KR100272623B1 - 재조합 효모를 이용한 한국산 흡혈종 거머리 유래 엘라스테이즈특이 저해 펩타이드의 대량 생산방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris)로부터 원하는 엘라스테이즈 특이 저해 단백질 즉, 거머린(Guamarin)을 효과적으로 생산하기 위해 탄소원으로 글리세롤을 사용하여 발현 및 분비에 적합한 세포량이 될 때까지 효모의 세포를 양적으로 증대시키는 단계, 용존산소량의 급격한 증가시점으로부터 일정시간 동안 탄소원의 공급을 중단하여 탄소원을 고갈시키는 단계, 및 메탄올을 첨가하여 유가배양하는 단계를 거쳐 단백질을 얻고, 이를 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피를 통해 정제함으로써 폐기종, 만성기관지염, 성인성 호흡곤란 증후군 등을 일으키는 원인인 엘라스테이즈의 활성을 선별적으로 저해시키면서 활성화 산소에 의한 불활성화를 극복할 수 있는 재조합 효모를 이용한 한국산 거머리로부터 유래된 엘라스테이즈 특이 저해(elastase inhibitor) 펩타이드의 대량 생산방법에 관한 것이다.

Description

재조합 효모를 이용한 한국산 흡혈종 거머리 유래 엘라스테이즈 특이 저해 펩타이드의 대량 생산방법
본 발명은 재조합 효모를 이용한 한국산 흡혈종 거머리 유래 엘라스테이즈 특이 저해(elastase inhibitor) 펩타이드의 대량 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 한국산 흡혈종 거머리로부터 유래된 엘라스테이즈만을 특이적으로 저해하는 펩타이드 즉, '거머린'을 재조합 효모를 이용하여 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 엘라스테이즈는 세린(serine)계 단백질 분해효소로 분류되는 데, 주로 엘라스틴(elastin)이라는 구조단백질을 분해하며, 또한 콜라겐, 연골, 피부로넥틴 등과 같은 생체조직을 구성하는 중요한 구조단백질을 분해하기도 한다.
엘라스테이즈는 사람의 경우 주로 중성구 세포(neutrophile)에 많이 저장되어 있다. 이 중성구 세포가 혈관속에서 외부로부터 감염된 병원균 또는 항원과 접촉하면, 이 세포속에 저장되어 있던 엘라스테이즈가 분비되어 이들 병원균이나 항원을 분해함으로써 생명체를 병원균으로부터 보호하는 역할을 한다. 그러나, 세포의 노화, 유전적 질환 등의 원인으로 인체내에서 엘라스테이즈의 분비가 정상적으로 조절되지 않아 조직으로 과량 분비되면 엘라스테이즈가 생체의 조직을 구성하는 중요한 구조단백질들을 무작위로 분해하여 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 폐기종(emphysema), 건선(psoriasis) 등의 질병을 유발하기도 한다.
보다 구체적으로, 호중구의 엘라스테이즈는 아조르필(azorphile) 미립에 저장되어 있으며, 감염부위 조직에 분비되어 엘라스틴, 콜라겐 등 구조 단백질을 분해시키는 기능을 갖고 있다. 이와같은 엘라스테이즈의 활성은 조직 내에 함께 존재하는 α1-프로테이나제 저해제(API) 등의 효소저해제에 의하여 조절되어 정상적인 상태에서는 그 기능이 호중구 내부나 또는 세포 외의 바로 인접한 장소에만 국한되어 있다. 그러나, 유전적인 결함에 의하여 선천적으로 API의 양이 적거나 엘라스테이즈가 과다분비되는 경우 또는 엘라스테이즈와 함께 호중구로부터 분비되는 활성화 산소에 의하여 API 등이 불활성화되는 경우에는 엘라스테이즈 활성억제 기작이 붕괴되어 폐기종(Pulmonary emphsema)등을 비롯한 다양한 질병을 유발시키는 바, 구체적인 질병은 다음 표 1에 나타낸 바와 같다.
엘라스테이즈 유래 질환
원인 엘라스테이즈의 과다 분비
산화에 의한 엘라스테이즈 저해제의 불활성화
엘라스테이즈 저해제의 유전적 결손(genetic defect)
질환 폐기종(Pulmonary emphsema)
낭포성 섬유증(Cystic fibrosis)
성인성 호흡곤란 증후군(Adult respiratory distress syndrome)
만성기관지염(Chronicbronchtis)
기관지 확장증(Bronchiesctasis)
특발성 폐섬유증(Idiophthiculmonary fibrosis)
건선(Psorasis)
췌장염(Pancreatitis)
소비성 응고장애(Consumption coagulophthy)
혈관염(Vasculitis)
사구체신염(Glomerularnephritis)
죽상동맥경화증(Athreosclerosis)
관절염(Arthritis)
따라서, 이러한 질병들의 효과적인 치료를 위하여 엘라스테이즈 활성을 선별적으로 저해시키고 또 활성화 산소에 의한 불활성화를 극복할 수 있는 저해제를 개발하는 것이 반드시 필요하다.
의학계에서는 오래전부터 이러한 질병의 치료를 위한 방안으로, 사람의 연골, 폐, 피부 등의 조직에 비정상적으로 분비된 엘라스테이즈의 활성을 효과적으로 억제할 수 있는 의약용 단백질을 개발하고자 노력한 결과, 칠면조 및 오리 등의 조류, 유럽산 거머리, 사람의 피부 등 여러 종류의 생물로부터 엘라스테이즈 억제 단백질을 분리하여, 이를 유효성분으로 함유하는 약제를 직접 환부에 주사함으로써 치료에 효과를 보고 있는 것으로 알려져 있다.
그러나, 사람의 피부에서 분리한 엘라스테이즈 억제 단백질을 제외한 나머지 전기 억제단백질은 엘라스테이즈에 대한 특이성이 떨어져서, 엘라스테이즈 외에도 인간에게 중요한 여러종류의 단백질 분해효소를 억제하기 때문에 의약용으로 사용하기에는 문제가 있었다. 또한, 사람의 피부에서 분리한 엘라스테이즈 억제 단백질을 포함하여 종래 분리된 엘라스테이즈 억제 단백질은 분자량이 너무 크기 때문에, 약한 열에도 쉽게 변성이 초래되어 그 활성이 급격하게 감소한다는 문제점이 있었다.
이에 한국과학기술원 강 계원 교수 연구진은 한국산 거머리로부터 신규한 엘라스테이즈 억제 단백질을 얻었으며, 이를 '거머린(Guamerin)'이라 명명하였다.
거머린(Guamerin)은 한국산 거머리로부터 분리정제된 57개의 아미노산 펩타이드로서(Hyo Il Jung, et al., JBC 270), 이같은 아미노산 서열을 갖는 거머린의 활성분석 결과 현재까지 알려진 어느 엘라스테이즈 억제제보다도 높은 활성저해능을 갖고 있으며, 동시에 엘라스테이즈 특이성도 매우 뛰어나(참조: 대한민국 특허출원 제95-10206호) 이미 세계 학계에 그 특성이 보고되었다. 이러한 특성을 가진 효소저해용 펩타이드 즉, 거머린은 종래의 엘라스테이즈 저해제의 단점을 보완한 보다 효과가 우수한 치료제로 개발되리라 기대되고 있다.
엘라스테이즈 기능조절의 이상으로 야기되는 여러 질병에 대한 효과적인 치료법이 미미한 현실정을 감안할 때 엘라스테이즈 저해제인 거머린이 성공적으로 약제화될 경우 독창성있는 신약으로서 세계 시장에의 진출이 가능할 것이다.
현재 세계의 엘라스테이즈 억제제 연구개발 현황을 살펴보면, 오노(Ono), 제네카(Zeneca), 코텍(Cortech), 후지사와(Fujisaw), 머크(Merck) 및 렉스틴(Lextic)사 등에서는 분자설계 방법에 의해 고안된 저분자량 화합물의 엘라스테이즈 억제제를 개발하고 있고, PPL사에서는 유전자 재조합 동물(transgenic animal????)을 이용한 α1-항트립신을 개발하고 있고, 플라토간(Platorgan), 사노피(Sanofi), 노바티스(Novartis)사 등에서는 거머리 유래의 에글린 C(Eglin C)를, 바이오팜(Biopharm, UK), 머크 KGaA사에서도 거머리 유래의 겔린(Gelin)을 개발하여 약제화하려는 노력을 경주하고 있다.
이러한, 선발업체들의 개발방향은 비교적 엘라스테이즈에 대한 특이성이 떨어지는 종래의 단백질 분해 억제제들을 변형시켜 엘라스테이즈 특이성이 개선되고, 또 산화반응에 강한 유도체 저해제 개발 등으로 요약할 수 있다.
한편, 한국과학기술원 강계원 교수 연구진에 의해 한국산 거머리로부터 분리정제되는 거머린은 대량생산에 적합하지 않으므로 이를 약제 등으로 실용화하기 위해서는 대량생산을 위한 발현체계의 개발이 요구되고 있다.
이에 본 출원인은 현재까지 알려진 어느 엘라스테이즈 억제제보다도 높은 활성저해능을 갖고 있으며 동시에 엘라스테이즈 특이성도 뛰어난 거머린을 유전공학적 기법을 이용한 재조합 효모로부터 대량 제조하고자 엘라스테이즈 특이성이 뛰어난 억제제인 거머린의 유전자를 확보하고 이를 메탄올 자화효모인 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 대량 생산하고자 발현체계를 구축하였으며, 재조합 거머린을 발현하는 균주를 1998년 6월 12일자로 사단법인 한국종균협회에 수탁하여 각각 수탁번호 KFCC-11037 및 KFCC-11038을 부여받았다.
그런데, 이와같이 엘라스테이즈 특이 저해활성이 우수한 거머린을 대량 생산하는 데는 재조합 효모를 통한 대량 확보기술 뿐만 아니라, 생산된 물질을 높은 순도로 확보하는 기술이 포함된다.
상기 본 출원인에 의해 기 출원된 특허에 개시된 바에 따르면 한국산 거머리 RNA의 PCR을 통하여 거머린의 open reading frame에 해당하는 부분 cDNA(거머린 유전자)가 클로닝되었고(고 재균, 1997, 거머린 cDNA의 분자클로닝, 염기서열 및 발현, 한국과학기술원 생물학과 석사학위 논문), 본 출원인에 의해 기출원된 클로닝된 유전자를 효모인 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 넣어 발현 체계를 확립하였다.
그러나, 아직까지 상기한 엘라스테이즈 특이 저해 펩타이드인 거머린을 대량으로 생산하는 방법에 관한 기술은 확립되어 있지 못하다.
기 밝혀진 바와 같이 한국산 흡혈종 거머리(Hirudo niponia)로부터 추출을 통해 거머린을 생산하는 것은 경제적 잇점이 전혀 없다.
이에 따라 거머린의 대량생산 문제를 해결할 수 있는 방안으로 재조합 미생물을 이용한 생산방법이 가장 적합한 것으로 판단되었다.
그러나, 재조합 미생물을 이용한 거머린의 대량 생산방법 확립에 있어서 해결해야 할 문제점은 거머리로부터 추출한 거머린과 같은 물질을 발현체계가 다른 생물종으로부터 생산하더라도 구조적으로 동일한 물질을 만들 수 있느냐는 점이다.
실제로 대상물질인 거머린은 57개의 아미노산 중 10개의 시스테인(cystein) 잔기가 존재하고, 이로부터 만들어지는 이황화 결합(disulfide bond)을 통하여 매우 견고하고 특이한 구조를 갖는 것으로 추정되었고, 일부는 확인되고 있다.
이와같은 이황화 결합을 제대로 유지해야 생물학적 활성을 유지할 수 있다.
이러한 기술적인 과제를 극복하기 위하여 고등생물과 발현 및 분비의 환경이 비슷한 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris)라는 효모에서 발현체계를 구축하였으며, 이에 대하여 본 출원인은 상기한 바와 같이 1998년 7월 7일자로 기 출원진행하였다(대한민국 특허출원 제98-27344호).
그러나, 이와같은 재조합 파이키아 파스토리스라는 효모로부터 발현체계를 구축한 경우 대량 생산이 용이하나 이를 순수정제하여 대량 생산하는 방법은 아직까지 개발되지 못하고 있는 실정이다.
본 발명의 목적은 거머린이라 명명된 엘라스테이즈 특이 저해 펩타이드를 재조합 효모로부터 순수 정제하여 대량 생산하는 방법을 제공하는 데 있다.
도 1 은 재조합 효모 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris)GS115로부터 엘라스테이즈 특이 저해제(거머린)를 발효한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 2 는 엘라스테이즈 특이 저해제(거머린)를 정제하기 위해 재조합 효모 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris)GS115 발효액으로부터 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 3 은 엘라스테이즈 특이 저해제(거머린)를 정제하기 위해 역상 크로마토그래피를 수행한 결과를 나타낸 그래프이며,
도 4 는 정제된 엘라스테이즈 특이 저해제(거머린)의 아미노산을 분석한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 5 는 정제된 엘라스테이즈 특이 저해제(거머린)의 질량분석 결과이다.
이와같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 재조합 효모를 이용한 한국산 거머리 유래 엘라스테이즈 특이 저해(elastase inhibitor) 펩타이드의 대량 생산방법은 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 거머린 유전자를 도입한 재조합 효모를 글리세롤을 탄소원으로 하여 회분발효 및 유가배양하는 단계, 용존산소량의 급격한 증가시점으로부터 30분간 탄소원의 공급을 중단하는 단계, 메탄올을 첨가하고 유가배양하여 발효물을 얻는 단계, 및 상기 발효물을 소수성상호작용 크로마토그래피 및 역상크로마토그래피를 통해 정제하는 단계로 이루어진 것에 그 특징이 있다.
이와같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 거머린이라 명명된 엘라스테이즈 특이 저해 펩타이드를 재조합 효모로부터 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 거머린의 대량 생산방법은 메탄올을 탄소원으로 사용할 수 있는 효모, 즉 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 거머린 유전자를 도입한 재조합 효모로부터 대상물질인 거머린을 얻는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 거머린 유전자를 도입한 재조합 효모로는 본 출원인에 의해 기 출원된 것으로서 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115;pGSI(수탁번호 KFCC-11037)와 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115;pGS29A(수탁번호 KFCC-11038)가 있다.
본 발명 거머린의 대량 생산방법은 우선, 효모를 글리세롤을 탄소원으로 하여 배양하다가 적정 세포농도로 자랐을 때 탄소원을 메탄올로 완전히 바꾸어줌으로써 거머린 단백질이 발현 및 분비되도록 하였다.
이와같이 얻어진 발효액을 모아 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography)와 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography)를 거쳐 활성을 가진 순도 99% 이상의 재조합 거머린을 얻을 수 있다.
보다 상세한 발효공정은 다음 세 단계로 크게 나눌 수 있다.
첫째 단계는 세포성장 단계로서, 발현 및 분비에 알맞는 세포량이 될 때까지 세포를 양적으로 증대시키는 과정이다(증식(growth) 단계). 구체적으로는 회분발효와 발효조 내의 용존산소량을 세포 영양상태의 지표로 삼는 유가배양의 두 단계로 나뉘는 바, 여기서는 탄소원으로 글리세롤을 사용하여 원하는 단백질의 때아닌 발현 및 분비를 억제한다.
둘째 단계는 발효조 내의 기존 탄소원을 완전히 고갈시키는 과정이다. 기 확립된 발현체계에서는 배지 내의 포도당이나 글리세롤이 발현 프로모터를 부분적으로 또는 완전히 억제하기 때문에 이러한 탄소원들을 모두 소모하도록 고갈시키는 과정이 필요하다. 본 발명에서는 이 과정을 탄소원의 고갈신호인 배지 내 용존산소량의 급격한 증가시점으로부터 30분 동안 다른 탄소원을 공급해주지 않음으로써 목적을 달성한다.
셋째 단계는 포도당이나 글리세롤과 같이 기 사용된 탄소원이 고갈된 후, 발현 유도물질이면서 세포의 탄소원으로 사용되는 메탄올을 첨가하여 유가배양하는 과정이다(생산(production) 단계). 이때 세포성장 자체는 세포성장 단계에 비하여 탄소원의 이용속도 차이에 의하여 둔화된다. 그러나, 증가한 세포량으로부터 효과적으로 원하는 단백질을 얻을 수 있다.
이와같이 발효공정이 완료되면 이를 정제하는 바, 본 발명에서는 소수성상호작용 크로마토그래피와 역상크로마토그래피를 통해 정제한다.
소수성 상호작용 크로마토그래피는 단백질의 소수성 부분과 분리고정상의 소수성 기능기의 상호작용 차이를 이용한 것이다.
본 발명에서 소수성상호작용 크로마토그래피는 분리수지로 페닐세파로즈를 사용하고, 농도구배 형성에 황산암모늄을 사용하여 수행하는 것이 수율이나 순도면에 있어서 바람직하다.
그리고, 역상크로마토그래피는 분리수지로 옥틸기를 갖는 수지을 사용하고, 전개용매로 2-프로판올과 물을 사용하여 수행한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거 상세하게 설명하면 다음과 같은 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재조합 거머린의 발효
기 확립한 재조합 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris strain) GS115;----로부터 원하는 단백질인 거머린을 효과적으로 생산하기 위하여 종래 알려진 생산공정(Chem, Y., Komives, E., White, C. Cino, J., Hart, G. and Kempi, N.M., High Protein Expression Fermentation of Recombinant Pichia pastoris in a Fed-Batch Process, Annual Meeting of the American Society for Microbiology in Washingtom, DC, May 21-25, 1995)을 기초로 하여 다음과 같은 기본적인 발효공정을 수행하였다.
본 발명을 위해 이미 알려진 배지조성을 기초로 하여 다음 표 2에 나타낸 바와 같은 조성으로 기본적인 발효공정에 대한 실험을 수행하였다.
발효배지 조성
성분 함량
회분발효배지 글리세롤K2SO4MgSO4KOHCaSO4H3PO4NH4OH(25%)*효모 미량금속 용액 40g/ℓ18g/ℓ10.24g/ℓ4.13g/ℓ0.9g/ℓ27㎖/ℓ30㎖/ℓ4.4㎖/ℓ
유가발효배지I 글리세롤*효모 미량금속 용액 500g/ℓ(50%, w/v)12㎖/ℓ
유가발효배지 II 메탄올*효모 미량금속 용액 500g/ℓ(50%, w/v)12㎖/ℓ
*효모 미량금속 용액 CuSO4·5H2OKIMnSO4·H2O소듐몰리브데이트 다이하이드레이트보론산CoCl2ZnClFeSO4·7H2O바이오틴황산 6.0g/ℓ0.09g/ℓ3.0g/ℓ24.0g/ℓ0.02g/ℓ0.5g/ℓ20.0g/ℓ65.0g/ℓ0.2g/ℓ5.0㎖/ℓ
우선, 종균배양은 YPD에서 15시간의 진탕배양을 통하여 수행하였다.
이때, 발효기는 실험실 규모의 발효조(KOREA Fermentor, SY-500)였으며, 처음 회분발효(batch)의 배지부피는 1.5ℓ이었고, 두 단계의 유가배지의 부피는 각각 0.5ℓ로 하였다.
배양온도와 pH는 각각 30℃, 5.0을 유지하였으며, 발효조의 교반속도는 600∼1,000rpm으로 조절하였다.
첫 번째 유가배양 구간(fed-batch I)에서는 발효조 내의 용존산소량을 일정하게 유지하는 DO-스탯트 방법을 채택하였다.
두 번째 유가배양 구간(fed-batch II)에서는 일정속도로 유가배지를 발효조 내로 주입하는 방법을 사용하였다.
그리고, 600nm에서의 흡광도(Ultrospec II, LKB biochrom)와 세포건조중량(Dry Cell Weight)을 통하여 세포성장을 측정하였다.
발현된 엘라스테이즈 저해제인 거머린의 양은 다음과 같은 방법을 통해 측정하였다; 측정하고자 하는 시료 0.10㎖와 완충용액(0.05M Tris-Cl 완충액, pH 8.0) 0.10㎖, 효소액(돼지 췌장액 엘라스테이즈(porcine pancreatic elastase), 0.1U, 시그마사 제품) 0.01㎖, 이 효소의 기질(N-석시닐-Ala-Ala-Ala-p-나이트로아닐라이드) 용액 0.30㎖를 차례대로 혼합하고 10분 동안 일정온도에서 반응시킨 후 410nm에서의 흡광도를 통하여 유리된 p-나이트로아닐린의 양을 측정하였다.
여기서, 시료는 희석배수를 1∼512배까지로 하였으며, 대조군은 시료 대신 사용 완충액을 첨가하였다.
이의 결과로부터 다음의 정의에 따른 저해제의 양인 IU를 얻을 수 있었다.
*1IU: 엘라스테이즈가 p-나이트로아닐린을 10분동안의 평균분당 1μM 만큼 생성하는 것을 저해하는 저해제의 양(참조: Jung, H.H., Kim, S.I., Ha, K.S., Joe, C.O. and Kang, K.W., 1995, Isolation and Characterization of Guamerin, a New Human Leukocyte Elastase Inhibitor from Hirudo niponia, J. Biol. Chem., 270(23): 14879-13884).
발효 과정은 상기와 같은 바, 첫째 단계는 발현 및 분비에 알맞는 세포량이 될 때까지 세포를 양적으로 증대시키는 바, 구체적으로는 회분발효와 발효조 내의 용존산소량을 세포 영양상태의 지표로 삼는 유가배양의 두 단계로 나뉜다. 여기서는 상기 표 2에 나타낸 바와 같이 탄소원으로 글리세롤을 사용하여 원하는 단백질의 때아닌 발현 및 분비를 억제한다.
둘째 단계는 발효조 내의 기존 탄소원을 완전히 고갈시키는 과정으로, 배지내 용존산소량의 급격한 증가시점으로부터 30분의 시간동안 다른 탄소원을 공급해주지 않는다.
셋째 단계는 포도당이나 글리세롤과 같이 기 사용된 탄소원이 고갈된 후 발현 유도물질이면서 세포의 탄소원으로 사용되는 메탄올을 첨가하여 유가배양하는 과정이다(생산(production) 단계). 이때 세포성장 자체는 세포성장 단계에 비하여 탄소원의 이용속도 차이에 의하여 둔화된다. 그러나, 증가한 세포량으로부터 효과적으로 원하는 단백질을 얻을 수 있다.
상기의 공정을 엘라스테이즈 저해 펩타이드인 거머린의 발효에 적용한 결과를 도 1에 나타내었다. 그 결과, 600nm에서의 흡광도가 300AU에 이르렀으며, 세포건조중량으로는 80g/ℓ 이상으로 추산되었다.
이와같은 결과로부터 본 발명에서 확립된 발효공정은 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) 발현체계가 엘라스테이즈 저해 펩타이드인 거머린의 대량 생산을 위한 발효공정에 적합하고 효율적임을 알 수 있다.
실시예 2: 소수성 상호작용 크로마토그래피(Hydrophobic interaction chromatography)
상기 실시예 1을 통해 얻어진 배양액을 원심분리하여 그 상징액을 얻었다. 이 상징액은 본 발명 균주로부터 발현, 분비된 재조합 거머린을 포함하고 있다.
구체적으로는 우선 배양액에 황산암모늄을 1M 되도록 녹인 다음, 이를 미리 준비한 컬럼에 준비하였다.
이 컬럼은 페닐 세파로오즈 6FF를 1M 황산암모늄이 녹은 0.05M Tris-Cl 완충액(pH 8.0)으로 평형시켜 놓은 것이다. 분리시료를 주입한 다음 황산암모늄의 농도를 0M까지 낮추면서 여러 단백질로부터 원하는 단백질인 거머린을 분리하였다. 이 방법은 단백질의 소수성 부분과 분리고정상의 소수성 기능기의 상호작용의 차이를 이용한 크로마토그래피 방법이다.
거머린의 검출은 엘라스테이즈 저해활성을 측정하여 수행하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2의 결과로부터 0.2M 황산암모늄 농도에서 엘라스테이즈 저해 활성을 지닌 단백질이 용출되는 것으로 보아 재조합 거머린은 보통의 단백질과는 달리 소수성을 많이 가지고 있음을 알 수 있다.
실시예 3: 역상크로마토그래피(Reverse phase chromatography)
상기 실시예 2에 따라 얻어진 단백질 용액을 보다 순수한 형태로 분리하기 위해 다음과 같이 역상크로마토그래피를 실시하였다.
상기 소수성 상호작용 크로마토그래피를 통해 분리된 단백질 용액에 2-프로판올을 5%(v/v) 되도록 혼합한 후 역상 크로마토그라피 칼럼에 주입하였다. 역상크로마토그래피 컬럼은 C8-100-10SP(아미콘사 제품)로 실리카에 기능기로 옥틸기가 결합된 것(옥틸실릴, 2.2cm/11.4cm)으로 단백질 잔기의 소수성 부분과의 상호작용으로 단백질을 분리해 낸다.
이를 5%(v/v) 농도의 2-프로판올로 평형시켜 놓고, 여기에 분리하고자 하는 시료를 주입하였다. 그 다음, 2-프로판올의 농도를 20%, 40%, 90%로 증가시키면서 재조합 거머린을 분리하였다. 이때, 유속은 5㎖/10분으로 하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. 여기에서 보면 재조합 거머린이 2-프로판올의 농도 10% 이하에서 용출되는 것을 알 수 있다.
본 분리방법에 대한 정제표를 다음 표 4에 나타내었다.
정제표(Purification table)
IU 단백질(㎍/㎖) 비활성도(10-3IU/㎍) 수율(%)
배양액 497 1050 0.489 100
HIC 643 290 2.22 29.1
RPC 784 303 2.59 15.4
주식회사HIC : 소수성 상호작용 크로마토그래피, RPC : 역상크로마토그라피
상기 표4의 결과로부터 최종 수율이 15% 이상인 것으로 보아, 본 발명의 생산방법을 대량 생산공정에 적용시 효과적인 스케일-업이 가능함을 예측할 수 있다.
실시예 4: 분리된 재조합 거머린의 확인
상기 실시예 2 및 3을 거쳐 얻어진 단백질의 순도와 원하는 거머린이 제대로 발현되었는 지를 알아보기 위해 분리된 단백질의 아미노산 분석 및 질량분석을 수행하였다. 그 결과를 각각 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4 및 도 5의 결과로부터 본 발명의 분리방법에 따라 얻어진 재조합 거머린의 순도는 99% 이상으로 매우 순수하였고, 활성도 그대로 유지하고 있음을 알 수 있다.
그리고, 정제된 재조합 거머린 시료를 기초로 하여, 상기 실시예 1의 발효공정에서 생산된 단백질의 양은 0.25g/ℓ 이상인 것으로 나타나 높은 수율의 효과적 발효공정이 실시되었음을 알 수 있다.
실제로 보고된 바에 의하면 본 공정과 유사한 다른 최적화된 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) 발현체계를 이용한 외래 단백질의 생산에 있어 그 발현량은 0.10∼12g/ℓ로 매우 넓게 분포한다(Cregg, J.M., Vedvick, T.S. and Rashke, W.C., 1993, Recent Advaces in the Expression of Foreign Genes in Pichia pastoris, Bio/Technology, 11:905∼910).
이로써 본 발명자는 재조합 거머린 생산 효모로부터 거머린을 발현, 분리 및 정제하는 방법을 확립하였다.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 따라 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 거머린 유전자를 도입한 재조합 효모를 글리세롤을 탄소원으로 하여 회분발효 및 유가배양한 후, 메탄올을 탄소원으로 하고 유가배양하여 발효액을 얻은 다음, 이를 소수성상호작용 크로마토그라피 및 역상크로마토그라피를 통해 분리하는 경우 고수율로 활성이 우수한 엘라스테이즈 특이 저해제 즉, 거머린을 우수한 활성으로 대량 얻을 수 있도록 하여 이를 폐기종, 건선, 관절염 등을 일으키는 엘라스테이즈에 특이적으로 저해활성을 갖는 약제로서 실용화할 수 있도록 하는 효과가 있다.

Claims (6)

  1. 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 거머린 유전자를 도입한 재조합 효모를 글리세롤을 탄소원으로 하여 회분발효 및 유가배양하는 단계,
    용존산소량의 급격한 증가시점으로부터 30분 동안 탄소원의 공급을 중단하는 단계,
    메탄올을 첨가하고 유가배양하여 발효물을 얻는 단계, 및
    상기 발효물을 소수성상호작용 크로마토그래피 및 역상크로마토그래피를 통해 정제하는 단계로 이루어진 재조합 효모를 이용한 한국산 흡혈종 거머리 유래 엘라스테이즈 특이 저해 펩타이드의 대량 생산방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 거머린 유전자를 도입한 재조합 효모로는 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115;pGSI(수탁번호 KFCC-11037)를 사용하는 것을 특징으로 하는 한국산 흡혈종 거머리 유래 엘라스테이즈 특이 저해 펩타이드의 대량 생산방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 거머린 유전자를 도입한 재조합 효모로는 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115;pGS29A(수탁번호 KFCC-11038)를 사용하는 것을 특징으로 하는 한국산 흡혈종 거머리 유래 엘라스테이즈 특이 저해 펩타이드의 대량 생산방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 글리세롤을 탄소원으로 하는 유가배양은 DO-스탯트 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 한국산 흡혈종 거머리 유래 엘라스테이즈 특이 저해 펩타이드의 대량 생산방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 소수성상호작용 크로마토그래피는 분리수지로 페닐세파로즈를 사용하고, 농도구배 형성에 황산암모늄을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 한국산 흡혈종 거머리 유래 엘라스테이즈 특이 저해 펩타이드의 대량 생산방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 역상크로마토그래피는 분리수지로 옥틸기를 갖는 수지을 사용하고, 전개용매로 2-프로판올과 물을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 한국산 흡혈종 거머리 유래 엘라스테이즈 특이 저해 펩타이드의 대량 생산방법.
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