KR100365533B1 - 상처치유 효과를 가진 재조합 거머린의 제조방법 및 이를 함유하는 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 상처치유 효과를 가진 재조합 거머린의 제조방법 및 이를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 메탄올에 의하여 발현이 유도되는 AOX1 프로모터를 가지고 있는 재조합 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 발현 유도를 위하여 자동 피드백 메탄올 공급 조절 시스템을 적용한 DO(dissolved oxygen)-stat 유가배양 방법을 개발하여 엘라스타제 억제활성을 가지는 재조합 거머린을 고효율로 제조하는 방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 거머린은 엘라스타제 억제제로서 포식세포의 화학주성을 억제하는 효과가 있으며, 이를 함유한 약학적 조성물은 상처치유를 위한 치료제로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

상처치유 효과를 가진 재조합 거머린의 제조방법 및 이를 함유하는 약학적 조성물{Method for preparation of recombinant Guamerin and pharmaceutical compositions containing the recombinant Guamerin for wound healing}

본 발명은 상처치유 효과를 가진 거머린 재조합 단백질의 제조방법 및 이를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 메탄올에 의하여 외부 유전자의 발현이 유도되는 AOX1 프로모터를 이용한 재조합 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)의 자동 피드백 메탄올 공급 조절 시스템을 적용한 DO(dissolved oxygen)-stat 유가배양 방법을 개발하여 엘라스타제 억제활성을 가지는 재조합 거머린을 고효율로 제조하는 방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

인간 백혈구의 단구(monocyte) 및 호중구(neutrophil)에 존재하는 것으로 알려진 엘라스타제(elastase)는 탄력섬유(elastic fiber)나 교원섬유(collagen)와 같은 중요한 연결 조직을 감성시키는 세린 프로테아제(serine protease)로, 원형질의 아주르 과립(azurophil granules)에 저장되어 있으며, 세포가 괴사조직과 접하거나 미생물이 식세포의 작용을 받을 때 조직내로 분비된다. 엘라스타제가 염증 부위에서 통제되어지지 않은 채 유리되면, 비특이적인 단백질 분해를 유발할 수 있으며, 이로 인하여 폐기종, 낭종성섬유증, 기관지염, 성인 호흡곤란증후군, 천식, 관절염, 건선 및 췌장염과 같은 질병을 야기하게 된다(Janoff A. et al., Ann. Rev. Med. 36, 207, 1985). 또한 대부분의 경우, 인간 백혈구의 엘라스타제의 기능적 활성은 저해제의 존재 유무에 따라 조절될 수 있는데, 이러한 저해제는 반성 염증 질병에 대한 치료제로 사용될 수 있다.

거머린은 사람의 백혈구와 돼지 췌장의 엘라스타제 특이 저해제로, 우리나라에 서식하고 있는 거머리인 히루도 니포니아(Hirudo nipponia)로부터 정제되었으며, 10개의 시스테인을 포함한 57개의 아미노산으로 이루어져 있음이 아미노산 서열분석을 통하여 밝혀졌다.(Jung, H.I. et al., J. Biol. Chem. 270, 13879, 1995; Kim et al., 1996). 또한 랫트 모델에서 거머린에 의한 췌장염의 치료효과도 밝혀져 관심의 대상이 되어온 물질이다(Song M. et al., Pancreas 18, 231, 1999).

이처럼 거머린은 강력한 엘라스타제 저해제로서 포식세포의 화학주성을 억제하는 효과가 있으므로 항염증 효과를 기대할 수 있는데, 이를 이용한 신약 개발을 위하여 거머린으로부터 직접 필요한 양의 거머린을 대량정제하는 것이 용이하지 않아 그 대체 수단으로 미생물을 이용하여 엘라스타제 억제활성을 보유한 재조합 거머린을 다량 생산하는 것이 중요한 문제로 대두되어 왔다.

거머린 외에 거머리로부터 분리된 다양한 프로테아제 억제제의 생화학적인 특성 및 생물학적인 특성은 이미 연구된 바 있다. 이들 억제제를 생산하는 몇몇의 발현시스템 또한 이들의 치료적 잠재력때문에 개발되어 왔는데, 히루딘(hirudin), 에그린 C(eglin C) 및 히루스타신(hirustasin)이 그 중 집중적으로 연구되어 왔다. 특히, 거머리의 한종류인 히루도 메디시날리스(Hirudo medicinalis)로부터 분리된 트롬빈 억제제 히루딘은 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한 많은 발현시스템을 이용하여 연구되었으며, 그 결과 97% 이상의 순도로 63%의 수득율을 보이며, 1.5 g/ℓ의 수준으로 정제하는데 성공하였다(Rosenfeld S. A. et al., Protein Expr. Purif. 8(4), 476, 1996). 또한, 히루도 메디시날리스로부터 분리된 엘라스타제/카텝신 G 억제제인 에그린 C 역시 대장균에서 발현되어, 그의 반응속도 및 결정학적인 분석이 집중적으로 수행되었다(Baici A. et al., Biochem. J. 218(3), 829, 1984; Hipler K. et al., FEBS Lett. 309(2), 139, 1992). 이외에도 안티스타신, 히루스타신, 벨라스타신, 피거머린, 테인 및 거머린등을 포함한 안티스타신-형 프로테아제 억제제로 알려진 히루스타신이 사카로마이시스 세레비지아에서 낮은 수율로 발현되었으며, 그 구조가 X-선 결정학에 의하여 밝혀졌다(Mittl P.R. et al., Structure 5(2), 253, 1998). 이에 의해 밝혀진 히루스타신(hirustasin)의 구조를 고려할 때, 거머린 내에도 많은 황(-SH) 그룹이 이황화 결합을 이루고 있을 것으로 추측된다. 또한, 억제 활성을 가지기 위하여는 올바른 4차 구조를 형성하는 것이 필요하다. 상기한 구조를 형성하기 위해서는 발현후 분비되는 과정(secretion)을 거치는 것이 필요한데, 이러한 이유로 다른 고등생물과 동일한 분비 과정을 거치는 메탄올 이용 효모(methylotrophic yeast)인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 이용한 발현 시스템이 재조합 거머린을 생산하는데 유용하게 이용될 수 있다.

인간 엘라스타제 억제제의 발현을 위한 몇가지 시스템의 이용가능성은 이전에도 보고된 바 있다. 곤충세포 및 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)를 이용한 발현 시스템에서는 3 내지 8 ㎎/ℓ의 수득율을 보였으며, 키모트립신 및 백혈구 엘라스테아제에 대하여 완전한 억제 활성을 보이는 것을 확인하였다. 인간의 상피에서 유래한 57개 아미노산으로 구성된 엘라핀(elafin) 또한 백혈구 엘라스테아제에 대하여 억제활성을 나타내었으며, 사카로마이시스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae) 역시 갈락토오스 유도 프로모터를 이용하여 약 1 ㎎/ℓ의 수준으로 발현되어 배지로 분비됨이 보고되었다(Cooley J. et al., Protein Expr. Purif. 14(1), 38, 1998; Meckelein B. et al., Biomed. Biochem. Acta. 50, 673, 1991; Heinzel R. et al., Eur. J. Biochem. 160, 61, 1986).

그러나, 지금까지 어떤 엘라스테아제 특이적인 억제제도 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 발현시스템을 이용하였다는 보고는 없었다. 다만, 와그너 등은 피키아 파스토리스 발현시스템을 이용하여 PN-2/A 베타 PP의 KPI 도메인을 대량생산하는데 성공하였는데, 상기 연구에서 57개의 아미노산으로 이루어진1.0 g/ℓ의 분비된 단백질을 배지로부터 발현 정제하여 생화학적인 특성을 확인할 수 있었다(Wagner S.L. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186(2), 1138, 1992).

이외에도 현재까지 많은 이종 단백질이 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 발현 시스템을 이용하여 산업적으로 이용가능한 유효량으로 발현 정제되었다. 일반적으로 피키아 파스토리스 시스템에서는 발현된 단백질의 60 내지 80%가 0.4-4.4 g/ℓ의 수율로 분비되며, 0.3-1.2 g/ℓ가 세포내로 발현된다(Cregg J.M. et al., Bio/Technology 11, 905, 1993; Hollenberg C.P. et al., Curr. Opinion Biotechnol. 8, 554, 1997). 이러한 넓은 범위의 수율은 발효 과정, 발현 도구의 특성 및 목적 단백질의 종류에 따라 달리 나타난다.

피키아 파스토리스 발현 시스템에서는 배양기 동안 유전적 불안정성을 해소하기 위하여, 발현벡터가 피키아 파스토리스의 염색체 DNA내로 삽입되는 방법이 도입되었다. 최근, 재조합 거머린을 생산하는 피키아 파스토리스가 제조되었는데(한국특허출원번호 : 98-27344), 이는 거머린의 구조 유전자가 분비되도록 하기위하여 α-factor 리더 시퀀스와 융합되어 있고, 숙주 DNA내로 삽입되도록 하였다.

본 발명에서는 삽입된 카세트 수의 측정, 제한 효소 분석 및 DNA 염기서열 분석방법을 이용하여 피키아 파스토리스 염색체내로 삽입된 거머린 구조유전자의 안정성을 확인하였으며, 이를 이용하여 재조합 거머린의 고밀도 세포배양에 성공하였다. 또한, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 발현 시스템에 있어 메탄올을유도 인자로서 이용할 수 있는 AOX1 프로모터를 발현벡터에 사용하였는데, AOX1 프로모터의 조절하에서 외부 유전자들은 메탄올 비존재시 미발현 상태가 유지되며, 메탄올 포함배지로 교체되면서 효율적으로 발현되는 원리를 이용하여 용존 산소(DO) 농도와 관련된 자동 피드백 메탄올 공급 조절 시스템을 자체적으로 개발하였다.

이에 더하여 본 발명자들은 상기한 방법에 의하여 고효율로 생산된 재조합 거머린을 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물이 상처치유에 효과적임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 메탄올에 의하여 외부 유전자의 발현이 유도되는 AOX1 프로모터를 이용한 재조합 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)의 자동 피드백 메탄올 공급 조절 시스템을 적용한 DO(dissolved oxygen)-stat 유가배양 방법을 개발하여 재조합 거머린을 고효율로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 방법을 이용하여 제조한 재조합 거머린을 유효성분으로 포함하며, 상처치유 효과를 가지는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 피키아 파스토리스를 이용한 재조합 거머린의 발현을 위해 사용된 발현벡터(8.2 kb)의 개열지도로서 AOX1 프로모터와 AOX1 터미네이터 사이에 거머린의 cDNA 유전자(171bp)가 삽입된 것을 나타낸 것이고,

도 2는 선별클론인 #3-32와 #12-44의 엘라스타제 억제활성을 비교한 것이고,

도 3은 무작위로 선택된 콜로니의 영양요구형 선별 표지 실험결과를 나타낸 것이고,

도 4는 재조합 피키아 파스토리스의 게놈 내에 삽입된 발현카세트의 수를 서던 블로팅에 의하여 확인한 결과를 나타낸 것이고,

제 1열 : 사이즈 마커(λ/BstEⅡ) 제 2열 및 제 3열: 숙주 균주 GS115

제 4열 : 거머린 유전자를 포함하는 발현카세트 1개가 삽입된 대조군 균주

제 5열: 선별 균주 #3-32 제 6열 : 사이즈 마커(λ/BstEⅡ)

도 5는 피키아 파스토리스의 게놈내에 2개의 발현카세트가 삽입되었을때, 예측되는 개열지도를 나타낸 것이고,

rG : 재조합 거머린 S : α-factor 리더 서열

TT : 터미네이터 5'AOX1 : AOX1 프로모터

* : 돌연변이

도 6은 피키아 파스토리스의 게놈내에 2개의 발현카세트가 삽입되었을때, BglⅡ/His4(A), BglⅡ/거머린(B), EcoRⅠ/His4(C) 및 EcoRI/거머린(D)의 다양한 조합을 이용한 서던 블로팅결과를 나타낸 것이고,

A- 제 1열 : 사이즈 마커(λ/BstEⅡ) 제 2열 및 제 3열: 숙주 균주 GS115

제 4열 : 거머린 유전자를 포함하는 발현카세트 1개가 삽입된 대조군 균주

제 5열: 선별 균주 #3-32 제 6열 : 사이즈 마커(λ/BstEⅡ)

B- 제 1열 : 사이즈 마커(λ/BstEⅡ)

제 2열 : 거머린 유전자를 포함하는 발현카세트 1개가 삽입된 대조군 균주

제 3열: 선별 균주 #3-32 제 4열 : 사이즈 마커(λ/BstEⅡ)

C- 제 1열 : 숙주 균주 GS115

제 2열 : 거머린 유전자를 포함하는 발현카세트 1개가 삽입된 대조군 균주

제 3열: 선별 균주 #3-32 제 4열 : 사이즈 마커(λ/BstEⅡ

D- 제 1열 : 거머린 유전자를 포함하는 발현카세트 1개가 삽입된 대조군 균주

제 2열: 선별 균주 #3-32 제 3열 : 사이즈 마커(λ/BstEⅡ)

도 7은 70세대까지 반복 배양하여도 거머린의 구조 유전자를 포함하는 DNA 절편이 동일하게 관찰되는 유전적 안정성을 나타내는 서던 블로팅의 결과를 나타내는 것이고,

제 1열 : 세대수 7.5 제 2열 : 세대수 18.3

제 3열 : 세대수 28.6 제 4열 : 세대수 40.1

제 5열 : 세대수 47.4 제 6열 : 세대수 58.8

제 7열 : 세대수 70.1 제 8열 : 사이즈 마커(λ/BstEⅡ)

도 8은 재조합 거머린을 생산하는 피키아 파스토리스의 고밀도 세포배양을 나타낸 그래프이고,

도 9는 유도후 메탄올 공급율의 시간별 변화를 나타내는 그래프이고,

─ : 자동 피드백 조절 -- : 수동 조절

도 10은 본 발명의 개선된 재조합 거머린 제조 방법의 시간별 배양양상을 나타낸 그래프이고,

● : 건조군체량 ▼ : 재조합 거머린의 활성

○ : 잔여 글리세롤 농도 ▽ : 잔여 메탄올 농도

도 11은 일반적인 재조합 거머린 제조 방법의 시간별 배양양상을 나타낸 그래프이고,

● : 건조군체량 ▼ : 재조합 거머린의 활성

○ : 잔여 글리세롤 농도 ▽ : 잔여 메탄올 농도

도 12는 유도 후 세포내 및 세포외 제조합 거머린의 축적 양상을 비교한 웨스턴 블럿 사진이고,

제 1열 및 제 10열 : 정제후 재조합 거머린

제 2, 3, 4, 5열 : 유도후 0, 6, 18, 25 시간 후의 총 세포 분쇄물

제 6, 7, 8, 9열 : 유도후 0, 6, 18, 25 시간 후의 배양 상등액

도 13a는 본 발명의 DO-stat 알고리즘을 나타내는 것으로서, 교반에 의한 용존 산소의 조절기작을 나타내는 것이고,

도 13b는 본 발명의 DO-stat 알고리즘을 나타내는 것으로서, 메탄올 공급율에 의한 용존산소의 조절기작을 나타내는 것이고,

도 14는 소수성 결합 크로마토그래피(A) 및 역상 크로마토그래피(B)를 이용한 재조합 거머린의 정제결과를 흡광도 및 엘라스타제 억제활성으로 나타낸 그래프이고,

도 15는 각 정제과정 결과 수득한 재조합 거머린의 C18 역상 HPLC 분석결과를 나타내는 그래프이고,

A : 배양 상등액

B : 소수성 결합 크로마토그래피 정제후 엘라스타제 억제활성을 보이는 분획

C : 역상 크로마토그래피 정제후 엘라스타제 활성을 보이는 분획

도 16은 재조합 거머린이 PPE에 동일한 몰수로 결합함을 나타내는 결합화학양론 및 억제속도론 그래프이고,

도 17은 재조합 거머린의 pH(A) 및 온도(B) 안정성을 나타내는 것이고,

도 18은 정제된 재조합 거머린의 질량 분석기를 이용한 메스 스펙트럼을 나타내는 그래프이고,

도 19는 재조합 거머린을 피브린 접합제에 첨가하여 세균감염이 차단된 상태에서 상처에 적용하였을 경우, 대조군에 비하여 빠른 상처치유 효과를 보이는 것을 육안 관찰로 나타낸 사진이고,

도 20은 재조합 거머린을 피브린 접합제에 첨가하여 세균감염이 차단된 상태에서 상처에 적용하였을 경우, 대조군에 비하여 결체조직의 변성현상이 감소되는 것을 현미경으로 관찰한 사진이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 재조합 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)의 자동 피드백메탄올 공급 조절 시스템을 적용한 DO(dissolved oxygen)-stat 유가배양 방법을 개발하여 재조합 거머린을 고효율로 제조하는 방법을 제공한다.

상처치유제의 개발을 위하여 대량 발현하여야 하는 본 발명의 거머린 단백질의 경우, 거머리로부터 필요한 양의 거머린 단백질을 대량 정제하는 것이 용이하지 않으므로 그 대체 수단으로 미생물을 이용한 거머린의 과다 발현이 필요하다. 게다가 거머린은 전체 57개의 아미노산 이외에 10개의 시스테인을 포함하고 있어, 거머린과 마찬가지로 거머리로부터 분리된 또 다른 세린 프로테아제(serine protease) 억제제인 히루스타신(hirustasin)의 구조를 고려할 때, 많은 황화(-SH) 그룹이 이황화 결합을 이루고 있을 것으로 추측되므로, 억제 활성을 위하여는 올바른 3차 구조를 형성하는 것이 중요하다. 따라서, 본 발명자들은 발현 단백질의 구조 형성에 있어 가장 중요한 과정인 분비과정(secretion)을 다른 고등생물과 동일하게 거치는 메탄올 이용 효모 (methylotrophic yeast) 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 이용한 발현 시스템을 재조합 거머린 생산을 위하여 도입하였다.

본 발명에서 제공하는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 발현시스템은 배양하는 동안 야기되는 삽입 유전자의 유전적 불안정성을 해소하기 위하여, 발현벡터가 피키아 파스토리스의 게놈 DNA내로 삽입되는 방법이 도입되었으며, 고농도 세포 배양 및 대량 배양이 가능하여 다양한 이종 단백질이 이를 이용하여 산업적으로 이용가능한 유효량으로 발현 정제되어왔다.

본 발명에서는 아직까지 산업적으로 유효한 양으로 발현되어 정제된 바 없는 거머린을 피키아 파스토리스 발현시스템을 이용하여 대량 발현시키고자 먼저 α-factor 리더 시퀀스와 함께 거머린 유전자가 게놈내로 삽입된 재조합 피키아 파스토리스의 유전학적 특성을 분석하였다. 본 발명의 재조합 피키아 파스토리스 게놈 DNA에는 두 카피의 거머린 구조 유전자가 삽입되어 있었으며, 삽입된 거머린 구조유전자는 70 세대까지 안정함이 확인되었다.

실제로 미생물을 이용한 대량 발현에 있어 수회에 걸친 종자 배양을 포함하여 생산 과정 전체에 걸쳐 유전적 안정성이 보장되어야 한다. 실제로 종자배양을 위하여 최초로 제공되는 세포인 MCB(master cell bank)로부터 최종의 발현단계 세포까지의 배양을 위하여 평균 5 내지 7회의 세대를 거쳐야 하며, 대량 규모의 발효에 있어서 배양 규모를 증가시키 위해 더 많은 세대를 거친다고 해도 20 세대 이상을 초과하지는 않는다. 따라서, 70 세대까지의 구조 유전자의 안정성 보장은 연속배양이 충분히 가능함을 의미한다.

따라서, 재조합 피키아 파스토리스을 이용한 수 세대에 걸친 고농도 세포 배양이 가능함을 확인하였으며, 이를 이용하여 본 발명자들은 용존 산소의 농도에 의하여 자동으로 배지의 공급이 조절되는 DO-stat 유가배양(fed-batch culture) 방법을 개발하였다.

피키아 파스토리스 발현시스템에서는 AOX1 프로모터가 이용된다(Buckholz et al., 1991, Cregg et al., 1993). AOX1 프로모터 시스템에서는 메탄올이 알코올 산화효소에 의하여 우선적으로 산화되어 탄소원으로 이용된다. 알코올 산화효소는 글루코오스, 글리세롤 또는 에탄올과 같은 탄소원을 이용하여 배양된 세포에서는 검출되지 않으나, 메탄올 포함배지에서 성장한 세포에서는 총 수용성 단백질의30%를 차지한다. 따라서, AOX1 프로모터의 조절하에서 삽입된 외부 유전자들은 메탄올 비존재하에서는 미발현 상태가 유지되며, 메탄올 포함배지로 교체되면서 효율적으로 발현되게 된다. 결국, 메탄올은 탄소원으로서 이용됨과 동시에 유도인자의 역할을 하게 된다.

또한, 용존 산소는 알코올 산화효소에 의한 메탄올 산화에 있어, 중요한 역할을 한다(Couderc, R. et al., Agric. Biol. Chem. 44, 2279, 1980). 이러한 이유로 적절한 용존 산소(DO) 농도의 유지와 관련된 메탄올 공급 방법이 본 발명의 피키아 파스토리스 발현시스템을 이용한 재조합 거머린의 제조방법에 있어 매우 중요한 인자이다.

피키아 파스토리스 배양시, 충분한 산소 분자만 존재하면 메탄올은 산화적 경로를 거치게 되지만, 산소가 결핍되면 메탄올의 더 이상의 산화가 억제되고, 배양액 내에 메탄올이 축적되게 된다. 이때, 축적된 메탄올은 세포 배양액 내에 치명적인 독성을 야기할 수 있으며, 동시에 재조합 거머린의 발현을 저해하게 된다. 따라서, 메탄올 농도 및 용존 산소의 농도는 메탄올에 의한 피키아 파스토리스의 발현 유도 후 유가식 회분 배양기에 있어 매우 중요한 조절요인이 된다. 메탄올 및 용존 산소에 의한 발현 과정의 조절은 복잡한 상호 의존적 관계에 의하며, 이러한 상호 의존성 없이는 효율적으로 수행될 수 없다.

피키아 파스토리스의 배양을 위한 기존의 일반적인 회분 배지 공급배양 방법에 있어, 메탄올 공급은 지표로서 사용되는 DO 수준에 따라 수동으로 변화되었다. DO의 수준은 교반에 의한 공기 도입시 산소 혼합 및 교반속도의 수동 조작에 의하여 유지되었으며, 양자 모두 변량은 독립적으로 조절되었다. 그러나, 메탄올 공급에 있어 이러한 수동 조절은 과공급 및 저공급이 유발될 수 있어 적합하지 않다.

본 발명에서 제공하는 두개의 상호연관된 순환 체계를 이용한 DO-stat 유가 배양(fed-batch culture) 방법은 이러한 메탄올 과발현 및 저공급을 방지하기 위한 조절 수단을 개선한 것이다. 본 발명자들은 보다 정교한 메탄올 공급 조절을 위하여,자동 피드백 메탄올 공급 조절 시스템을 적용하였다. 이는 산소 결핍 및 초과 메탄올 공급으로부터 세포를 보호하는 수단이 된다. 상기 방법은 효과적으로 공급과정을 조절하기 위하여 컴퓨터 시스템을 이용한다.

두개의 상호연관된 순환 체계를 이용한 안정된(balanced) DO-stat의 개념은 재조합 단백질 생산 시스템에 있어 아세트산의 배출조절 개념(Konstantinov K. et al., Biotech. Bioeng. 36, 750, 1990)이 적용되었다. 이들은 미리 결정된 한계수치 내에서 교반 속도의 변화에 의하여 DO 수치를 조절하였으며, 교반속도를 모니터함으로써 영양공급율을 조절하였고 이러한 효율적인 영양공급은 탄소원을 완전하게 이용될 수 있도록 하였다. 그러나, 상기 과정을 피키아 파스토리스 시스템의 메탄올 공급에 직접 적용하기에는 문제가 있었다.

DO-stat의 안정적인 조절을 위해 요구되는 조건은

OTR<OUR_max이다.

OTR은 산소 전이율(oxygen transfer rate)이고, OUR_max는 산소 수득율의 최대 가능수치(maximum potential value of the oxygen uptake rate)로, 이들은 세포수및 생물량 농도의 생리적 상태에 따른다. OUR은 또한 영양소모율과 밀접하게 연관되어 있는데, 영양소모율이 높아져 메탄올이 탄소원으로 이용될때, OUR 역시 고수치로 유지된다. 즉, 효율적인 배양공정의 경우 OUR은 산소수득율의 최대가능수치인 OUR_max에 접근하게 된다. DO가 좁은 교반 속도의 범위(1300-1350 rpm)내에서의 OTR의 변화에 의하여 조절되고, 교반 속도가 고정 수치를 벗어날 때만 영양공급율이 변화되면, 영양공급율과 OUR은 설정된 교반속도의 한계수치에 의하여 제한된다. 결국, 세포는 OTR 수치에 의존적으로 직선상으로 성장하고, OUR 및 영양수득율은 이 OTR값에 따라 특정 수치로 설정되게 된다. 균체의 최대 영양요구량 및 이에 수반되는 OUR_max는 세포 농도와 밀접하게 연관되어 있기 때문에, 세포 농도가 커질수록 OUR과 OUR_max의 차이는 더 커지게 되고, 발현과정의 효율성은 낮아지게 된다. 이러한 원리는 아세트산의 축적을 막는데 있어 효율적이나, 미생물의 고농도 세포 배양에는 적합하지 않다.

미생물의 고농도 세포 배양을 위한 DO-stat 원리의 적용은 DO가 OUR 및 OTR의 조절에 의하여 직접적으로 조절되는 다른 간단한 구조로 현실화 될 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 OTR 및 OUR의 동시적인 조절에 의하여 조절되는 DO-stat의 개념을 도입하였다. 본 발명에서 피키아 파스토리스의 세포농도는 메탄올이 공급되는 유도 후 회분 배양 초기시점에 140 g/ℓ까지 도달하는데, 이때 산소요구량이 너무 커서 압축공기만으로 통기를 시키는 경우 최고 교반속도에서도 OTR값이 OUR을 유지할 수 없다. 이러한 이유때문에, 공기 도입부에서의 순수 산소의 혼합비율을변화시킴으로써 DO-stat 회분 배양 과정을 위한 OTR을 조절하게 된다. 본 발명자들은 이와 동시에 또한 메탄올 공급율의 조절에 의하여 OUR을 조절하였다. 제안된 조절기작은 두개의 상호연관된 순환체계로 구성되도록 고안되었으며, DO는 좁은 범위의 설정 수치(40-45%)로 조절되었다. 첫번째 순환 체계는 가스 도입부의 순수 산소의 함량 변화에 기인하는 OTR의 조절을 통하여 DO를 조절한다(도 13a 참조). DO 수치가 DO 설정 수치이하(DO_low)로 떨어지면, 공기 도입부에서의 순수 산소비율의 설정수치가 높게 조절되고, DO 수치가 DO 설정 수치이상(DO_up)으로 올라가면, 공기 도입부에서의 순수 산소비율의 설정수치가 낮게 조절된다. 이와 동시에, 메탄올 공급율의 변화에 의한 OUR 조절을 통하여 두번째 순환체계가 DO 수치를 조절하게 된다(도 13b 참조). DO 수치가 DO 설정수치 이하로 떨어지면(DO_low), 이는 메탄올이 과잉 공급됨을 의미하고, 메탄올 공급율은 낮은 수치로 조절된다. DO 수치가 DO 설정수치 이상으로 올라가게 되면(DO_up), 이는 메탄올의 공급 부족을 의미하게 되고, 메탄올 공급율이 높은 수치로 조절되게 된다. 이러한 순환체계는 30초마다 측정되어 조절된다.

구체적으로 재조합 거머린 생산을 위한 DO-stat 유가 배양(fed-batch culture) 방법에 있어, 배양은 4단계, 즉 접종물(inoculum), 회분 배양, 유도 전 유가 배양 및 유도 후 유가 배양으로 수행된다. 먼저, 접종물을 글리세롤을 포함하는 YPD 배지를 이용하여 배양한후, 최소 염배지를 포함하고 있는 발효기로 접종한다. 발효기 내의 pH는 15%(v/v) NH₄OH 및 30%(v/v) H₃PO₄의 자동조절 첨가에 의하여 pH 5.1로 유지된다. 용존 산소의 수준은 자동 교반조절기와 유입가스의 산소 분압조절에 의하여 30% 이상의 포화도가 유지되도록 한다. 유입가스의 산소 분압조절은 공기와 순수산소의 유입구에서 2-가스 혼합기를 이용하여 컴퓨터 시스템으로 조절되며, 발효용기의 온도는 30℃로 유지된다. 세포는 글리세롤이 모두 소모될 때까지(세포 건량 > 25 g/ℓ) 회분 배양 방식으로 15시간 배양된다.

이후, DO-stat 유가 배양을 글리세롤과 효모 미량금속 용액을 포함하는 글리세롤 배지를 이용하여 수행한다. 이때, DO의 수준이 50% 포화도 이상으로 올라가면, 배지 공급 펌프가 작동되고, DO 수준이 떨어지게 되면, 배지 공급펌프의 작동이 중단되게 된다. 이러한 과정은 바이오코멘드(New Brunswick Scientific Co.) 소프트웨어를 이용하여 30초마다 DO 수준을 점검하여 반복된다. 마지막으로, 메탄올 및 효모 미량금속 용액을 포함하는 배지를 공급하여 거머린의 생산을 유도하는데, 배지 공급 속도는 단계적으로 증가되며, 초기 유도 과정시 4시간 동안은 프로모터의 발현을 활성화하기 위한 낮은 배지 공급비율을 유지한다.

본 발명의 개선된 DO-stat 유가배양 방법에 있어서, 처음 3 단계는 일반적인 회분배양 과정과 동일하게 수행된다. 그러나, 메탄올 유도 후, 회분 배양 공급 단계에서 DO는 40-45%의 좁은 범위에서 조절된다. DO 수치가 고정수치 이하로 떨어지면 공기 도입부에서의 순수 산소비율이 높게 조절되고, DO 수치가 고정수치 이상으로 올라가게 되면, 공기 도입부에서의 순수 산소비율이 낮게 조절된다. 동시에DO 수치가 고정수치 이하로 떨어지면 메탄올 공급율이 떨어지며, DO 수치가 올라가게 되면, 메탄올 공급율이 올라가게 된다. 이러한 순환 체계는 매 30 초마다 조절되게 된다. 이러한 자동 조절은 인터페이스를 통하여 발효기와 연결된 컴퓨터 시스템을 이용하며, 용존산소량, pH, 온도 및 교반 속도, 영양 펌프 속도등 수집된 데이타는 바이오코멘드 소프트웨어에 의하여 분석 및 조절된다.

본 발명의 개선된 DO-stat 회분 배양 방법이 의하여 생산된 재조합 거머린은 수동으로 배지 공급이 조절되는 기존의 회분 배양 결과와 비교하여 40% 이상의 높은 발현율을 나타내었으며, 재조합 거머린이 발현 이후 즉시 배지내로 분비되어 본 발명의 DO-stat 유가 배양 방법에 의한 재조합 거머린의 제조방법이 효율적임을 확인하였다.

또한, 본 발명은 상기의 방법을 이용하여 제조한 재조합 거머린을 유효성분으로 포함하며, 상처치유 효과를 가지는 약학적 조성물을 제공한다. 상기한 방법에 의하여 생산된 재조합 거머린을 상처치유 효과를 가지는 약학적 조성물에 이용할 수 있는지는 확인하기 위하여 본 발명자들은 재조합 거머린을 정제하여 이의 생화학적 특성을 밝혔다.

1) 엘라스타제 억제활성

재조합 거머린을 생산하는 피키아 파스토리스가 화학적으로 성분이 명백한 배지를 이용하여 배양되었기 때문에, 복합 배지로부터의 단백질 오염에 대한 문제점은 해결되었다. 따라서, 페닐 세파오로스(phenyl sepharose 6FF)를 이용한 소수성 결합 크로마토그래피(HIC) 및 C8 역상 크로마토그래피(RPC)를 이용한 간단한 정제 방법을 이용하였다. 정제된 재조합 거머린은 C18 역상 HPLC를 이용하여 분석되었으며, 또한 SDS-PAGE를 통하여 균일하게 정제되었음을 확인할 수 있었다. 마지막 정제 수율은 약 68% 였으며, 정제후 거머린의 엘라스타제 억제활성은 9.3 배 증가함을 확인하였다.

엘라스타제 억제활성은 돼지의 췌장 엘라스타제와 N-숙시닐-Ala-Ala-Ala-p-니트로아닐리드(N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide)을 효소 및 기질로서 사용하여 측정하였으며, 1 억제 유니트(iu)는 주어진 조건에서 기질로부터 1μmole p-니트로아닐리드의 유리를 억제하는 억제제의 양으로 정의한다. 억제상수(Ki)는 결합 동력학(tight-binding kinetics)에 근거하여 결정하였으며, 하기의 방정식을 이용하여 계산되었다.

α = 1-[(E₀+I₀+K_i)-{(E₀+I₀+K_i)²-4E₀I₀}^1/2]/(2E₀)

상기에서 α는 억제제에 결합하지 않는 엘라스타제의 분획활성이고, E₀및 I₀는 효소 및 억제제 각각의 초기농도이다.

2) 재조합 거머린의 pH 및 온도 안정성

정제된 재조합 단백질의 pH 및 온도에 대한 안정성을 조사한 결과 pH 1- 12의 범위에서 24 시간 동안 방치하여도 90% 이상의 활성을 보이고, 90℃ 이상의 온도에서 6시간 방치하여도 90% 이상의 활성을 나타내었다.

이러한 pH 및 온도의 안정성은 거머린의 많은 이황화 결합에 의해 부여된 경직성 및 조밀함에 의하여 나타나는 것으로 예측되며, 이는 본 발명에서 제공하는 제조방법에 의한 재조합 거머린이 올바른 구조를 형성하며 발현되었음을 의미한다.

3) 재조합 거머린의 생체내 면역화 반응

인간-비유래 단백질의 신약 제제로서의 이용은 생체내에서 이들 단백질의 면역반응 유발 여부가 중요한 문제가 된다. 본 발명의 재조합 거머린은 그 자체로는 체액성 면역 반응을 유발하지 않으므로, 면역반응 유발로 인한 시약 개발의 한계를 극복하는데 문제가 없음을 확인하였다.

4) 재조합 거머린의 아미노산 서열분석

정제된 재조합 거머린이 천연상태의 거머린과 동일한 아미노산 서열과 분자량을 가지는지 확인하기 위하여, N-말단 서열 분석, 아미노산 구성분석 질량 분광분석을 수행하였다. 그 결과, 본 발명의 재조합 거머린은 천연 거머린과 동일한 아미노산 서열 및 구성을 가지고 있음이 확인되었다. 재조합 거머린의 분자량은 질량 분광 분석 결과, 6,110이었으며, 이 역시 천연 거머린과 동일하였다.

따라서 본 발명의 재조합 거머린은 상처치유를 위한 신약개발에 유효성분으로 이용될 수 있는 충분한 잠재력을 가지며, 이를 확인하기 위하여 본 발명자들은실제로 재조합 거머린을 포함하는 약학적 조성물을 이용한 상처치유 효과를 측정하기 위하여 생쥐를 이용한 동물실험을 수행하였다.

거머린은 강력한 엘라스타제 억제제로서 포식세포의 화학주성을 억제하는 효과가 있으므로 항염증 효과를 기대할 수 있는데, 한편으로는 박테리아의 감염이 있는 경우 감염초기에 포식세포가 일차적인 포식작용을 못하게 되므로, 오히려 세균 감염에 의한 염증상태가 악화되어 질 수 있다. 본 발명에서는 재조합 거머린을 피브린 접합제에 첨가하여 세균감염을 차단한 상태로 적용하였을 경우에 대조군에 비하여 빠른 상처치유 효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명에서 제조된 재조합 거머린을 이용한 신약 개발을 위하여, 안전성 실험의 일환으로 급성 독성 및 항원성의 존재 여부를 ICR 마우스, 기니픽 및 마우스-랫트 모델에서 확인하였다.

급성독성시험 결과, 투여용량군에서 시험기간동안 사망한 동물은 없었으며, 어떠한 임상증상도 나타나지 않았다. 또한, 암수의 투여용량군에서 대조군과 비교하여 유의성있는 체중변화가 관찰되지 않았다. 육안적 부검소견에 있어서도 대조군과 투여용량군에서 사망개체는 없었으며, 생존개체에서도 특이할만한 부검소견이 관찰되지 않았다. 따라서, 거머린의 정맥투여에 의한 최대 무독성량(무해용량)은 1,000 ㎎/㎏ 이상일 것으로 추정할 수 있다.

항원성 여부 조사를 위한 능동 전신성 아나팔락스 반응시험의 결과에서도 특이한 아나팔락시스 증상이 관찰되지 않았으며, 수동 피부 아나팔락시스 시험결과 역시 음성으로 나타났다.

결론적으로 본 발명의 재조합 거머린은 임상시험에서 항원성으로 인한 부작용을 일으킬 가능성이 희박하며, 인체에 투여시 특이한 아나팔락시스 반응을 유발하지 않을 것으로 예측된다.

상기의 약학적 조성물은 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 약학적 조성물은 실제 임상투여시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 세균감염을 차단하기 위하여, 재조합 거머린을 함유하고 있는 피브린 접합제와 함께 처치하였다.

상처치유를 위한 재조합 거머린의 유효용량은 상처 ㎠ 당 1 ng 내지 100 mg이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 피키아 파스토리스 발현 시스템의 유전적 안정성 확인 및 이를 이용한 고농도 배양

<1-1> 발현 균주의 제조

피키아 파스토리스 발현 시스템을 이용하여 재조합 거머린을 생산하기 위하여 먼저 거머린의 cDNA 라이브러리로부터 PCR을 통하여 얻은 거머린의 구조 유전자를 KEX2 절단 부위를 포함하는 α-factor 리더 서열와 융합시켜 pGS29A 발현벡터를 제조한 뒤, 피키아 파스토리스 GS115, his4 strain내로 형질전환시켜 피키아 파스토리스를 이용한 발현 균주를 제조하였다(한국 특허출원 98-27344). 유전자는 염색체 내의 his 4 지역과 벡터의 HIS4 마커 사이의 한번의 교차에 의해 삽입되었다.도 1은 pGS29A 발현벡터를 나타낸다.

<1-2> 클론선별 및 MCB 준비

피키아 페스토리스 호스트 스트레인 GS115 는 복합배지인 YPD(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 포도당), 그리고 형질전환체는 MD(1.34% YNB, 4X10^-5% 바이오틴, 2% 포도당)에서 배양 되었다. 발현벡터인 pGS29A로 메탄올 자화 효모인 피키아 페스토리스 GS115를 형질전환 시키기 위하여 스페로 프라스트(sphero flast) 방법을 사용하였다. 형질전환체를 히스티딘 결손배지인 MD에 도말하여 30℃에서 콜로니가 나타날 때까지 배양하였다. 1차 선택된 수백개의 클론을 액체배양액 MGY(1.34% YNB, 4X10^-5% 바이오틴, 1% 글라이세롤)에 접종하고, 30℃, 250 rpm으로 진탕배양후 배양세포의 농도가 600nm에서 2~6의 OD에 도달하였을 때, 형질전환체의 단백질 발현을 유도하는 MM 액체배양액(1.34% YNB, 4X10^-5% 바이오틴, 0.5 % 메탄올)으로 바꿔주고, 30℃, 250 rpm으로 72시간 더 진탕배양하였다. 상기 배양액을 원심분리후 상등액을 취하여 에라스테이즈 에제 활성을 1차적으로 조사 비교하였다.

엘라스타제 억제활성 측정을 위한 효소 및 기질로는 돼지의 췌장 엘라스타제(PPE, Sigma)와 N-숙시닐-Ala-Ala-Ala-p-니트로아닐리드(N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide)를 사용하였다. 반응은 0.05M Tris-HCl(pH 8.0)의 완충용액하에서 수행되었다. 구체적으로, 0.1 유니트의 PPE를 포함하는 완충용액에 동일부피의 샘플용액을 첨가하여 잘 혼합한 후, 0.1 mM 기질용액을 3배 부피로 첨가하고, 25℃에서 10분간 반응시킨 후, 410 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 1 억제 유니트(iu)는 주어진 조건에서 기질로부터 1 μmole p-니트로아닐리드의 유리를 억제하는 억제제의 양으로 정의한다. 엘라스타제 억제활성을 나타내는 비율(%)은 샘플 대신 0.05M Tris-Cl(pH 8.0) 완충용액을 대조군으로 이용하였을 때, 생성된 p-니트로아닐리드에 대하여 감소된 비율로서 정의된다.

그 결과, 가장 높은 엘라스테이즈 억제 활성을 지닌 두 개의 클론 #3-32 및#12-24가 선별되었으며, 좀더 정확한 비교를 위하여 메탄올 발현 유도를 3일간 실시하는 하기와 같은 실험을 수행하였다. #3-32 및 #12-24가 단일 클론을 최소배지에 접종한 후, 15시간동안 배양하였다. 원심분리를 통하여 세포만 회수한후 글리세롤 대신 0.5% 메탄올을 포함하는 최서배지에 분산시켰다. 매 24시간 마다 배양액의 최종 메탄올 농도가 0.5%가 유지되도록 메탄올을 첨가하였고 이것을 3일간 유지하였다. 상기와 같은 방법으로 #3-32와 #12-24 균주의 엘라스테이즈 억제활성을 비교하였다. 최종적으로도 2에서 보듯이 3일간의 메탄올 유도에 의하여 클론 #3-32가 #12-44에 비하여 높은 엘라스타제 억제활성을 나타내었으므로 클론 #3-32를 종자배양을 위한 원균주로서 제공되는 MCB(master cell bank) 준비를 위하여 선별하였다.

MCB 준비를 위하여, 상기의 재조합 피키아 파스토리스 #3-32를 YPD 배지로 16시간동안 배양한 후, 배양액을 50% 글리세롤과 1:1로 혼합한 다음 튜브(cryo-tube, Corning)로 옮겨 -70℃로 보관하였다.

배양액 내의 균질성을 확인하기 위하여, MCB의 1개 튜브로부터 생성된 360개 콜로니의 영양요구 선별 표지인 his4에 대한 표현형을 분석하였다. L-히스티딘을 포함하는 비선별 배지로부터 콜로니를 L-히스티딘이 존재하지 않는 선별 배지로 옮겨 37℃에서 18시간 배양한 결과, 모든 콜로니가 새로운 콜로니를 생성하였다(도 3). 이는 MCB 내의 모든 콜로니가 게놈내에 균일하게 발현 카세트를 포함하고 있음을 의미한다.

<1-3> 재조합 피키아 파스토리스의 유전적 형질 분석

거머린의 구조 유전자를 포함하는 카세트의 삽입여부는 제한효소 처리후 서던 블로팅을 수행하여 게놈 DNA를 분석함으로써 확인하였다. 재조합 피키아 파스토리스로부터의 DNA 추출은 이지-DNA 키트(easy-DNA kit, Invitrogen Co.)를 이용하여 수행하였으며, 서던 블로팅은BglⅡ/거머린,EcoRⅠ/His4 및EcoRI/거머린등 다양한 제한효소와 탐침의 조합을 이용하여 수행되었다. 서던 블로팅의 분석은 염색체 DNA의 his4 지역의 상동재조합 원리에 기초한다.

HIS4 및 거머린 유전자를 검출할 탐침은 무작위 프라이머 표지방법(random primer labelling module, Gene Image^TM, Amersham international plc)으로 제조하였다. 구체적으로, pGS29A벡터를 주형으로 하여 HIS4 및 거머린 유전자를 PCR로 증폭하였다. 다시 증폭된 HIS4 및 거머린 유전자를 주형으로 하여 무작위 프라이머를 결합시키고, DNA 중합효소 I(DNA polymerase I)의 Klenow 절편에 의해 무작위 표지반응이 일어나는 동안 형성되는 DNA 탐침에 fluorescein-11-dUTP가 포함되도록 하였다. fluorescein-11-dUTP가 포함된 DNA 탐침은 알카라인 포스파타제(alkaline phosphatase, AP)가 접합된 항-형광물질(fluorescein) 항체와 결합하게 되고, AP는 기질인 디옥세탄(dioxetane)을 분해함으로써 화학적 발광(chemiluminescent) 신호를 보내게 되며, 이를 필름에 표식하게 된다.

표 1은 his4 위치에서 상동 재조합에 의해 발현카세트가 삽입되었을때, 서던 블로팅에 의하여 검출이 기대되는 절단된 DNA 절편의 크기를 나타낸다. 서던 블로팅 결과,표 1에 나타난 바와 같이, 다중 유전자가 삽입된 것을 확인할 수 있었다. 삽입된 카세트의 수를 확인하기 위하여BglⅡ 제한효소와 His4 탐침을 이용하였다. 그 결과, 3.7, 4.7 및 5.8 Kb크기의 절편에서 HIS4 구조유전자 절편이 1:1:1의 비율로 탐지되었다(도 4). 상기 결과는 발현카세트의 2개 카피가 피키아 파스토리스 게놈내 his4 위치에 삽입되었음을 의미한다.도 5는 2개의 발현카세트가 삽입되었을때, 예측되는 개열지도를 나타낸 것이다. 상기의 조합외에도 BglⅡ/거머린, EcoRⅠ/His4 및 EcoRI/거머린 등 다양한 조합을 이용하여 도 6에 기재된 바와 동일한 개열지도를 가짐을 확인하였다(도 6).

<표 1> 선별 균주 #3-32의 다양한 제한효소 및 탐침을 이용한 서던 블로팅의 기대되는 DNA 크기

제한효소	BglⅡ	EcoRⅠ
탐침	HIS4 거머린	HIS4	거머린
1개 카피 삽입(kb)	3.7, 4.7	4.7	3.8, 7.4	7.4
2개 카피 삽입(kb)	3.7, 4.7,5.8	4.7,5.8	3.8, 7.4,8.2	7.4,8.2

<1-4> 재조합 피키아 파스토리스의 유전적 안정성 분석

상기에서 제조한 재조합 피키아 파스토리스의 게놈내에 삽입된 거머린 구조 유전자의 유전적 안정성을 분석하기 위하여 연속 플라스크 배양을 실시하였다.

거머린을 생산하는 피키아 파스토리스의 콜로니를 50㎖의 YPD 배지에 접종시키고, 30℃, 150 rpm으로 교반시키면서 하룻밤 동안 배양하였다. 상기 배양액을 다음의 새로운 플라스크 배양을 위한 접종액으로 사용하여 70 세대까지 반복하여연속 배양을 수행하였다. 각각의 게놈 DNA는 접종하기 직전 각 플라스크로부터 10 ㎖의 배양액을 취하여 분석하였다. 세포의 총 DNA는SalI으로 처리하고, 0.6% 아가로스 젤에 전기 영동한 후, 블로팅을 위하여 나일론 멤브레인으로 이동시켰다. 거머린의 구조 유전자에 대한 탐침은 무작위 프라이머 표지 모듈(random primer labeling module, Gene Images^TM, Amersham International plc)을 이용하여 준비하였다.

그 결과,도 7에 나타난 바와 같이, 70세대까지 반복 배양하여도 거머린의 구조 유전자를 포함하는 DNA 절편은 동일하게 관찰되었다. 고효율의 제조합 단백질의 생산을 위하여 삽입된 구조 유전자는 몇번에 걸친 종자 배양을 포함하여 생산 과정 전체에 걸쳐 안정하여야 한다. 일반적으로 제조원균인 MCB로부터 실제 재조합 단백질을 발현시키는 WCB(working cell bank)의 준비를 위하여는 평균 5 내지 7회의 세대를 거치게 되며, 대규모의 발효를 위하여, 배양 규모를 증가시킨다고 할지라도 20 세대 이상을 초과하지는 않는다. 따라서, 상기에서 확인된 바와 같이 70 세대까지의 구조 유전자의 안정성이 보장된다면 이는 산업적으로 충분히 이용가능하다고 할 수 있다. 결국 상기의 연속 배양 결과는 산업적 생산과정을 위하여 요구되는 거머린 구조 유전자의 안정성이 보장됨을 의미한다.

<1-5> 재조합 피키아 파스토리스의 고농도 배양

상기에서 유전적 안정성이 확인된 재조합 피키아 파스토리스의 거머린 생산을 위한 고농도 세포배양을 위하여, 본 발명에서는 메탄올 유도에 의한 DO-stat 회분 배지 공급 방법을 이용하였다. Bioflio Ⅲ 발효기(New Brunswick Scientific Co.)를 이용하여, 온도, pH 및 공기 포화도는 각각 30℃, 5.0 및 2.0 vvm 으로 배양하였다. 먼저, 접종액을 준비하기 위하여, 50 ㎖ YPD 배지에서 30℃, 200rpm의 조건으로 18시간 종자 배양하였다. 최소 염 배지는 효모 미량 금속 용액을 포함하는 배양을 위하여 사용되었다. 배지에서 글리세롤이 완전히 고갈된 후, 유가 배양(fed-batch culture)을 연속적으로 수행하였다. 상기에서 배지의 공급은 50%의 공기 포화도 조건에서 조절되었다. 공급 배지는 50%(w/v)의 글리세롤과 12 ㎖/ℓ의 효모 미량금속 용액을 포함한다. 500 ㎖의 배지가 공급된 후, 배지의 공급을 중단시키고, 0.5시간 동안 더 배양하여 글리세롤을 배양액으로부터 완전히 고갈시켰다. 마지막으로, 50% 메탄올 및 12 ㎖/ℓ의 효모 미량금속 용액을 포함하는 배지를 공급하여 거머린의 생산을 유도하였는데, 배지 공급 속도는 22부터 46 ㎖/h 까지 40 시간동안 단계적으로 증가시켰다.

그 결과,도 8에서 보듯이, DO-stat 유가 배양 후 세포 농도는 600 nm에서의 흡광도 250으로 나타났다. 메탄올 공급시에도 세포농도의 변화가 미약하게 관찰되었다. 재조합 거머린은 메탄올 유도 후 260 ㎎/ℓ까지 배지내로 분비되었으며, 최종적으로 재조합 거머린을 생산하는 고농도 세포 배양기의 세대수는 10.4 세대였다. 유도기 동안 거머린은 세대수가 0.1 증가하였다. 이러한 결과는 발현 카세트가 생장기 뿐만 아니라 유도기에도 안정적으로 유지됨을 의미한다.

고농도의 세포 배양 이후에도 거머린 구조유전자의 DNA 서열이 올바르게 유지되었는지를 확인하기 위하여, 3번의 DNA 염기서열 분석을 반복 수행하였다.

DNA 서열분석을 위한 시료는 MCB, 최종연속 배양액 및 EOPC(고농도 세포배양

액)을 이용하였다. 거머린 유전자의 PCR 증폭을 위하여 5'AOX 및 3'AOX의 염기서열에 상응하는 프라이머를 이용하였으며, 증폭된 거머린 유전자는 형질전환 키트(pGEMT easy transformation kit, Promega)를 이용하여 형질전환시켰다. 상기의 형질전환체로부터 추출한 DNA의 염기서열분석 결과, 모든 시료의 DNA 염기서열은 발현벡터의 염기서열과 동일함을 확인하였다. 이러한 결과는 삽입된 거머린 유전자의 안정성을 재확인하는 것이다.

<실시예 2> 개선된 피키아 파스토리스 발현 시스템을 이용한 재조합 거머린의 생산방법

재조합 거머린 생산을 위하여 본 발명에서 사용한 개선된 파스토리스 발현시스템의 DO-stat 유가 배양에 있어, 배양은 4단계, 즉 접종물(inoculum), 회분 배양(batch), 유도 전 유가 배양(pre-induction fed batch) 및 유도 후 유가 배양(post-induction fed batch)으로 수행된다. 접종물의 배양은 100 ㎖의 YPD 배지(1%(w/v) 글루코오스, 1% w/v yeast extract, 2%(w/v) 펩톤)를 포함하는 플라스크에 글리세롤을 100 ㎕ 첨가한 후, 30℃, 150 rpm에서 20 시간동안 배양되었다. 상기 배양된 접종물은 2.5 ℓ의 최소 염배지(glycerol, 40 g/ℓ; H₃PO₄, 27 ㎖/ℓ; CaSO₄, 0.9 g/ℓ; K₂SO₄, 18.0 g/ℓ; MgSO₄, 10.24 g/ℓ; KOH, 4.13 g/ℓ; MH₄OH, 30㎖/ℓ; 효모 미량금속 용액(Yeast trace metal solution), 4.4 ㎖/ℓ)를 포함하고 있는 Bioflio Ⅲ 발효기(New Brunswick Scientific Co.)로 접종하였다. 효모 미량금속 용액은 CuSo₄·5H₂0 6.0 g/ℓ, KI 0.09 g/ℓ, MnSO₄·H₂O 3.0 g/ℓ, NaMo·H₂O 24.0 g/ℓ. H₃BO₄0.02 g/ℓ, CoCl₂0.5 g/ℓ, ZnCl₂20.0 g/ℓ, FeSO₄·H₂0 65.0 g/ℓ, 비오틴 0.2 g/ℓ, H₂SO₄20 ㎖/ℓ를 포함한다. 용기내의 pH는 15%(v/v) NH₄OH 및 30%(v/v) H₃PO₄의 자동조절 첨가에 의하여 pH 5.1로 유지되었다. 용존 산소량(dissolved oxygen)의 수준은 자동 교반조절기와 유입가스의 산소 분압조절에 의하여 30% 이상의 포화도 이상으로 유지되도록 하였다. 유입가스의 산소 분압조절은 공기와 순수산소의 유입구에서 2-가스 혼합기(New Brunswick Scienctific, Edison)를 이용하여 컴퓨터 시스템으로 조절되었다. 발효용기의 온도는 30℃로 유지되었다. 세포는 글리세롤이 모두 소모될 때까지(세포 건량 > 25 g/ℓ) 회분 배양 모드로 15시간 배양되었다. 이후, DO-stat 유가 배양을 80%(w/v)의 글리세롤과 12 ㎖/ℓ의 효모 미량금속 용액을 포함하는 글리세롤 배지를 이용하여 수행하였다. DO의 수준이 50% 포화도 이상으로 올라가면, 공급 펌프가 작동되고, DO 수준이 떨어지게 되면, 공급펌프의 작동이 중단되게 된다. 이러한 과정은 바이오코멘드(New Brunswick Scientific Co.) 소프트웨어를 이용하여 30초마다 DO 수준을 점검하여 반복하였다. 상기 글리세롤 DO-stat 유가 배양 동안, 500 ㎖의 배지가 공급되었다.

마지막으로, 100% 메탄올 및 12 ㎖/ℓ의 효모 미량금속 용액을 포함하는 배지를 공급하여 거머린의 생산을 유도하였는데, 배지 공급 속도는 22부터 46 ㎖/h 까지 40 시간동안 단계적으로 증가시켰다. 초기 유도 과정시 4시간 동안은 프로모터의 발현을 활성화하기 위한 낮은 배지 공급비율을 유지하였다.

본 발명의 개선된 DO-stat 유가배양에 있어서, 처음 3 단계는 일반적인 회분배양 과정과 동일하게 수행되었다. 그러나, 유도 후 유가배양 단계에서 DO는 40-45%의 좁은 범위에서 조절된다. DO 수치가 고정수치 이하로 떨어지면 공기 도입부에서의 순수 산소 비율이 높게 조절되고, DO 수치가 고정수치 이상으로 올라가면, 공기 도입부에서의 순수 산소비율이 낮게 조절된다. 동시에 DO 수치가 고정수치 이하로 떨어지면 메탄올 공급율이 떨어지며, DO 수치가 올라가게 되면, 메탄올 공급율이 올라가게 된다. 이러한 순환 체계는 매 30 초마다 조절되게 된다.

본 발명의 데이타의 측정, 계산 및 조절을 위하여 펜티엄 133 MHz의 PC 시스템을 사용하였다. 컴퓨터는 RS422 인터페이스를 통하여 발효기와 연결하였다. 용존산소량, pH, 온도 및 교반 속도, 영양 펌프 속도등 수집된 데이타는 바이오코멘드 소프트웨어에 의하여 분석되었다.

상기 배양 방법의 결과분석에 있어, 세포농도는 세포건량의 측정으로 결정되었다. 이를 위하여 10 ㎖의 배양액을 9000 rpm에서 원심분리하여 침전물을 인산염 완충용액으로 두번 세척하고, 마지막으로 세포 침전물을 증류수에 용해시킨 후, 전자 수분 분석기(Sartorius MA 40, Sartorious)를 이용하여 건조시켰다.

글리세롤과 메탄올 농도는 가스 크로마토그라피(HP5890 시리즈 Ⅱ, Hewlett Packard)에 의하여 측정하였으며, 6 ft OV-17 WHP 100/120 19001A-B12와 6ft 10%degs whp 100/120 19001a-L12 컬럼을 이용하였다.

분비 효율의 결정을 위하여는 토끼로부터 채취한 항-재조합 거머린 혈청에 대한 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 일정 시간 간격으로 채취한 세포 및 배양 상등액으로 분석하였다. 본 발명에서는 전기영동 후 멤브레인으로 이동시켜, 이를 글루타르알데히드로 처리하여 펩타이드를 결합시킴으로써, 검출 민감도를 고양시켰으며(Karey and Sibasku, Anal. Biochem. 178, 255, 1989), 고추냉이 인산화효소가 접합된 2차 항-염소 토끼 IgG을 이용하여 분석하였다.

상기와 같이 고안된 본 발명의 제조방법의 결과를 수동으로 배지 공급이 조절되는 유가배양 방법의 결과와 비교 분석하였다.

도 9에 나타난 바와 같이, 제안된 두개의 조절 순환체계는 동시에 조절되고, 컴퓨터 시스템에 잘 적용되었으므로, 초기 설정이후에, 매개 변수를 변화시킬 필요는 없었다. 개선된 DO-stat의 배양 양상은도 10에 나타나 있다. 배양 후 24 시간 이후의 재조합 거머린 발현 정도는도 11에 나타난 일반적인 이전의 유가 배양방법에 의한 결과에 비하여 40% 높은 수치인 450 U/ℓ였다. 이 때, 웨스턴 블럿팅 결과는 생산기의 세포내에 재조합 거머린이 거의 존재하지 않음을 보여준다(도 12). 이는 재조합 거머린이 발현 이후 즉시 배지내로 분비됨을 의미하며, 본 발명의 발현 시스템에 있어, 재조합 피키아 파스토리스의 분비 기작이 잘 구축되었음을 의미한다.

결론적으로, 본 발명의 재조합 거머린의 제조를 위한 DO-stat 유가 배양(fed-batch culture) 방법을 이용한 결과, 재조합 피키아 파스토리스의 배양시스템이 잘 구축되어 재조합 거머린의 생산수율이 증가되었음을 확인할 수 있었다.

<실시예 3> 재조합 거머린의 분리정제

<3-1> 크로마토그래피를 이용한 재조합 거머린의 분리

본 발명의 DO-stat 유가 배양 방법을 이용하여 생산한 재조합 거머린이 실제로 신약개발에 이용될 수 있는지를 확인하기 위하여 제조된 재조합 거머린을 분리하였다. 소수성 결합 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography)를 위하여, 발현된 재조합 거머린을 포함하는 배양 상등액에 먼저 암모늄 설페이트(ammonium sulfate)를 최종농도 1.0 M이 되도록 첨가하였다. 상기 용액을 페닐 세파로오스 6FF(Amersham Pharmacia Biotech.)로 충진되어 1.0 M 암모늄 설페이트를 포함하는 0.05 M 트리스 완충용액으로 평형화된 HIC 컬럼(Econo, 5㎝ × 13㎝, Biorad)에 주입하고, 1.0 내지 0.0 M 의 농도 구배로 암모늄 설페이트를 포함하는 완충용액 1.5 ℓ를 50 ㎖/hr의 속도로 주입하여 단백질을 용출시켰다. 재조합 거머린을 포함하는 용출액은 0.2 ㎛ 필터를 이용하여 필터시키고, 다시 2%(v/v) 2-프로판올로 평형화된 C8-100 10 SP(2.5 ㎝×10 ㎝, Amicon)을 이용하여 역상크로마토그래피를 수행하였다. 용출은 30 ㎖/hr의 속도로 2-프로판올/물의 농도구배(2-5-20-95 %(v/v)를 이용하여 수행하였다. 상기 정제된 용출액은 UV 검출기(Beckman)를 이용하여 280 nm에서의 흡광도로 분석하고, 엘라스타제 억제활성을 결정하였다.

그 결과, 엘라스타제 억제 활성은 0.2 M 암모늄 설페이트로 용출된 분획에서 측정되었다(도 14의 A). 배양액 내의 불순물은도 15에서 보듯이 HIC를 이용하여 거의 모두 제거되었다. HIC로부터의 용출분획은 다시 RPC를 이용하여 정제하였다. 엘라스타제 억제 활성을 보이는 분획은 2-프로판올/물의 초기 농도구배에서 수득된 분획이었다(도 14의 B). 정제된 재조합 거머린은 C18 역상 HPLC 및 SDS-PAGE를 통하여 균일하게 정제되었음을 확인할 수 있었다. 역상 HPLC는 컬럼 온도 40℃에서 C18 컬럼(Macrosphere 300 C18 5U, 250 mm×4.6 mm, Altech)과 0.1% TFA(tetraflouroacetic acid)를 포함한 아세토니트릴/물의 용매를 0.7 ㎕/min의 속도로 수행하였으며, 주입 후 5분 동안은 10% 아세토니트릴로 농도가 유지되도록 하였고, 이후 5분 동안은 35%로, 10분 동안은 55%로, 마지막 5분 동안은 95%로 농도구배를 변화시켰다. 이후 분석을 위하여 상기 분획은 저온 건조시켰으며, 마지막 정제 수율은 약 68% 임을 확인하였다.

재조합 거머린의 특이활성을 측정하기 위하여실시예 1에 기재된 방법을 이용하여 엘라스타제 억제활성을 측정하였다. 상기 재조합 거머린의 특이적 억제활성으로부터 계산된 억제 유니트가표 2에 나타나 있다.

<표 2> 재조합 거머린의 정제후 활성

본 발명의 재조합 거머린의 엘라스타제 억제 활성은 603 u/g이었으며, 정제 후 활성이 9.3 배 이상 증가하였음을 확인하였다. 이는 배양액 내의 재조합 거머린 양이 총 단백질의 11%를 차지함을 나타낸다. 재조합 거머린의 억제 반응속도는 38 nM의 Ki로 PPE의 가역적인 동일-몰수 결합 억제제임을 보여준다. 또한,도 16은 결합화학양론 및 억제속도론을 나타내는 것으로 재조합 거머린은 PPE에 동일한 몰수로 결합함을 나타낸다.

따라서, 두 단계의 크로마토그래피 과정(HIC 및 RPC)을 통하여 완전한 억제활성을 지닌 98% 순도의 재조합 거머린을 68% 수율로 생산할 수 있었다.

<3-2> 재조합 거머린의 pH 및 온도 안정성

정제된 재조합 단백질의 pH에 대한 안정성을 조사하기 위하여, pH 1 내지 12의 범위에서 0 내지 24 시간동안 25℃에서 방치한 후, 잔여 엘라스타제 억제활성을 결정하였다. 온도 안정성을 조사하기 위하여는 50, 70 및 90℃에서 0.5 내지 6 시간동안 방치한 후, 엘리스타제 잔여 활성을 측정하였다. 그 결과, pH 및 온도 안정성에 있어, pH 1 내지 12의 범위에서 24 시간 동안 방치하여도 90% 이상의 활성을 보이고(도 17의 A), 90℃ 이상의 온도에서 6시간 방치하여도 90% 이상의 활성을 보임을 확인하였다(도 17의 B). 이러한 결과는 거머린의 많은 이황화 결합에 의해 부여된 경직성 및 조밀함이 pH 및 온도의 안정성 나타냄을 의미한다.

<3-3> 재조합 거머린의 아미노산 서열 분석

정제된 재조합 거머린이 천연상태의 거머린과 동일한 아미노산 서열과 분자량을 가지는지 확인하기 위하여, N-말단 서열 분석, 아미노산 구성분석 및 질량 분광분석을 수행하였다. N 말단 서열분석은 자동 펩타이드 서열분석기(Model 492, Procise TM, Perkin-Elmer)를 이용하였으며, 아미노산의 구성 분석을 위하여는 재조합 거머린을 6 N HCl에서 155℃, 60분 동안 가수분해시켜, 세척 건조시킨 후, PTC(phenylisothiocyanate)를 이용하여 유도체화하였다. 상기 PTC-아미노산은 C18 역상컬럼을 이용하여 분리시켰으며(Bidlingmeyer B.A. et al., J. Chromatogr. 336(1), 93, 1984), 재조합 거머린의 분자량 측정은 질량 분광기인 플래트폼 Ⅱ(Platform Ⅱ, Micromass)를 이용하였다(Van Dorsselar A. et al., Biomed. Environ. Mass Spectrom. 19(11), 692, 1990).

그 결과, 본 발명의 재조합 거머린은 천연 거머린과 동일한 아미노산 서열 및 구성을 가지고 있음이 확인되었다(표 3). 재조합 거머린의 분자량은 질량 분광 분석 결과, 6,110이었으며, 이 역시 천연 거머린과 동일하였다(도 18).

<표 3> 정제된 재조합 거머린의 아미노산 구성 분석

* : 시스테인 잔기는 분석방법 자체의 한계로 정량 분석이 불가능 함

<3-4> 재조합 거머린의 면역화 반응

상기 재조합 거머린의 면역화 반응을 조사하기 위하여, 복막내 주사에 의하여 4가지 샘플을 투여하여 마우스에서의 항체 생성반응을 조사하였다. 음성대조군으로서 인산염 완충용액 및 면역보강제(Fruend's adjuvant)가 사용되었고, 실험군으로서 재조합 거머린을 포함한 인산염 완충용액 및 면역보강제를 각각 마리당 500 ㎍씩 투여하여 사용하였다. 각각의 샘플 투여는 5 마리의 마우스를 대상으로 하였다.

마우스는 첫번째 면역화 이후 1, 2, 4주째 혈액을 채취하였으며, 두번째 면역화는 첫번째 면역화 이후 2주째 말에 실행하였다. 각 그룹의 항체역가는 효소면역 방법(enzyme-linked immunoassay, ELISA)을 통하여 정량하였는데(Tijssen, P., Elsevier Science Publishers B. V., The Netherlands, 1985), 각각의 역가는 평균 흡광도에 마우스 음성대조군 혈청 흡광도 표준편차의 3배를 더한 한계치(cut-off value)에 의해 결정된 양성반응 샘플의 희석 정도로서 정의되었다.

그 결과, 재조합 거머린 자체는 면역보조제와 함께 투여되었을때를 제외하고는 체액성 면역반응을 일으키지 않았다(표 4).

<표 4> 생쥐의 재조합 거머린 체내 면역 반응

따라서 본 발명의 제조합 거머린은 체액성 면역 반응을 유발하지 않으므로, 면역반응 유발로 인한 시약 개발의 한계를 극복하는데 문제가 없을 것으로 확인되었다.

<실시예 4> 재조합 거머린의 상처치유 효과

본 발명의 재조합 거머린을 포함하는 약학적 조성물을 이용한 상처치유 효과를 측정하기 위하여 생쥐를 이용한 동물실험을 수행하였다. 거머린은 강력한 엘라스타제 억제제로서 포식세포의 화학주성을 억제하는 효과가 있으므로 항염증 효과를 기대할 수 있다. 이러한 사실에 근거하여 본 발명에서는 세균 감염이 없는 상태에서 상처치유 과정을 관찰하였다.

무세균 상태에서 상처 치유과정을 살펴보기 위하여, 생쥐의 배부에서 움직임이 적은 부위, 대체로 가슴 뒷부분, 피부를 포비돈 및 알코올 소독액으로 처리한 후, 15번 수술용 칼로 약 7 mm 정도 절개한 후 피브린 접합제(녹십자)로 도포하여 절개 후 세균 감염이 되지 않게 처리하였다. 대조군에서는 순수한 피브린 접합제를 사용하였고, 실험군에서는 피브린 접합제에 상기실시예 3에서 정제한 재조합 거머린을 100 ng/㎖의 농도로 희석하여 사용하였다. 모두 20 마리의 생쥐를 사용하였으며, 절개 후, 제 1, 2, 3, 4, 5일 후에 각각 4 마리 생쥐로 육안 및 조직학적인 관찰을 시행하였다.

그 결과,도 19에서 보듯이, 거머린을 피브린 접합제에 첨가하여 사용하였을 경우, 대조군에 비하여 빠른 상처치유 효과를 보였다. 특히 육안 관찰에서 대조군에서는 상처가 크게 벌어져서 치유가 지연되는 양상을 보이는 대 비하여, 거머린을 상처에 적용하였을 경우에는 상처가 벌어지지 않고 점차적인 치유 양상을 관찰할 수 있었다. 현미경 관찰에서는 대조군에서는 중등도 이상의 염증 반응과 결체조직의 변성으로 콜라겜 섬유들의 용해현상이 관찰되었으나, 거머린을 투여한 경우에는 비교적 경도의 염증 반응에 초기에 관찰되었으며 결체조직의 변성 현상도 많이 감수됨을 확인할 수 있었다(도 20).

<실시예 5> 재조합 거머린의 안전성 실험

본 발명에서 제조된 재조합 거머린을 이용하여 신약으로 개발하기 위하여 안전성 실험의 일환으로, 급성 독성 및 항원성의 존재 여부를 ICR 마우스, 기니픽 및 마우스-랫트 모델에서 확인하기 위하여, 식품의약청 안전청 고시(1998. 12. 3.)의 의약품 등의 독성시험 기준 제 1998-116호에 준하여 급성독성 및 항원성 시험중 능동 돈신상 아나필락시스 반응시험(active systemic anaphylaxis test, ASA test)과 수동 피부 아나필락시스 반응시험(passive cutaneous anaphylaxis test, PCA test)을 실시하였다.

<5-1> 급성독성시험

재조합 거머린은 2-프로판올/물을 최종 용매로 하여 동결 건조된 백색 분말의 형태를 멸균 생리식염수(중외제약)에 현탁하여 사용하였다. 항원성 시험에서 양성대조물질로는 알부민(ovalvumin, Sigma)을 멸균 생리 식염수에 용해한 후, 면역보조제(Freund's complete adjuvant, Gibco)와 동량씩 혼합하여 사용하였으며, 음성대조군으로는 용매인 멸균 생리식염수를 사용하였다.

급성독성시험에서는 17-24g의 SPF(특정병원체 부재) ICR계 마우스를, 항원성 시험에서는 200 내지 350 g의 Hartley계 수컷 기니픽, 20-30 g의 Balb/c계 수컷 마우스, 250-270 g의 수컷 Sprgue Dawley계 랫트를 서울대학교 실험동물사육장에서 구입하여 약 1주일간 순화적응 시킨 후 건강한 동물을 선택하여 온도 23±3℃, 상대습도 50±10%, 배기 10-12회/시간, 형광등 명암 12시간 사이클, 조도 150-160Lux로 전 시험기간 동안 플리카보네이트 사육상자에 넣어 실험하였다. 순화 및 시험기간 중에는 실험동물용 고형사료를 신촌사료(주)로부터 구입하여 섭취시켰으며, 음수는 수돗물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.

먼저, 순화기간 중 건강하다고 판정된 동물에 대하여 체중을 측정하고, 평균체중에 가까운 개채를 선택하여 무작위법을 이용, 군분리를 실시하였으며, 각 군의 평균체중에 대한 군간 차이는 ANOVA 검정으로 통계학적 검증을 실시하여 확인하였다. 동물의 개체 식별은 피모색소표시법 및 사육상자멸 태그(tag) 표시법을 이용하였다. 각 군은 암수 각 5 마리씩 10마리로 구성하였으며, 투여 용량의 설정은 예비실험결과 및 시험물질의 용해도 등을 고려하여 1,000 ㎎/의 용량군으로 설정하였으며, 대조군은 무처치 대조군으로 하여 1회 정맥 투여하였다

재조합 거머린은 시험당일 증류수를 이용하여 시험군에 맞는 농도로 희석한 후, 1 ㎖ 주사기를 이용하여 마우스의 미정맥에 주사하였다. 투여용량의 설정은 정맥투여 직전의 체중을 측정하여 산정하였다.

모든 시험동물에 대한 임상증상은 투여당일에는 투여후 1시간에서 6시간까지 매시간, 투여 1일부터 14일까지는 1일 1회 이상씩 일정시간 관찰하여 14일 동안 일반상태의 변화, 중독증상발현, 사망동물의 유무 및 시험물질 투여 후 시험물질에 의해 나타날 가능성이 있는 증상에 대해 주의하여 관찰하였다.

시험에 사용된 모든 실험동물에 대하여 시험물질 투여 당일(0일), 4일, 7일 12일, 14일째에 체중을 측정하였다.

시험종료후 생존례는 부검전에 체중을 측정하고 에테르 마취하에 방혈치사시킨 다음 외관 및 내부 장기 이상유무를 상세히 관찰하였다.

통계학적 처리는 ANOVA(one way analysis of variance)를 이용하였으며, P<0.05, P<0.01의 수준으로 대조군과의 군간 유의성을 검정하였다.

급성독성시험 결과 투여용량군에서 시험기간동안 사망한 동물은 없었으며(표 5), 어떠한 임상증상도 나타나지 않았다(표 6). 또한, 암수의 투여용량군에서 대조군과 비교하여 유의성있는 체중변화가 관찰되지 않았다(표 7). 육안적 부검소견에 있어서더 대조군과 투여용량군에서 사망개체는 없었으며, 생존개체에서도 특이할만한 부검소견이 관찰되지 않았다(표 8).

<표 5> 거머린의 정맥주사 투여후 치사율

성별	투여량(㎎/㎏)	생쥐수	투여후 시간	투여후 일	최종치사율
			1 2 3 4 5 6	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
수컷	대조군	5	0 0 0 0 0 0	0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0	0/5
	1,000	5	0 0 0 0 0 0	0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0	0/5
암컷	대조군	5	0 0 0 0 0 0	0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0	0/5
	1,000	5	0 0 0 0 0 0	0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0	0/5

<표 6> 거머린의 정맥주사 투여후 임상증상

성별	투여량(㎎/㎏)	임상증상	투여후 일
			시작 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
수컷	대조군	NAD	5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
	1,000	NAD	5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
암컷	대조군	NAD	5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
	1,000	NAD	5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

NAD : 비정상적 임상증상이 관찰되지 않음.

<표 7> 거머린의 정맥주사 투여후 체중

성별	투여량(㎎/㎏)	생쥐 수	투여후 일
				0	4	7	12	14
수컷	대조군	5	평균S.D.	23.403.21	24.402.51	27.201.30	28.201.10	28.200.84
	1,000	5	평균S.D.	23.600.89	26.002.12	27.801.92	28.001.58	28.002.24
암컷	대조군	5	평균S.D.	17.802.59	23.401.82	25.602.30	25.201.48	25.400.89
	1,000	5	평균S.D.	17.800.84	25.000.71	25.801.48	25.600.89	25.801.10

p<0.05에서 대조군와 유의한 차이를 보임.

p<0.01에서 대조군와 유의한 차이를 보임.

S.D. : 표준 편차

따라서, 거머린의 정맥투여에 의한 최대 무독성량(무해용량)은 1,000 ㎎/㎏ 이상일 것으로 추정할 수 있다.

<표 8> 거머린의 정맥주사 투여후 부검소견

부검소견
	수컷	암컷
투여량(㎎/㎏)	대조군	1,000	대조군	1,000
생쥐수	5	5	5	5
부신피질NGF뇌NGF심장NGF간NGF신장NGF이자NGF정소NGF난소NGF흉선NGF	5(100%)5(100%)5(100%)5(100%)5(100%)5(100%)5(100%)5(100%)	5(100%)5(100%)5(100%)5(100%)5(100%)5(100%)5(100%)5(100%)	5(100%)5(100%)5(100%)5(100%)5(100%)5(100%)5(100%)5(100%)	5(100%)5(100%)5(100%)5(100%)5(100%)5(100%)5(100%)5(100%)

NGF : 특이 부검소견 관찰안됨.

( ) : 관찰안된 특이부검 소견 비율

<5-2> 능동 전신성 아나필락시스 반응시험

감작에 이용된 거머린의 용량 설정 및 투여일정은표 9와 같다.

<표 9> 능동 전신성 아나필락시스 반응시험을 위한 기니픽의 감작

그룹	투여물질	투여용량	시간	개체수	투여방법
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ	거머린 거머린 거머린+FCAcOVAd+FCA음성대조군	10 ㎍/개체 100 ㎍/개체 100 ㎍/개체 2 ㎎/개체 1 ㎖/개체	9a9a3b3b9a	7 7 7 7 7	피하투여 피하투여 피하투여 피하투여 피하투여

a : 1주당 3번

b : 3주간 1주당 1번

c : 면역보조제(Freund's complete adjuvant)

d : 알부민

군당 7마리의 기니픽에 1군은 거머린을 10 ㎍/개체, 2군은 100 ㎍/개체, 3군은 100 ㎍/개체+FCA, 4군은 알부민(ovalvumin) 2 ㎎/개체 +FCA, 5군은 음성대조군(vehicle)으로 투여하였다. 단독투여군에서는 1주일에 3회씩 총 9회, 혼합군의 경우에는 1주일에 1회씩 총 3회 피하투여를 실시하였다. 시험물질은 모두 멸균 생리식염수에 녹여 사용하였고, 최종감작 2주 후에 야기항원(거머린 100 ㎍/개체 또는 알부민 10 ㎎/개체)을 뒷발 정맥(tarsal vein)내에 투여하였다. 야기 후 30분 동안 전신의 증상을 관찰하여 아나팔락시스 쇼크유무를 확인하였으며, 시험 결과는표 10의 판정기준에 따라 평가하였다.

<표 10> 능동 전신성 아나필락시스 반응시험의 판정기준

1. 불안2. 입모(立毛)3. 떨림4. 코를 문지르거나 핥음5. 재채기6. 기침7. 신경과민8. 배뇨9. 배변10. 유누(流淚), 눈물흘림11. 호흡곤란12. (폐의) 수포음13. 청색증(靑色症)14. 보행불안15. 뜀16. 헐떡거림17. 경련18. 횡와 (橫臥)19. Cheyne-Strokes 호흡20. 사망

판정 [-] 무증후성[±] 약한증상 : 1∼4[+] 보통증상 : 1∼10[++] 심한증상 : 1∼19[+++] 치사

상기의 능동 전신성 아나팔락스 반응시험의 결과는표 11과 같다. 거머린을 10 ㎍/개체와 100 ㎍/개체로 단독 감작한 군 및 100 ㎍/개체를 면역보조제와 혼합하여 감작한 군에서는 혼합감작군의 2마리만이 의양성을 보였고, 나머지 군에서는 특이한 아나팔락시스 증상이 관찰되지 않았다. 양성대조물질인 알부민을 명역보조제와 혼합하여 감작한 경우에는 모든 동물에서 심한 아나팔락시스 반응이 관찰되었다.

<표 11> 능동 전신성 아나필락시스 반응시험의 결과

그룹	감 작	반응야기	시간	아나팔락시스 반응- ± + ++ +++	양성반응율
Ⅰ	거머린(10 ㎍/개체)	거머린(100 ㎍/개체)	7	- - - - -	0/7
Ⅱ	거머린(100 ㎍/개체)	거머린(100 ㎍/개체)	7	- - - - -	0/7
Ⅲ	거머린+FCAa(100 ㎍/개체)	거머린(100 ㎍/개체)	7	- 2 - - -	2/7
Ⅳ	OVAb+FCA(0.2 ㎎/개체)	OVA(10 ㎎/개체)	7	- - - - 7	7/7
Ⅴ	음성대조군(0.1 ㎖/개체)	거머린(100 ㎍/개체)	7	- - - - -	0/7

a : 면역보조제

b : 알부민

<5-3> 수동 피부 아나필락시스 반응시험

감작에 사용된 거머린의 용량 및 군 설정은 능동 전신성 아나팔락시스 쇼크 반응시험의 경우와 마찬가지로 군 당 7마리의 수컷 Balb/c계 마우스에 1군은 거머린을 10 ㎍/개체, 2군은 100 ㎍/개체, 3군은 100 ㎍/개체+FCA, 4군은 알부민(ovalvumin) 0.2 ㎎/개체 +FCA, 5군은 음성대조군(vehicle)으로 투여하였다(표 12).

<표 12> 수동 피부 아나필락시스 반응시험을 위한 생쥐의 감작

그룹	투여물질	투여용량	시간	개체수	투여방법
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ	거머린 거머린 거머린+FCAcOVAd+FCA음성대조군	10 ㎍/개체 100 ㎍/개체 100 ㎍/개체 0.2 ㎎/개체 0.2 ㎖/개체	9a9a3b3b9a	7 7 7 7 7	피하투여 피하투여 피하투여 피하투여 피하투여

a : 1주당 3번

b : 3주간 1주당 1번

c : 면역보조제(Freund's complete adjuvant)

d : 알부민

단독투여군에서는 1주일에 3회씩 총 9회, 혼합군의 경우에는 1 주일에 1회씩 총 3회 피하투여를 실시하였다. 실험군, 감작량 및 감작회수, 감작경로는 표 3에 수록된 바와 같으며 최종투여 2 주일 후에 마우스 안와정맥총에서 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였다. 클리퍼를 이용하여 랫트의 등 부위 털을 가능한 넓게 제거한 후 등의 좌우 부위를 미리 적색 매직으로 표시한 다음 멸균 생리식염수로 8배부터 6단계 희석한 마우스 항혈청 100 ㎕를 26 1/2 G의 1 ㎖ 주사기를 이용하여 각 표시 부위에 피내 주사하였다.

항혈청을 피내 주사한 시점으로부터 24시간 후에 야기항원을 1% 에반스 블루(Evans blue)와 동량으로 혼합하여 랫트의 미정맥에 1 ㎖씩 주사하였다. 야기 항원을 랫트 미정맥내에 주사한 뒤 30분 후에 경추 탈골하여 랫트를 도살하고, 피부를 박리하여 항혈청 주사부위에 나타나는 청색 반점을 관찰하였다. 청색 반점의 직경이 5 mm 이상을 양성으로 하고 양성이 나타나는 항혈청의 최대희석비율은 그 항혈청의 PCA 항체가로 결정하였다.

마우스 항혈청에 대한 수동 피부 아나팔락시스 시험결과는표 13과 같다.

<표 13> 수동 피부 아나필락시스 반응시험의 결과

그룹	감작	반응야기	시간	생쥐수	감작혈청의 희석음성 8 16 32 64 128 256	양성반응율
Ⅰ	거머린(10 ㎍/개체)	거머린(100 ㎍/개체)	7	14	- - - - - - -	0/14
Ⅱ	거머린(100 ㎍/개체)	거머린(100 ㎍/개체)	7	14	- - - - - - -	0/14
Ⅲ	거머린+FCAa(100 ㎍/개체)	거머린(100 ㎍/개체)	7	14	- - - - - - -	0/14
Ⅳ	OVAb+FCA(0.2 ㎎/개체)	OVA(10 ㎎/개체)	7	14	- 1 4 9 - - -	14/14
Ⅴ	음성대조군(0.2 ㎖/개체)	거머린(100 ㎍/개체)	7	14	- - - - - - -	0/14

a : 면역보조제

b : 알부민

거머린을 단독 또는 면역보조제와 혼합하여 감작한 모든 군의 혈청은 항체가가 8 미만으로서 PCA 반응을 전혀 관찰할 수 없었으나, 양성대조물질인 알부민을 감작한 궁의 혈청은 1마리가 8배, 4마리가 16배, 그리고 9마리가 32배의 PCA 항체가를 보였다.

결론적으로 본 발명의 재조합 거머린은 임상시험에서 항원성으로 인한 부작용을 일으킬 가능성이 휘박하며 인체에 투여시 특이한 아나팔락시스 반응을 유발하지 않을 것으로 예측된다.

본 발명은 메탄올에 의하여 외부 유전자의 발현이 유도되는 AOX1 프로모터를이용한 재조합 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)의 자동 피드백 메탄올 공급 조절 시스템을 적용한 DO(dissolved oxygen)-stat 유가배양 방법을 개발하여 엘라스타제 억제활성을 가지는 수용성 재조합 거머린을 고효율로 제조하는 방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 방법에 의해 제공되는 거머린 재조합 단백질은 천연 거머린과 동일하게 엘라스타제 억제제로서 포식세포의 화학주성을 억제하는 효과가 있으며, 생체내에서 체액성 면역 반응을 유발하지 않으므로, 면역반응 유발로 인한 시약 개발의 한계를 극복할 수 있다. 또한 상기 재조합 거머린을 포함하는 약학적 조성물은 상처치유 효과가 있으므로, 치료제로서 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (14)

1. 메탄올에 의하여 외부 유전자의 발현이 유도되는 AOX1 프로모터 유전자 및 거머린 구조 유전자를 게놈내에 포함하는 재조합 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)의 자동 피드백 메탄올 공급 조절 시스템을 적용한 DO(dissolved oxygen)-stat 유가 배양법을 이용하는 재조합 거머린의 제조방법.
2. 삭제
3. 제 2항에 있어서, DO-stat 유가배양법은 4단계, 즉 접종물(inoculum), 회분 배양(batch), 유도 전 유가 배양(pre-induction fed batch) 및 유도 후 유가 배양(post-induction fed batch) 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 재조합 거머린의 제조방법.
4. 제 3항에 있어서, 유도 후 유가 배양단계는 DO 수치에 의하여 유입가스의 산소분압 조절 및 메탄올 공급율이 자동으로 조절되는 것을 특징으로 하는 재조합 거머린의 제조방법.
5. 제 4항에 있어서, 유입가스의 산소 분압조절은 공기와 순수산소의 유입구에서 2-가스 혼합기를 이용하여 컴퓨터 시스템으로 조절되는 것을 특징으로 하는 재조합 거머린의 제조방법.
6. 제 4항에 있어서, 자동조절은 제 1 순환체계 및 제 2 순환체계를 이용하여 조절되는 것을 특징으로 하는 재조합 거머린의 제조방법.
7. 제 6항에 있어서, 제 1 순환체계는 도 13a에 기재된 알고리즘과 같이 가스 도입부의 순수 산소의 함량 변화에 기인하는 산소전이율(oxygen transfer rate)의 조절을 통하여 DO를 조절하는 것을 특징으로 하는 재조합 거머린의 제조방법.
8. 제 7항에 있어서, DO조절은 DO 수치가 DO 설정 수치이하로 떨어지면 공기 도입부에서의 순수 산소비율의 설정수치가 높게 조절되고, DO 수치가 DO 설정 수치이상으로 올라가면 공기 도입부에서의 순수 산소비율의 설정수치가 낮게 조절되는 것을 특징으로 하는 재조합 거머린의 제조방법.
9. 제 6항에 있어서, 제 2 순환체계는 도 13b에 기재된 알고리즘과 같이 메탄올 공급율의 변화에 의한 산소수득율(oxygen uptake rate) 조절을 통하여 DO를 조절하는 것을 특징으로 하는 재조합 거머린의 제조방법.
10. 제 9항에 있어서, DO 조절은 DO 수치가 DO 설정수치 이하로 떨어지면 메탄올 공급율은 낮은 수치로 조절되고, DO 수치가 DO 설정수치 이상으로 올라가면 메탄올 공급율이 높은 수치로 조절되는 것을 특징으로 하는 재조합 거머린의 제조방법.
11. 제 8항 또는 제 10항에 있어서, DO 설정 수치는 40 내지 45% 로 설정되는 것을 특징으로 하는 재조합 거머린의 제조방법.
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