JPH01228490A - 糖リン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 □本発明はへキシュロースリン酸シンターゼ（ＨＰＳ）
産生能を有する新規な微生物を使用して、新規な糖リン
酸を製造する方法に関するものである。

〔従来の技術および発明が解決しようとする問題点〕

従来、例えばメチロコッカス　力プシュレイタス、メチ
ロモナスアミノファシェンス菌等のメタノール資化性菌
のへキシュロースリン酸シンターゼ（ＨＰＳ）は、Ｃ１
化合物資化経路の初発酵素で、リブロース５−リン酸と
ホルムアルデヒドがアルドール縮合して３−へキシュロ
ースリン酸を合成する反応の触媒となる。

しかしながら、この酵素の基質特異性は狭く、リブロー
スＳ−リン酸とホルムアルデヒドのアルドール縮合のみ
しか、触媒能力を示さない（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、＋左
上」、シンターゼざ６．／り７ダ；Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ−Ａｃｔａ＋　！；２３＋　２Ｊｂ−２１
１１１＊／９りざ〕。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者は、基質特異性の広い触媒能力を有す
る酵素を提供すべく、新菌株のスクリーニングを行った
ところ、従来基質特異性が狭いとみられていたベキシュ
ロースリン酸シンターゼ（ＨＰＳ）の基質特異性の広い
触媒能力を有する酵素を産生ずる新菌株を見いだし、本
発明を完成するに至った。

即ち本発明の要旨は、ミコバクテリウム　エスピーＭ　
Ｂ　／　９　（Ｍ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｍ　二ＬＭ　Ｂ
　／デ９が産生するヘキシュロースリン酸シンターゼの
存在下でリブロース３リン酸とグリコールアルデヒド系
化合物とを反応させることを特徴とす本発明で使用する
ヘキシュロースリン酸シンターゼ（ＨＰＳ）産生能を有
する菌株であるｃｏｂａｃｔｅｔ工皿ｊ巨ＭＢ／９は、
本発明者により鳥取市の土壌よりｉ’ｐｇｙ年に採集さ
れた菌でアシ、従来のへキシュロースリン酸シンターゼ
（）ＩＰＳ　）酵素を産生ずる菌株と比べ基質特異性が
広く、ホルムアルデヒド以外の基質とも反応する特徴が
挙げられる。

かかるメタノール資化性細菌Ｍｙｃｏｂａｃ　ｔｅｒ　
ｉｍ　ｓｐ・ＭＢ／？の微生物学的性質は次の通りであ
る。

／　形態学的特徴 普通寒天培地上、３０℃、３日間培養中の性質 ｌ）　外　　　　形　　二　　円　形 り　大　き　さ　：／ｍｍ以下 ３）表面の隆起　：　凸　状 り　表面の形状　：　平　滑 り光　沢：鈍光 ６）色　　　調　：　クリーム色〜白色７）透　明　度
　：　不透明 ざ）周　縁：金縁 υ　細胞形態　：　培養後、／ｇ時間位まで細胞は不均
一に伸長し、分枝する。その後伸長細胞に隔壁が形成さ
れ、漸次分裂をくシ返す。７３時間以降は、はとんどの
細胞が桿状〜短桿菌状の整一な形態に変化する。

、！〕　　細胞分裂様式　　：　　　Ｂｅｎｄｉｎｇ　
ｔｙｐｅ３）運動性：無 り胞子形成　：　無 Ｓ）　グラム染色性　　：　　陽　性 ６）抗　酸　性　二　弱い陽性 −生理学的性質 ｌ）　嫌気条件下での生育　　二　　−り　空気中での
生育　：　＋ リ　カタラーゼ活性　：　＋ リ　オキシダーゼ活性　二　− り　、ブドウ糖（酸の生成）ニー ６）Ｏ−Ｆ　テスト　二　− ７）硝酸塩の還元　二　− ｇ）　ゼラチンの加水分解　　二　　−タ〕　デンプン
の加水分解　　二　　−１ｏ）　　インドールの生成　
：　　−／／）硫化水素の生成　二　− ／２）　Ｍ　Ｒテスト　：　− １３）Ｖ−Ｐテスト　：　− ｌリ　ＤＮａｓｅ　　　　　　：　　　−／、！；）　
　ウレアーゼ活性　二　十／６）生育温度域　：コ。〜
４ｔｓ℃ ／７）炭素源の資化性 グルコース　：　− フルクトース　：　− シュクロース　：　− キシロース　二　− マンニトール　：　− メタノール　：　十 エタノール　二　十 ｎ−プロパツール　　：　　− ホルムアルデヒド　　二　　− アセトアルデヒド　　：　　− ア　　セ　　ト　　ン　　　二　　　−フェノール　二
　− ベンゼンニー ナフタレン　：　− ギ　　　　　　　酸　　二　　− 酢　　　　　　酸　　：　　− ピルビン酸　：　十 シ　　ュ　　　ウ　　酸　　　：　　　−乳　　　　　
　酸　　：　　± マ　　ロ　　ン　　酸　　　：　　　−グルコン酸　：
　士 プロピオン酸　二　− リンゴ酸：　十 フマル酸：　± コハク酸二− り　　エ　　ン　　酸　　　二　　　−エチルアミン　
二　− ジエチルアミン　　：　　− メチルアミン　二　− ジメチルアミン　二　　− トリメチルアミン　　：　　＋ ３　生化学的性質 ／）　　ＤＮＡのＧＣ含量　　　：ｇｑ、ｔ、チり細胞
壁組成　：　■型 アミノ酸−メンジアミノピメリン酸 糖　　　−ガラクトース、アラビノース３）　グリコレ
ート　テスト　　：　　グリコリル型す　　ミコール酸
（π℃州の　＝　　陽　性ｊ）メナキノン組成　：　Ｍ
Ｋ−タ（Ｈ２）９　分類学的考察 以上の微生物学的性質を有する属について、パージエイ
ズマニュアルオプシステマチックバクテリオロジ−（Ｂ
ｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＳｙｓｔｅｍａｔ
ｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）第２巻に基づいて
検索した結果、本菌株（ＭＢ／？）はＭ　ｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ属に帰属する新菌株と同定し、Ｍ　ｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　！部ＭＢ　／デと命名した。

本菌株は、微工研菌寄第９ざ９り号（ＦＥＲＭＰ−９ｇ
９’ｌ）として寄託されている。

本菌株の培養だ必要な栄養物としては炭素源以外はとく
に限られるものではなく通常微生物の培養に用いられる
物が利用される。

即ち、炭素源としてはメタノールを用い、窒素源として
は硝酸塩類、アンモニウム塩類等が挙げられ、無機塩と
してはリン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリ
ウム等が利用できる。

培養温度は−ｏ−１Ｉｏ℃、特に３０〜３７℃が好まし
く、培養は通常／−ｊ日程度、特に３日程度、好気的に
培養をおこなうのが好ましい。

本発明においては上記微生物を利用してリブロース５−
リン酸とグリコールアルデヒド系化合物とから新規糖リ
ン酸の生成反応を行う。

グリコールアルデヒド系化合物としては、Ｃ２〜Ｑの、
好１しくはＱ−Ｃｓのグリコールアルデヒド、メチルグ
リオキザール等が挙げられる。

リブロースＳ−リン酸とグリコールアルデヒド系化合物
の使用モル比は通常／：／で行うのが好ましい。

反応の際、本菌株を前記の様に培養した後、常法に従っ
て分離した酵素を用いても良いし、培養液のまま使用し
てもよく、又公知の担体に固定化しても良い。

これらの酵素は、主として微生物の菌体内に存在してお
シ、菌体から超音波処理、硫安分離、イオン交換クロマ
トグラフィー、ゲル沢過などの公知の方法によって、分
離精製して使用することか出来る。

酵素を抽出する場合は、例えば醗酵を行った培養液を遠
心分離にかけ菌体を得、超音波処理によシ無細胞抽出液
を作成し、次だフェニールセファロース（商品名：ファ
ルマシア社Ｈ）、ＤＥＡＥ−セファセル（商品名：ファ
ルマシア社製９などのカラムクロマトグラフィーを行っ
て３−へキシュロースリン酸シンターゼの精製品を得る
ことが出来る。

本発明方法においては、反応液中にリブロースよ一すン
酸トヘキシュロースリン酸シンターゼとグリコールアル
デヒド系化合物とを添加する。

その際、反応液中で先ずリボース３−リン酸をフォスフ
オリボイソメラーゼでリブロースＳ−リン酸に変換した
後、ヘキシュロースリン酸シンターゼとグリコールアル
デヒド系化合物を添加してもよい。

反応はコｏ　−ｕ　Ｏ’Ｃで行う。反応はグリコールア
ルデヒド系化合物の減少で追跡し、その減少が停止する
まで反応を続けるが、通常、３０分〜３時間程度である
。反応から糖リン酸の採取、精ｆｆＫ際しては、常法に
従い陰イオン交換クロマトグラフィー等によって行えば
よい。

（実施例） 以下、実施例によシ本発明をさらに説明するが、その要
旨を超えない限り、以下の実施例によって限定されるも
のではない。なお実施例における物質の同定はペーパー
クロマトグラフィー、ガスマス等によシ確認した。

（製造例／） 菌培養 培地は硝酸ナトリウム２．０り、硫酸アンモニラムコ・
０２、リン酸水素二カリウム２．０２、リン酸二水素カ
リウムへ０２、硫酸マグネシウム・７水塩Ｏ０λ２、酵
母エキスｉ、ｏｒ、蒸留水／１（ｐＨ７，０）から成る
培地のｇｏ。

ｍｌにｌチ（Ｖ／Ｖ）メタノールを添加し、２１の坂ロ
フラスコて入れた。

殺菌後菌を接種し、３０℃で３日間振盪培養した。

酵素の精製 酵素を抽出する場合は、例えば醗酵を行った培養液を遠
心分離にかけて菌体を得、超音波処理により無細胞抽出
液を作成し、次にフェニールセファロース、ＤＥＡＥ−
セファセル、さらにフェニールセファロースの各カラム
クロマトグラフィーを行い、最終的に７３．り０７ｍ９
の比活性を有する３−へキシュロースリン酸シンターゼ
の精製品を得た。

（実施例１） リポースＳ−リン酸／　００　ｍＭ及び市販のフォスフ
ォリボイソメラーゼ２ＳＯ単位（ｕｎｉ　ｔＳ）を含む
！；ＯｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７・５つ及び！ｒｍ
Ｍ塩化マグネシウムから成る反応液、２５ｍ１を３０°
Ｃで７時間静置することによシ、リポースＳ−リン酸Ｋ
ｌブロースＳ−リン酸に変換した。

この後、フォス７オリボイソメラーゼ２．ｔＯ年単位ｕ
ｎｉ　ｔｓ　）　、ヘキシュロースリン酸シンターゼＳ
Ｏ単位（ｕｎｉｔｓ）及びグリコールアルデヒド１００
ｍＭｆ加え、３０℃で２時間静置し、反応を行わせた。

その経時変化を基質であるグリコールアルデヒドの減少
量で追跡し、その結果を第１図に示した。

この反応物の糖リン酸をイオン交換樹脂ダウエックス（
Ｄｏｗｅｘ　）　／　Ｘ　ｇ　（商品名：ダウケミカル
社製）に吸着させ、０．２Ｍギ酸／　０．２　Ｍギ酸す
）　ＩＪウムで溶出して生成物画分を水酸化バリウムで
飽和したｌｌＮ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ４，，２に
調整後、６倍量のエタノールを加えて沈殿生成させて遠
心分離で沈殿物を取り出した。この沈殿物を水に溶解後
ダウエックス（Ｄｏｗｅｘ　）　！；　ＯＸ　４１　（
）（＋）　（商品名：ダウケミカル社製）を通して陽イ
オンを除去し、溶液中のギ酸をエーテルで抽出して除去
した。この後水相をエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥
精製して弘−へプチュロースー７−リン酸を得た。

この物質のペーパークロマトグラフィー〔展開剤トシて
９０％メタノール、ギ酸、水（ｇｏ　：ｉｓ：ｓ）のｌ
ｏｏｍｌにｏ、ｏ　ｔ　ｒのＥＤＴＡを加えたもの：発
色剤としてノ・−ネスーイシャーウソド試薬〔モリブデ
ン酸アンモニウム過塩素酸〕〕Ｋよる移動率（Ｒｆ値〕
は０．２７でろつた。

〔発明の効果〕

本発明によれば、リブロース３１）ン酸と種々の炭素数
のグリコールアルデヒド系化合物から、従来になかった
炭素数の糖リン酸を容易だ得ることができる。

【図面の簡単な説明】

第７図は、実施例／のダーヘプチュロースー７−リン酸
の生成の経時変化を基質であるグリコールアルデヒドの
減少量で表わした図面である。 出　願　人　　三菱化成工業株式会社 代　理　人　　弁理士　要否用　　− ほか１名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ミコバクテリウムエスピーＭＢ１９ （￥Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｍ￥￥ｓｐ．￥ＭＢ１９）
   が産生するヘキシュロースリン酸シンターゼの存在下で
   リブロース５−リン酸とグリコールアルデヒド系化合物
   とを反応させることを特徴とする糖リン酸の製造方法。