JPS58871B2 - グリセリン脱水素酵素の製出法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、微生物からのグリセリン脱水素酵素の製出法
並びに公知グリセリン脱水素酵素に比して著しく低いＫ
Ｍを有する新規グリセリン脱水素酵素に関する。

グリセリン脱水素酵素は、なかんずくグリセリンを測定
する場合に重要である。

グリセリンはトリグリセリドの分解で遊離する。

それ故、方程式（この場合ＮＡＤＨはこのための公知方
法の１つによって測定する）によるグリセリン脱水素酵
素でのグリセリンの測定は、トリグリセリドから先づリ
パーゼ及び場合によってエステラーゼによって等量のグ
リセリンが遊離するトリグリセリン測定の範囲で極めて
重要である。

この方法は、グリセリン脱水素酵素は従来のその公知製
出法によれば比較的低い収量で生じ、微生物を培養する
際の必要な長い発酵時間によって費用が余りにも大きい
ことによってなやまされる。

このようにして、公知方法を用いると培養時間約２４時
間で活量の収量約４０Ｕ／培地ｌが得られるのに過ぎな
かった。

それ故、本発明の目的は同じか又は減少した費用で著し
く大量の酵素が得られる方法を得ることである。

この方法は、本発明によればグリセリン脱水素酵素を形
成する微生物を適当なグリセリン含有培地中で好気性培
養し、生物質又は培地から酵素を得ることによって微生
物からグリセリン脱水素酵素を製出する方法によって解
決され、この方法は微生物を先づ好気性条件下、次いで
嫌気性条件下、即ち０２の遮断下に培養することからな
る。

好ましくは、アエロバクタ−・アエロゲネス（Ａｅｒｏ
−ｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）又はクレブシェ
ラ・プノイモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅ）ＤＳＭ１６４３又はＮＣＩＢ４１８を培
養する。

アエロバクタ−・アエロケネスＤＳＭＩ６４３は、胞子
形成をしない、非運動性の、１μ×２〜４μの桿菌であ
る。

培養条件は栄養寒天（Ｄｉｆｃ。０００１）培地上で３
７℃で好気性。

このアエロバクタ−・アエロゲネスＤＳＭＩ６４３は微
工研に寄託し、微工研菌寄第５８２７号を有する。

アエロバクタ−・アエロケネスＮＣＩＢ４１８は、クレ
ブシェラ・プノイモニアエ（Ｋｉｅｂｓｉｅ−１１ａ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）４１８としてナショナル・コレ
クション・オブ・インダストリアル・バクテリア（Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ １ｎｄｕ
ｓｔｒｉａｌ ｂ−ａｃｔｅｒｉａ）に保在されており
、１９７５年カタログに収載されている。

本発明によって使用される微生物を用いると、その他の
条件を変えないで少くとも１０倍の活量の収量を得るこ
とができることが判明した。

この場合アエロバクタ−・アエロゲネス（Ａｅｒｏｂａ
ｃ−ｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）ＤＳＭ１６４３で改
良された収量は、公知製出法を使用する、つまり嫌気性
で培養するのに過ぎないか又は好気性で培養するのに過
ぎない場合に得られる。

好ましくは好気性条件、つまり空気又は酵素又は酵素含
有ガスの供給をＬｏｇ相の終りまで維持する。

Ｌｏｇ相とは、一定の最大除法率によって特性を有する
指数又は対数の生長相である。

グリセリン脱水素酵素を形成する微生物は多くは嫌気性
条件下、つまり酵素の遮断下に培養するとこの酵素を最
もよく形成することは公知である。

酵素の存在では多くの場合代謝作用の能率の変位が生じ
、グリセリン脱水素酵素の代りにグリセリン−３−燐酸
塩一説水素酵素が形成し、グリセリンの分解には予めの
グリセリンキナーゼでの燐酸化後に使用する。

しかしながら、既にグリセリン脱水素酵素を通気で形成
する微生物も記載された（日本特許公報第０４０７３７
号）。

ところで、これに対して前述の好気性条件及び嫌気性条
件の連続の場合、純好気性培養又は純嫌気性培養の場合
よりも著しく大きい収量の酵素が得られることが判明し
た。

特に際立っているのは、前述の両微生物の場合である。

その他の点では、微生物の培養及び微生物からの酵素の
製出は公知方法によって行なう。

このようにして、本発明範囲内で使用することのできる
公知培地はグリセリン、ペプトン、肉の抽出物、酵母抽
出物及びＮａＣｌ並びに緩衝剤を含有する。

この場合グリセリンを単一炭素源として約４０ｇ／ｌの
比較的大量で使用し、公知方法で約２４時間である生長
時間の間に消費される。

しかしながら、本発明範囲内では好気性／嫌気性培養法
において嫌気相でグリセリン含量を更に増大する、即ち
微生物によって消費されるよりも多くのグリセリンを添
加すると、なお良好な結果が得られることが判明した。

それ故好ましくはグリセリン含量を、対数の生長相の終
りまで出発値に対して約０．３〜０．５％に下げ、次い
で嫌気性相の間に再び０．８〜１．５％に上げるように
して調節する。

同じようにして、酵母抽出物の代りにビオチンを培地に
添加することが好ましいことが判明した。

好ましいビオチンの濃度は、１０〜１００μｇ／ｌであ
る。

培用温度は常用の範囲内であり、所望の好ましい結果に
対しては温度２５〜４０℃を維持する。

ｐＨは好ましくは６〜９であり、この場合ｐＨを調節す
るためには常用の緩衝剤を使用する。

特に良好な結果は燐酸イオン及びアンモニウムイオンを
含有する緩衝剤によって得られた。

本発明による方法は、公知方法よりも著しく迅速に進行
する。

原則として、既に６〜７時間の発酵後に最適値の酵素活
量が得られる。

培養の終了はｐＨの低下によって容易に認めることがで
きる。

好ましい条件を使用すると、本発明によって酵素活量の
収量９０００Ｕ／１以上が得られる。

これは、公知方法に対して１００倍以上の増大に相応す
る。

更に本発明方法の特性は、アエロバクタ−・アエロゲネ
ス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）ＤＳ
Ｍ１６４３の培養で、公知グリセリン脱水素酵素とは著
しく低いミバエリスの定数ＫＭによって優れているグリ
セリン脱水素酵素が得られることである。

この定数は公知酵素では比較的大きく、１〜４×１０−
２の範囲内であるが、本発明によって使用した前記菌株
からの酵素はＫＭ６．６Ｘ１０−４Ｍを有する。

つまり２０％低く存在する。この好ましい性質に基づい
て、その他は同じ条件下でこの酵素を使用すると、公知
グリセリン脱水素酵素におけるよりも著しくわずかな量
の酵素で一定の変換率が得られる。

それ故ＫＭ６．６ＸＩＦ４Ｍを有するグリセリン脱水素
酵素は本発明のもう１つの課題である。

前述のように、所望の酵素を微生物の生物質から常法で
製出することができる。

例えば、培養懸濁液を直接的に超音波によって溶解し、
不溶性成分を分離した後に、粗製抽出物から酵素を常用
の沈殿剤、例えば硫酸アンモニウムで単離することがで
きる。

硫酸アンモニウムを使用する場合には、好ましくは３５
〜４５％の飽和で分別する。

もう１つの純化は、例えば好ましくは５０〜７０℃で２
〜１０分間加熱することによって行なうことができる。

この場合不純物の１部分を変性し、炉別又は遠心分離す
ることができる。

このようにして、比較量的２０Ｕ／■を有する酵素が得
られる。

培養は、常用の振盪培養又は攪拌下に行なう。

次に実施例につき本発明を説明する。

例１ アエロバククー・アエロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ
ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）ＤＳＭＩ６４３を、１０１の発
酵話中でカゼインのペプトン０．８％、肉のペプトン０
．８％、Ｋ２ＨＰＯ４０，３％、ＮＨ４（２・ＨＰＯ４
） ０．２％、ＮａＣｌ Ｏ，６％、グリセリン１〜２
％及びビオチン５０μｇを含有する培地で３７℃及びｐ
Ｈ７，０で通気及び攪拌下に培養する。

毎時空気３００１を供給し、攪拌を３０Ｏｒ、ｐ、ｍ、
で対数の生長相の終りまで行なう。

対数の生長相の終了後、空気の供給を止め、グリセリン
の添加を始める。

この場合グリセリン濃度は発酵の終りまで（約６時間）
０．３〜０．５％から１．０％に上る。

このようにして、生物質７〜１０ｇ／ｌ及び活量７００
０〜９０００Ｕ／ｌが得られる。

得られた培養懸濁液を超音波装置で３分間溶解し、不溶
性成分を遠心分離し、透明な上澄みで活量の測定を次の
ようにして行なう。

試験溶液： （１）緩衝剤−硫酸アンモニウム溶液 ＮａＨＣＯ３（分子量＝８４．０１）： ０．１２Ｍ＝９．６９ｇ／１ （ＮＨ４）２８０４（分子量＝１３２．１５）：０．０
４Ｍ＝５．０８ｇ／１ ｉｎ−ＮａＯＨでｐＨ１０，０にする （２）ＮＡＤ溶液（分子量＝６６３．４）ｃ＝１０〜１
００：使用した粗製抽出物の試料による （３）グリセリン１．５Ｍ ２回蒸溜した水１００ｍ１に対して８７％のグリセリン
１２．９ｍ１ （４）生理学的食塩水（ＮａＣｌＯ，８５％）ＰＯ４−
緩衝剤０．１Ｍ、ｐＨ７ 試験項目 測定の照射：３６５ｎｍ 試験容量：３．０５ｍ１ 層の厚さ＝１ｃｍ 温度：２５℃ 緩衝剤／（ＮＨ４）２８０． （１）２．６５ｍ１ＮＡ
Ｄ （２）０．１０ｍ１試料
０．１０ｍ１ 混合、前留出物 出発：グリセリン （３）０．２０ｍ１計算
： 更に酵素を精製するために、粗製抽出物を硫酸アンモニ
ウム溶液で分別し、この場合フラクションによって３５
〜４５％の飽和が得られ、ＮａＣ１００８５％を含有す
る燐酸塩緩衝剤（ｐＨ７）０．１Ｍに溶解する。

溶液６０℃で４分間加熱し、遠心分離する。

死活量的２０Ｕ／ｍｇを有する透明なグリセリン脱水素
酵素の溶液が得られる。

このプレパラートのＫＭの測定によって６．６×１０−
４Ｍの値が得られた。

例２ 例１の方法を、アエロバクタ−・アエロゲネス（Ａｅｒ
ｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）ＮＣＩＢ４１８
〔エンテロバクタ−・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂ−
ａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）とも呼ばれる〕を使
用してくり返した。

培養時間は８時間であり、粗製抽出物中の活量は３００
０〜４０００Ｕ／ｌであった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ グリセリン脱水素酵素を形成する微生物を適当なグ
   リセリン含有培地中で好気性培養し、生物質又は培地か
   ら酵素を得ることによって微生物からグリセリン脱水酵
   素を製出する方法において、微生物を先づ好気性条件下
   、次いで嫌気性条件下に培養することからなるグリセリ
   ン脱水素酵素の製出法。 ２ アエロバクタ−・アエロバクタ（Ａｅｒｏｂａｃ−
   ｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）ＤＳＭ１６４３又はＮＣ
   ＩＢ４１８を培養する特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ３ 好気性条件を、Ｌｏｇ相の終りまで維持する特許請
   求の範囲第２項記載の方法。 ４ 嫌気性条件下で、培地に微生物によって消費される
   よりも多くのグリセリンを添加する特許請求の範囲第２
   又は第３項記載の方法。 ５ 嫌気性相で、培地のグリセリン含量を０．３〜０．
   ５％から０．８〜１．５％に高める特許請求の範囲第４
   項記載の方法。 ６ 培地にビオチンを添加する特許請求の範囲第１〜５
   項のいずれか１項に記載の方法。 ７ 温度２５〜４０℃で培養する特許請求の範囲第１〜
   第６項のいずれか１項に記載の方法。