KR20030079194A

KR20030079194A - 재조합 효모를 이용한 고순도 ｓｈＬｋｎ-1의 대량정제방법

Info

Publication number: KR20030079194A
Application number: KR1020020018045A
Authority: KR
Inventors: 임인환; 안주형; 강관엽; 최무림; 윤엽; 정경환; 박두홍
Original assignee: 재단법인 목암생명공학연구소
Priority date: 2002-04-02
Filing date: 2002-04-02
Publication date: 2003-10-10

Abstract

본 발명은 재조합 효모를 이용한 고순도 shLkn-1 단백질의 대량 정제방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 shLkn-1 유전자를 도입한 재조합 효모의 배양액을 2 내지 4배의 증류수로 희석시키는 단계, 양이온 크로마토그래피를 수행시키는 단계 및 역상 크로마토그래피를 수행시키는 단계를 포함하는 재조합 효모를 이용한 고순도 shLkn-1 단백질의 대량 정제방법에 관한 것이다. 상기 방법에 따른 조혈모세포 증식억제 기능을 갖는 C6 β-케모카인에 속하는 고순도 shLkn-1의 대량 정제를 통하여 항암보조제로서의 실용화가 가능하게 된다.

Description

재조합 효모를 이용한 고순도 ｓｈＬｋｎ-1의 대량정제방법{Large-scale purification method of shLkn-1 protein with high purity using recombinant yeast}

본 발명은 재조합 효모를 이용한 고순도 shLkn-1 (short version of humanLeukotactin-1)의 대량 정제방법에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 조혈모세포 증식억제 기능을 갖는 C6 β-케모카인에 속하는 shLkn-1을 양이온 크로마토그래피와 역상 크로마토그래피를 수행하여 고순도 shLkn-1 단백질을 대량으로 정제하는 방법에 관한 것이다.

조혈모세포는 적혈구, 백혈구, 혈소판 등을 만드는 미분화된 골수조혈세포의 조상세포로, 몸 전체에서 발견되며, 특히 골수에서 대량생산된다. 조혈모세포의 이상과 관련된 질환으로 재생불량성 빈혈, 백혈병, 골수이형성 증후군 등이 있고, 또한 항암제의 지나친 투여로 조혈모세포의 손상이 야기될 수 있다.

케모카인은 분자량이 7∼16kDa인 단백질로서 일반적으로 4개의 시스테인을 함유하고 있으며, 이들의 위치에 따라 CXC 서브패밀리(α subfamily)와 CC(β subfamily)로 구분할 수 있는 사이토카인류에 속하는 물질로서, HIV-억제작용, 면역 조절작용, 조혈 모세포의 분열 억제능(참조; Cocchi, F. et al., Science, 270:1811(1995); Wolpe, S.D. et al., J. Exp. Med., 167:570(1988); Graham, G.J. et al., Nature, 344:442(1990); Broxmeyer, H.E. et al., Blood, 76:1110(1990); Youn, B. S. et al., J. Immunol., 155:2661-2667(1995)) 등의 생물학적 활성을 나타내는 것으로 보고되어 있다.

이러한 기능 중 조혈모세포의 증식을 억제한다는 기능을 이용하여 계속적으로 증식하는 암세포를 파괴하는 화학항암제 치료요법 및 방사선 치료요법에 사용하는 경우 암세포뿐만 아니라, 활발하게 증식하는 각종 혈구세포들도 함께 손상되는 문제점이 발생한다.

혈구세포들은 각종 감염균에 대한 퇴치 기능, 면역기능, 산소전달기능, 혈액응고 및 용해 기능 등 일상 생활의 영위에 있어 필수 불가결한 작용을 하는 아주 중요한 구성 성분으로서, 이러한 혈구세포의 결핍은 화학항암제 치료요법 및 방사선 치료요법에 있어 질병에 대한 방어 및 퇴치 기능의 저하, 화학항암제의 투여 용량 및 회수의 감소로 인한 치료효과의 저하, 입원 치료기간의 증가로 인한 치료비용 증가 등의 문제점을 수반하게 된다.

따라서, 상기 혈구세포 결핍증으로 야기되는 문제점을 극복하기 위하여 화학항암제 치료보조제의 개발이 요구되었다.

혈구세포의 종류, 수량 및 기능은 조혈모세포(hematopoietic stem cell) 및 혈구세포 전구세포의 분화, 증식을 촉진하는 사이토카인 물질과 반대로 이를 억제하는 사이토카인 물질의 평형적 작용으로 조절되는 조혈과정(hematopoiesis)에 의하여 일정하게 유지된다.

따라서 화학항암제 치료로 야기되는 혈구세포 결핍증을 개선하기 위한 치료보조제의 개발전략에는 조혈과정 촉진 사이토카인 물질을 이용하여 결핍된 혈구세포의 회복을 증진시키는 방법(post-chemotherapy approach)과 조혈과정 억제 사이토카인 물질을 이용하여 조혈모세포를 화학항암제 활성으로부터 보호하는 방법(pre-chemotherapy approach)이 있다.

이중 조혈과정 촉진 사이토카인을 이용하는 방법은 G-CSF, GM-CSF, EPO등의 재조합 단백질 대량생산 공정의 개발로 이미 상업화되어 있다.

한편, 케모카인 물질 중 조혈모세포 증식억제 기능을 갖고 있는 것으로 밝혀진 MIP-1α, IL-8, MCP-1, MPIF-1 등에 대한 생물학적 기초 연구와 임상적 응용을 위한 연구가 여러 연구 기관들에 의하여 경쟁적으로 이루어지고 있는 상황이고, 이중, MIP-1α의 경우에는 시험관내(in vitro) 뿐만 아니라 화학항암제를 투여한 실험동물을 이용한 생체내(in vivo) 동물실험에서 화학항암제로부터의 조혈모세포 보호활성이 확인되었으며, 현재 영국의 British Biotech Pharmaceutical 사와 미국의 Genetics Institutes사에서 이의 약제화를 위한 전임상 및 임상시험을 수행 중에 있다. 상기 조혈모세포 증식억제제를 화학항암제 및 방사선 치료 보조제로 이용하는 방법은 혈구세포 결핍증 유발 시기의 지연, 혈구세포 결핍증으로부터 회복되는 기간의 단축 효과를 얻을 수 있고, 이에 따라 화학항암제 투여량의 증대 및 화학항암제 투여 회수의 증대가 가능하여 항암치료 효과를 향상시킬 수 있다.

본 발명자들은 기 출원한 국제 특허출원 PCT/KR99/00262호에서 조혈모세포 증식억제 인자인 Lkn-1의 트렁케이티드 폼(truncated form)으로 Lkn-1 보다 생물학적 활성이 큰 shLkn-1의 유전자를 확보하고, 이를 메탄올 자화효모균인 파이키아 파스토리스에서 대량 생산하고자 발현체계를 구축(Pichia pastorisGS115:pPM2-HF, 한국종균협회:KCCM-10159)하였다. 상기 shLkn-1은 CC 케모카인 중에서 4개의 시스테인 외에 2개의 시스테인이 더 첨가되어 있는 C6 케모카인에 속하며 3개의 이황화결합을 하고, 총 66개의 아미노산으로 구성되어 있다. 분자량은 약 7.2kDa이며 용액상태에서 단량체로 존재한다.

한편, 재조합 단백질에 대한 종래의 정제방법으로는 융합형태로 발현되는 단백질의 정제시 일반적으로 사용되는 재중첩 방법이 있는데, 이는 재조합 단백질의봉입체를 화학물질로 용해한 후 투석하는 방법이나 단백질의 희석방법을 이용하는 것인데, 투석방법은 투석용 여과체(membrane)를 사용하므로 대량생산에 도입하기에는 경제성이 떨어지고, 단백질 희석방법은 전체 단백질의 부피가 많아져 그 다음 단계인 융합 단백질로부터 목적 단백질을 절단하기 위해서는 단백질을 농축해야 하는 단점이 있다. 또한, 단백질의 재중첩 후 다음 정제 단계인, 융합단백질로부터 목적단백질을 분리하는 방법에는 화학물질을 이용한 방법(chemical cleavage) 또는 여러 가지 효소를 이용하여 절단하는 방법(enzyme cleavage)이 있는데, 화학적 방법들은 일반적으로 절단부위에 대한 특이성이 낮으며, 효소를 이용한 방법들은 절단부위에 대한 특이성은 높으나 효소 가격이 비싸므로 경제적이지 못한 문제점 등이 있었다.

이에 본 발명에서는 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 shLkn-1 유전자를 도입한 재조합 효모인 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115:pPM2-HF(KCCM-10159)로부터 세포밖으로 분리된 shLkn-1 단백질을 포함하는 배양액을 이온 교환 크로마토그래피 (ion exchange chromatography: IEC)와 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography: RPC)의 정제를 통하여 고순도의 shLkn-1을 대량 정제할 수 있었고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 shLkn-1이라 명명된 기존의 Lkn-1 유전자 보다 생물학적 활성이 큰 조혈모세포 증식억제인자를 고순도로 대량 정제하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 방법은 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 shLkn-1 유전자를 도입한 재조합 효모의 배양액을 2 내지 4배의 증류수로 희석시키는 단계, 양이온 교환 크로마토그래피를 수행시키는 단계 및 역상 크로마토그래피를 수행시키는 단계로 이루어진다.

도 1은 양이온 교환 크로마토그래피와 역상 크로마토그래피 수행 후, 정제된 shLkn-1의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯(Western blot) 결과를 나타내는 사진이고,

도 2는 양이온 교환 크로마토그래피와 역상 크로마토그래피 수행 후, 정제된 shLkn-1의 역상(Reverse phase)-HPLC 분석 결과를 나타낸 사진이고,

도 3은 정제된 shLkn-1의 역상 등전점전기이동(Reverse Isoelectric Focusing; IEF)을 수행한 결과를 나타내는 사진이고,

도 4는 정제된 shLkn-1의 젤 여과 크로마토그래피 결과를 나타낸 그래프이고,

도 5는 정제된 shLkn-1의 아미노산 분석 결과를 나타내는 그래프이고,

도 6은 정제된 shLkn-1의 질량분석 결과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 shLkn-1 유전자를 도입한 재조합 효모의 배양액을 2 내지 4배의 증류수로 희석시키고, 양이온 교환 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피를 수행하여 고순도로 shLkn-1 단백질을 대량 정제하는 방법에 관한 것이다.

상기 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 shLkn-1 유전자를 도입한 재조합 효모로는 본 출원인에 의해 기 출원된 것으로서 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115:pPM2-HF(KCCM-10159)이다.

본 발명에 따르면, 먼저Pichia pastorisGS115: pPM2-HF(KCCM-10159) 균주로부터 발현 및 분비된 재조합 shLkn-1을 포함하는 배양액을 2∼4배 증류수로 희석하였고, 상기 배양액은 본 발명의 균주로부터 발현, 분비된 재조합 shLkn-1 단백질을 포함하고 있다.

본 발명의 이온 교환 크로마토그래피는 분리 수지로 설포프로필(sulphopropyl) 강 양이온 교환수지를 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피로서 익스팬디드 배드 컬럼(expanded bed column)에 설포프로필 강 양이온 교환수지를 충진한 후, pH 6 내지 8의 10 내지 100mM Tris-HCl 평형완충용액으로 평형시켜 놓는다. 상기 희석된 배양액을 컬럼의 하단을 통해 주입하여 충진된 수지를 부유시키면 수지에 shLkn-1만 흡착되고, 세포와 다른 불순물은 컬럼 밖으로 제거된다. 이는 중성 pH 범위에서 shLkn-1이 양이온을 띠고 있기 때문에 수지의 설포프로필기의 음이온과 이온결합에 의해 shLkn-1만이 흡착되고, 그 이외의 단백질과 세포가 제거되는 것이다. 주입이 끝나면 부유된 상태에서 평형완충용액을 이용하여 세척을 하고, 세척이 끝나면 팩트 배드(packed bed)로 컬럼을 충진하고 0.1 내지 0.5M 소듐 클로라이드가 포함된 용출완충용액을 이용하여 shLkn-1을 배양액으로부터 분리하였다. 이에 의해 배양액으로부터 세포를 분리해야 하는 공정이 생략되어 비용과 시간면에서 경제적이다.

상기 양이온 크로마토그래피를 수행한 다음 역상 크로마토그래피를 수행하게 되는데, 이때 분리수지로 폴리스티렌/디비닐 벤젠(polystyrene/divinyl benzene)을 사용하고, 이는 단백질 잔기의 소수성 부분과의 상호작용에 의해 단백질을 분리하며, 전개 용매로는 트리플루오로아세트산이 포함된 증류수와 트리플루오로아세트산이 포함된 아세토니트릴을 사용하여 수행하였고, 이는 트리플루오로아세트산이 포함된 증류수(0.1% TFA(v)/증류수(v))에 트리플루오로아세트산이 포함된 아세토니트릴(0.1% TFA(v)/아세토니트릴(v))이 5%정도 포함되도록 하여 시작되고, 트리플루오로아세트산이 포함된 아세토니트릴(0.1% TFA(v)/아세토니트릴(v))의 농도를 점차로 높여주면서 전개하였다. 이 때, 재조합 shLkn-1 단백질은 약 15 내지 25%(v/v) 농도의 아세토니트릴에서 용출되었다.

본 발명의 이온 크로마토그래피와 역상 크로마토그래피를 포함하는 정제 과정을 통하여 조혈모세포 억제 기능을 갖는 shLkn-1 단백질을 고순도, 저비용으로 대량 정제할 수 있었다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하지만, 하기 실시예에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1

양이온 교환 크로마토그래피(IEC)

Pichia pastorisGS115 : pPM2-HF(KCCM-10159) 균주로부터 발현 및 분비된 재조합 shLkn-1을 포함하는 배양액을 3배의 증류수로 희석하였다.

익스팬디드 배드 컬럼에 설포프로필 강 양이온 교환수지인 StreamLine SP (Amersharm Pharmacia Biotech) 수지를 충진한 후, pH 7.4의 20mM Tris-HCl 평형완충용액으로 평형시켰다. 상기 희석된 배양액을 컬럼의 하단을 통해 주입하여 충진된 수지를 부유시켜 수지에 shLkn-1만 흡착시키고, 세포와 다른 불순물은 컬럼 밖으로 제거하였다. 주입이 끝나면 부유된 상태에서 pH 7.4의 20mM Tris-HCl 평형완충용액을 10배 컬럼 볼륨(약 80 리터)으로 세척한 후, pH 7.4의 20mM Tris-HCl에 0.3M 소듐 클로라이드가 포함된 용출완충용액으로 용출시켜 25 리터의 shLkn-1이 포함된 용출액을 얻었다.

상기 분리된 shLkn-1의 검출은 흡광도 280nm로 측정하고, SDS-PAGE(Novex, 4∼20% Tris-Glycine gradient gel)와 웨스턴 블롯을 통하여 확인하였고, 그 결과를도 1에 나타내었다. 분리된 시료의 순도를 C₁₈분석 역상 HPLC(analytical reverse phase HPLC)(Gilson 322 322 HPLC system, Gilson UniPoint system software 3.0, Vydac사의 C18 protein & peptide column)를 통하여 확인하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

실시예 2

역상 크로마토그래피(RPC)

상기 실시예 1에 따라 얻어진 단백질 용액을 보다 순수한 형태로 분리하기 위해 하기와 같이 역상 크로마토그래피를 수행하였다. 역상 크로마토그래피에 사용된 수지는 폴리스티렌/디비닐 벤젠 비드(bead)로 Source 15 RPC(Amersham Pharmacia Biotech)이었다. 상기 수지를 충진한 후, 트리플루오로아세트산이 포함된 증류수(0.1% TFA(v)/증류수(v))에 트리플루오로아세트산이 포함된 아세토니트릴(0.1% TFA(v)/아세토니트릴(v))을 1 내지 10%(v/v)농도로 평형시키고, 이온 교환 크로마토그래피에서 얻어진 시료와 상기 전개용매를 혼합 주입하였다. 시료 주입이 끝나면 트리플루오로아세트산이 포함된 증류수(0.1% TFA(v)/증류수(v))에 트리플루오로아세트산이 포함된 아세토니트릴(0.1% TFA(v)/아세토니트릴(v))을 1 내지 10%(v/v) 농도로 세척한 후, 아세토니트릴의 용출 농도를 단계 및 선형 농도 구배 조건을 혼합하여 순도 99%이상의 shLkn-1를 분리하였다. 이때, 재조합 shLkn-1 단백질은 약 20%(v/v) 농도의 아세토니트릴에서 용출되었다.

상기 분리된 shLkn-1의 검출은 흡광도 280nm로 측정하고, SDS-PAGE와 웨스턴블롯을 통하여 확인하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 분리된 시료의 순도를 C₁₈분석 역상 HPLC를 통하여 확인하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

상기 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, SDS-PAGE와 웨스턴 블롯의 사진에서 배양액의 경우 shLkn-1 단백질 외에 다양한 효모 유래 단백질이 함께 존재하고 있었으나, 이온 교환 크로마토그래피를 수행한 결과, 효모 유래 단백질(분자량이 높은 단백질)이 제거됨을 확인할 수 있었다.

또한, 역상 크로마토그래피를 수행하였음에도 불구하고, SDS-PAGE와 웨스턴 블롯으로 구별할 수 없었던 불순물(도 1 참조)을 도 2에 나타낸 바와 같이, 역상 HPLC를 통해 분석하였다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 역상 HPLC상에서 배양액은 불순물(효모 유래 단백질)과 shLkn-1이 혼합되어 있었고, 이온 교환 크로마토그래피 수행 후에는 shLkn-1과 소량의 shLkn-1 관련 단백질(이성체 등)만이 존재하였으며, 최종 역상 크로마토그래피 후 단일 피크로 나타나는 순도 99%이상의 shLkn-1 단백질을 얻을 수 있었다.

하기 표 1에 본 발명의 정제 방법에 따른 shLkn-1 단백질의 순도 및 수율을 나타내었다.

단계	단백질량	순도	수율
배양액	54g
IEC	51.6g	86%	95.5%
RPC	28.1g	>99%	52.0%

상기 표 1의 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 99% 이상의 순도 및 50% 이상의 정제 수율로 재조합 shLkn-1 단백질을 얻었고, 정제된 시료량과 순도 및 최종 수율을 확인함으로써, 본 발명의 생산방법으로 파일롯 스케일(pilot scale) 정제 공정을 확립할 수 있었다.

실시예 3

분리된 재조합 shLkn-1의 확인

상기 실시예 1-2를 통하여 얻어진 단백질이 shLkn-1임을 확인하기 위해 분리 정제된 단백질을 N-말단 시퀀싱하였고, 그 결과 shLkn-1의 N-말단 서열( HFAADXXTSY(His-Phe-Ala-Ala-Asp-X-X-Thr-Ser-Tyr)(여기서, X는 시스테인이다.))과 동일함을 확인할 수 있었다.

또한, 역상 등전점 전기이동을 수행하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 정제된 shLkn-1 단백질은 등전점 pI 값이 약 9.0인 단일 단백질 밴드를 나타내는 고순도의 shLkn-1 단백질이었다.

한편, 정제된 shLkn-1이 역상 HPLC에서 확인되지 못한 불순물이 존재하는지와 수용액 상태에서 단량체로 존재하는지를 확인하기 위해 젤 여과 크로마토그래피를 Gllson 119 HPLC System, TSK G200SWXL 컬럼을 이용하여 수행하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 상기 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 정제된 shLkn-1 단백질의 순도는 99% 이상이고, 단일 피크를 나타내어 이성체 등이 없는 단량체로 존재함을 확인할 수 있었다.

실시예 4

아미노산 분석 및 질량 분석

실시예 1-3을 통해 정제되고, 확인된 shLkn-1 단백질의 아미노산을 HPLC에서아미노산 성분의 물리화학적 성질의 차이로 각각 분리된 표준 크로마토그램과 목적단백질을 가수분해하여 측정된 크로마토그램의 면적을 비교하여 목적단백질의 아미노산 조성을 측정하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 정제된 shLkn-1 단백질의 아미노산 몰비를 분석한 결과, 그 실험적 값과 이론적 값이 일치함을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 shLkn-1 단백질을 액체크로마토그래피를 통해 분리한 후 질량분석기에 주사하여 이온원의 전자에너지에 의해 이온화된 각 이온들의 상대세기를 질량대 전하비로 기록하여 질량을 구하는 LC-매스(LC-mass)를 수행하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 정제된 shLkn-1 단백질의 분자량이 계산상의 7.2kDa과 같음을 확인하였고, 이를 통해 목적 단백질인 shLkn-1이 정확하게 발현 및 정제되었음을 확인할 수 있었다.

전술한 바와 같이, 본 발명에서는 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 shLkn-1 유전자를 도입한 효모를 이용하여 shLkn-1 단백질을 포함하는 배양액을 양이온 교환 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피로 고수율 및 고순도로 활성이 우수한 shLkn-1를 대량 정제하여, 이를 화학항암제 및 방사선 치료 보조제로 사용함으로써 혈구세포 결핍증 유발 시기의 지연, 혈구세포 결핍증으로부터 회복되는 기간 단축의 효과를 얻을 수 있고, 이에 의해 화학항암제 투여량의 증대,화학항암제 투여 회수의 증대가 가능하여 항암치료 효과를 향상시킬 수 있다.

Claims

파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 shLkn-1 유전자를 도입한 재조합 효모의 배양액을 2 내지 4배의 증류수로 희석시키는 단계, 양이온 교환 크로마토그래피를 수행시키는 단계 및 역상 크로마토그래피를 수행시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 효모를 이용한 고순도 shLkn-1 단백질의 대량 정제방법.
제1항에 있어서, 상기 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115에 shLkn-1 유전자를 도입한 재조합 효모는 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115:pPM2-HF(KCCM-10159)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배양액은 상기 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115:pPM2-HF(KCCM-10159)로부터 세포 밖으로 분비된 shLkn-1 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 분리수지로 설포프로필(sulphopropyl) 강 양이온 교환수지를 사용하고, 용출완충용액으로 0.1 내지 0.5M의 소듐 클로라이드를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 역상 크로마토그래피는 분리수지로 폴리스티렌/디비닐 벤젠을 사용하고, 전개 용매로 트리플루오로아세트산이 포함된 증류수와 트리플루오로아세트산이 포함된 아세토니트릴을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.