KR20000007822A

KR20000007822A - 한국산 흡혈종 거머리로부터 분리된 엘라스타제 저해제 유전자를 함유한 재조합 벡터 및 형질전환체

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Publication number: KR20000007822A
Application number: KR1019980027344A
Authority: KR
Inventors: 이공주; 최경한; 고재균; 정경환; 강계원; 손영덕; 박두홍; 정수일
Original assignee: 허영섭; 재단법인 목암생명공학연구소
Priority date: 1998-07-07
Filing date: 1998-07-07
Publication date: 2000-02-07
Also published as: KR100299752B1

Abstract

본 발명은 한국산 흡혈종 거머리로부터 분리된 엘라스타제 억제제인 거머린(Guamerin)을 암호화하는 유전자를 함유하는 발현벡터 및 이로써 형질전화된 효모에 관한 것으로서, 좀더 구체적으로는 거머리의 전체 mRNA를 분리하여 cDNA 라이브러리를 건설하였고, 이로부터 거머린을 암호화하는 유전자를 분리, 염기서열을 밝히고, 이 유전자를 이용해 거머린을 대량 발현하기 위해 효모에서의 발현벡터를 건설하였는 바, 이는 발현된 단백질을 세포밖으로 유도하는 α-인자 시그널 펩타이드의 유전자에 정확한 절단을 돕도록 PCR로 변형한 거머린의 유전자를 연결하여 제조한 발현벡터로서, 이를 메탄올 자화효모인 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris)의 염색체내로 삽입하고 메탄올이 유일한 탄소원인 배지에서 배양하여 발현을 유도함으로써 엘라스타제 억제제를 대량으로 제조할 수 있도록 하였는 바, 본 발명의 발현벡터로부터 제조되는 엘라스타제 억제제는 메탄올에 의하여 고수율로 제조되며, 제조된 단백질은 정확히 프로세싱되어 천연형 거머린이 가지는 활성과 효소특이성을 가진다.

Description

한국산 흡혈종 거머리로부터 분리된 엘라스타제 저해제 유전자를 함유한 재조합 벡터 및 형질전환체

본 발명은 한국산 흡혈종 거머리로부터 분리된 엘라스타제 저해제 유전자를 함유한 재조합 벡터 및 이로써 형질전환된 효모에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 한국산 흡혈종 거머리로부터 분리한 엘라스타제만을 특이적으로 저해하는 억제 단백질 즉, 거머린을 대량 생산할 수 있도록 한 재조합 벡터와 이로써 형질전환된 효모에 관한 것이다.

일반적으로, 엘라스타제는 세린(serine)계 단백질 분해효소로 분류되는 데, 주로 엘라스틴(elastin)이라는 구조단백질을 분해하며, 또한 콜라겐, 연골, 피부로넥틴 등과 같은 생체조직을 구성하는 중요한 구조단백질을 분해하기도 한다.

엘라스타제는 사람의 경우 주로 중성구 세포(neutrophile)에 많이 저장되어 있다. 이 중성구 세포가 혈관속에서 외부로부터 감염된 병원균 또는 항원과 접촉하면, 이 세포속에 저장되어 있던 엘라스타제가 분비되어 이들 병원균이나 항원을 분해함으로써 생명체를 병원균으로부터 보호하는 역할을 한다. 그러나, 세포의 노화, 유전적 질환 등의 원인으로 인체내에서 엘라스타제의 분비가 정상적으로 조절되지 않아 조직으로 과량 분비되면 엘라스타제가 생체의 조직을 구성하는 중요한 구조단백질들을 무작위로 분해하여 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 폐기종(emphysema), 건선(psoriasis) 등의 질병을 유발하기도 한다.

보다 구체적으로, 호중구의 엘라스타제는 아조르필(azorphil) 미립에 저장되어 있으며, 감염부위 조직에 분비되어 엘라스틴, 콜라겐 등 구조 단백질을 분해시키는 기능을 갖고 있다. 이와같은 엘라스타제의 활성은 조직 내에 함께 존재하는 α1-프로테이나제 저해제(API) 등의 효소저해제에 의하여 조절되어 정상적인 상태에서는 그 기능이 호중구 내부나 또는 세포 외의 바로 인접한 장소에만 국한되어 있다. 그러나, 유전적인 결함에 의하여 선천적으로 API의 양이 적거나 엘라스타제가 과다분비되는 경우 또는 엘라스타제와 함께 호중구로부터 분비되는 활성화 산소에 의하여 API 등이 불활성화되는 경우에는 엘라스타제 활성억제 기작이 붕괴되어 폐기종(Pulmonary emphsema), 낭포성섬유증(Cystic fibrosis), 성인성 호흡곤란 증후군(Adult respiratory distress symdrome), 만성기관지염(Chromic bromchitis), 기관지 확장증(Bronchiectasis), 특발성 폐섬유증(Idiopathic pulmonary fibrosis), 건선(Psoriasis), 췌장염(Pancreatitis), 소비성 응고장애(Consumptiom coagulopathy), 혈관염(Vasculitis), 사구체신염(Glomerulanephritis), 죽상동맥경화증(Atherosclerosis) 및 관절염(Arthritis) 등 많은 질병을 야기시키게 된다. 따라서, 이러한 질병들의 효과적인 치료를 위하여 엘라스타제 활성을 선별적으로 저해시키고 또 활성화 산소에 의한 불활성화를 극복할 수 있는 저해제를 개발하는 것이 반드시 필요하다.

류마티스 관절염은 사람의 무릎이나 손가락 등의 관절부위에 과량 분비된 엘라스타제가 연골을 비정상적으로 분해시킴으로써 야기되는 염증성 질환이다. 폐기종은 폐의 조직 일부에 상처가 생기면 이 부분이 공기중의 산소에 노출되고, 이어 공기중에 있을지 모르는 병원균의 침입을 막기 위해 중성구 세포들이 전기 부위로 많이 모이면서 엘라스타제가 과량 분비되어 폐조직을 분해시킴으로써 유발되는 염증성 질환이다. 건선은 엘라스타제로 인해 생기는 대표적인 피부질환으로 붉은 반점과 함께 피부가 트는 질병이다.

의학계에서는 오래전부터 이러한 질병의 치료를 위한 방안으로, 사람의 연골, 폐, 피부 등의 조직에 비정상적으로 분비된 엘라스타제의 활성을 효과적으로 억제할 수 있는 의약용 단백질을 개발하고자 노력한 결과, 칠면조 및 오리 등의 조류, 유럽산 거머리, 사람의 피부 등 여러 종류의 생물로부터 엘라스타제 억제 단백질을 분리하여, 이를 유효성분으로 함유하는 약제를 직접 환부에 주사함으로써 치료에 효과를 보고 있는 것으로 알려져 있다.

그러나, 사람의 피부에서 분리한 엘라스타제 억제 단백질을 제외한 나머지 전기 억제단백질은 엘라스타제에 대한 특이성이 떨어져서, 엘라스타제 외에도 인간에게 중요한 여러종류의 단백질 분해효소를 억제하기 때문에 의약용으로 사용하기에는 문제가 있었다. 또한, 사람의 피부에서 분리한 엘라스타제 억제 단백질을 포함하여 종래 분리된 엘라스타제 억제 단백질은 분자량이 너무 크기 때문에, 약한 열에도 쉽게 변성이 초래되어 그 활성이 급격하게 감소한다는 문제점이 있었다.

이에 한구과학기술원 강 계원 교수 연구진은 한국산 거머리로부터 신규한 엘라스타제 억제 단백질을 얻었으며, 이를 '거머린(Guamerin)'이라 명명하였다.

거머린(Guamerin)은 한국산 거머리로부터 분리정제된 57개의 아미노산 펩타이드로서(Hyo Il Jung, et al., JBC 270) 그 아미노산 서열은 서열 1과 같다.

이같은 아미노산 서열을 갖는 거머린의 활성분석 결과 현재까지 알려진 어느 엘라스타제 억제제보다도 높은 활성저해능을 갖고 있으며, 동시에 엘라스타제 특이성도 매우 뛰어나(참조: 대한민국 특허출원 제95-10206호) 이미 세계 학계에 그 특성이 보고되었다. 이러한 특성을 가진 효소저해용 펩타이드 즉, 거머린은 종래의 엘라스타제 저해제의 단점을 보완한 보다 효과가 우수한 치료제로 개발되리라 기대되고 있다.

엘라스타제 기능조절의 이상으로 야기되는 여러 질병에 대한 효과적인 치료법이 미미한 현실정을 감안할 때 엘라스타제 저해제인 거머린이 성공적으로 약제화될 경우 독창성있는 신약으로서 세계 시장에의 진출이 가능할 것이다.

현재 세계의 엘라스타제 억제제 연구개발 현황을 살펴보면, 오노(Ono), 제네카(Zeneca), 코텍(Cortech), 후지사와(Fujisaw), 머크(Merck) 및 렉스틴(Lextic)사 등에서는 분자설계 방법에 의해 고안된 저분자량 화합물의 엘라스타제 억제제를 개발하고 있고, PPL사에서는 유전자 재조합 동물(transgenic animal????)을 이용한 α1-항트립신을 개발하고 있고, 플라토간(Platorgan), 사노피(Sanofi), 노바티스(Novartis)사 등에서는 거머리 유래의 에글린 C(Eglin C)를, 바이오팜(Biopharm, UK), 머크 KGaA사에서도 거머리 유래의 겔린(Gelin)을 개발하여 약제화하려는 노력을 경주하고 있다.

이러한, 선발업체들의 개발방향은 비교적 엘라스타제에 대한 특이성이 떨어지는 종래의 단백질 분해 억제제들을 변형시켜 엘라스타제 특이성이 개선되고, 또 산화반응에 강한 유도체 저해제 개발 등으로 요약할 수 있다.

한편, 한국과학기술원 강계원 교수 연구진에 의해 한국산 거머리로부터 분리정제되는 거머린은 대량생산에 적합하지 않으므로 이를 약제 등으로 실용화하기 위해서는 대량생산을 위한 발현체계의 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명은 현재까지 알려진 어느 엘라스타제 억제제보다도 높은 활성저해능을 갖고 있으며 동시에 엘라스타제 특이성도 뛰어난 거머린을 유전공학적 기법을 이용한 재조합 효모로부터 대량 제조하고자 하였다.

이같은 차원에서 본 발명자들은 엘라스타제 특이성이 뛰어난 억제제인 거머린의 유전자를 확보하고 이를 메탄올 자화효모인 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 대량 생산하고자 발현체계를 구축하였다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 거머린 유전자를 클로닝하여 그 염기서열을 밝히고 재조합 거머린을 대량 생산하는 발현체계를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기와 같은 재조합 거머린을 발현하는 균주를 제공하는 데 있다.

도 1은 한국산 흡혈종 거머리로부터 분리된 엘라스타제 저해제, 즉 거머린의 프로브를 얻기 위해 천연 거머린의 cDNA로부터 pPIG1-1을 구축하는 과정을 도식화한 것이고,

도 2는 한국산 거머리의 cDNA 라이브러리를 건설하는 과정을 도식화한 것이고,

도 3은 거머린의 발현벡터 구축을 위한 pBLGSI을 구축하는 과정을 도식화한 것이고,

도 4는 거머린의 발현벡터 pGSI을 구축하는 과정을 도식화한 것이며,

도 5는 거머린의 발현벡터 pGS29A을 구축하는 과정을 도식화한 것이고,

도 6은 본 발명의 거머린 발현벡터 pGSI의 유전자 지도를 나타낸 것이고,

도 7은 본 발명의 거머린 발현벡터 pGSI로 형질전환된 효모의 염색체를 각 프라이머(AOX, GUM)로 PCR을 수행하여 얻은 밴드의 전기영동사진이며,

도 8은 본 발명의 거머린 발현벡터 pGSI로 형질전환된 효모로부터 생산된 거머린을 나타내는 전기영동사진이다.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

A - Intact AOX1; 2.1kb B - (primer; 5AO X, 3 AOX); 660kb

C - (primer; 5GUM, GUM3RI); 170bp

본 발명은 한국산 거머리로부터 분리한 엘라스타제 억제 단백질인 거머린을 암호화하는 cDNA 염기서열과 이를 분비 발현하도록 유도한 유전자를 함유한 재조합 벡터에 그 특징이 있다.

또한, 본 발명은 상기 거머린 유전자를 함유한 발현 비히클로 형질전환된 효모에도 그 특징이 있다.

이와같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

천연 거머리로부터 분리정제되는 거머린은 대량생산에 적합치 않으므로 재조합 거머린 발현은 응용 가능성이 있을 것으로 예상되었다.

또한, P. pastoris는 단백질 제조, 단백질 활성화, 후전사 변이(posttranslation modification)와 같은 고등생물의 발현 시스템을 갖추고 있고, 대장균, 효모(Saccharomyces cerevisiae)와 같이 분자생물학적으로 손쉽게 이용할 수 있다.

특히, P. pastoris가 외래 단백질을 세포밖으로 분비하는 발현체계에 적합하다고 할 수 있는 점은 배양배지로 분비되는 자신의 천연 단백질이 매우 적으며 배지조성도 단순하기 때문이다(참고: Barr, et al., 1992).

이에 본 발명자들은 먼저 상기 거머린 단백질을 암호화하는 유전자를 분리하여 염기서열을 규명하였고, 이 유전자를 이용해 P. pastoris의 분비발현 시스템에 적합하도록 발현벡터를 구축하였고, 그로부터 P. pastoris 염색체내로 거머린 유전자를 삽입시켜 영구적인 거머린 발현 균주를 선별하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

거머린의 유전자를 분리하기 위해 거머리로부터 전체 RNA를 분리하여 이로부터 mRNA를 분리하였다. mRNA로부터 첫 번째 상보적 DNA(이하, 1st cDNA)를 합성하였으며, 이를 주형으로 하여 축퇴성(degenerate) DNA 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하, PCR이라 함)을 실시하였다.

합성된 PCR 산물들을 클로닝 벡터인 pUC19의 SmaI 자리에 클로닝한 후, DNA 염기서열을 분석, 거머린을 암호화하는 170 염기의 유전자 단편을 분리하였다.

또한, 1st cDNA로부터 거머리의 cDNA 라이브러리를 건설하였으며, 거머린의 170 염기의 유전자 단편을 프로브로하여 거머린의 전체 유전자를 분리하였다.

거머린을 효모에서 대량으로 발현시키기 위하여 pUC19의 SmaI 부위에 삽입된 170 염기의 거머린 cDNA를 PCR로 증폭시키고, 파이키아(Pichia) 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 거머린 cDNA는 1번 발린으로부터 시작하는 활성화 형태로 파이키아 발현벡터의 α-인자 리더(α-factor leader)와 융합시켰다.

P. pastoris 발현벡터 및 숙주는 네덜란드의 인비트로겐(Invitrogen)사에서 개발된 pPIC9 벡터(8.0kb)를 이용하였다. pPIC9 벡터의 α-인자 리더 하류에 목적 단백질을 결합하여 분비시킬 수 있도록 하였고, 이때 융합단백질의 효과적인 절단을 돕기 위해 PCR로 유전자 변형을 수행하여 KEX2 부위(Lys-Arg) 바로 뒤에 거머린의 첫 번째 아미노산 발린이 연결될 수 있도록 유전자 조작을 통하여 클로닝 부위를 만들었다. 여기서, 사용한 PCR 프라이머는 AOX1 프로모터 상류의 SacI 주변부위 프라이머와 α-인자 리더의 프라이머를 이용하였다. 변형된 벡터의 α-인자 리더 하류에 생성된 StuI 부위에 거머린 cDNA를 삽입시켜 거머린 발현벡터인 pGSI(8.2kb)를 제조하였다.

cDNA 라이브러리로부터 분리된 거머린 유전자는 거머리 추출물로부터 분리, 정제된 엘라스타제 저해활성이 확인된 천연형 거머린과 29번째 아미노산 코돈에서 차이를 보였다. 이는 거머리가 갖는 엘라스타제 저해제의 종류가 다양한 사실에 기인하는 것으로 보인다.

따라서, 천연형 거머린에 대한 발현체계를 구축하기 위하여 제조된 pGSI을 바탕으로 돌연변이를 유발시켜 천연형 거머린과 아미노산 서열이 일치하는 거머린 발현벡터인 pGS29A를 제조하였다.

거머린 발현벡터를 SalI 제한효소로 처리하여 직선화한 후 P. pastoris GS115 균주 염색체의 AOXI 유전자 내로 균질 재조합(homologous recombination)을 이용하여 삽입시켰다. 이때, 형질전환은 일렉트로포레이션(electroporation) 방법으로 실시하였으며, 히스티딘(Histidine) 결손 배지에서 콜로니를 형성한 효모 형질전환체를 선별하였다.

이 형질전환체의 염색체내 AOX1 부위로 삽입된 거머린 cDNA를 PCR과 서턴블랫(southern blat)을 통하여 확인하였다.

상기 발현벡터를 메탄올 자화 효모의 염색체에 삽입시켜 재조합한 형질전환체를 1998년 6월 12일자로 균주기탁하여 수탁번호 KFCC-11037 및 11038을 부여받았으며, 이 형질전환체를 배양하고 메탄올로 발현을 유도함으로써 생성된 배양배지의 상등액만을 사용하여 엘라스타제 억제여부를 관찰하였다. 그 결과, 소량의 상등액으로 높은 엘라스타제 억제효과를 나타내어 거머린이 배양배지에서 대량 발현됨을 확인하였다. 즉, 본 발명의 발현벡터는 정확히 효모의 염색체 내로 삽입되었고, 높은 발현과 정확한 분비 발현을 나타내었다.

아울러, 상기에서 발현된 단백질의 엘라스타제 억제효과를 보다 정확히 증명하기 위하여 거머린의 순수한 형태가 필요하였으며, 이 단백질을 얻기 위하여 소수성 상호작용 크로마토그래피(Hydropobic interaction chromatography)와 역상 크로마토그라피(reverse-phase chromatography)를 통하여 발현된 단백질을 분리하였다.

분리된 단백질은 엘라스타제 억제 효과를 나타내었다.

본 발명에서 제공되는 거머린 발현균주는 엘라스타제 분비조절 이상으로 야기되는 여러 질병에 대한 치료제 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 거머린 유전자의 탐색 및 염기서열

거머린의 유전자를 거머리의 cDNA 라이브러리로부터 분리하였다. 거머리를 액체 질소에 얼린 후 잘게 빻아 페놀과 클로로포름을 넣어 섞은 후 원심분리를 실시하여 단백질을 제거하였다.

상층액을 취해 이소프로판올을 넣고 다시 원심분리를 실시하여 전체 RNA를 침전시켰다. 추출한 전체 RNA로부터 올리고 dT 칼럼을 이용하여 mRNA를 분리하였고, 이를 주형으로 하여 역전사 반응을 실시하여 첫 번째 상보적 DNA 가닥을 합성하였다. 이때, 뮤린(Murine) 역전사효소를 사용하였으며, 올리고뉴클레오타이드 (dT)₁₈-EcoRI(5'-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAA(T)₁₈-3')를 프라이머로 하였다.

거머린의 프로브를 얻기 위해 우선 거머린의 아미노 말단으로부터 유추한 축퇴된 프라이머(5'-GTNGAYGARAAYGCNGAR GA-3')와 카르복시 말단으로부터 유추한 축퇴된 프라이머(5'-GCRCANGTRCANGGRTAYTC-3')를 합성하였다. 이들을 이용해 첫 번째 상보적 DNA 가닥을 주형으로 하여 PCR을 실시하였으며, 예상한 170개 염기의 PCR 산물을 분리하였다.

이 PCR 산물의 5'말단을 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제를 이용하여 인산기를 붙인 후 SmaI 제한효소로 자른 클로닝 벡터 pUC19에 재조합시켰다. 이로부터 분리한 클론들의 DNA 염기서열을 분석하여 거머린의 57개 아미노산을 암호화하는 유전자가 재조합된 클론을 얻어 pIG1-1이라 명명하였다(도 1 참조).

거머린을 암호화하는 유전자의 전체 염기서열을 밝히기 위해 cDNA 라이브러리를 다음과 같은 방법으로 건설하였다; 먼저 합성한 첫 번째 상보적 DNA 가닥들의 3' 말단에 터미널 트랜스퍼라아제를 이용하여 dG 잔기들을 붙여 폴리G 꼬리를 만들었다. 이를 주형으로 하여 올리고뉴클레오티드 (dT)₁₈-EcoRI (5'-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAA(T)₁₈-3')와(dC)₁₈-XhoI(5'-TTGCGGATCCTCGAG(C)₁₈-3')를 프라이머로 하여 PCR을 실시하였다.

분리한 PCR 산물을 EcoR I과 Xho I 제한효소로 절단하여 라이브러리 건설 벡터로 널리 쓰이는 Uni-ZAP^TMXR 벡터(stratagene Ltd.)041의 EcoR I과 Xho I 제한효소 인식부위에 재조합하였다.

건설된 거머리의 cDNA 라이브러리로부터 거머린의 전체 cDNA를 탐색하기 위해 pIG1-1의 170 염기의 거머린 유전자를 프로브로 사용하였으며, 탐색결과 320 염기의 거머린 유전자를 분리하였다(도 2 참조).

상기에서 얻은 거머린 유전자의 염기서열 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열은 서열 2와 같다.

실시예 2: 거머린 발현벡터 pGSI의 제조

상기 실시예 1에서 증폭시킨 거머린 유전자를 메탄올 자화효모 P. pastoris에서 발현시키기 위하여 파이키아용 삽입 발현벡터인 pPIC9을 이용하였다.

pPIC9는 파이키아에서 메탄올에 의한 높은 발현을 가능하게 해주는 프로모터 AOX1, 발현된 단백질의 분지를 가능하게 해주는 α-인자 분비시그널(α-factor secretion signal), mRNA의 효과적인 터미네이션과 폴리아데닐레이션을 가능하게 해주는 AOX1의 폴리아데닐레이션 시그널인 3' AOX1(TT) 및 파이키아 형질전환체의 표시인자(selectable marker)로서 히스티디놀 데하이드로게나아제(histidinol dehydrogenase)의 파이키아 야생형 유전자를 암호화하고 있는 DNA 단편을 일련의 순서로 포함하고 있는 발현벡터이다.

이 발현벡터의 AOX1 프로모터를 이용하여 거머린이 메탄올에 의해 발현이 유도되도록 하였고, α-인자 분비 시그널 바로 뒤에 목적단백질을 결합함으로써 발현된 단백질이 세포 밖으로 분비되도록 하였다.

이를 위하여 먼저 융합 단백질이 KEX2 유전자 산물에 의해 효과적으로 시그널 서열을 절단할 수 있도록 유전자 변형을 PCR을 통해 실시하였다.

KEX2 부위(Lys-Arg) 바로 뒤에 거머린의 첫 번째 아미노산 발린이 연결되도록 클로닝 사이트를 만들기 위하여 AOX1 프로모터 염기서열로부터 상류의 SacI 주변부위에 해당하는 올리고뉴클레오티드(5'-CTTGATTGGAGCTCGCT-3')와 α-인자 리더의 말단 부위에 해당하는 올리고뉴클레오티드 (5'-AGGCCTTTTCTCGAGAGATAC-3')를 각각 5' 및 3' 프라이머로 사용하는 PCR을 수행하였다. 이때, α-인자 리더의 말단 부위에 해당하는 프라이머는 발현벡터의 α-인자 리더 안에 위치한 KEX2 부위(Lys-Arg) 바로 뒤에 StuI 제한효소 인식부위의 염기서열을 갖도록 합성하였다.

합성된 유전자 절편을 pUC19 유래의 파지미드(phagemid)인 pBluescript-SK(+)의 EcoRV 부위에 재조합하여 pBLSS를 제조하였다. 재조합된 pBLSS의 α-인자 리더안에 위치한 KEX2 부위(Lys-Arg) 바로 뒤에 StuI 제한효소로 절단하여 상기 실시예 1에서 증폭한 거머린 유전자와 조합하여 pBLGSI을 제조하였다(도 3 참조).

pPIC9으로 형질전환된 대장균 TOP10F'(F'{proAB, lacIq, lacZΔM15, Tn10(Tet^R)} merA, Δ(mrr-hsdRMS-mrcBC), Φ80lacZΔM15, ΔlacX74, deoR, recA1, araD139, Δ(ara-leu)7679, galU, galK, rpsL(Str^R), endA1, mupG λ^-)으로부터 플라스미드를 분리하여 SacI과 EcoRI의 제한효소로 처리한 다음, 전기영동을 수행하여 벡터절편을 얻었다.

다음으로, pBLGSI을 SacI과 EcoRI의 제한효소로 처리한 다음 전기영동을 수행하여 α-인자 리더와 연결된 거머린 유전자를 분리하여 pPIC9 발현 벡터 절편과 조합하여(도 4 참조) 거머린 발현벡터인 pGSI(8.2kb)를 제조하였다(도 6 참조).

도 3과 도 4는 발현벡터 pGSI 조합과정의 모식도이며, 도 6은 발현벡터 pGSI의 유전자 지도를 나타낸다. GUM는 거머린 유전자 단편을 나타낸 것이다.

결국, 상기의 유전적 변형과 재조합을 거쳐 α-인자 리더 안에 위치한 KEX2 부위(Lys-Arg) 바로 뒤에 거머린 유전자가 위치하도록 하였고, 이는 발현된 융합단백질이 KEX2 유전자 프로덕트에 의해 α-인자 리더만을 절단하도록 유도한 것이다.

실시예 3: 거머린 발현벡터 pGS29A의 제조

상기 실시예 2에서 사용한 거머린 유전자(서열 2 참조)는 거머리 추출물로부터 분리, 정제하여 엘라스타제 저해활성이 확인된 천연형 거머린(서열 1 참조)과 비교할 때 29번째 아미노산 코돈이 Ala에서 Val로 바뀐 형태이다.

이 재조합 거머린의 29번째 아미노산을 변형시켜 천연형과 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 거머린을 제조하기 위하여 U-DNA 돌연변이 유발(mutagenesis, Kunkel 방법)을 수행하였다.

우선 f1 기원(origin)이 있는 pBLGSI을 사용하여 우라실을 포함하는 단일 유전자 가닥 파지미드 DNA를 제조하였다. 그리고, 거머린에 해당하는 유전자 중에서 29번째 아미노산인 Val을 Ala로 치환하기 위해 그 주변부위에 해당하는 올리고뉴클레오티드(5'-TTGCTTACGCGAACGTGACG-3')을 이용하여 돌연변이를 유발시켜 pBLGS29A를 제조하였다.

다음으로 pBLGS29A을 SacI과 EcoRI의 제한효소로 처리한 다음 전기영동을 수행하여 α-인자 리더와 연결된 거머린 유전자를 분리하여 pPIC9 발현벡터 절편과 조합하여 거머린 발현벡터인 pGS29A(8.2kb)를 제조하였다.

도 5는 발현벡터 pGS29A 조합과정의 모식도이다. 이렇게 제조된 pBLGS29A와 pGS29A의 DNA 시퀀싱을 수행하여 원하는 부위의 염기서열 변형을 확인하였다.

실시예 4: 거머린의 형질전환체 제조

상기 실시예 2와 3에서 제조된 발현벡터 pGSI와 pGS29A의 발현숙주로는 메탄올 자화효모인 파이키아 파스토리스 GS115(Pichia pastoris host strain GS115)을 사용하였다. GS115 균주는 히스티디놀 데하이드로게나아제 유전자(his4)에 결함이 있어 히스티딘 합성이 저해되기 때문에 이를 형질전환체의 숙주로 사용이 가능하다. 즉, 모든 발현 플라스미드는 HIS4 유전자를 가지고 있어 숙주가 가지는 결함을 보상해 주게 되므로 형질전환체만이 선별적으로 히스티딘 결손배지에서 자랄 수 있다.

우선, 파이키아 파스토리스(P. pastoris) 호스트 스트레인의 배양조건에 있어서, GS115는 복합배지인 YPD(1% 효모추출물, 2% 펩톤, 2% 덱스트로오스)에서 형질전환체는 히스티딘 결손 배지인 MD(1.34% YNB, 4×10^-5% 바이오틴, 1% 덱스트로오스)에서 배양하였다.

발현벡터 pGSI 또는 pGS29A로 메탄올 자화효모인 P. pastoris 호스트 스트레인 GS115을 형질전화시키기 위하여 GS115를 5㎖ YPD에서 30℃로 밤샘 배양한 후 500㎖ YPD에 0.5㎖ 접종하였다. 광학 밀도(O.D₆₀₀)가 1.3∼1.5가 되면 침전되는 세포만을 원심분리로 회수하여 차가운 멸균수로 씻어주었다. 다시 침전되는 세포만 원심분리로 회수하여 20㎖의 차가운 1M 솔비톨로 씻어주고, 최종적으로 1㎖의 차가운 1M 솔비톨에 풀어주었다. 이렇게 준비된 세포 80㎕에 제한효소 SalI으로 절단된 5∼20㎍의 DNA을 넣어 섞은 후 일렉트로포레이션 큐벳(0.2cm)에 옮겨 얼음에서 5분 동안 배양한 후 일렉트로포레이션을 실시하였다. 이때, 충전압은 1500V이고, 정전용량 25㎌, 저항 200으로 하였다.

일렉트로포레이션 후 즉시 1㎖의 차가운 1M 솔비톨을 넣어준 후 MD 배지에 도말하여 30℃ 배양기에서 콜로니가 나타날 때까지 배양하였다. pGSI이나 pGS29A을 SalI으로 절단하는 것은 숙주의 염색체에 위치하는 HIS4 부위로 플라스미드가 삽입되도록 유도한 것이며, 이는 mut⁺의 표현형을 나타낸다. 즉, 염색체 상에 위치한 AOX1 유전자에는 아무런 영향을 주지않기 때문에 메탄올만을 탄소원으로 하여도 잘 성장할 수 있는 특성을 갖는다.

형질전환체에 거머린 유전자가 제대로 염색체내로 삽입되었는지 알아보기 위하여 PCR을 실시하였다.

도 7에서, AOX(도 7)는 형질전환체를 AOX1 프로모터 부위에 해당하는 올리고뉴클레오타이드(5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3')와 AOX1의 폴리아데닐레이션 시그널인 3'AOX1(TT) 부위에 해당하는 올리고뉴클레오타이드 (5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3')를 각각 5' 및 3' 프라이머로 사용하는 PCR을 수행하여 얻은 DNA 단편을 1% 아가로스젤에 전기영동한 것이고, GUM(도 7)은 거머린 유전자의 염기서열로부터 아미노 말단 부위에 해당하는 올리고뉴클레오타이드(5'-GTTGACG'GAATGCGGAG-3')와 카르복시 말단 부위에 해당하는 올리고뉴클레오타이드(5'-GAATTCTTACGCGCAGGTACATGG-3')를 각각 5' 및 3' 프라이머로 사용하는 PCR을 수행하여 얻은 DNA 단편을 2% 아가로스 젤에 전기영동한 결과이다.

그 결과, AOX(도 7)에서는 삽입된 플라스미드 중에서 AOX의 프로모터 일부와 α-인자 리더, 그리고 3' AOX(TT)일부가 증폭되어서 660개의 뉴클레오타이드 밴드가 나타나고, 약하게 염색체의 온전한 AOX 유전자(2.1kb)가 증폭되었다. 또한, GUM(도 7)에서는 삽입된 플라스미드 중에서 거머린만이 증폭되어 170개의 뉴클레오타이드 밴드가 나타났다. 따라서, 제대로 발현벡터가 파이키아에 삽입되었고, 선택한 균주가 mut⁺표현형을 갖는 형질전환체임을 알 수 있다.

실시예 5: 거머린의 발현

상기 실시예 4에 따라 제조된 형질전환체를 MGY(1.34%YNB, 4×10^-5% 바이오틴, 1% 글리세롤) 액체 배양액에 접종하고, 30℃, 250rpm으로 진탕 배양하였다. 배양 세포의 농도가 600nm에서 2∼6의 O.D(optical density)에 도달하였을 때, 형질전환체의 단백질 발현을 유도하는 MM(1.34% YNB, 4×10^-5% 바이오틴, 0.5% 메탄올)액체 배양액으로 바꿔주고 30℃, 250rpm으로 72시간 더 진탕배양하였다.

배양액으로 분비발현된 단백질을 10∼20% 트리신 겔(Tricine gel)로 분석한 결과, 57개 아미노산으로 구성된 거머린이 정확히 유도되어 높은 발효율로 분비 발현되었음을 전기영동겔을 통해 확인하였다(도 8 참조). 도 8에서 약 6.1KD에서 보이는 밴드가 거머린을 나타낸다.

상기의 발현벡터 pGSI으로 형질전환된 메탄올 자화 효모 파이키아 파스토리스(P. pastoris)는 정확히 거머린을 세포밖으로 분비하였고, 이를 GS115:pGSI이라 명명하였다.

또한, 발현벡터 pGS29A로 형질전환된 메탄올 자화효모 역시 정확히 거머린을 세포밖으로 분비하였고, 이를 GS115:pGS29A라 명명하였다.

실시예 6: 거머린의 엘라스타제 활성저해 효능 측정

상기 실시예 5에 따라 발현된 재조합 거머린의 엘라스타제 저해효능을 비교하기 위하여 PPE(porcine pancreatic elastase)와 HLE(human leukocyte elastase)에 대한 거머린의 억제상수(inhibition constant, K_i)를 측정하였다.

PPE 기질로는 Suc-Ala-Ala-Ala-pNA를 사용하였으며, HLE의 기질로는 MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA를 사용하였다.

엘라스타제 합성 펩타이드 기질(synthetic peptide substrate)을 분해하여 파장 410nm에서 측정되어지는 p-니트로아닐린(p-nitroaniline)을 생성한다.

거머린은 엘라스타제 활성을 저해하기 때문에 p-니트로아닐린의 생성속도가 느려지고, 이때의 정상상태 속도(steady state rate)를 다음 수학식 1에 의거 측정하였다. 억제상수를 구하기 위하여 각각의 측정값들을 사용하여 비선형 리그레션 피팅(non-linear regression fitting)하였다.

V_s/V_o={([E_t]-[I_t]-K_iapp)+{([I_t]+K_iapp-[E_t])²+4K_iapp[E_t]}^1/2}/2[E_t]

상기 식에서, V_o는 비저해 정상상태 속도이고,

V_s는 저해된 정상상태 속도이고,

E_t는 전체 효소농도이며,

I_t는 전체 저해제 농도이고,

K_iapp는 겉보기 해리상수(apparent dissociation constant)이다.

그 결과, P. pastoris에서 발현된 재조합 거머린은 엘라스타제 활성을 nM 수준으로 저해하였다. 각 반응의 조건과 그 결과는 다음 표 1에 나타낸 바와 같다.

엘라스타제	돼지 췌장액(porcin pancreatic)	사람 백혈구(human leukocyte)
완충액	50mM 트리스-HCl pH 8.0	0.1M HEPES, 0.5M NaCl, pH 7.5
기질	Suc-Ala-Ala-Ala-pNA	MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA
억제상수(K_i),(nM)	20	12

상기 표 1의 결과로부터 재조합 거머린은 엘라스타제를 억제하는 효과가 있음을 알 수 있다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명의 발현벡터 pGSI이나 pGS29A으로 형질전환된 재조합 미생물을 배양하여 메탄올로 발현을 유도함으로써 대량 생산된 거머린은 천연형 거머린과 동일한 아미노산 서열과 분자량을 갖는 재조합 거머린인 바, 이로써 본 발명의 발현벡터를 이용하여 천연형 거머린이 지닌 활성을 유지하고 있는 재조합 거머린을 메탄올 유도조절을 통하여 고수율로 제조할 수 있다.

서열 번호 :1

서열의 길이 : 57

서열의 타입 : 아미노산

쇄의 수 : 1본쇄

토폴로지 : 선형

분자의 타입 : 단백질

서열의 특징 :

특징을 나타내는 기호 : mat peptide

특징을 결정하는 방법 : E

서열번호 : 2

서열의 길이 : 317

서열의 타입 : 핵산

쇄의 수 : 2 본쇄

토폴로지 : 선형

분자의 타입 : cDNA to mRNA

기원

생물명 : Hirudo nipponia

개체·분리클론명 : Full length cDNA of guamarin

Claims

한국산 흡혈종 거머리로부터 분리한 엘라스타제 억제 단백질을 암호화하는 cDNA의 염기서열과 이를 분비 발현하도록 유도한 유전자를 함유한 메탄올 유도성 재조합벡터.
제 1 항에 있어서, 상기 재조합벡터는 pGSI인 것임을 특징으로 하는 재조합벡터.
제 1 항에 있어서, 상기 재조합벡터는 pGS29A인 것임을 특징으로 하는 재조합벡터.
제 1 항의 거머린 유전자를 함유한 발현 비히클로 형질전환된 숙주.
제 4 항에 있어서, 상기 숙주는 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115;pGSI(수탁번호 KFCC-11037)임을 특징으로 하는 숙주.
제 4 항에 있어서, 상기 숙주는 파이키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115;pGS29A(수탁번호 KFCC-11038)인 것임을 특징으로 하는 숙주.