분 1.0%, 효모추출액 0.5%, 폴리펩톤 0.5%, K₂HPO₄0.1%, MgSO₄7H₂O 0.02%를 함유한 배지에 Na₂CO₃의 농도 또는 NaHCO₃의 농도를 0.25% 0.5%, 1.0%, 2.0%로 변화 시키면서 가하여 초기 pH를 다르게 조절한 다음, 37℃에서 24시간 동안 진탕배양하고, 그 효소활성을 측정한다. 효조활성의 측정결과는 하기 표 2에 나타낸다.

[표 2]

용해 효소 생산에 대한 탄산염 농도의 효과

세포벽 용해 효소 생산량은 탄산염의 농도를 저농도로 첨가한 것 보다 2.0% 첨가한 쪽이 좋았고, 배양초기 pH는 중성쪽 보다 pH 10쪽이 좋았다. Na₂CO₃를 2.0% 가한 pH 10.4쪽의 효소생산량은 탄산염 0.25%를 가한 중성쪽 보다 3배 이상 높게 되었다.

상기 효소의 활성을 측정하기 위해 기질로 사용하는 균체를 제조한다.

기질균주인 호알칼리성 바실러스 속 미생물 액체배지로 37℃에서 16시간 배양한 후 원심분리하여 균체를 모은 다음 0.9% 식염(NaCl)으로 2회 세척하고 완충액(pH 10.0)으로 OD₆₆₀=1.0되게 균체를 현탁시켰다. OD₆₆₀=1.0의 균체 2ml에 효소액 0.1ml를 가해서 45℃에서 10분간 반응시킨 후 흡광도 감소를 660nm에서 측정하였다. 이때, 효소활성 1단위(unit)는 주어진 조건에서 1분동안 660nm에서의 흡광도를 0.001 감소를 일으키게 하는 효소의 양으로 하였다.

[실시예 2]

가용성전분 2%, 효모추출액 0.5%, 폴리펩톤 0.5%, 인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.02%, 탄산나트륨 1%를 증류수에 용해한 배지(pH 10.2)에서 본 발명의 바실루스 속 sp. KFCC 10671을 배양하였다. 균주의 생육과 효소 생산 및 pH 변화를 경시적으로 관찰한 결과를 제 4 도에 나타내었다.

제 4 도에서 볼 수 있는 바와같이 균의 생육은 접종 18시간까지 증가하여 정지기에 들어 갔으며, 18시간이 지나면서 점차 감소하였다. 배지의 pH 는 최초 10.2로부터 점차 감소하기 시작하여 24시간에서 pH 8.6까지 떨어진 후 24시간이 지나면서 다시 증가하여 60시간 이후부터 9.4가 되는 호알칼리 세균의 발효 현상을 나타내였다. 효소의 생산은 12시간부터 점차 증가하여 36시간때에 최대 활성(1.2×10³U/ml)을 보였으나 이후 활성이 감소되는 현상을 보였다.

[실시예 3]

본 균주가 생산하는 효소의 특성을 확인한 결과 본 효소는 분자량이 27,000달톤(dalton)정도의 단일 서브유니트(subunit)를 가진 한 종류의 효소임을 에스 디 에스-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 확인하였으며 최적 pH는 10.0이었다. 이 실험 결과는 제 5도에 나타내었다.

이는 미생물 세포벽 생산균주로 보고된 스트렙토마이세스 에리쓰라에우스, 스트렙토마이세스 루터제네시스, 스트렙토마이세스 오리엔탈리스, 아크로모박터 루나터스, 슈도모나스 아에로지노사 등의 분자량이 18,500, 22,000, 33,00, 16,000, 24,500으로 다소 차이가 있었으며 최적 pH에 있어서도 스트렙토마이세스 루터제네시스가 6.0, 아크로모박터 루나터스가 8.5, 믹소코코스 잔투스가 7.5, 슈도모나스 아에로지노사가 6.4인 것과 비교해 높은 최적 pH를 보여 본 효소는 다른 세포벽 용해 효소와 상이함을 알 수 있었다.

[실시예 4]

본 균주가 생산하는 세포벽 용해 효소의 작용 범위를 알아보기 위해 본 실험에 사용한 검정 균주를 말트추출액 0.5%, 펩톤 1%, 식염 0.5% 배지로 30℃에서 정지기까지 배양한 후 완충액(pH 10.0)으로 OD₆₆₀=1.0으로 맞춘 후 이 균체 2ml에 효소액 0.1ml을 가해 45℃에서 15분간 반응시켜 660nm에서 흡광도 감소를 %로 측정한 결과 표 3에 나타내었다. 실험에 사용한 검정 균주들 중 바실러스 속 미생물은 바실러스 메가테리움, 바실러스 브레비스(Bacillus brevis), 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens)등이 본 효소에 의해 용해되었으며 슈도모나스속 미생물은 모두 용해됨을 알 수 있었다.

미생물의 세포벽은 순수한 글리코펩타이드가 아닐 뿐 아니라 펩티도글리칸의 중합, 교차 결합(cross-linking)정도나 전하(electric charge)에 따라 세포벽 용해 효소의 특이성을 나타낸다고 알려져 있다.

기존의 세포벽 용해 효소는 슈도모나스 속 미생물을 용해시키지 못하는 반면 본 효소는 슈도모나스 속 미생물을 용해시킴을 알 수 있었다.

[표 3]

Claims

미생물 세포벽 용해 효소를 생산하는 호알칼리성 비실러스 속 KFCC 10671의 미생물.
호알칼리성 바실러스 속 KFCC 10671의 미생물을 pH 7.5∼11.5의 영양배지에서 배양하여 배양액으로부터 미생물 세포벽 용해 효소를 회수함을 특징으로 하는, 미생물 세포벽 용해 효소의 제조방법.
호알칼리성 바실러스 속 KFCC 10671가 생산하는, 하기의 특성을 갖는 미생물 세포벽 용해 효소.

분자량 : 약 27,000 달톤

최적 활성 pH : pH 10 근처

반응 온도 : 40∼80℃

최적반응 온도 : 50℃

안정 pH : pH 5∼11

최적안정 pH : pH 10

내알칼리성